KR100266146B1

KR100266146B1 - 긴 보장기간을 갖는 g-csf의 수성 약제 조성물

Info

Publication number: KR100266146B1
Application number: KR1019950702589A
Authority: KR
Inventors: 미하엘리스 우베; 루돌프 라이너; 빈터 게르하르트; 보오크 하인리히
Original assignee: 헤르베르트 포우퀘트; 로셰 디아그노스틱스 게엠베하; 라인홀트 밍크
Priority date: 1992-12-18
Filing date: 1993-12-15
Publication date: 2000-09-15
Also published as: DE59310197D1; US5919757A; JPH08505610A; AU692430B2; NZ259333A; AU692430C; ATE203411T1; DE4242919A1; CA2151957C; EP0674525A1; CA2151957A1; WO1994014466A1; KR950703988A; AU5810994A; HU9501767D0; HUT74270A; EP0674525B1; HU219548B

Abstract

본 발명은 아세트산, 락트산, 시트르산, 말레산, 인산 및 이것들의 염 또는 아르기닌 및 이것의 염으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 완충제를 100mmol/ℓ 이하의 농도로 함유하고 저장시에 안정한, G-CSF를 함유하는 수성 약제 조성물에 관한 것이다.

Description

긴 보장기간을 갖는 G-CSF의 수성 약제 조성물

본 발명은 저장시에 안정하고 안정화를 위해 각각의 경우에 100mmol/ℓ 이하의 농도로 아세트산, 락트산, 시트르산, 말레산, 인산 및 이들의 염 또는 아르기닌 및 이것의 염으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 완충제를 함유하는 G-CSF의 수성 약제 조성물에 관한 것이다.

G-CSF(과립 백혈구 콜로니 자극 인자)를 함유하는 여러 약제 조성물이 이미 당해 기술로부터 공지되어 있다.

G-CSF를 안정화시키기 위해 적어도 하나의 약제학적으로 허용될 수 있는 표면 활성제, 당류, 단백질 또는 고분자량 화합물을 함유하는, G-CSF를 함유하는 약제가 DE 37 23 781호(GB 2,193,631호)에 기술되어 있다. 안정화제로서 사람 혈청 알부민을 함유하는 조성물이 제안되었다. 특히 G-CSF의 사용량의 1-10000배에 해당하는 중량부로 표면 활성제를 함유하는 조성물이 유용한 것으로 기재되어 있다.

본질적으로, 가능한한 낮은 전도성을 갖는 용액의 산성 pH를 특징으로 하는 안정화된 G-CSF 조성물이 EP 0 373 679호에 기술되어 있다. 상기 용액은 용액이 예를 들어, 완충제 또는 만니톨과 같은 추가의 약제 보조 성분을 함유하는 경우에 3 내지 3.7의 pH를 갖는다. 약제 제형중에 완충성분이 존재하지 않는 경우에, 2.75 내지 4의 pH 범위가 유용한 것으로 기술되어 있다.

EP 0 306 824호에 사람 단백질 조성물의 안정화된 동결 건조물이 기술되어 있으며, 여기에서 안정화는 우레아, 아미노산 및 세제의 혼합물의 첨가에 의해 달성된다.

PCT 특허출원 PCT/EP92/01823호에는, 주입 및 주사를 위한 G-CSF를 함유한 잘 용인되는 약제의 제조 방법이 기술되어 있다. 투여의 액체 형태는 특히, 낮은 적정 산도 및 낮은 완충 능력을 특징으로 한다. G-CSF를 함유하는 기술된 주입 및 주사 용액의 pH 값은 3.8 내지 4.5의 산성 범위이다.

방부제를 부가적으로 함유하는 G-CSF를 함유하는 액체 형태의 약제의 제조방법은 PCT/EP92/01822호에 공지되어 있다. 약제 용액의 pH 값은 2.5 내지 4.5의 산성 범위이다. 상기 경우에 G-CSF의 안정화는 본질적으로 G-CSF에 대해 바람직한 산성 pH 값을 고정시키고, 여러 아미노산의 혼합물을 첨가함으로써 달성된다.

그러나, G-CSF에 대한 이미 공지된 약제 제형은 몇가지 단점을 갖는다. DE 37 23 781호에 기술된 조성물은 의료적 관점에서 무해한 것으로 간단하게 판단될 수 없는 약제 첨가제 또는 보조 성분을 함유한다. 중합체 및 단백질은 이들의 기원 및 물리화학적 성질로 인해, 약제 첨가제로서의 적합성에 대해 특정의 잔류 위험을 갖는다. 사람 또는 동물 기원의 단백질 뿐만 아니라, 세포 배양액으로부터 수득한 단백질은 바이러스 감염의 잠재적 잔류 위험을 갖는다. 분석적으로 검출하기 어려운 다른 단백질-형 불순물은 또한 그들의 항원 성질로 인해 사람에게서 면역 반응을 야기할 수도 있다. 더욱이, 동물 기원의 단백질은 일반적으로 종-특이 성질로 인해 사람에게서 면역 반응을 유발할 수 있다. 이러한 단백질의 나중 재투여후의 장기간 반응이 또한 가능하다.

고분자량 화합물의 첨가가 또한 문제될 수 있다. 중합체는 그들의 큰 분자 질량으로 인해 체내에 축적될 수 있고, 따라서 생분해가 일어나지 않는다면 장기간 동안 체내에 잔류될 수 있다. 이것은 특히, 피하 투여의 경우에, 혈류를 통한 제거 및 분배가 정맥내 투여와 비교하여 상당히 더 느리기 때문에 위험하다. 중합체는 또한 그들의 분자 질량에 따라 항원 성질을 가질 수 있다. 그 외에, 중합체의 순도는 그들의 제조를 위해 사용되는 촉매, 또는 단량체 및 다른 중합체 단편의 존재 때문에 보장하기 어렵다. 따라서, 투여의 액체 약제 형태에서 중합체의 사용은 특히 피하 투여될 수 있는 약제의 형태의 경우에 가능하다면 피해야 한다.

