KR100236393B1 - 사람성장호르몬을 함유하는 의약제제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 분자량 약 20,000의 사람성장호르몬을 함유하고, 동결건조재용해후의 수용액속에서의 용해성 및 안정성을 향상시킨 의약제제를 제공하는 것을 과제로 한 것이며, 그 해결수단으로서, 분자량 약 20,000의 사람성장호르몬의 수용액에 크레아티닌, 아세틸트립토판나트륨 및 니코틴아미드로부터 선택되는 적어도 1종이상의 수용성 복소고리화합물, 비이온성 계면활성제 및 부형제를 첨가하여, 동결건조제제를 제조하는 것을 특징으로 한 것이다. 이로써, 본 발명에 의해, 분자량 약 20,000의 사람성장호르몬을 의약품으로서 적합한 농도를 함유하고, 또한 동결건조재용해후에도 안정적으로 유지할 수 있는, 주사제로서 사용하는데 적합한 의약제제를 제공가능하게 된다.

Description

사람성장호르몬을 함유하는 의약제제
본 발명은, 분자량 약 20,000의 사람성장호르몬(이하 20khGH)을 함유하는 의약제제에 관한 것이며, 상세하게는 20khGH를 함유하는 용액을 동결건조한 후 재용해한 경우 이물질이나 불용물이 없고, 저장안정성이 뛰어난 동결건조제제 및 그 제조법에 관한 것이다.
사람성장 호르몬은 분자량이 약 22,000(22khGH)인 것과 약 20,000(20khGH)인 것이 있는 것이 알려져 있다. 22khGH는 유전자재결합기술에 의해 제조되어, 소아과영역에 있어서 하수체성 소인증(小人症)의 치료에 사용되고 있다. 20khGH는 아직 공업적 레벨에서 제작된 일이 없고, 의료용으로서 사용된 일이 없다.
20khGH는 분자량 약 20,000의 단사슬의 폴리펩티드이며, 등전점(等電点)을 약 5.5부근에 가지고, 중성의 pH의 수용액속에서는 안정되고 있으나, 산성 및 알칼리성의 pH영역에서는 불안정하다. pH 범위가 약산성으로부터 약알칼리성에서의 20khGH의 용해성은 약 1㎎/㎖이하이며, 동결보존후의 재용해시에는 불용물을 발생하는 등, 매우 용해성이 낮은 단백질이라고 할 수 있다. 또 약산성으로부터 약알칼리성의 pH범위의 수용액속에서는, 20khGH는 매우 2량체를 형성하기 쉽고, 이미 보고된 바 있는 사람하수체유래의 20khGH에 있어서도 20khGH분자끼리 혹은 분자량 약 22,000의 사람성장호르몬과 2량체를 형성하기 쉬운 것이 보고된 바 있다(Chapman et al., J. Biolo. Chem. Vol. 256, pp. 2395-2401, 1981). 이들에 의해, 20khGH의 용해성이 낮은 원인은 단백질의 소수성 상호작용에 의한 것임이 추측된다.
소수성이 높은 단백질의 용해성을 향상시키는 일반적인 방법으로서는, 매우 강한 계면활성작용을 가진 도데실황산나트륨이나 변성제, 예를들면 요소, 염산구아니딘 등이 사용된다. 그러나, 이들은 단백질의 구조를 파괴하는 것으로, 단백질본래의 기능을 상실 혹은 저감시킨다. 즉, 단백질을 의약제제로서 사용하는 것을 목적으로 한 경우에는, 이들 일반적인 방법은 결코 바람직하지 않다.
한편, 단백질의 용해성을 향상시키기 위해 용해보조제를 사용하는 예로서, 양의 전하를 가진 히스티딘 및 크레아티닌과 음의 전하를 가진 시트르산을 등몰씩 첨가해서 조직플라스미노겐활성체(이하 tPA)개변체의 용해성을 향상시키는 방법(PCT공개WO90/08557호)이 알려져 있다. tPA 및 tPA개변체는, 중성의 pH에서의 용해성은 극단으로 낮지만, 산성의 pH에서는 뛰어난 용해성을 표시하는 단백질이다. 즉 tPA 및 tPA개변체의 용해성의 낮기는 단백질의 등전점 침전에 의한 것이며, 이 방법은, 양의 전하를 가진 히스티딘 및 크레아티닌과 음의 전하를 가진 시트르산을 첨가함으로써, 등전점침전을 억제하는 것이다.
