KR100266145B1

KR100266145B1 - G-csf의 안정한 동결건조된 약제학적 제제

Info

Publication number: KR100266145B1
Application number: KR1019950702588A
Authority: KR
Inventors: 우베미하엘리스; 라이너루돌프; 게르하르트빈터; 하인리히보오크
Original assignee: 헤르베르트 포우퀘트; 로셰 디아그노스틱스 게엠베하; 라인 홀트밍크
Priority date: 1992-12-18
Filing date: 1993-12-15
Publication date: 2000-09-15
Also published as: CA2151732A1; ES2117781T3; HUT74269A; KR950703987A; US5919443A; SG66740A1; EP0674524B1; WO1994014465A1; EP0674524A1; JPH08504784A; AU6808694A; NZ258912A; AU676573B2; HU9501764D0; CA2151732C; ATE165007T1; HU220256B; DE59308415D1; DE4242863A1; DK0674524T3

Abstract

본 발명은 안정화 성분으로서 말토오스, 라피노오스, 슈크로오스, 트레할로오스 또는 아미노 당을 함유하는 G-CSF의 동결건조된 약제학적 제제에 관한 것이다. 또한 본 발명은 안정한 동결건조물의 제조 방법 뿐만이 아니라 G-CSF 를 함유하는 약제학적 제제의 안정화제로서 말토오스, 라피노오스, 슈크로오스, 트레할로오스 또는 아미노 당을 사용하는 방법에도 관한 것이다.

Description

G-CSF의 안정한 동결건조된 약제학적 제제

본 발명은 안정제로서 말토오스, 라피노오스, 슈크로오스, 트레할로오스 또는 아미노 당을 함유하는 G-CSF의 동결 건조된 약제학적 제제에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 상기 안정화된 동결 건조물의 제조 방법 및 G-CSF를 함유하는 약제학적 제제의 안정제로서 말토오스, 라피노오스, 슈크로오스, 트레할로오스 또는 아미노 당의 용도에 관한 것이다.

G-CSF(과립구 콜로니 자극 인자)를 함유하는 여러가지 약제학적 제제가 당해 기술분야에 이미 공지되어 있다.

DE 37 23 781 (GB 2,193,631)에는 최소한 하나의 약제학적으로 허용될 수 있는 계면활성제, 사카라이드, 단백질 또는 G-CSF를 안정시키기 위한 고분자 화합물을 함유하는 G-CSF를 함유한 약제학적 제제가 개시되어 있다. 제제는 안정화제로서 사람의 혈청 알부민을 함유하는 제제가 제안되어 있다. 특히, 제제는 사용된 G-CSF 양의 1 내지 10000 배에 상당하는 중량부로 계면활성제를 함유하는 제제가 유리하다고 기재되어 있다.

EP 0 373 679에는 가능한 낮은 전도도를 가져야 되는 용액의 산성 PH 값에 의해 근본적으로 특정지워지는 G-CSF의 안정화된 제제가 개시되어 있다. 이 용액은 예컨대 완층액 또는 만니톨과 같은 약제학적 보조제를 함유하는 경우에 3-3.7의 PH 값을 갖는다. 만약 어떤 완충제도 약제학적 제제중에 중재하지 않는다면, 2.75-4 범위의 PH가 유익한 것으로 기재되어 있다.

추가로, EP 0 306 824에는 사람 단백질 제제의 안정화된 동결 건조물이 개시되어 있는데, 안정화는 우레아, 아미노산 및 세제의 혼합물이 첨가됨으로써 성취된다고 기재하고 있다.

선행 PCT 특허 출원 PCT/EP92/01823에는 주입 또는 주사시키기 위한, G-CSF를 함유하는 내성이 우수한 약제학적 제제의 제조 방법이 기재되어 있다. 액체 투여 형태는 특히 낮은 적정 산도 및 낮은 완충제 용량이 특징이다. G-CSF를 함유한 개시된 주입 및 주사 용액의 pH 값은 약 3.7 내지 4.5의 산성 범위에 있다.

PCT/EP92/01822에는 본조제를 추가로 함유하는 G-CSF를 함유한 액체 약물 투여 형태의 제조 방법이 공지되어 있다. 약제학적 수용액의 PH 값은 2.5 내지 4.5의 산성 범위내에 있다. 이러한 경우에 있어서, G-CSF의 안정화는 근본적으로는 G-CSF에 적합한 산성의 pH 값이 설정되고, 여러가지 아미노산들의 혼합물이 첨가됨으로써 성취된다.

그러나, 이미 공지되어 있는 G-CSF를 위한 약물 투여 형태는 약간의 단점을 갖는다. 액체 G-CSF 제제가 일부 경우에 있어서 동결 및 해동에 대해서 민감할 수 있다는 것이 발견되었다. 동결 및 해동이 조정되지 않은 상기 제제는 이합체, 올리고머 및 응집체의 형성을 초래할 수 있으며, 불용성의 침전물을 또한 형성시킬 수 있다. 단백질을 함유한 약제학적 제제의 상기 성질은 의학적-약제학적 관점의 측면에서 의문의 여지가 있는 것인데, 왜냐하면, 약제학적 용액의 우발적인 동결을 완전히 피할 수 없어서 정상적으로 변화된 제제가 투여될 위험이 있기 때문이다.

DE 37 23 781호에 기재된 제제는 의학적인 관점에서, 무해한 것으로서 간단하게 판단될 수 없는 약제학적 첨가제 또는 보조 물질을 함유하고 있다는 단점이 있다. 중합체 및 단백질은 이것들의 약제학적 첨가제로서의 안정성에 관련하여, 본래의 성질 및 물리화학적 성질에 기인되는 특정한 잠재적 위험성을 갖는다. 사람 또는 동물로부터 얻어지는 단백질 뿐만 아니라 세포 배양물로부터 얻어진 단백질은 바이러스 오여물의 잠재적 잔류 위험성을 내포하고 있다. 또한, 분석적으로 검출되기 어려운 다른 단백질-유사 불순물은 이것의 항원성으로 인하여 사람에게서 면역학적 반응을 일으킬 수도 있다. 더욱이 일반적으로 동물 유래의 단백질은 이것의 종 특이적 반응으로 인하여 사람에게서 면역학적 반응을 더욱 촉발시킬 수 있다. 상기 단백질의 재투여 후에도 장기간에 걸쳐 반응이 일어날 수 있다.