DE 37 23 781호에 기술된 계면활성제의 양은 또한 의료적 관점에서 문제점이 있는 것으로 간주되어야 한다. 여기에서 계면활성제 농도는 G-CSF의 중량부에 대해 110000 중량부의 계면활성제가 존재하는 경우에 유용한 것으로 기술되어 있다. 다른 한편으로, 임상용으로 최종 약제 제형중에 0.05 내지 1.5㎎/㎖의 G-CSF의 바람직한 투여 농도가 고려된다면, 이것은 상승하게 높은 계면활성제 농도를 야기한다. 이것은 국소적 자극을 야기할 수 있으므로 의료적 관점에서 피해야 한다.

상기 기술된 제형의 단점은, 특히 피하 투여의 경우에, 사용되는 낮은 pH로 인해 환자에게서 국소적 비용인성을 유도한다는 것이다. 얻어지는 생성물은 조직중에 존재하는 7.0 내지 7.5의 생리학적 pH 범위가 유지되지 않으므로 민감성 환자에게서 고통 및 국소적 조직 자극을 유발할 수 있다.

그 외에, 관련 문헌에는, 특히 비-글리코실화 형태의 G-CSF가 CHO 세포로부터 얻어지는 글리코실화 G-CSF에 비해 특히 불안정함이 공지되어 있다(참조 : J. Biol, Chem. 1990, 265, 11432). 따라서 비-글리코실화 형태의 G-CSF의 안정화는 특히 어렵고, 안정한 약제 제형으로 상기 분자를 제형화시키기 위해 특별히 선택된 수단을 필요로 한다.

그 외에, G-CSF를 함유하는 액체 약제 조성물의 주된 단점은, 그들이 특히 장기간 저장 또는 분배 경로상에서의 운반 동안 비교적 쉽게 혼탁되는 경향이 있는 것임이 발견되었다. 그 외에, 즉석 투여 용액은 기계적 응력에 대해 매우 민감한 것으로 입증되었다. 예를 들어, 용액을 진탕시키는 것과 같은 기계적 응력은 다양하고 조절할 수 없는 방식으로 운반 동안 액체 약제 조성물에 영향을 줄 수 있다. 또한, 의사, 의료인 또는 환자에 의한 사용 동안, 앰플 또는 바이알내에 충전된 약제 용액에 대한 부정확한 취급 및 가능하게는 이에 의한 기계적 응력이 절대적으로 배제될 수 없다. 따라서, 기계적 응력에 대한 내성이 단백질을 함유하는 약제에 대한 질적 기준이다. 기계적 응력에 대한 G-CSF의 안정성을 유지시키기 위한 수단은 이전에 관련 문헌에 기술된 바 없다. 통상적인 방법에 따라 제조된 G-CSF의 액체 조성물이 증가된 온도에서의 저장시에도 충분한 안정성을 가질지라도, 기계적 응력에 대한 이러한 제형의 안정성은 모든 경우에 만족스럽지는 않다. 특히, G-CSF의 이량체 또는 응집체의 형성에 의해 야기되는 가시적 혼탁이 약제 용액에서 종종 발생한다. 액체 약제 조성물에서의 이러한 변화는 특히 개별적 투여 형태에 함유된 활성 성분의 양에 대해 불리한 효과를 갖고, 의료적 관점에서 가능한 한 피해야 한다.

본 발명의 목적은 약제로서 G-CSF의 적절한 사용을 가능하게 하고, 상기 기술된 이미 공지된 약제 조성물의 단점을 갖지 않는 G-CSF의 안정한 액체 약제 조성물을 제공하는 데에 있다. 특히, 약제 조성물은 긴 보장기간을 가지고, 기계적 응력에 대해 안정하고, 생리학적으로 잘 용인되고, 사용하기에 간단하고, 정확하게 투여할 수 있어야 한다. 특히, 이것은 생리학적으로 양립할 수 있는 pH 값을 가져야 한다.

놀랍게도, 아세트산염, 락트산염, 시트르산염, 말레산염 또는 인산염으로 구성된 군으로부터 선택된 완충 성분이 첨가제로서 사용되는 경우에 본 발명의 의미내의 안정한 수성 약제 조성물이 제조될 수 있다는 것이 발견되었다. 바람직하게는 상기 완충 성분들은 각각의 경우에 선택된 완충 성분의 농도가 시판되는 즉석 투여 약제 조성물중에 2 내지 100mmol/ℓ인 양으로 사용된다. 놀랍게도, 상기 방식으로 제조된 용액은 기계적 응력에 대해 상당히 안정하다. 그 외에, 상기 용액은 당업계에 공지된 용액이 단백질을 안정화시키기 위해 바람직하게는 2.5 내지 3.5의 pH를 갖는 용액을 필요로 하는 반면, 완충 성분에 관한 선택을 통해, 4 내지 5 또는 7 내지 8의 유리한 pH를 갖는 용액이 제공될 수 있다는 장점을 갖는다.

본 발명에 따라 제조된 조성물의 부가적 장점은 그들이 의료적 관점에서 그 사용이 문제될 수 있는 단백질-형 또는 중합체 보조 성분을 함유하지 않는다는 것이다. 7 내지 8의 pH를 갖는, 즉 혈액의 pH(pH 7.2-7.4) 근처의 pH를 갖는 G-CSF를 함유하는 액체 약제 조성물이 제조될 수 있다는 점으로 인해, 상기 조성물은 잘 용인되고 실질적으로 고통 없이 투여될 수 있다는 장점을 갖는다.