현재 시판되고 있는 분자량 약 22,000의 사람성장호르몬을 함유한 의약제제의 처방은 하기 표 1과 같다. 이들은 통상 피하투여 혹은 근육내투여된다.
또, 이들 22khGH의 제제는 기본적으로는 글리신 또는 만니톨을 함유하고 있고, 5℃보존으로 1년간 안정하다.
시판되고 있는 22khGH동결건조제제의 처방
[표 1]
Figure kpo00001
본 발명자들의 검토에 의하면, 이와 같은 처방으로 20khGH의 동결건조제제를 제조해도 안정적인 제제는 얻지 못하였다.
20khGH를 이들과 마찬가지의 투여방법·처방으로 사용하는 경우에, 충분한 농도를 가진 안정적인 수용액을 얻지 못한다고 하면, 그것은 투여용량의 증대를 초래한다. 이와 같은 일은 20khGH의 주사제로서 사용할 때에 있어서 매우 적합하지 않는 일로 생각된다.
사람성장호르몬의 용액 속의 안정화방법으로서는 이제까지 몇가지 기술이 알려져 있다. 예를들면, 22khGH수용액의 안정화제로서 아르기닌과 EDTA를 함유한 제제처방(일본국 특표평 8-502021호), 22khGH용액의 불용물의 생성과 용해물의 활성을 유지하기 위해 다가알콜이나 아미노산을 첨가하는 처방(EP303746호), 22khGH수용액의 유연물(類緣物)의 증가를 억제하기 위해 안정화제로서 히스티딘을 첨가하는 처방(동 특표평 7-502516호)이 보고되어 있다. 그러나, 이들 처방은 어느 것이나 용액속에서의 22khGH의 안정화방법으로서 검토된 것이며, 22khGH동결건조품의 안정화작용은 기재되어 있지 않다. 또 20khGH의 동결건조제제의 안정화에 관해서는 아무것도 알려진 것이 없다.
본 발명자들은 20khGH의 용해성 및 안정성에 대해서 검토하였다. 그 결과, 이하 표 2에 표시한 바와 같이, 20khGH는 22khGH와 비교하면, 분자량이 작을 뿐아니라, 생리활성 및 안정성, 용해성 등의 물리화학적 성질이 크게 다른 것이 판명되었다. 특히 20khGH의 원체는 동결건조해도 불안정하며, 5℃와 같은 저온에서 동결건조제제를 보존해도 20khGH의125Asp가 탈아미드되어125Asn으로 된 탈아미드체나14Met가14OXMet로 된 술폭시드체와 같은 유연물질 및 고분자량중합물이 경시적으로 증가한다. 유연물질("유연체"라고도 함)이란 20khGH의 예를 들면 Asn134가 탈아미드되어 Asp134로 된 모노탈아미드체, Asn134에 부가해서 Asn137도 탈아미드된 디탈아미드체, Met14가 oxMet14로 된 술폭시드체를 의미하고 있다. 또 원체를 용해시킨 용액속에서 예를 들면 피펫조작과 같은 핸들링으로 용이하게 단백이 회합하여, 불용물이 석출한다. 즉 수용액 속의 안정성이 낮다. 후술하는 바와 같이 20khGH의 용액에 염기성 아미노산을 첨가해도 불용물이나 유연물질의 생성은 억제되지 않는다. 상술한 바와 같이 20khGH는 소수성이 높고, 그 때문에 22khGH보다도 불용물이 석출되기 쉬운 것을 생각할 수 있다.
20khGH와 22khGH와의 물리화학적 성질의 차이
[표 2]
Figure kpo00002
1 : Endocrine Reviews, (1991), vol. 12, pp.314-324
2 : J Biol.Chem., (1981), vol.256, pp.2395-2401
3 : 본 발명데이터
이상 설명한 바와 같이, 20khGH의 생리학적 활성을 유지한 채로 뛰어난 용해성및 안정성을 가진 수용액을 얻기 위해서는, 22khGH의 제제처방을 단지 답습하는 것만으로는 그 달성은 매우 곤란하고, 주사제로서 적합한 농도를 유지하고 또한 안정적인 20khGH의 새로운 처방의 의약제제가 강하게 요망되고 있었다.
또, 20khGH를 동결건조해도 유연물질 및 고분자량중합물의 생성은 방지될 수 없으므로, 유연물질이나 고분자량분해물의 생성이 적은, 안정적인 20khGH를 함유하는 동결건조의약제제의 제공이 요망되고 있었다.