고분자량 화하물(중합체)의 첨가가 또한 문제가 될 수 있다. 중합체는 중합체의 거대한 분자 질량으로 인하여 신체중에 누절될 수 있으며, 따라서 만약 어떤 생체분해가 일어나지 않으면 장기간에 걸쳐 신체중에 잔류될 수 있다. 이것은 특히 피하로 투여되는 경우에 있어서 위험한데, 정맥내 투여에 비교하여 혈액 스트림을 거쳐서 상당히 느리게 제거 및 분포되기 때문이다. 또한, 중합체는 중합체의 분자 질양에 좌우되는 항원성을 갖는다. 추가로, 중합체의 순도는, 중합체 제조용으로 사용되는 촉매 또는 단량체 및 다른 중합체 단편의 존재 때문에 보장되기 어렵다. 따라서, 투여되는 약제학적 형태로의 중합체의 사용은, 만약 가능하다면 피해야 하며, 특히 피하로 투여될 수 있는 약제학적 제제의 형태의 경우에 있어서 피해야 된다.

또한, DE 37 23 781호에 기재되어 있는 계면활성제의 양은 의학적 관점에서 문제가 있는 것으로 생각된다. 여기서, 계면활성제의 농도는 G-CSF의 중량비에 관련하여 1 내지 10000 중량부의 계면활성제가 존재하는 것이 유익한 것으로 기재되어 있다. 다른 한편으로, 당업자가 만약 임상 사용을 위한 최종 약제학적 제형중에 G-CSF의 바람직한 적용 농도를 0.05 내지 1.5_㎎/㎖로 간주한다면, 이것은 상다히 높은 계면활성제 농도를 초래한다. 이것은 국소적인 자극을 일으킬 수 있으므로, 의학적 관점으로는 피해야 된다.

추가로, 특히 피하 투여의 경우에 있어서, 공지된 제형의 일부는 사용된 낮은 pH 값으로 인하여 환자에게 국소적 불내성을 일으킨다. 얻어진 생성물은 조직중의 7.0 내지 7.5의 생리학적 pH 범위가 생성물의 pH와 일치하지 않으므로, 민감성 환자에게 고통 및 국소적인 조직 자극을 야기시킬 수 있다.

추가로, 특히 G-CSF의 비글리코실화된 형태가 CHO 세포들로부터 얻어지는 글리코실화된 G-CSF와 비교하여 특히 불안정한 것으로 공지되어 있다 [J. Biol. Chem. 1990, 265, 11432]. G-CSF의 비글리코실화된 형태의 안정화는 특히 어려운 것으로 판명되었으며, 상기 분자를 안정한 약물 투여 형태로 제형시키기 위해 특별하게 선택된 조치가 요구된다.

본 발명의 목적은 약제학적 제제로서 G-CSF의 적절한 사용을 가능하게 해주며 상기에서 설명된 종래의 공지된 약제 형태의 단점을 가지지 않는 G-CSF의 약제 투여 형태를 제공하는 것이다. 약제학적 제제는 조절되지 않은 동결 및 해동 과정에 대해서 안정해야 될 뿐만 아니라, 또한, 장기간 동안 동결 건조물로서 저장될 때에도 안정해야 되며, 생리학적으로 내성이 강하고 사용하기 용이하며 그리고 정확한 분량으로 투여될 수 있어야 한다.

DE 37 23 781에 기재된 실시예는, 안정한 동결 건조물이 사람의 혈청 알부민이 보조제로서 사용될 때 얻어질 수 있음을 보여준다. 당 알코올만의 첨가는 덜 안정한 제형을 초래한다. 따라서, 기술분야의 개선에 관련해서는, 사람의 혈청 알부빈(HAS)이나 다른 단백질 또는 중합체는 함유하지 않지만, 그럼에도 불구하고 증가된 온도에서조차도 양호한 안정성을 갖는 제형을 발견하는 것이 요구된다. 사람의 혈청 알부민 및 중합체의 부재는, 예컨대 HSA에 대해서 개시되어 있는 것과 같은 부작용의 의학적 위험을 감소 시킨다.

놀랍게도, 본 발명의 범주내에서, 말토오스, 라피노오스, 슈크로오스, 트레할로오스 또는 아미노 당이 첨가제로서 사용될 때, 약제학적 제제의 안정한 형태가 제조될 수 있음이 발견되었다.

보조제로서 말토오스, 라피노오스, 슈크로오스, 트레할로오스 또는 아미노 당을 함유한 고체 제제는 동결될 수 있거나, 40℃까지 증가된 온도에서도 어떤 상당한 단백직의 손실엇이 저장될 수 있다. 활성 물질의 약제학적 성질은 이것에 의해 불리한 영향을 받지 않는다. 본 발명에 따른 제제는 바라직하게는 동결 건조물로서 시판된다. 다시 용해된 후에 제조된 수성 제제는 내성이 매우 강하고, 단백질 안정성에 관련하여 높은 품질을 나타낸다. 보조제로서 말토오스, 라피노오스, 슈크로오스, 트레할로오스 또는 아미노 당의 첨가는, 당해 기술분야중에 일반적으로 공지되어 있는 용액이 단백질 안정화를 위해 2.5-3.5의 pH 값을 갖는 용액을 요구하는 반면에, 용액이 4-5 또는 7-8의 유익한 pH 값으로 제조될 수 있도록 해준다.

