HU219548B

HU219548B - Granulocitakolóniát stimuláló faktort tartalmazó, tárolható, vizes gyógyszerkészítmények és eljárás ezek előállítására

Info

Publication number: HU219548B
Application number: HU9501767A
Authority: HU
Inventors: Uwe Michaelis; Rainer Rudolph; Gerhard Winter; Heinrich Woog
Original assignee: Roche Diagnostics Gmbh
Priority date: 1992-12-18
Filing date: 1993-12-15
Publication date: 2001-05-28
Also published as: ATE203411T1; US5919757A; CA2151957C; JPH08505610A; EP0674525B1; KR950703988A; AU5810994A; NZ259333A; EP0674525A1; AU692430C; HUT74270A; KR100266146B1; HU9501767D0; WO1994014466A1; CA2151957A1; DE59310197D1; DE4242919A1; AU692430B2

Abstract

A találmány tárgyát tárolás alatt stabilis, vizes G–CSFgyógyszerkészítmények képezik, amelyek stabilizálás cél- jábóllegalább egy pufferanyagot, mint ecetsavat, tejsavat, citromsavat,maleinsavat, foszforsavat tartalmaznak, ilyen savak sóit tartalmazzákvagy arginint vagy argininsót tartalmaznak 100 mM/l-ig terjedőkoncentrációban. ŕ

Description

A jelen találmány tárgyát olyan, tárolás alatt stabilis, vizes granulocitakolóniát stimuláló faktor (G-CSF) gyógyszerkészítmények képezik, amelyek stabilizálásra 1 mM-ig teijedő koncentrációban legalább egy pufferanyagot, mint ecetsavat, tejsavat, citromsavat, maleinsavat, foszforsavat tartalmaznak, vagy e savak sóit tartalmazzák vagy arginint vagy argininsót tartalmaznak.

A technika állása szerint különböző, G-CSF-et (granulocitatenyészetet stimuláló faktort) tartalmazó gyógyszerkészítmények ismeretesek.

A DE 37 23 781 számú német (2 193 631 számú nagy-britanniai) szabadalmi leírás olyan G-CSF-tartalmú gyógyszert ír le, amely a G-CSF stabilitása céljából legalább egy, gyógyszerészetileg elviselhető felületaktív anyagot, szacharidot, proteint vagy nagymolekulás vegyületet tartalmaz. A leírásban olyan készítményeket javasolnak, amelyek stabilizálószerként humán szérumalbumint tartalmaznak. Különösen azokat a készítményeket tartják előnyösnek, amelyek a felhasznált G-CSF-mennyiség 1-10 000-szeresének megfelelő tömegrész mennyiségű felületaktív szert tartalmaznak.

Az EPA 0 373 679 számú európai szabadalmi leírásban olyan stabilizált G-CSF-készítményeket imák le, amelyek lényegében az oldat savas pH-értékével tűnnek ki, mimellett ezeknek az oldatoknak lehetőleg kicsi a vezetőképessége. Az oldatok pH-értéke 3-3,7 abban az esetben, ha az oldat további gyógyszerészeti segédanyagokat, mint például puffereket vagy mannitolt tartalmaz. Abban az esetben, ha a gyógyszerformában nincsenek pufferanyagok, akkor a 2,75-4 pH-tartományt tartják előnyösnek.

Az EPA 0 306 824 számú európai szabadalmi leírás humán proteinkészítmények stabilizált liofílizátumait írja le, melyeknél a stabilizálás egy karbamid, aminosavak és detergenskeverék hozzáadásával történik.

A korábbi WO 9303745 számú nemzetközi találmányi bejelentés eljárást ír le G-CSF-tartalmú, infúzió és injekció célra szolgáló, jól elviselhető gyógyszer előállítására. A folyékony halmazállapotú adagolási formák különösen kis titrálási savassággal és kis pufferkapacitással tűnnek ki. A leírt G-CSF-tartalmú infúziós és injekciós oldatok pH-értéke a 3,8-4,5 savas tartományban van.

Olyan G-CSF-tartalmú folyékony gyógyszerformák előállítási eljárása, amelyek még konzerválószereket is tartalmaznak, a WO 9303744 számú nemzetközi találmány bejelentésből ismert. A gyógyszerészeti oldatok pH-értéke a 2,5-4,5 savas tartományban van. A G-CSF stabilizálását ott lényegében a G-CSF részére előnyös savas pH-érték beállításával és különböző aminosavak keverékének hozzáadásával érik el.

Az eddig ismert G-CSF gyógyszerformáknak azonban van néhány hátránya. A DE 37 23 781 számú német szabadalmi leírásban leírt készítmények olyan gyógyszerészeti adalék- vagy segédanyagokat tartalmaznak, amelyek orvosi szempontból minden további nélkül nem tekinthetők problémamentesnek. A polimereknek és a proteineknek származásuk és fizikai-kémiai tulajdonságaik miatt gyógyszerészeti hatóanyagokként bizonyos rizikópotenciáljuk van. Az emberi vagy állati eredetű proteinek, valamint a sejtkultúrákból nyert proteinek potenciálisan vírusos szennyezések kockázatát hordozzák. Egyéb, analitikailag nehezen kimutatható proteinszerű szennyezések antigén tulajdonságaik következtében képesek embereknél immunológiás reakciókat kiváltani. Az állati eredetű proteinek ezen túlmenően fajtaspecifikus tulajdonságaik következtében tudnak embereknél immunológiás reakciókat kiváltani. Az ilyen proteinek későbbi újraalkalmazásánál hosszan tartó reakciók is lehetségesek.