추가의 장점은 보조성분에 관한 선택으로 인해, 이전에 액체 약제 조성물에서 필요했던 비교적 많은 양의 계면활성제가 더 이상 필요하지 않다는 것이다. 반면, G-CSF를 안정화시키기 위해 0.5㎎/㎖ 이하, 바람직하게는 0.01 내지 0.1㎎/㎖의 적응 양의 계면활성제가 적합하다. 유리하게는, 부피 단위당 사용되는 G-CSF의 양(㎎/㎖) 이하의 계면활성제 농도(㎎/㎖)가 사용될 수 있따. 이것은 G-CSF의 피하 투여를 위한 액체 약제 조성물에 대해 특별한 장점이다. 그 외에, 본 발명에 따르는 방법은, 특히 불안정한 비-글리코실화 G-CSF 분자의 약제 조성물에 대해 적합한 안정화를 유도한다. 보조 성분의 특별한 선택은 전체적으로 매우 잘 용인되고 단백질 안정성에 대해 질적으로 고급인 조성물을 나타내는 G-CSF를 함유하는 약제 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르는 G-CSF를 함유하는 약제 조성물은 치료 효과를 달성하기에 적합한 양으로 활성 성분을 함유한다. 일반적으로 0.01 내지 5㎎/㎖, 바람직하게는 0.1 내지 1.5㎎/㎖의 활성 성분의 농도가 사용된다.

본 발명에 따라 약제 보조 성분 및 완충 성분으로서 아세트산, 시트르산, 락트산, 말레산 및 인산 또는 이들의 생리학적으로 용인되는 염이 사용된다. 보조 성분 용액의 제조에서 상기 완충 성분은, 상응하는 유리산의 형태로 또는 알칼리 금속, 알칼리 토금속 또는 암모늄염의 형태로 존재할 수 있다. 용액은 그 외에 추가의 통상적인 약제 보조 성분을 함유할 수 있다. 액체 약제 조성물의 제조 동안 여러 보조 성분 또는 활성 성분의 첨가 순서는 본 발명에 따라 발견된 저장시의 안정화 효과와 대개 무관하고 당업자에 의해 임의로 선택된다. 용액의 바람직한 pH 값은 알칼리 금속 수산화물, 알칼리 토금속 수산화물 또는 암모늄 수산화물과 같은 염기의 첨가에 의해 조절된다. 바람직하게는 이를 위해 수산화나트륨이 사용된다. 바람직한 pH 값의 조절은 원칙적으로 염기성 용액의 첨가에 의해 달성될 수 있다. 일반적으로, 이를 위해 약산과 강염기의 염, 예를 들어 아세트산 나트륨, 시트르산 나트륨, 인산 수소 이나트륨 또는 이칼륨 또는 탄산 나트륨이 고려된다. 보조 성분의 약제 용액이 염기성 pH를 갖는다면, 이것은 4 내지 7 또는 7 내지 8의 바람직한 pH 범위가 얻어질 때까지 산에 의한 적정에 의해 조절된다. 예를 들어 염산, 인산, 아세트산, 시트르산 또는 산성 pH 값을 갖는 성분의 통상적인 용액과 같은 생리학적으로 용인되는 무기 또는 유기산이 산으로서 고려된다. 이에 대해 바람직한 성분은 약염기와 강산의 염, 예를 들어 인산 이수소 나트륨 또는 인산 이수소 칼륨이다.

본 발명에 따라 약제 보조 성분 및 완충 성분으로서 아르기닌 및 이것의 염이 또한 사용될 수 있다.

즉석 투여용 약체 약제 조성물중의 완충 성분 아세트산, 시트르산, 락트산, 말레산 또는 인산의 농도는, 각각의 경우에 바람직하게는 약 2 내지 100mmol/ℓ이다. 상기 언급된 산이 일반적으로 약제 보조 성분 용액의 제조 동안 염의 형태로, 그리고 덜 자주 유리산의 형태로 사용된다는 사실로 인해, 하기에서는 각각의 경우에 간편함을 위해 상기 산의 음이온 농도, 예를 들어 아세트산염, 시트르산염, 락트산염, 말레산염 또는 인산염 농도에 대해 언급된다. 완충 성분의 전체 농도는 100mmol/ℓ, 바람직하게는 80mmol/ℓ의 값을 초과하지 않아야 한다. 완충 성분의 전체 농도는 바람직하게는 약 5 내지 40mmol/ℓ이다.

특별한 완충 성분과 조합되어 있는 액체 약제 조성물의 특별한 pH 범위가 특히 안정한 용액을 생성시킴이 입증되었다. 아세트산염 또는 락트산염 완충제가 5 내지 40mmol/ℓ의 농도로 사용되고, 용액의 pH가 약 2 내지 5의 범위로 조절되는 경우, 기계적 응력에 대해 특히 안정한 약제 조성물이 얻어진다. 하기의 완충제 농도 및 pH 값이 바람직하게 사용된다: 5 내지 80mmol/ℓ, 특히 10 내지 30mmol/ℓ, 아세트산염 또는 락트산염 및 pH 3.5 내지 5.