본 발명에 따른 제제의 부가적인 이점은, 이것들이 본질적으로 의학적인 목적으로 사용되는 경우에 문제를 유발시킬 수 있는 단백질-유사 보조 물질 또는 중합체 보조 물질을 함유하지 않는다는 것이다. 동결 건조물이 용해됨으로써 얻어지는 G-CSF를 함유한 액체 약물 투여 형태는 약 4-5 또는 7-8, 바람직하게는 혈액의 pH 값(pH 7.2-7.4)에 근사한 pH 값으로 제조될 수 있다는 사실에 기인하여, 본 발명의 제제들은 내성이 강하고 실질적으로는 고통없이 투여될 수 있는 이점을 갖기도 한다. 이것은, 특히, 피하 투여의 경우에 있어서 정맥내 투여 보다 쉽게 내성이 생길 수 있기 때문에 피하 투여를 위해 중요하다. 또한, 본 발명에 따른 제제는 0.05-1.5㎎/㎖의 임상 적으로 특히 바람직한 농도 범위로 제조될 수 있어서, 1.0㎖ 이하의 주사 부피를 유지할 수 있다. 적은 주사 부피는 피하 조직중에 매우 적은 기계적 자극만을 야기시키기 때문에 피하 투여에 특히 유익하다.

추가의 이점은, 선택된 보조 물질에 기인하여 액체 약제학적 제제에 사전에 요구되는 상대적으로 많은 양의 계면활성제가 더 이상 필요하지 않다는 것이다. 반대로, 0.5㎎/㎖ 이하, 바람직하게는 0.01-01㎎/㎖의 적은 양의 계면활성제가 G-CSF를 안정화시키는데 적합하다. 계면활성제 농도(㎎/㎖)는 유리하게는 부피 단위단 사용된 G-CSF의 양보다 적거나 같은 양(㎎/㎖)으로 사용될 수 있다. 이것은 G-CSF의 피하 투여를 위해 의도된 액체 약제 형태에 대해 특히 유익하다. 추가로, 본 발명에 따른 조치로 특히 가변적인 비글리코실화된 G-CSF 분자의 약제학적 제제가 충분히 안정된다.

보조제인 말토오스(말트 당, 말토비오스, 4-0-알파-D-글루코피라노실-D-글루코오스)는 활성 물질 G-CSF의 양의 0.01 내지 10000 배의 양으로 사용된다. 이것은 보조제들인 라피노오스, 슈크로오스 및 트레할로오스에 대해서 동일하게 적용된다. 약제학적 제제의 액체 형태중에 상기 보조제의 농도는 0.1 내지 200 ㎎/㎖, 바람직하게는 10 내지 60 ㎎/㎖이다. 입체 이성질체인 디사카라이드 셀로비오스, 겐티오비오스 또는 이소말토오스 또한 말토오스 대신에 사용될 수 있다. 일반적으로 아미노 당은 수산기 대신에 아미노기 또는 아실화된 아미노기를 갖는 모노사카라이드를 의미한다. 이것의 실례로는 글루코오스아민, 갈락토오스아민 및 뉴라민산을 들 수 있다.

특정 구체예에서, 말토오스, 라피노오스, 슈크로오스 또는 트레할로오스 이외에도 아미노산을 함유하는 약제학적 제제가 제공된다. 염기성 아미노산, 예컨대 아르기닌, 라이신, 오르니틴 등과 같은 아미노산, 예컨대 글루탐산, 아스파르산 등과 간은 산성의 아미노산, 및 또한 페닐알라닌, 티로신, 트립토판 등과 같은 방향족 아미노산이 특히 고려된다.

아미노산은 활성 물질 G-CSF의 양의 0.01 내지 10000 배의 양으로 사용된다. 액체 약제학적 제제중에 상기 보조제의 농도는 0.1 내지 200㎎/㎖, 바람직하게는 1 내지 50 ㎎/㎖ 이다.

동결 건조물은 제조하기 위해서, 먼저 활성 물질 및 다른 종래의 약제학적 보조제를 함유한 수성의 약제학적 용액이 제조된다.

예컨대, 아르기닌, 라이신, 오르니틴, 페닐알라닌 또는 티로신과 같은 아미노산이 약제학적 보조제로서 특히 고려된다. 추가로, 수성 제제는, 예컨대 아세트산, 염산, 시트르산, 락트산, 타르타르산, 말레산 및 인산과 같은 종래의 완충액 물질 또는 이것들의 생리학적으로 허용되는 염을 함유할 수 있다. 보조 물질 용액의 제조에 있어서, 상기 완충액 물질들은 상응하는 유리산의 형태로 존재할 수 있거나, 알칼리염, 알칼리-토염 또는 암모늄염의 형태로 존재할 수 있다. 이 외에도, 상기 용액은 추가로 종래의 약제학적 보조 물질을 함유할 수 있다.

여러가지 보조 물질 또는 활성 물질의 첨가 순서는 제조 방법에 크게 관계되지 않으며, 당해 기술분야의 숙련자들의 재량에 달려 있다. 용액의 바람직한 pH 값은 수산화 알칼리염, 수산화 알칼리토염 또는 수산화 암모늄염을 첨가함으로서 조정된다. 이 중에서 수산화 나트륨이 바람직하다. 바람직한 pH 값의 조정은 염기성 용액을 첨가시킴으로써 주로 이루어질 수 있다. 통상, 강염기와 약산의 염은, 예컨대 아세트산 나트륨, 시트르산 나트륨, 인산수소 이나트륨, 인산수소 이칼륨 또는 탄산나트륨과 같은 것을 들 수 있다. 만약 보조 물질의 약제학적 용액이 염기성의 pH 값을 갖는다면, 바람직한 pH 범위에 이를 때까지 산으로 적정시킴으로써 조정된다. 생리학적으로 허용되는 무기산 또는 유기산으로는, 예컨대 염산, 인산, 아세트산, 시트르산 또는 산성의 pH 값을 갖는 물질의 종래의 용액을 들 수 있다. 이러한 측면에서 바람직한 물질은, 예컨대 인산 이수소 나트륨 또는 인산 이수소 칼륨과 같은 강산과 약염기의 염을 들 수 있다.

투여될 액체 약제 투여 형태중의 완충액 물질의 농도는 각각의 경우에 있어서, 바람직하게는 약 2-80 mmol/l 이다. 완충액 물질의 총 농도는 100mmol/l의 값을 초과해서는 안된다. 완충액 물질의 농도는, 바람직하게는 5-40 mmol/l 이다.