따라서 본 발명의 목적은, 물에 용해한 경우 20khGH에 유래되는 불용물의 석출이 없는 20khGH를 함유한 의약제제를 제공하는 일이며, 또 다른 목적은 재용해후의 유연물질 및 고분자량중합물의 생성이 억제된 20khGH를 함유한 동결건조제제를 제공하는 일이다.
또, 본 발명의 다른 목적은, 20khGH를 함유한 의약제제에 있어서의 20khGH의 불용화를 방지하고, 안정성을 향상시키는 방법, 20khGH를 함유한 동결건조제제의 경시적인 유연물질이나 고분자량중합물의 생성을 억제하는 방법을 제공하는 일이다.
본 발명자들은, 상기의 과제인 20khGH의 용해성 및 안정성의 향상과 동결건조했을 때 안정한 20khGH의 제제처방을 얻는 것을 목적으로 예의 연구를 진행하였다. 그 결과, 뛰어난 20khGH의 용해성과 안정성을 가진 20khGH를 함유한 의약제제의 제조에 성공하였다.
또, 20khGH를 함유한 동결건조제제에 염기성 아미노산과 비이온성 계면활성화제를 첨가하면 동결건조제제의 유연물질의 생성이 억제되어 안정성이 향상되고, 이 동결건조제제는 물에 재용해한 경우에 불용물을 발생하지 않는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
즉 본 발명은, 분자량 약 20,000의 사람성장호르몬 또는 그 유연체와 수용성 복소고리화합물을 함유한 의약제제, 분자량 약 20,000의 사람성장호르몬 또는 그 유연체를 함유한 의약제제에 수용성 복소고리화합물을 첨가함으로써, 이 사람성장 호르몬 또는 그 유연체의 불용화를 방지하고, 안정성을 향상시키는 방법, 1종류 또는 2종류의 염기성 아미노산 또는 그 염 및 비이온성 계면활성제를 첨가함으로써, 분자량 약 20,000의 사람성장호르몬 또는 그 유연체를 함유하는 동결건조제의 경시적인 유연물질의 생성을 억제하는 방법이다.
본 발명에 관한 성장호르몬은 분자량 약 20,000의 사람성장 호르몬으로서, 이 사람성장호르몬은 천연 혹은 유전자재결합기술에 의해 얻게 되는 어느 것이라도 된다.
본 발명에 관한 20khGH의 예로서는, 서열번호 1 및 서열번호 2에 기재된 아미노산서열을 함유한 것을 들 수 있으나, 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재된 아미노산전체서열 속의 하나 또는 몇 개의 아미노산이 달라도 되고, 20khGH의 생리학적 특징을 유지하고 있는 한, 본 발명의 범주이다.
본 발명의 20khGH를 함유하는 의약제제에 함유되는 20khGH의 농도는, 동결건조전의 용액상태에 있어서 0.5∼10.0㎎/㎖이며, 바람직하게는 1.0∼3.0㎎/㎖, 더 바람직하게는 1.5∼2.5㎎/㎖이다. 또 동결건조된 제제의 재용해후의 20khGH의 농도는 10㎎/㎖이하가 유효하다.
본 발명의 20khGH를 함유하는 의약제제는, 용액상의 제제 및 동결건조된 제제의 재용해후의 20khGH의 용해성을 향상시키기 위해 수용성 복소고리화합물을 함유한다. 본 발명에 사용되는 수용성 복소고리화합물로서는 크레아티닌, 아세틸트립토판나트륨 등의 아세틸트립토판의 염 및 니코틴아미드중에서 적어도 1종류이상이 선택되나, 바람직하게는 크레아티닌이다. 이 수용성 복소고리화합물농도는 용액상의 제제 및 동결건조후의 재용해액에 있어서, 0.1%∼10%이며, 바람직하게는 0.3%∼5%이다.