시트르산염은 5 내지 40mmol/ℓ, 바람직하게는 5 내지 20mmol/ℓ의 농도로 사용된다. 완충 성분 시트르산염 및 인산염의 조합물이 바람직하게 사용되며, 이 경우에 완충 성분의 전체 농도는 10 내지 40mmol/ℓ, 바람직하게는 15 내지 30mmol/ℓ이다. 약체 약제 조성물의 pH 값은 바람직하게는 약 2.5 내지 3.5 또는 7 내지 7.5이다.

말레산염은 바람직하게는 5 내지 40mmol/ℓ의 농도로 사용된다. 이 경우에 액체 약제 조성물의 pH 값은 바람직하게는 약 2.5 내지 3.5 또는 7 내지 7.5이다.

인산염은 단독으로 또는 다른 완충 성분중 하나와 조합하여, 5 내지 80mmol/ℓ, 바람직하게는 5 내지 30mmol/ℓ의 농도로 사용된다. 단지 인산염 완충제만을 함유하는 액체 약제 조성물의 pH 값은 바람직하게는 약 3.5 내지 5 또는 7 내지 8이다.

인산 아르기닌, 염산 아르기닌 및 시트르산 아르기닌 완충제는 또한 2 내지 100mmol/ℓ, 바람직하게는 5 내지 80mmol/ℓ의 농도로 사용된다. 아르기닌 완충제를 함유하는 액제 조성물의 pH 값은 약 7 내지 8, 바람직하게는 7 내지 7.5이다.

생리학적으로 용인되는 pH 값 및 생리학적으로 용인되는 농도에서 본 발명에 따르는 완충 시스템의 상기 기술된 선택은 또한 재용해에 의해 동결 건조물 또는 분말로부터 제조되는 G-CSF의 용액의 경우에 우수한 아이디어 및 장점이다.

동결 건조물이 재용해될 때 기계적 교반(진탕)이 수행되므로, 이 경우에는 특별한 완충 시스템 및 pH 값을 특히 선택하는 것이 중요하다. 본 발명의 범위내에 있지 않은 완충 시스템 또는 pH 값의 선택은 응집체의 형성, 혼탁의 발생 및 이로 인한 저질의 생성물을 유도할 수 있다.

이와 관련하여, 본 발명에 따르는 pH 값 및 완충 시스템을 제조하기 위해 필요한 산, 염 또는 염기가 동결 건조물내에 함유되는지, 용해용 수용액내에 함유되는지 또는 둘 모두에 함유되는지는 당업자에게 달려 있다.

본 발명에 따르는 수성 조성물은 통상적인 동결 건조에 의해 동결 건조물을 제조하거나, 또는 예를 들어 분무 건조에 의해 분말을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 따르는 조성물은 물 또는 수용액중에 이들을 용해시킴으로써 다시 얻어진다. 7 내지 7.5의 pH 범위에서 아르기닌 완충제를 함유하는 재용해된 동결 건조물은 적어도 24시간 동안 안정하다는 것이 입증되었다.

상기 완충 성분에 의해 가능한 G-CSF 분자의 안정화는 원칙적으로 재조합 방법 및 이것의 변형에 의해 생성된 모든 G-CSF와 관련된다. 본 발명에 따르는 용어 G-CSF 또는 G-CSF 변형체는 G-CSF의 모든 천연 변형체 뿐만 아니라, 이로부터 유도된 재조합 DNA 기술에 의해 변형된 G-CSF 단백질, 특히 G-CSF 부분 이외에 다른 단백질 서열을 부가적으로 함유하는 융합 단백질을 포함한다. 이에 대해, 전핵 세포에서의 발현에 적합한 위치 -1에서 N-말단 Met 잔기를 갖는 G-CSF 무테인(mutein)이 특히 바람직하다. PCT/EP91/00192에 따라 생성될 수 있는 재조합 메티오닌-비함유 G-CSF 변형체도 적합하다. 용어 "G-CSF 변형체"는 G-CSF의 본질적 성질이 실질적으로 유지되고, 하나 또는 수개의 아미노산이 결실되거나 또는 다른 아미노산에 의해 치환될 수 있는 G-CSF 분자를 포함하는 것으로 이해된다. 적합한 G-CSF 무테인은, 예를 들어 EP 0 456 200호에 기술되어 있다.

G-CSF를 함유하는 용액의 혼탁도의 측정은 기계적 응력에 대한 액체 약제 조성물의 안정성을 시험하는데 특히 적합하다. 기계적 응력을 받은 후의 단백질 용액의 혼탁도의 평가는 수행하기가 간단한 시험 방법으로서 특히 유용하다. 혼탁의 발생은 중합체, 올리고머 및 응집체의 생성과 상관한다. 혼탁법의 경우에는, 예를 들어 HPLC의 경웨서 처럼 큰 응집체가 정량화로부터 샘플 제조에 의해 제거되지 않는 대신에 원래의 용기에서 평가되어 신뢰성 있게 검출될 수 있기 때문에, 몇몇 경우에는 광학적 평가가 이량체 및 응집체를 검출하기 위한 더욱 특별한 방법(예를 들어 HPLC법)보다 더 우수한 것으로 입증된다. 혼탁 현상의 정량화는 시판 탁도계, 산란광 광도계 등에 의해 쉽게 수행될 수 있다. 이러한 결과의 평가는 또한 예를 들어 혼탁도에 대한 기준점(그 이하에서 용액은 맑거나 또는 약간 혼탁한 것으로 간주될 수 있음)을 규정하는 약전의 요건으로 전환될 수 있다.

활성 성분 및 안정화를 위해 사용되는 보조 성분의 삼투 성질에 의해 등장성이 달성될 수 없다면, 잘 용인되는 비경우 약제 조성물의 제조를 위해 등장적으로 작용하는 보조 성분을 첨가하는 것이 편리하다. 이를 위해, 예를 들어 만니톨, 글리세롤 또는 다른 당 알코올과 같은 비-이온화되고 잘 용인되는 보조 성분이 주로 사용된다.