상기 보조 물질에 의한 G-CSF 분자의 안정화는 재조합 방법 및 이것의 변형에 의해 제조된 모든 G-CSF 분자에 기본적으로 관계된다. 본 발명에 따른 G-CSF 또는 G-CSF 변형물로는 모든 자연적으로 발생되는 G-CSF 변형물 뿐만 아니라 이것으로부터 유도되는 재조합 DNA 기법에 의해 변형된 G-CSF 단백질, 특히 G-CSF 부분 외에 다른 단백질 서열을 추가로 함유하는 융합 단백질을 들 수 있다. 이런 견지에서, G-CSF 뮤테인은 원핵 세포중에서의 발현에 적당한 위치 -1 에서 N-말단 Met 잔기를 가지는 것이 특히 바람직하다. PCT/EP91/00192 에 따라 제조될 수 있는 재조합 메타오닌 비함유 G-CSF 변형물도 마찬가지로 적당하다. 본 명세서에 있어서, 용어 "G-CSF 변형물"은 하나 또는 여러 개의 아미노산이 삭제되거나 다른 아미노산에 의해 치환될 수 있는 G-CSF 분자를 포함하는 것을 의미하는 것으로, G-CSF의 본질적인 성질은 실질적으로 유지되는 G-CSF 분자를 의미한다. 적당한 G-CSF 뮤테인은, 예컨대 EP 0 456 200에 개시되어 있다.

만약 등장성(isotonicity)이 안정화를 위해 사용된 활성 물질 및 보조 물질의 삼투압 성질에 의해 이루어질 수 없다면, 내성이 강한 기경구 약제 투여 형태의 제조를 위해 등장적으로 작용하는 보조 물질을 첨가시키는 것이 유리하다. 이러한 목적을 위하여, 비-이온화된, 허용 가능한 보조 물질이 주로 사용된다.

등장성을 조정하기 위해 염이 첨가되는 것은 바람직하지 못한데, 이것은 염 또는 이온의 높은 농도가 G-CSF 응집체의 형성을 촉진시키기 때문이다. 따라서, 염은 유익하게는 적은 양으로 첨가된다.

또한, 약제학적 제제는 종래의 보조 물질 또는 첨가 물질을 추가로 함유할 수 있다. 예를 들면, 글루타티온, 아스코르브산 또는 유사한 물질과 같은 산화방지제, 예를 들면 우레아 및, 예컨대 아르기닌, 라이신, 오르니틴, 글루탐산과 같은 아미노산과 같은 챠오트로픽(chaotropic) 보조 물질 및 다른 것들이 첨가될 수 있다.

본 발명은 이하의 구체예를 나타내는 실시예를 토대로 보다 상세히 설명된다.

실시예 1 내지 14는 본 발명에 따라 제형될 수 있는 동결 건조물의 제조 방식 및 단백질의 안정성에 관련된 보다 상세한 실험 방식을 보여준다. 말토오스, 라피노오스, 슈크로오스 또는 트레할로오스 외에 첨가된 보조 물질의 영향 및 pH 값의 영향이 설명된다.

만니톨 또는 글리신을 기재로 하여 제조된 동결 건조물에 대한 비교 실험은 말토오스, 라피노오스, 슈크로오스 또는 트레할로오스 동결 건조물이 다른 구조물로 제조된 제제보다 훨씬 더 좋은 결과를 가져옴을 보여준다. 본 발명에 따라 서술되고 실시예중에서 설명된, 생리학적으로 허용된 pH 값을 갖는, 동결 건조물의 사용은, 기계적 응력 뿐만 아니라 증가된 저장 온도에 대해 단백질 상에 부정적인 효과를 미치지 않고 견딜 수 있는 장기간 저장 안정성을 갖는, 상기 설명된 목적을 위한 최적의 제형을 가능하게 해준다. 이 제제는 특히 동결에 대해 민감하지 않으며, 단백질 또는 중합체와 같이 중요한 것으로 여겨지는 보조 물질을 전혀 필수없게 할 수 있다. 또한, 상기 제제는 단지 상대적으로 적은 양에 불과한 양의 생리학적으로 허용되는 계면활성제를 함유한다.

실시에 3에서는, 여러가지 당 또는 알코올이 G-CSF 동결 건조물에 미치는 안정화 영햐에 대해 시험된다. 말토오스는 락토오스와 마닌톨과 비교하여 유사하다.

실시예 4에서는, 말토오스 및 추가의 보조 물질을 함유하는 동결 건조물이 설명된다. 그 결과는, 계면활성제의 첨가가 실질적으로는 제제의 안정성에 영향으로 미치지 않지만, 표면에 대한 단백질의 점착을 막아서 함량의 손실을 막을 수 있음을 명백히 증명한다. 이러한 제형중에 계면활성제의 존재는 정상적인 사용량을 유지시키기 위해서 보다는 안정화를 위해 요구된다.

실시예 5에서는, 말토오스를 함유한 여러가지 동결 건조물 제형과 말토오스를 함유하지 않는 것 이외에는 동일하게 제형된 2가지 동결 건조물이 비교된다. 그 자료는 말토오스가 존재하는 것은 제제의 안정성에 관련하여 시험된 매개변수들 상에 유익한 영향을 미침을 명백히 보여준다. 아스코르브산, 글루타티온 또는 글루탐산과 같은 추가의 보조 물질의 첨가는 시험된 저장 온도 및 저장 기간의 조건에서 안정성에 어떠한 상당한 영향도 미치지 않는다. 실시예 5에서 설명된 제제는, 특히 증가된 온도에서 장기간 저장시에 시험된 품질 기준을 변화시키지 않는다는 사실에 의해 특징지워진다.

나아가, pH가 염산, 인산, 시트르산 또는 다른 산에 의해 조정될 때, 형성된 아르기닌 완충액은 적당한 pH-안정화 효과를 갖기 때문에 추가의 완충염은 말토오스 및 아르기닌을 함유한 동결 건조물에 절대적으로 필요한 것이 아님이 실시예들로부터 명백해진다. 아르기닌 완충액은 5.0 이하 및 7.0-7.5의 pH 범위로 적당한 제제를 제형하는데 가장 적당하다(실시예 11 및 12). 실시예 9에서는, pH 7.4이고 말토오스 및 아르기닌 완충액을 함유하는 재용해된 동결 건조물이 최소한 24시간 동안 안정함을 보여준다.