본 발명의 20khGH를 함유한 의약제제의 pH는 5∼8의 범위이며, 바람직하게는 6.0∼7.8, 더 바람직하게는 6.5∼7.6이다. 특히 pH를 7.6으로 함으로써 통상의 육안관찰에서는 판별하기 어려운, 6,000럭스정도의 광원 밑에서 육안관찰로 확인할 수 있는, 극미세한 불용물까지도 감소 내지는 소실시킬 수 있다.
pH조정을 필요로 하는 경우, 단지 pH조정제, 예를 들면 염산, 인산 및 황산 등을 사용하거나, 또는 완충액, 예를 들면 트리스(히드록시메틸)아미노메탄, 인산, 말레산, 숙신산, 시트르산, 아세트산, 히스티딘 또는 그 염을 사용하는 것이 가능하다. 바람직하게는 인산 또는 그 염이다. 이 완충액농도는 0.1mM∼100mM이며, 바람직하게는 5mM∼50mM이다.
본 발명의 20khGH를 함유한 동결건조제제에 사용되는 염기성 아미노산으로서는, 리신, 히스티딘, 아르기닌 또는 그 염 등을 들 수 있다. 염기성 아미노산의 첨가량은 20khGH 1중량부에 대해 1∼20중량부이며, 바람직하게는 2∼15중량부이다.
또 본 발명의 20khGH를 함유한 동결건조제제는, 이 동결건조제제의 재용해후의 20khGH의 안정성을 향상시키기 위해 비이온성 계면활성제를 함유한다. 본 발명에 사용되는 비이온성 계면활성제는 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜, 혹은 폴리소르베이트이며, 예를 들면 폴리옥시에틸렌(160)폴리옥시프로필렌(30)글리콜, 폴리소르베이트20, 폴리소르베이트80이며, 바람직하게는 폴리소르베이트20 또는 폴리소르베이트 80 혹은 그 양쪽이다. 더 바람직하게는 폴리소르베이트80이다. 이 비이온성 계면활성제농도는, 동결건조후의 재용해액에 있어서 0.02%∼1%이며, 바람직하게는 0.02%∼0.2%이다.
또 본 발명의 20khGH를 함유한 동결건조제제는, 동결건조했을때의 외관 및 성형성 향상을 위하여 부형제를 배합할 수 있다. 부형제의 하나로서는 당알콜, 예를 들면 만니톨을 들 수 있다. 이 부형제의 농도는, 동결건조후의 재용해액에 있어서 0.1%∼5%이며, 바람직하게는 0.5%∼2%이다.
본 발명의 의약제제는 상술한 수용성 복소고리화합물을 첨가한 수용액에 20khGH의 희박용액을 첨가한 후 pH를 조정하면 된다. 또, 본 발명의 의약제제는 동결건조품으로 하는 것이 바람직하고, 동결건조품의 제조방법 및 조건 등에 대해서, 특히 한정되는 일이 없다. 동결건조는 예를 들면, 상기 농도범위의 수용성 복소고리화합물, 소정량의 염기성 아미노산, 비이온성 계면활성화제, 필요에 따라 부형제를 첨가한 수용액에 20khGH의 희박용액을 첨가한 후 pH가 조정된 조제용액을, -30℃∼-80℃에서 동결시켜, 상법에 의해 감압건조를 행한다.
또, 본 발명의 의약제제를 주사제로서 사용하는 경우에는, 동결건조품을 적절한 주사용수, 혹은 침투압조절제 예를 들면 나트륨, 포도당, 만니톨 등의 당알콜을 함유한 수용액에 의해 재용해하면 된다.
이하에 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하나, 본 발명은 이들 실시예에 의해 하등 한정되는 것은 아니다.
(실시예 1)크레아티닌의 첨가에 의한 20khGH의 용해성의 검토
실시예 1∼9에서 사용되는 20khGH는 유전자조작에 의해 조제된 것이며, 상세하게는, 형질전환주MT-10765(본 균주는 수탁번호FERM BP-5020으로서 일본국 통상 산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소에 부다페스트조약에 기초해서 기탁되어 있다)를 사용해서 일본국 특개평 6-269292호에 기재된 방법에 따랐다. 즉, 20khGH를 코딩하는 유전자를 가진 발현·분비플라스미드를 대장균에 도입해서 얻게된 형질전환주 MT-10765를, 폴리펩톤, 효모엑스 및 글리세롤 등으로 구성되는 배양액을 사용해서 배양한다. 배양종료후, 원심분리조작에 의한 균체를 집균하고, 침투압쇼크법에 의해, 균체외막을 파열시켜, 페리플라즘분획만을 회수한다. 페리플라즘분획으로부터의 20khGH의 분리·정제방법은, 공지의 방법 및 그에 준한 수법에 의해 실시하였다.