G-CSF의 경우에는, 만니톨이 G-CSF의 안정성에 대해 중요하지 않다면 바람직하게 사용된다. 단백질은 만니톨-비함유 조성물에서 동등하게 안정하지만, 상기 용액은 등장성의 결핍으로 인해 덜 용인된다.

고농도의 염 또는 이온은 G-CSF 응집체의 생성을 조장하므로, 등장성을 조절하기 위해 염을 첨가하는 것은 유리하지 않다. 따라서 염은 유리하게는 소량으로 첨가된다. 완충제 농도는 pH-안정화 효과가 달성되지만 이온 강도는 가능한한 작게 유지되도록 산정된다. 완충제 농도는 바람직하게는 80mmol/ℓ 이하, 특히 바람직하게는 30mmol/ℓ 미만이다.

즉시 투여 주사 용액은 또한, 추가의 통상적인 보조 성분 또는 첨가제를 함유할 수 있다. 예를 들어 글루타티온, 아스코르브산 또는 유사 성분과 같은 산화방지제, 예를 들어 우레아와 같은 챠오트로픽(chaotropic) 보조 성분, 및 예를 들어 아르기닌, 리신, 오르니틴 등과 같은 아미노산이 첨가될 수 있다.

본 발명은 하기에서 대표적인 실시예를 기초로 더 상세히 설명된다.

[액체 약제 조성물을 제조하는 일반적 방법]

주사용 물중에 기술된 보조 성분을 용해시키고, G-CSF를 규정된 양으로 첨가하고, 필요하다면 소량의 완충 성분에 의해 pH 값을 정확하게 목표값으로 조절함으로써 실시예에서 사용되는 G-CSF의 용액을 제조하였다. 그런 다음, 용액을 공극 크기가 0.2㎛인 적합한 살균 막 필터를 통해 여과시키고, 가수분해 클라스 I의 유리로 만든 주사 바이알내에 충전시키고, 살균 테플론화 고무 마개로 밀봉하였다. 바람직하게는 질소 분위기하에 충전을 수행한다.

[실시예 2]

[안정성 측정을 위한 시험 방법]

밀봉된 플랜지 바이알을 규정된 저장 온도로 암실에서 저장하고, 계속해서 단백질 순도에 대해서 뿐만 아니라 응집체 및 이량체의 발생에 대해, 역상 HPLC(RP-HPLC), 겔 크로마토그래피 또는 크기 배제 크로마토그래피(SEC HPLC) 및 웨스턴 블롯에 의해 시험하였다. 사용된 방법은 다음과 같이 기술될 수 있다.

[2.1 역상 HPLC]

Nucleosil C18 칼럼(Knauer Company)를 사용하여 RP-HPLC를 수행하였다. 이동상은 0.12%(v/v) 트리플루오로아세트산(TFA)/물(A) 및 0.1%(v/v) TFA/아세토니트릴(B)로 구성되었다. A 에서 B로의 선형 구배를 사용하여 0.5ml/min의 유속으로 크로마트그래피를 수행하였다.

주사량은 제형에 따라 3 내지 6㎍의 G-CSF이었다. 이것은 외부 기준을 사용하여 피크 영역에 의해 214㎚의 파장에서 평가하였다.

[2.2 크기 배제 크로마토그래피(SEC)]

SE 크로마토그래피를 위해 TSK G 2000 SW 분리 컬럼(7.5×㎜)을 사용하였다. 실온에서 0.6㎖/min의 유속으로 인산염 완충제(22.2mM Na₂HPO₄; 107.7mM KH₂PO₄; pH 6.2) 중에서 분리를 동등하게(isocratically) 수행하였다. 주사량은 3 내지 6㎍의 G-CSF이었다. 이것은 외부 기준을 사용하여 피크 영역에 의해 214㎚의 검출 파장에서 평가하였다.

[2.3 SDS 페이지/웨스턴 블롯]

3㎍의 rhG-CSF를 비-환원 조건에서 12% 폴리아크릴아미드 SDS 겔에 적용하고, 겔 전기영동시킨다. 계속해서, 분자량에 따라 분리된 G-CSF 단량체, 이량체 또는 응집체를 전기 블롯팅에 의해 니트로셀룰로오스상으로 옮긴다. 단백질 띠를 특이적 다클론성 비오틴화 항-G-CSF 항체(PAG＜GCSF＜lgG)와의 인큐베이션에 의해 확인하고, 스트렙트아비딘-알칼리성 포스파타아제 컨쥬게이트(SA-AP 컨쥬게이트), 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 인산염(BCIT) 및 니트로 블루 테트라졸륨(NBT)을 사용하는 포스파타아제 기술에 의해 검출한다.

단량체, 이량체 및 응집체의 % 양을 일련의 rhG-CSF 표준에 의해 레이저 농도측정 평가에 의해 측정한다.

[2.4 NFS-60 생물학적 검정(생물학적 활성)]

G-CSF 활성의 생체의 측정은 G-CSF에 의해 자극되는 NFS-60 세포의 세포 배양액중의 세포 계수의 측정에 근거한다.

적합한 조건하에 배지중의 G-CSF의 농도와 세포의 탈수소 효소 활성을 상관시킬 수 있다. G-CSF 완충 용액의 적합한 희석액을 제조하여 탈수소 효소 활성의 쉽게 측정할 수 있는 증가를 얻는다.

그런 다음, 활성을 570 및 690㎚에서 광도계를 측정하고 ; 테트라졸륨염 MTT(황색)의 포르마잔(청색)으로의 환원을 측정한다.