실시에 6에서 설명된 G-CSF 동결 건조물은 아미노 당 (갈락토오스아민, N-메틸-글루코오스아민)을 함유한다. 이로부터, 말토오스 및 아미노 당의 조합물이 글리신과 아미노 당의 조합물 보다 더 안정한 제제임을 알 수 있다. 생리적으로 허용되는 보조 물질과 혼합된 말토오스가 상당히 안정되고, 따라서 약제학적 품질과 관련하여 문헌중에 기재된 다른 빌더 및 안정제보다도 더 높은 품질의 G-CSF 동결 걸조물을 산출한다는 것을 증명해준다.

실시예 7은, G-CSF가 말토오스를 함유한 동결 건조물중에서 만니톨을 함유한 동결 건조물중에서 보다 휠씬 더 안정함을 보여준다. 이것은 상대적인 저장 온도에 따라서, 그리고 오랜 저장 기간동안에 증명된 것이다.

실시예 8은, 다양한 pH 값에서 말토오스를 함유하고 여러가지 보조물질 첨가제를 함유한 동결 건조물이 다른 구조물 및 안정제(당 알코올, 아미노산)를 함유하는 동결 건조물에 비하여 유익한 결과를 가져옴을 보여준다.

실시예 10에서는, 말토오스, 라피노오스, 슈크로오스 또는 트레할로오스를 함유한 본 발명에 따른 동결 건조물의 40℃에서 13주 저장후의 안정성을 증명해준다.

실시예 11에서는, 본 발명에 따른 동결 건조물이 더 높은 G-CSF 농도로도 안정됨을 보여주고, 실시예 12에서는, 본 발명에 따른 제형의 장기간 안정성은 증가된 온도에서 조차도 유지됨을 보여준다.

[실시예 1 : 안정성 측정에 대한 시험 방법]

동결 건조된 제제를 규정된 저장 온도에서 어두운 곳에 저장하였다가 계속해서 응집체 및 이합체의 형성에 대하여 뿐만 아니라 단백질 속도에 대하여 역상 HPLC (RP-HPLC), 겔 크로마토그래피 또는 크기 배제 크로마토 그래피 (SE HPLC) 및 웨스턴 블롯을 사용하여 조사하였다. 또한 단백질 함량은 OD 280 분광기에 의해 조사하였고, 생물학적 활성은 생체 검정(NFS 60 세포 시험)에 의해, 그리고 응집 및 침전은 혼탁도 측적에 의해 조사하였다. 사용한 방법들은 다음과 같다 :

1.1 역상 HPLC

RP-HPLC는 누클레오실 C18 컬럼(Knauer Compny)을 사용하여 수행하였다. 이동상은 0.12% (V/V)의 트리플루오로아세트산(TFA) / 물(A) 및 0.1% (V/V)의 TFA/아세토니트릴(B)로 구성된다. 크로마토그래피는 A에서 B의 선형 구배를 사용하여 0.5 ㎖/분의 유속에서 수행하였다.

주입량은 제형에 따라 3 내지 6 ㎍의 G-CSF 였다. 외부 표준을 사용하여 피크 영역에 의해 214 ㎚의 파자에서 평가하였다.

1.2 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)

SE 크로마토그래피를 위해 TSK G 2000 SW 분리 컬럼 (7.5 × 300㎜)을 사용하였다. 분리는 실온에서 및 인산염 완충액(22.2 mM Na₂HPO₄; 107.7 mM KH₂PO₄; pH 6.2)중에서 0.6 ㎖/분의 유량에서 균일하게 수행하였다. 주입량은 3 - 6 ㎍ G-CSF 였다. 외부 표준을 사용하여 피크 영역에 의해 214 ㎚의 검출 파장에서 평가하였다.

1.3 SDS PAGE/웨스턴 블롯

3㎍의 rhG-CSF를 12%의 폴리아클릴아미드 SDS 겔에 비환원조건하에 적용하고 겔 전기영동을 수행하였다. 계속해서 그것들의 분자량에 따라 분리된 G-CSF 단량체, 이합체 또는 응집체들을 전기 블롯팅에 의하여 니트로셀룰로오스 상에 옮겼다. 단백질 밴드를 특이한 다클론성 비오티닐화된 항-G-CSF 항체(PAB＜GCSF＜lgG)와 함께 인큐베이션함에 의해 확인하고 스트렙트아비딘-알칼리 포스파타제 접합체(SA-AP 접합체), 5-브로모-4-클로로-3-인돌린 포스페이트(BCIP) 및 니트로 블로 테트라졸륨(NBT)을 사용하여 인산염 기법에 의하여 검출하였다. 단량체, 이합체 및 응집체의 백분율은 일련의 rhG-CSF 표준을 사용하여 레이저 밀도계 평가에 의하여 측정하였다.

1.4 NFS-90 생체 검정 (생물학적 활성)

G-CSF 활성의 시험관내 측정은 G-CSF에 의해 자극된 NFS-60 세포의 세포 배양물줄의 세포 수를 측정하는 것을 토대로 한다.

적절한 조건하에서 세포의 타수소효소 활성을 배지중의 G-CSF의 농도와 상화 연관시키는 것이 가능하다. G-CSF 완충 용액의 적절한 희석액을 탈수소효소 활성의 쉽에 측정가능한 증가를 얻기 위하여 제조하였다.

그런 다음 활성을 570 및 690 ㎚에서 분광학적으로 측정하였다. 테트라졸륨 염 MTT(황색)의 포르마잔(청색)으로의 환원이 측정되었다.

G-CSF의 시험관내 활성은 샘플에 대해 얻어진 데이타를 평행선 방법에 따른 대조 표준에 대한 데이터와 비교함으로써 계산하였다. 평가는 Ph. Eur. (Vlll, 13)의 요구조건에 따른다.