상기에서 얻게된 약 0.2㎎/㎖∼0.4㎎/㎖농도의 20khGH수용액에 요소를 첨가하고, 약 8㎎/㎖까지 농축한 후, 0%, 0.3%(27.8mM), 0.6%(55.5mM), 1.25%(11.1mM), 2.5%(221mM), 5%(442mM)의 각 농도의 크레아티닌을 함유한 20mM인산나트륨완충액(pH6.5)으로 충만된 겔여과컬럼의 각각에 상기 농축액을 첨가하였다. 겔여과에 의해, 요소가 제거되고, 또 상기 각각의 농도의 크레아티닌을 함유한 20mM인산나트륨완충액으로 치환되어 용출되는 정제분획을 분취하여, 그 얻게된 정제분획 속의 단백농도의 측정 및 용액상태의 변화를 육안으로 평가하였다. 크레아티닌의 첨가에 의한 효과를 표 3에 표시한다. 표 3에서, 용액속에 크레아티닌이 존재함으로써 20khGH의 용해성을 향상시키는 것이 가능해지고, 또 크레아티닌농도의 증가에 수반해서 겔여과법으로 얻게되는 정제분획 속의 20khGH의 농도가 상승하는 것도 확인되었다. 마찬가지로, 본 발명에 있어서 사용되는 기타의 복소고리화합물인 아세틸트립토판나트륨, 니코틴아미드에 대해서도 평가하였던 바, 크레아티닌에 있어서의 경우와 마찬가지의 효과가 인정되었다.
또, 형질전환주 MT-10712(본 균주는 수탁번호 FERM BP-4361로서 일본국 통상 산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소에 부다페스트조약에 기초해서 기탁되어 있음)에서 상기와 마찬가지 조작에 의해 얻게된 20khGH를 사용한 실험을 행하였던 바, 상기와 마찬가지의 결과를 얻었다.
이들 실험결과, 크레아티닌의 첨가효과의 발현은 크레아티닌과 등몰의 음의 전하를 가진 화합물을 필요로 하지 않았다. 이것은 20khGH의 용해성에 미치는 크레아티닌의 작용은 등전점침전의 방지와는 다른 작용인 것을 표시하고 있다.
[표 3]
Figure kpo00003
(실시예 2)폴리소르베이트 80의 첨가에 의한 20khGH동결용해후의 용액상태의 검토
표 3에 기재한 크레아티닌농도 1.25%(111mM)를 기본으로 0, 0.005, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2%농도의 폴리소르베이트 80(상품명; Tween80)을 각각 첨가했을때의 동결·융해전후의 20khGH수용액의 용액상태변화를 4면유리용기에 넣고, 6000럭스의 형광등하에서 육안으로 판정하였다. 이때의 20khGH농도는 약 2㎎/㎖이였다. 폴리소르베이트 80의 첨가에 의한 효과를 표 4에 표시한다. 0.02%이상의 폴리소르베이트 80을 첨가함으로써, 동결·융해조작에서 발생되는 미량의 20khGH의 불용물의 생성이 방지되어, 안정적인 용액상태를 유지할 수 있는 것을 알았다.
[표 4]
Figure kpo00004
(실시예 3)만니톨의 첨가에 의한 20khGH동결건조케이크의 외관, 성형성 및 재용해후의 용액상태의 검토
표 4에 기재된 폴리소르베이트 80농도가 0.05% 및 0.2%이며, 어느 것이나 크레아티닌농도가 1.25%(111mM)인 20khGH수용액에 부형제로서 0, 1.0, 5.0%농도의 만니톨을 각각 첨가해서 바이알병에 넣었다. 바이알병을 5℃에서 -40℃까지 냉각하고, -40℃에서 5시간 냉각하였다. -40℃에서 -25℃까지 감압하 온도를 올리고, -25℃에서 또 60시간 감압건조하였다. 감압하에 15℃까지 승온하고, 이 온도에서 6시간 건조하였다. 동결건조케이크의 외관 및 성형성을 관찰한 후, 또 주사용 증류수 1㎖을 첨가해서 재용해했을때의 용해성을 6000럭스의 형광등하에서 관찰하였다. 만니톨의 첨가에 의한 효과를 표 5에 표시한다. 동결건조한 케이크의 외관 및 성형성은 만니톨을 첨가하지 않은 것에 비해서, 만니톨을 첨가함으로써 더 향상하는 것이 가능해졌다. 또, 재용해후의 용액상태도 매우 양호한 것이 확인되었다.