G-CSF의 생체외 활성을 샘플에 대한 데이타와 표준에 대한 데이타를 평행선법에 따라 비교함으로써 계산한다. 이것은 문헌[Ph. Eur. (VIII, 13)]의 요건에 따라 평가된다.

[2.5 광도측정법 OD 280(단백질 함량)]

G-CSF UV 스펙트럼은 트립토판, 티로신 및 페닐알라닌 잔기와 같은 곁사슬 발색단으로 인해 280㎚에서 최대 흡수도를 갖는다. UV 분광기(예를 들어 Uvikon 810 P 또는 941, Kontron Instruments) 및 세미-마이크로 석영크벳, 500㎕, 경로 길이:1㎝(예를 들어 Hellma, Suprasil, Cat. No. 104.002 B-QS)에 의해 플라시보 용액과 비교하여 측정을 수행한다.

[2.6 산란광 측정, 혼탁도 측정]

유리 크벳(직경 2㎝)에서 비희석 생성물 용액에 대해 측정을 직접 수행한다. 액체에 의해 산만하게 굴절되는 산란광을 90°의 각도로 측정한다. 이것은 DIN 38404C2에 따라 포르마진 표준 현탁액과 비교하여 측정하고, 그 값은 TU/F로 나타낸다. 적합한 혼탁도 광도계, 예를 들어 LTP 5(Dr. Lange Company, Dsseldorf)에서 측정을 수행한다.

[실시예 3]

[기계적 응력 용량(혼탁도)에 대한 연구]

하기에 언급된 완충제에 의해 투석에 의해 0.5㎎/㎖의 농도로 G-CSF 용액을 제조하였다. 기계적 응력후에 발생하는 혼탁도를 측정하기 위해, 각각의 경우에 1㎖의 샘플을 가수분해성 클라스 I의 유리로 만들어진 주사병내에 넣고 마개로 밀봉하였다. 샘플을 실험용 진탕기(예를 들어 Heidolph Company)에서 최대 강도로 10초 동안 처리하였다. 기계적 응력 과정 직후에, 각각의 경우에 360㎚의 EX 및 EM 파장에서 Hitachi F4000 형광 분광계를 사용하여 산란광 측정을 수행하였다. 하기에서 pH 값 및 사용되는 완충제와 관련하여 360㎚ 에서의 산란광 강도가 제공된다. 아세트산염 및 시트르산염 완충제의 기술된 물 농도는 아세트산 및 시트르산의 사용된 물 농도와 관련된다. 적합한 pH 값을 수산화나트륨 용액에 의해 조절하였다. 적합한 양의 시트르산을 첨가하고, 인산 수소 이나트륨에 의해 pH 값을 조절함으로써 인산염/시트르산염 완충제를 제조하였다. 일정한 몰 농도의 인산 수소 나트륨을 첨가하고, 인산 또는 인산 수소 이나트륨에 의해 pH 값을 조절함으로써 인산염 완충제를 제조하였다.

[실시예 4]

G-CSF의 액체 약제 조성물을 실시예 1에 규정된 바와 같이 제조하고, 용액의 pH를 4.5로 조절한다. 조성물은 표 1에 규정된 성분을 함유하였다 :

[표 1]

a) 정지(stationary) 저장에 의한 단백질 순도에 대한 결과

RP HPLC, SEC HPLC 및 웨스턴 블롯에 의한 액체 제형 1 내지 4의 분석은 변하지 않은 단백질의 순도가 99% 이상이고, G-CSF의 이량체 또는 응집체가 검출되지 않음을 보여준다. 상기 결과는 제형 1 내지 4를 4 내지 8℃에서 6개월 동안 저장한 후에, 30℃에서 4주 동안 저장한 후에, 그리고 40℃에서 4주 동안 저장후에 얻어졌다. 결과는 4.5의 pH에서 그리고 여러 저장 조건하에 G-CSF의 용액이 정지 저장 조건에 대해 실질적으로 안정함을 특징으로 할 수 있음을 보여준다.

b) 기계적 응력후의 단백질 순도에 대한 결과

그러나, 정지하의 저장시에 물리화학적 안정성을 위한 용액의 적합한 pH 및 완충제의 선택은 기계적 응력후의 안정성에 대해 다르다. 상기 안정성은 시트르산염/인산염의 완충제 혼합물에서가 아닌 아세트산염 및 인산염 완충제에서 pH 4.5에서 달성된다.

[표 2]

[실시예 5]

각각의 경우에 여러 완충제 및 0.005%(제2도 및 제3도에서는 0.05%)의 폴리소르베이트를 함유하는 G-CSF의 용액을 실시예 3에 따라 제조하였다. 시험되는 각각의 완충계에 대해 0.5 pH 단위의 간격으로 2 내지 7.5 사이의 다른 pH를 갖는 여러 용액(즉, 하나의 완충계에 대해 13개의 용액)을 제조하였다. 용액의 기계적 응력 저항성을 산란광 측정을 사용하여 상기 기술된 방법(실시예 3)에 의해 시험하였다. 하기의 완충제를 시험하였다(G-CSF 및 다른 보조 성분의 함량은 실시예 3에서와 같음).