1.5 산란 광 측정, 혼탁도 측정

상기 측정은 유리 큐빗(직경 2㎝)중의 희석되지 않은 생성물 용액에 대하여 직접적으로 수행하였다. 액체에 의해 확산 반사된 산란광은 90도의 각도에서 측정하였다. 이것은 DIN 38404C2에 따라 포르마진 표준 현탁액에 비교하여 측정하고, 측정치는 TU/F로 표시하였다. 측정은 적절한 혼탁도 분광계, 예컨대 LTP 5 (Dr. Lange Company, Dusseldorf) 상에서 수행하였다.

1.6 분광기 OD 280 (단백질 함량)

G-CSF UV 스펙트럼은 트립토판, 티로신 및 페닐알라닌 잔기와 같은 측쇄 발색단에 기인하는 280㎚ 에서의 최대 흡광도를 갖는다. 측정은 하기의 것들에 의하여 위(placebo) 용액과 비교하여 수행하였다 :

---- UV 분광계, (예컨대 Uvikon 810 P 또는 941 (Kontron Instrument)).

---- 반-마이크로 수정 큐빗, 500 ㎕, 경로 길이 : 1㎝ (예컨대 Hellma, Suprasil, Cat. No. 104.002B-QS).

0.1 ㎎/㎖의 폴록사머 118과 50 ㎎/㎖의 다음 당 또는 당 알코올, 만니톨(제형 1), 락토오스(제형 2) 및 말토오스(제형 3)의 수용액을 70㎍/㎖의 농도로 G-CSF와 혼합하였다. 멸균된 0.2㎛의 막 필터를 통과시킨 후, 용액을 가수분해 부류 I의 유리로 만들어진 멸균 주사 병에 넣었다. 동결 건조후 그것들을 멸균 질소로 처리하고 처음에는 느슨하게 끼워지는 스토퍼를 무균 조건하에서 가압하여 동결 건조물을 밀폐시켰다. 동결 건조물에 플랜지를 붙이고 어두운 곳에서 6주 및 13주 동안 상이한 온도에서 저장하였다. 그런 다음 제제의 안정성을 하기 설명되는 방법들을 사용하요 조사하였다.

[표 1a : 20℃ 에서 저장]

Ⅰ RP HPLC에서 변화되지 않은 단백질의 순도

Ⅱ SEC HPLC 에서 변화되지 않은 단백질의 순도

Ⅲ 웨스턴 블롯에서 이합체/응집체

[표 1b : 40℃ 에서 저장]

Ⅰ RP HPLC에서 변화되지 않은 단백질의 순도

Ⅱ SEC HPLC 에서 변화되지 않은 단백질의 순도

Ⅲ 웨스턴 블롯에서 이합체/응집체

[실시예 3 : ]

G-CSF의 동결 건조물을 제조하였다. 이것을 위하여 다음 표에 나타낸 보조 물질을 주사용 물에 녹인 후, 계속해서 G-CSF를 70㎍/㎖의 농도로 첨가하고 필요하다면 pH 값을 소량의 완충 시스템으로 정확하게 조정하였다. 대표적인 적절한 계면활성제로서 플루로닉 F 68을 사용하였다. 다른 계면활성제들도 유사하게 작용하였다. 적당한 0.2 ㎛ 막 필터를 통과시킴으로써 멸균시킨 후, 용액을 가수분해 부류 I의 유리로 만들어진 멸균 주사 병에 넣고 종래 방법에 따라 동결 건조시켰다. 동결 건조 후 질소로 처리하고 주사 병을 무균 조건하에서 동결-건조 스토퍼를 사용하여 밀폐시켰다. 제제들을 6 및 12주 동안 규정된 저장 온도의 어두운 곳에서 플랜되어 있는 병에 저장한 후 실시예 1에서 설명한 방법으로 조사하였다.

[표 2 : 말토오스를 함유하는 pH가 3.6인 G-CSF의 제형

[표 3 : 20℃에서 저장]

[실시예 4 : ]

500㎍/㎖의 G-CSF를 함유하고 있는 G-CSF 동결 건조물(제형 6-10)을 다음과 같이 제조하였다. 하기 표에 나타낸 보조 물질들을 주사용 물에 녹이고, G-CSF 를 첨가한 후, 필요에 따라 pH 값을 소량의 염산 또는 인산 수소 이나트륨으로 조정하였다. 각 경우에 0.2㎛의 막 필터를 통과시킴에 의해 사전에 멸균된 1㎖씩의 용액을 가수분해 부류 I의 유리로 만들어진 주사 병에 넣고 종래 방법에 따라 동결 건조시켰다. 동결 건조시킨 후 질소로 처리하고 동력 건조물을 무균 조건 하에 동결 건조용 스토퍼로 밀폐시켰다. 플랜지를 붙인 동결 건조물을 어두운 곳의 규정된 온도에서 저장하고 실시예 1에서 설명한 방법을 사용하여 조사하였다.

[표 4 : 제형 6-10의 조성]

[표 5 : 분석 결과]

[실시예 5 : ]

하기 표에 나타낸 제형들(제형 11-14)을 다음과 같이 제조하였다. 보조 물질을 물에 녹이고 계속해서 G-CSF를 표시된 농도로 첨가하였다. 필요에 따라 pH 값을 인산염 완충액을 사용하여 정확하게 조정하였다. 그런 다음 용액을 기공 크기가 0.2㎛인 멸균된 막 필터를 통해 여과시킨 후 무균 조건하에서 가수분해 부류 I의 주사병에 넣고 동결 건조시켰다. 동결 건조 후 질소로 처리하고, 동결 건조물을 무균 조건하에서 동결 건조용 스토퍼로 밀폐시킨 후 플랜지를 붙였다. 동결 건조물을 어두운 곳의 규정된 온도에서 저장하였다. 6주 및 13주 후에 그것들을 실시에 1의 방법을 사용하여 조사 하였다.

[표 6 : 아미노 당을 함유하는 동결 건조물 제제]

상기 언급한 제제들의 저장후에 얻어진 분석 데이타는 하기 표에 요약한다.

[표 7 : 분석 결과]

DCP = 분해 생성물

[실시예 6 : ]

하기에서 설명되는 제형 15 및 16을 다음과 같이 제조하였다. 표시된 보조 물질을 주사용 물에 녹이고 계속해서 G-CSF를 표시된 농도로 첨가하였다. 필요에 따라 pH 값을 완충액 성분을 사용하여 조정하였다. 그런 다음 용액을 기공 크기가 0.2㎛인 멸균된 막 필터를 통해 여과시킨 후 무균 조건하에서 가수분해 부류 I의 유리로 만들어진 멸균된 주사병에 넣었다.