[표 5]
Figure kpo00005
(실시예 4) 20khGH동결건조제제의 재용해후의 불용물의 생성에 대한 염기성 아미노산과 만니톨의 첨가효과
소정량의 염기성 아미노산 또는 그 염산염, 1.25%(111mM)크레아티닌, 2.5%만니톨, 0.05%폴리소르베이트 80을 함유하고, 인산 2수소나트륨과 수산화나트륨에 의해 pH를 7.6으로 조절한 20khGH를 2㎎/㎖함유한 수용액 1㎖를 바이알병에 넣었다. 바이알병을 5℃에서 -40℃까지 냉각하고, -40℃에서 5시간 냉각하였다. -40℃에서 -25℃까지 감압하 온도를 올리고, -25℃에서 더 60시간 감압건조하였다. 감압하에 15℃까지 승온하고, 이 온도에서 6시간 건조하였다. 얻게된 동결건조제제를 주사용 증류수 1㎖에서 복수(재용해)하고, 5℃에서 7일간 보존하였다. 시험개시때와 7일후의 용액상태를 6,000럭스의 형광등하에서 관찰하였다. 결과를 표 6에 표시한다.
[표 6]
Figure kpo00006
표 6에서 분명한 바와 같이 염기성 아미노산은 20khGH용액의 불용물의 생성을 억제하지 않고, 오히려 더 악화시키는 경향이 있었다. 불용물의 생성은 만니톨을 첨가해서 pH를 조정함으로써 억제되는 것을 알수 있었다.
(실시예 5) 20khGH동결건조제제의 재용해후의 용액 속의 유연물질의 증가에 대한 염기성 아미노산의 첨가 효과
20khGH를 함유한 수용액의 pH를 7.6으로 조절한 이외는 실시예 4와 마찬가지의 실험을 행하고, 시험개시때와 7일후의 유연물질(탈아미드체와 술폭시드체)량을 액체크로마토그래피에 의해 정량하였다. 결과를 표 7에 표시한다.
[표 7]
Figure kpo00007
표 7에서 명백한 바와 같이, 염기성 아미노산의 첨가는 용액 속의 유연물질의 증감에는 영향을 미치지 않았다.
(실시예 6) 20khGH동결건조제제 속의 유연물질의 증가에 대한 아르기닌 및 염산아르기닌의 첨가효과
아르기닌 또는 염산아르기닌 소정량, 1.25%(111mM)크레아티닌, 0.05%폴리소르베이트 80을 함유하고 인산 2수소나트륨과 수산화나트륨에 의해 pH를 7.6으로 조절한 20khGH를 2㎎/㎖ 함유한 수용액 1㎖을 바이알병에 넣었다. 바이알병을 5℃에서 -40℃까지 냉각하고, -40℃에서 5시간 냉각하였다. -40℃에서 -25℃까지 감압하 온도를 올리고, -25℃에서 또 60시간 감압건조하였다. 감압하에 15℃까지 승온하고, 이 온도에서 6시간 건조하였다. 얻게된 동결건조제제를 40℃에서 2주간 보존하였다. 시험개시때와 2주간후의 유연물질의 함량을 액체크로마토그래피에 의해 측정하였다. 결과를 표 8에 표시한다.
표 8에 표시한 바와 같이 아르기닌 또는 염산아르기닌의 첨가에 의해 유연물질의 생성이 억제되는 것이 명백해졌다.
[표 8]
Figure kpo00008
(실시예 7) 20khGH동결건조제제 속의 유연물질의 증가에 대한 리신염산염 및 히스티딘의 첨가효과
리신염산염 또는 히스티딘을 소정량, 1.25% 크레아티닌, 0.05% 폴리소르베이트 80을 함유하고 인산2수소나트륨가 수산화나트륨에 의해 pH를 7.6으로 조절한 20khGH를 2㎎/㎖ 함유한 수용액 1㎖를 바이알병에 넣었다. 바이알병을 5℃에서 -40℃까지 냉각하고, -40℃에서 5시간 냉각하였다. -40℃에서 -25℃까지 감압하 온도를 올리고, -25℃에서 또 60시간 감압건조하였다. 감압하에 15℃까지 승온하고, 이 온도에서 6시간 건조하였다. 얻게된 동결건조제제를 40℃에서 2주간 보존하였다. 시험개시때와 2주간 후의 유연물질의 함량을 액체크로마토그래피에 의해 측정하였다. 결과를 표 9에 표시한다.