5.1 아세트산염 10mmol/ℓ

5.2 아세트산염 20mmol/ℓ

5.3 아세트산염 40mmol/ℓ

5.4 인산염 20mmol/ℓ

5.5 10mmol/ℓ의 인산염을 함유하는 인산염/시트르산염 총 20mmol/ℓ

5.6 락트산염 10mmol/ℓ

5.7 말레산염 10mmol/ℓ

5.8 시트르산염 20mmol/ℓ

기계적 응력이 완결된 후에 용액의 pH 값에 대해 산란광을 측정하였다. 결과는 제1도 내지 제4도에 도시되어 있다. 이것은 각각의 완충계에 대한 pH 혼탁도 곡선의 개별적 형태를 보여준다. 시트르산염은 특히 4 내지 6.5의 pH 범위에서 부적합하고 ; 시트르산염/인산염 완충제는 4.5 내지 6.5의 pH 범위에서 부적합하고 ; 아세트산염은 약 5 내지 7의 pH 범위에서 부적합하고, 인산염은 약 5 내지 6.75의 pH 범위에서 부적합하다. 락트산염은 아세트산염, 말레산염 및 시트르산염/인산염과 같은 성질을 갖는다.

[실시예 6]

완충제 농도 및 pH 값에 대해 0.5㎎/㎖의 Tween 80을 함유하는 0.35㎎/㎖의 농도의 G-CSF 용액의 기계적 안정성의 연구

약 5㎎/㎖의 농도의 G-CSF 용액을 하기 기술된 완충제 용액을 사용하여 0.35㎎/㎖의 활성 성분 함량까지 희석시켰다. 모든 완충제 용액은 0.05%의 폴리소르베이트 80을 함유하였다. 먼저 규정된 몰 농도로 개별적 염기성 염 성분을 첨가하고, 상응하는 산을 이용하여 규정된 값으로 pH 값을 조절함으로써 완충제 용액을 제조하였다. 상기 방식으로 얻은 G-CSF 완충 용액을 10㎖의 양으로 가수분해성 클라스 I의 유리로 만든 주사병내에 넣고, 적합한 마개로 밀봉시키고, 실험용 진탕 장치(예를 들어, Heidolph Company)에서 최대 강도로 10초 동안 진탕시켰다. 약 10분 동안의 정지시간 후에 포르마진 표준에 대해 보정된 혼탁도 값(TU/F)을 LTP 5 산란광 광도계(Dr. Lange Company)(측정각 90°)를 사용하여 측정하였다.

[표 3a]

[표 3b]

데이타는 시험된 pH 범위에서 인산염 완충액이 5 내지 80mmol/ℓ의 전체 몰 농도에서 혼탁도에 대해 낮은 값을 나타내며, 이 값은 기계적 응력하에 약간 증가함을 보여준다.

아세트산염 완충제는 기계적 응력하에서도 3.5 내지 4.5의 pH 범위에서 혼탁도에 대해 매우 낮은 값을 나타낸다.

5 내지 40mmol/ℓ의 농도의 시트르산염 완충제는 7 내지 7.5의 pH 범위에서 안정화를 위해 적합하다.

[실시예 7]

이 중 몇개에 등장화 첨가제 이외에 산화방지제 및 챠오트로픽 보조 성분의 군으로부터 선택된 추가의 보조 성분이 첨가된 7 내지 7.5의 pH 범위의 액체 제형을 기술한다.

하기에 언급되는 제형을 제조하기 위해, 적합한 보조 성분을 주사용물에 용해시키고, G-CSF를 첨가하고, 필요하다면 pH를 소량의 적합한 완충 성분에 의해 정확하게 조절하였다. 용액을 0.2㎛의 공극 크기를 갖는 살균 막 필터를 통한 여과에 의해 살균시키고, 무균 조건하에 가수분해성 클라스 I의 유리로 만든 살균 주사병내에 넣고, 살균 테플론화 고무 마개로 밀봉시켰다. 살균 주사병내에 넣는 것은 질소 분위기하에서 수행하였다. 플랜지 주사병을 실험 때까지 규정된 저장 온도에서 암실에 저장하였다. 실시예 2 및 3에 기술된 방법을 실험을 위해 사용하였다.

[표 4a]

[표 4b]

I RP HPLC에서 변하지 않은 단백질의 순도

II SEC HPLC에서 변하지 않은 단백질의 순도

III 웨스턴 블롯에서 이량체/응집체

표 4b의 분석 데이타는 pH 7 및 규정된 인산염 완충제 농도에서 안정한 용액이 얻어지고, 4주 저장후 단백질의 순도가 거의 변하지 않고 유지됨을(＞99%) 보여준다.

[실시예 8]

본 발명에 따라 인산염 완충제를 함유하고 4.5의 pH를 갖는 G-CSF의 용액을 제조한다(제형 8). 비교를 위해 6.5의 pH를 갖는 제 2 용액을 제조한다(제형 9).

의약 성분 용액을 제조하기 위해, 보조 성분을 주사용 물에 용해시킨 다음, G-CSF를 첨가하였다. 용액을 살균 0.2㎛ 막 필터를 통한 여과에 의해 살균시키고, 가수분해성 클라스 I의 유리의 바이알내에 넣고, 테플론 마개로 밀봉시켰다. 그런 다음, 그것들을 실험용 진탕 장치(Heidolph Company)를 사용하여 10분 동안 처리하였다. 실시예 2 및 3에 기술된 방법을 사용하여 용액을 시험하였다.

[표 5a]

[표 5b]

표에 기재된 결과는 사람 혈청 알부민의 첨가도 pH 6.5에서 기계적 응력에 의해 야기되는 단백질의 응집 및 이량화를 방지할 수 없음을 보여준다. 반면, 기계적 응력에 대해 안정한 용액은 안정화제로서 사람 혈청 알부민이 존재하지 않는 경우에도 4.5의 pH에서 얻어진다.