계속해서 주사 제제를 동결 건조시킨 후 질소로 처리하고, 주사병을 무균 조건하에서 동결 건조용 스토퍼로 밀폐시킨 후 플랜지를 붙였다. 제형을 어둔 곳의 규정된 온도에서 저장하고 하기 기재된 변수들에 대하여 조사하였다. 이것을 위하여 실시예 1에 기재된 시험 방법을 사용하였다.

[표 8 : 제형 15 및 16의 3달 및 6달 동안의 저장후 조사 결과]

[실시예 7 : ]

하기 표 9에 표시된 제형들을 다음과 같이 제조하였다 :

표시된 보조 물질들을 주사용 물에 녹이고 G-CSF를 표시된 농도대로 첨가한 후, 필요에 따라 소량의 완충액 성분으로 pH를 조정하였다. 그런 다음 약제학적 용액을 기공 크기가 0.2㎛인 멸균된 막 필터를 통해 여과시킨 후 무균 조건하에서 가수분해 부류 I의 유리로 만들어진 멸균된 주사병에 넣은 후 동결 건조시켰다.

동결 건조시킨 후 질소로 처리하고, 병을 무균 조건하에서 동결 건조용 스토퍼로 밀폐시킨 후 플랜지를 붙였다. 병을 어두운 곳에서 규정된 온도에서 저장하였다. 각각의 저장 기간이 지난 후 실시예 1에 기재된 방법을 사용하여 조사를 수행하였다(표 10).

[표 9 : 다른 구성성분과 비교하여 만니톨을 함유하는 G-CSF 동결건조물]

하기 표 10에 표시된 제형들에 대한 분석 데이타를 요약한다 :

[표 10]

[실시예 8 : pH 7.4의 본 발명에 따르는 재용해된 동결 건조물의 방치 시간]

다음의 조성물을 제조하였다 :

㎎/㎖ 제형 25

G-CSF 0.35

폴리소르베이트 80 0.1

말토오스 50

아르기닌 10

페닐알라닌 10

염산 pH 7.4 까지

표시된 보조 물질들을 1㎖의 주사용 물에 녹이고, G-CSF를 첨가한 후 pH 값을 7.4로 조정하였다. 용액을 기공 크기가 0.2㎛인 멸균된 막 필터를 통하여 여과시킴으로써 멸균시킨 후 가수분해 부류 I의 주사병에 분배하였다.

적절한 동결 건조용 스토퍼상에 올려 놓은 후, 제제를 -25℃의 주 건조 온도에서 동결 건조시키고, 계속해서 잔류 습도가 5% 미만으로 될 때까지 +8℃에서 동결 건조시켰다. 건조된 동결 건조물을 질소로 처리하고 밀폐 시켰다.

4-8℃에서 6달 동안 저장한 후에 동결 건조물을 1㎖의 주사용 물에 녹인 다음, 24시간 동안 실온에서 방치하였다. 이 방치 시간 후에 용해후 직접 조사된 샘플에 비교하여 생물학적 활성(NFS-60 시험), 단백질 함량(분광기 OD 28) 및 순도(웨스턴 블롯), 순도(SEC HPLC), 순도(SDS PAGE) 및 순도(RP HPLC)와 관련하여 실시예 1에서 설명된 시험 방법을 사용하여 변화를 관찰하지 못하였다. 기계적 응력하에서 조차도 혼탁도 측정은 매우 낮은 혼탁도 값을 나타냈다.

이것은 명백하게 pH 7.4에서 말토오스와 아르기닌 완충제를 함유하는 본 발명에 따르는 제형의 재용해 동결 건조물이 임상 적용을 위해 적당한 방치 시간을 가지고 있음을 나타낸다.

[실시예 9 : 40℃에서 13주 동안 저장 한 후 말토오스, 라피노오스, 슈크로오스 또는 트레할로오스를 함유하는 본 발명에 따르는 동결 건조물의 안정성]

50㎎/㎖의 말토오스 또는 동일한 양의 a) 라피노오스 또는 b) 슈크 로오스 또는 c) 트레할로오스를 함유하는 실시예 8, 제형 25에 상응하는 3개의 동결 건조물을 제조하였다. 모든 동결 건조물을 13주 동안 5℃, 25℃, 30℃ 및 40℃에서 저장한 후, 용해시키고 실시예 1에 기재된 시험 방법들 SEC HPLC, RP HPLC, 웨스턴 블롯 및 SDS PAGE를 사용하여 시각적으로 관찰하였다.

모든 경우에 투명한 무색 용액이 얻어졌다. SEC HPLC 에서는 생성물 피크의 크기는 ＞98%였고, 이합체/응집체의 크기는 ＜1%였다. RP HPLC에서는 생성물 피크는 100%에 도달하였고, 2차 피크는 검출되지 않았으며, 주 피크는 작업 표준에 상응하였다. SDS-PAGE에서는 분해 생성물, 이합체 또는 응집체가 검출되지 않았다.

[표 : 13주 저장 후]

[실시예 10 : 30℃에서 13주 동안 저장한 후 pH 4.5 및 pH 7.2에서 인산 아르기닌 및 염화 아르기닌 완충액을 함유하는 본 발명에 따르는 말토오스 동결 건조물의 안정성]

완충액 pH 값만이 상이한 다음의 제형들을 실시예 8에 기재된 제조 과정을 따라 제조하였다 :

제제들을 4 내지 8℃, 20 내지 25℃ 및 30℃의 온도에서 13주 동안 저장 한 후, 1㎖의 주사용 물에 녹인 다음, 실시예 1에 기재된 시험 방법들, 즉 RP HPLC, SEC HPLC(순도) 및 웨스턴 블롯(분해, 이합체화 및 응집체 형성)을 사용하여 조사하였다. 그 결과를 하기 표 11에 나타내며 하기 표는 본 발명에 따르는 pH 4.5 및 7.2를 가지는 동결 건조물이 30℃에서 13주 동안 저장 한 후에 안정함을 보여준다.