표 9에 표시한 바와 같이 염기성 아미노산 및 그 염인 히스티딘 및 리신염산염에도 상기 아르기닌 및 아르기닌염산염과 마찬가지로 유연물질의 생성을 억제하는 효과가 인정되었다.
[표 9]
Figure kpo00009
(실시예 8) 20khGH동결건조제제 속의 고분자량중합물의 증가에 대한 염기성 아미노산의 첨가효과
염기성 아미노산 소정량, 1.25% 크레아티닌, 0.05%폴리소르베이트 80을 함유하고 인산2수소나트륨과 수산화나트륨에 의해 pH를 7.6으로 조절한 20khGH를 2㎎/㎖함유한 수용액 1㎖를 바이알병에 넣었다. 바이알병을 5℃에서 -40℃까지 냉각하고, -40℃에서 5시간 냉각하였다. -40℃에서 -25℃까지 감압하 온도를 올리고, -25℃에서 또 60시간 감압건조하였다. 감압하에 15℃까지 승온하고, 이 온도에서 6시간 건조하였다. 얻게된 동결건조제제를 40℃에서 2주간 보존하였다. 시험개시때와 2주간후의 고분자량중합물의 함량을 전기영동법(SDS-PAGE)에 의해 분석하였다. 즉 동결건조제제를 주사용수로 용해하고, 환원제(메르캅토에탄올)존재하 혹은 비존재하에서 비등수욕속에서 3분간 가열하고, 이 시료용액을 폴리아크릴아미드그라디엔겔에 1웰당 10㎍첨가해서 정(定)전류에 의해 영동후, 은염색하였다. 결과를 표 10에 표시한다.
표 10에 표시한 바와 같이 염기성 아미노산의 첨가에 의해 고분자량의 중합물의 생성이 억제되는 것이 명백해졌다.
동결건조제제 속의 고분자량의 중합물의 생성에 대한 염기성 아미노산의 첨가효과
[표 10]
Figure kpo00010
SDS-PAGE위에서의 고분자량중합물의 밴드의 농도. +++;진하게 보인다. ++;분명하게 보인다. +;보인다. ±;매우 연하게 보인다. -;보이지 않는다.
(실시예 9) 20khGH동결건조제제
동결해서 보존하고 있던 20khGH(2㎎/㎖), 크레아티닌(1.25%(111mM)), 폴리소르베이트(0.05%)를 함유한 용액 560㎖를 유수속에서 정치한 그대로 용해하고, 0.22㎛의 필터에 의해 여과하였다. 이 여과액 510㎖에 D-만니톨 15g 및 염산아르기닌 5.52g을 첨가하고, 얼음위에서 교반자를 사용해서 용해시켰다. 또, 얼음위에서 이 용액에 0.5N의 수산화나트륨용액 약 14㎖를 첨가하고, pH를 7.6으로 조정한 후, 새로이 정제수를 첨가, 전체량을 정확히 600㎖로 하였다. 이 용액을 주사용 바이알충전기를 사용해서, 2㎖의 유리제바이알병에 1㎖ 충전하고, 동결건조제에 제공하였다. 동결건조는 선반온도 5℃에서 -40℃까지 급속냉동하고, -40℃에서 5시간 예비동결시켰다. 감압하에서 선반온도를 -25℃로 제어하고, 약 50시간 건조시킨 후, 감압하에서 선반온도를 15℃로 제어하고, 6시간 건조시켜, 동결건조제제를 얻었다. 얻게된 동결건조제제의 케이크성질상태는 양호하고, 주사용 증류수를 첨가해서 재용해했을 때, 용액은 맑았다. 이 동결건조건조제제를 40℃에서 2개월간 보존하고, 외관, 복수했을 때의 용액상태 및 유연물질의 양을 측정하였다. 결과를 표 11에 표시한다.
그 결과, 이 제제는 장기보존후에도 외관이 양호하고, 물에 재용해한 경우 불용물이 생성되지 않고, 또 유연물질의 생성도 제어된, 안정적인 20khGH를 함유하는 동결건조제제인 것이 확인되었다.