[실시예 9]

장기간 안정성

50㎎/㎖의 만니톨, 0.1㎎/㎖의 폴리소르베이트 80 및 0.5㎎의 인산의 용액중에 0.35㎎/㎖의 G-CSF를 용해시키고, 인산 수소 나트륨으로 pH 4로 조절하면서 교반시킴으로써 G-CSF 주사 용액을 제조하였다. 용액의 제조 및 분배는 질소 분위기하에서 수행하였다. 맑은 용액을 0.2㎛의 공극 크기를 갖는 살균 막 필터를 통한 여과에 의해 살균시키고, 계속해서 가수분해성 클라스 I의 주사병내에 넣고 적합한 고무 마개로 밀봉시켰다. G-CSF를 함유하는 약제 조성물을 4 내지 8℃ 및 20 내지 25℃의 온도에서 9개월 동안 저장하였다.

[표 6]

[실시예 10]

약 5㎎/㎖의 농도를 갖는 G-CSF 용액을 하기 기술된 완충 용액을 사용하여 0.35㎎/㎖의 활성 성분 함량까지 희석시켰다. 모든 완충 용액은 0.05%의 폴리소르베이트 80을 함유하였다. 5 내지 80mmol/ℓ의 규정된 몰량으로 아르기닌을 첨가하고, 인산 또는 염산 또는 시트르산으로 pH 값을 조절함으로써 완충 용액을 제조하였다. 상기 방식으로 얻은 G-CSF 완충 용액을 10㎖의 양으로 가수분해성 클라스 I의 유리로 만든 주사병내에 넣고, 적합한 마개로 밀봉시키고, 실험용 진탕 장치(예를 들어, Heidolph Company)에서 최대 강도로 10초 동안 진탕시켰다. 약 10분 동안의 정지 시간 후에 포르마진 표준(독일 약전)에 대해 보정된 혼탁도 값(TU/F)을 LTP 5 산란광 광도계(Dr. Lange Company)(측정각 90°)를 사용하여 측정하였다.

진탕되지 않은 용액 및 진탕된 용액의 평균 혼탁도 값을 표 7에 나타낸다. 아르기닌 완충계의 여러 몰 농도(5, 10, 20, 40 및 80mmol)는 각각의 경우에 똑같은 결과를 유도한다.

아르기닌 완충제가 7.0 내지 7.5의 pH 범위에서 기계적 응력에 대해 특히 양호하게 작용함을 발견하였다. 아르기닌 완충제는 동결 건조물을 용해시킴으로써 제조되는 용액에서 특히 유리하게 사용될 수 있다.

[표 7]

평균 몰 농도 5-80mmol/ℓ

Claims

i) 치료적 유효량의 G-SCF, ii) 조성물중 0.5㎎/㎖ 이하의 하나 이상의 계면활성제, 및 iii) 시트르산염, 말레산염, 인산염 및 시트르산염의 조합물, 및 아르기닌, 또는 인산 아르기닌, 염산 아르기닌 및 시트르산 아르기닌으로 구성된 군으로부터 선택된 아르기닌의 염으로 구성된 군으로부터 선택된 완충 성분을 포함하며, 조성물중 완충 성분의 최종 농도가 2 내지 100mmol/ℓ이고, 조성물의 pH가 7 내지 8인 안정한 수성 약제 조성물.
제1항에 있어서, 시트르산염의 농도 또는 말레산염의 농도가 5 내지 40mmol/ℓ임을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 인산염 및 시트르산염의 전체 농도가 5 내지 40mmol/ℓ임을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 인산 아르기닌, 염산 아르기닌 또는 시트르산 아르기닌의 농도가 5 내지 8mmol/ℓ임을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 조성물중 0.01 내지 0.1㎎/㎖의 계면활성제를 함유함을 특징으로 하는 조성물.
제1항, 제2항, 제3항, 제4항 및 제5항중의 어느 한 항에 있어서, 통상적인 보조 성분 또는 등장제를 추가로 함유함을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 중합체 또는 단백질-형 보조 성분을 함유하지 않음을 특징으로 하는 조성물.
치료적 유효량의 G-CSF를, 하나 이상의 계면활성제 및 시트르산염, 말레산염, 인산염 및 시트르산염의 조합물, 및 아르기닌, 또는 인산 아르기닌, 염산 아르기닌 및 시트르산 아르기닌으로 구성된 군으로부터 선택된 아르기닌의 염으로 구성된 군으로부터 선택된 완충 성분과 혼합시키는데, 계면활성제의 양을 조성물중 계면활성제의 양이 0.5㎎/㎖ 이하가 되도록 선택하고, 완충 성분의 양을 조성물중 완충 성분의 최종 농도가 2 내지 100mmol/ℓ이 되도록 선택하며, 조성물의 pH를 7 내지 8로 조절하는, G-CSF를 함유하는 안정한 수성 약제 조성물의 제조 방법.
조성물중 0.5㎎/㎖ 이하의 하나 이상의 계면활성제 외에, 혼탁을 방지하는 안정화제로서 시트르산염, 말레산염, 인산염 및 시트르산염의 조합물, 및 아르기닌, 또는 인산 아르기닌, 염산 아르기닌 및 시트르산 아르기닌으로 구성된 군으로부터 선택된 이것의 염으로 구성된 군으로부터 선택된 완충 성분을 조성물중 2 내지 100mmol/ℓ의 최종 농도로 사용하고, 조성물의 pH를 7 내지 8로 조절하는, G-CSF를 함유하는 수성 약제 조성물의 안정화 방법.
제1항에 따르는 조성물로부터 제조되는 동결건조물 또는 분말.
제10항에 따르는 동결건조물 또는 분말을 물 또는 수용액중에 용해시킴으로써 제조되는, 제1항에 다르는 조성물.