[표 11 : 30℃에서 13주 동안 저장 한 후의 결과]

n.d. = 검출되지 않음

[실시예 11 : 40℃에서 4주 및 13주 동안 저장한 후 pH 7.4를 가지는 인산 아르기닌 및 염화 아르기닌 완충액을 함유하는 본 발명에 따르는 말토오스 동결 건조물의 안정성]

실시예 8에 기재된 것과 동일한 방식으로 제형들을 제조하여 그것들의 pH를 한 경우에는 염산을 사용하여 7.4로 조정하고 다른 경우에는 인산을 사용하여 조정하였다.

상기 두가지 제제들을 4 및 13 주 동안 4-8℃ 및 40℃의 온도에서 저장하였다. 13주 동안 저장 한 후의 조사 결과(웨스턴 블롯, SDS PAGE)는 하기 표 12에 나타낸다. 4주 동안 저장 한 후의 결과는 동일하다.

상기 결과는 본 발명에 따르는 pH 7.4를 가지는 말토오스 동결 건조물이 40℃에서 13주 동안 저장한 후에 안정함을 보여준다.

[표 12 : 40℃에서 13주 동안 저장한 후의 결과]

[실시예 12 : 40℃에서 13주 동안 저장한 후 0.5 및 1.0 ㎎/㎖ 농도의 G-CSF 및 7.4의 pH를 가지는 본 발명에 따르는 동결건조물의 안정성]

G-CSF의 함량만이 상이한 다음의 제형들을 실시예 8의 제조 과정을 따라 제조하였다 :

제형들을 -20℃, 4-8℃, 20℃-25℃, 30℃ 및 40℃에서 4주 및 13주 동안 저장한 후, 1㎖의 주사용 물에 녹인 다음, 실시에 1에 기재된 시험 방법들, SEC HPLC, RP HPLC, 웨스턴 블롯 및 SDS-PAGE를 사용하여 조사하였다(조가 결과는 하기 표 13에 나타낸다).

결과는 본 발명에 따르는 동결 건조물들이 40℃에서 13주 동안 저장한 후에도 1㎎/㎖ 까지의 높은 단백질 농도에서도 안정함을 보여준다.

[실시예 14 : 9달 동안의 장기간 안정성]

실시에 11의 제형 31을 사용하여 동결 건조물을 제조하고 제제들을 9달 동안 -20℃, 5℃, 25℃, 30℃ 및 40℃의 온도에서 저장한 다음 실시예 1에 기재된 모든 조사 방법들을 사용하여 3, 6 및 9달 후에 조사하였다.

저장 기간 동안에 모든 조사된 변수들에서 변화는 검출되지 않았다. 저장 기간이 완료되었을 때 모든 온도에서 제제는 완전히 생물학적으로 활성인 것으로 증명도었고, 완전한 단백질 함량을 가졌으며, 모든 순도의 측정치에서 무상 G-CSF 분자의 1%에 휠씬 못 미치는 밴드 또는 피크들을 나타냈다.

상기 결과는 본 발명에 따르는 동결 건조물들이 고온에서 장기간 동안 저장한 경우에도 안정하며, 따라서 선행 기술에서 기재된 안정성 보다 월등함을 보여준다.

[표 14 : 30℃ 에서 저장]

[표 13]

Claims

G-CSF와 말토오스, 셀로비오스, 젠티오비오스, 이소말토오스, 라피노오스, 트레할로오스 및 아미노 당중에서 선택된 약제학적 보조 물질의 수성 제제를 제조하고, 이어서 이 용액을 동결 건조시키는 것으로 이루어지며, 동결되는 동안 또는 증가된 온도에서 저장되는 동안 G-CSF의 질의 손실을 피하기 위하여 상기 약제학적 보조 물질이 수용액의 제조에 사용되는 것을 특징으로 하는, 저장시 안정한 G-CSF의 동결 건조된 약제학적 제제를 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 동결 건조물의 재용해 후 G-CSF의 응집체 및 이합체의 발생이 실질적으로 없는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 도는 2항에 있어서, 말토오스, 라피노오스, 슈크로오스, 트레할로오스 또는 아미노 당이 첨가제로서 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 말토오스, 라피노오스, 글루코스아민, 갈락토스아민 또는 뉴라민산이 첨가제로서 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 사용된 G-CSF 단백질의 양 이하의 생리적으로 허용되는 양의 계면활성제가 추가로 함유되는 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, 계면활성제가 0.5 ㎎/㎖ 이하의 양으로 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 생리적으로 허용되는 양의 아미노산이 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 아르기닌 및/또는 페닐알라닌이 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 산화방지제, 복합체화제, 완충액, 산, 염기 또는 등장화제가 생리적으로 허용되는 보조 물질로서 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 인산염, 완충액 도는 아세트산염 완충액이 생리적으로 허용되는 보조 물질로서 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 7 내지 8의 pH 값을 가지는 인산 아르기닌 완충액, 염화 아르기닌 완충액 또는 시트르산 아르기닌 완충액이 생리적으로 허용되는 보조 물질로서 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
말토오스, 셀로비오스, 젠티오비오스, 이소말토오스, 라피노오스, 글루코스아민, 갈라토스아민 또는 뉴라민산과 0.5㎎/㎖ 이하의 계면활성제를 함유하는, pH 값이 3 내지 5 또는 6.5 내지 8인 G-CSF의 동결 건조된 약제학적 제제.
제12항에 있어서, 말토오스, 셀로비오스, 젠티오비오스 또는 이소말토오스를 함유하는 것을 특징으로 하는 G-CSF의 동결 걸조된 약제학적 제제.
제12항 또는 13항의 동결 건조물을 재용해시킴으로써 얻을 수 있는 G-CSF의 수성 약제학적 제제.
제14항에 있어서, 용액이 7.0 내지 7.5의 pH 값을 가지는 것을 특징으로 하는 수성 약제학적 제제.
제6항에 있어서, 계면활성제가 0.01 내지 0.1 ㎎/㎖의 양으로 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.