[표 11]
Figure kpo00011
본 발명자들은, 통상의 생리활성물질에 사용되는 완충액에서는 약제로서 적당한 농도를 얻지 못하는 20khGH에, 크레아티닌 등의 수용성 복소고리화합물을 소정의 농도를 첨가함으로써, 20khGH의 용해성을 향상시키는 것을 발견하였다. 또, 20khGH의 수용액의 pH를 조정함으로써 극미량의 불용물의 생성을 방지할 수 있다. 또, 폴리소르베이트 80 등의 비이온성 계면활성제를 첨가함으로써, 동결용해에 있어서의 용액에서의 안정성을 향상시키는 것이 가능해지고, 또, 염기성 아미노산과 당알콜인 만니톨을 첨가함으로써, 동결 건조때의 안정성의 향상 및 재용해때의 안정적용해를 가능하게 하는 것을 발견하였다. 이들에 의해, 20khGH를 함유하고, 동결건조후, 재용해한 수용액을 주사제로서 사용하는데 적합한 의약제제가, 용이하고 또한 대량의 제공가능하게 되었다.
[서열목록]
서열번호 : 1
서열의 길이 : 176
서열의 타입 : 아미노산
토폴로지 : 직사슬형
서열의 종류 : 단백질
[서열 1]
Figure kpo00012
서열번호 : 2
서열의 길이 : 176
서열의 타입 : 아미노산
토폴로지 :직사슬형
서열의 종류 : 단백질
[서열 2]
Figure kpo00013

Claims (12)

  1. (정정) 분자량 약 20,000의 사람성장호르몬 또는 해당 사람성장호르몬의 Asn134가 탈아미드되어 Asp134로 된 모노탈아미드체, Asn134에 부가해서 Asn137도 탈아미드된 디탈아미드체 및 Met14가 oxMet14로 된 술폭시드체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종이상의 유연체와 크레아티닌, 아세틸트립토판의 염 및 니코틴아미드로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 수용성 복소고리화합물을 함유한 의약제제.
  2. (정정) 제1항에 있어서, 물에 용해한 경우의 pH가 pH5∼8인 것을 특징으로 하는 의약제제.
  3. 제2항에 있어서, pH가 pH조정제 혹은 완충액에 의해 조정되어 있는 것을 특징으로 하는 의약제제.
  4. 제2항에 있어서, 1종류 또는 2종류의 염기성 아미노산 혹은 그 염 및 비이온성 계면활성제를 함유하고, 동결건조제인 것을 특징으로 하는 의약제제.
  5. 제4항에 있어서, 분자량 약 20,000의 사람성장 호르몬 1중량부에 대하여 1∼20중량부의 염기성 아미노산 또는 그 염을 함유한 것을 특징으로 하는 의약제제.
  6. 제5항에 있어서, 비이온성 계면활성제가 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80 혹은 그 양쪽인 것을 특징으로 하는 의약제제.
  7. 제4항에 있어서, 부형제를 함유하는 것을 특징으로 하는 의약제제.
  8. 제7항에 있어서, 부형제가 당알콜인 것을 특징으로 하는 의약제제.
  9. 분자량 약 20,000의 사람성장호르몬 또는 해당 사람성장호르몬의 Asn134가 탈아미드되어 Asp134로 된 모노탈아미드체, Asn134에 부가해서 Asn137도 디탈아미드된 디탈아미드체 및 Met14가 oxMet14로 된 술폭시드체로 이루어진 군으로부터 선행된 1종이상의 유연체를 함유한 의약제제에 크레아티닌, 아세틸트립토판의 염 및 니코틴아미드로 이루어진 군으로부터 선택된 1종이상의 수용성 복소고리화합물을 첨가함으로써, 상기 사람성장호르몬 또는 그 유연체의 불용화를 방지하여, 안정성을 향상시키는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 물에 용해한 경우의 pH를 pH5∼8로 하는 것을 특징으로 하는 사람성장호르몬 또는 그 유연체의 불용화를 방지하여, 안정성을 향상시키는 방법.
  11. 1종류 또는 2종류의 염기성 아미노산 또는 그 염 및 비이온성 계면활성제를 첨가함으로써, 분자량 약 20,000인 사람성장호르몬 또는 해당 사람성장호르몬의 Asn134가 탈아미드되어 Asp134로 된 모노탈아미드체, Asn134에 부가해서 Asn137도 탈아미드된 디탈아미드체 및 Met14가 oxMet14로 된 술폭시드체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종이상의 유연체를 함유하는 동결건조제의 경시적인 유연물질의 생성을 억제하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 부형제를 또 함유한 것을 특징으로 하는 동결건조제의 경시적인 유연물질의 생성을 억제하는 방법.
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