A nagymolekulás vegyületek, mint adalékanyagok felhasználása szintén problematikus lehet. A polimerek molekulatömegük következtében felgyűlhetnek a testben és így - amennyiben biológiai lebomlásuk nem következik be - hosszú ideig megmaradhatnak a testben. Ez különösen szubkután adagolásnál veszélyes, mert az elszállítás és a véráram által végzett eloszlatás az intravénás adagolással ellentétben erősen lassítva történik. A molekulatömegtől függően a polimereknek antigén tulajdonságaik is lehetnek. Az előállításhoz alkalmazott katalizátorok és monomerek, valamint egyéb polimertöredékek jelenléte miatt a polimerek tisztasága is nehezen biztosítható. Ezért polimerek felhasználását folyékony gyógyszerkészítmények, különösen szubkután módon adagolható gyógyszerkészítmények felhasználásánál hacsak lehetséges, el kell kerülni.

A DE 37 23 781 számú német szabadalmi leírásban leírt tenzidmennyiségek orvosi szempontból ugyancsak problematikusnak tekintendők. Ott olyan tenzidkoncentrációkat írnak le, amelyek a G-CSF-tömegrészre számított 110 000 tömegrész felületaktív anyagot tartalmaznak. Ha másfelől figyelembe vesszük a klinikai gyakorlatban előnyös módon a kész gyógyszerkészítményben alkalmazott 0,05-1,5 mg/ml G-CSF-koncentrációkat, akkor ennek megfelelő nagy tenzidkoncentrációk adódnak. Ezeket orvosi szempontból el kell kerülni, mert ezek lokális irritációkat tudnak kiváltani.

A fentiekben leírt receptúráknak az a hátránya, hogy az alkalmazott alacsony pH-értékek miatt, különösen szubkután adagolás esetén, a betegeknél lokálisan elviselhetetlenné válnak. A beadott gyógyszertermék erre érzékeny személyeknél fájdalomérzethez és lokális szövetizgatáshoz vezethet, mert a szövetben uralkodó 7,0-7,5 pH-tartomány nincs betartva.

Az irodalomból az is ismert, hogy különösen a G-CSF nem glikozilált formái a glikozilált, CHO-sejtekből nyert G-CSF-hez képest különösen instabilak (J. Bioi. Chem., 1990, 265. számú, 11 432. oldal). A G-CSF nem glikozilált formáinak stabilizálása ezért különösen nehéz feladat és különleges módon megválasztott műveletekre van szükség ahhoz, hogy ezt a molekulát egy stabilis gyógyszerformává recepturáljuk.

A G-CSF-tartalmú folyékony gyógyszerformák egy jelentős hátrányaként ezen túlmenően azt találtuk, hogy elsősorban hosszabb tárolás vagy az elosztás céljából történő szállítás folyamán könnyen hajlamosak megzavarosodásra. Különösen azt tapasztaltuk, hogy az alkalmazandó oldatok fokozottan érzékenyek a mechanikai feszültségekre. A mechanikai igénybevételek, mint például az oldat rázása - a folyékony gyógyszer2

HU 219 548 Β formák szállítása alatt - sokféle, szabályozhatatlan módon tud azokra hatást gyakorolni. Még orvosi, egészségügyi személyzet vagy maga a beteg általi alkalmazás esetén sem zárható ki biztonsággal az ampullákba vagy edényekbe letöltött gyógyszerészeti oldatok rossz kezelése és az ezzel kapcsolatos mechanikai terhelés. Ennek megfelelően, a protein gyógyszerek mechanikai feszültségtűrő képessége minőségi kritériuma a protein gyógyszereknek. A G-CSF mechanikai terheléssel szembeni stabilitását biztosító intézkedéseket eddig nem írták le a szakirodalomban. Bár a G-CSF szokásos eljárásokkal előállított folyékony készítményei magasabb hőmérsékleten történő tárolás alatt is megfelelő stabilitást mutatnak, az ilyen receptúrák mechanikai terheléssel szembeni stabilitása nem minden esetben kielégítő. Különösen látható zavarosodás lép fel gyakran a gyógyszeroldatokban, amelyet G-CSF-dimerek vagy -aggregátumok képződése okoz. A folyékony gyógyszerformák ilyen változásai mindenekelőtt az egyes gyógyszeradagokban jelen lévő hatóanyag-mennyiségre gyakorolnak negatív hatást és orvosi szempontból lehetőleg elkerülendők.

A találmányi feladat stabilis G-CSF folyékony gyógyszerforma kifejlesztése volt, amely a G-CSF, mint gyógyszeradagolás megfelelő alkalmazását teszi lehetővé és nincsenek meg az eddig ismert gyógyszerformák fentiekben ismertetett hátrányai. A gyógyszerkészítménynek különösen hosszú idő alatt tárolásstabilisnak, mechanikai terheléssel szemben stabilisnak, fiziológiásán jól elviselhetőnek, egyszerű módon kezelhetőnek és pontosan adagolhatónakkell lennie. Különösen fiziológiásán jól elviselhető pH-értéke kell legyen.

Meglepetésszerűen azt találtuk, hogy a találmány szerint stabilis vizes gyógyszerformák állíthatók elő akkor, ha adalékanyagként pufferanyagot, valamely acetátot, laktátot, citrátot, maleátot vagy foszfátot használunk. Ezeket előnyösen olyan mennyiségben alkalmazzuk, hogy a mindenkori, kiválasztott pufferanyag koncentrációja a kész, alkalmazott gyógyszerformában 2-100 mM legyen. Az ily módon előállított oldatok meglepetésszerűen igen stabilisak mechanikai terheléssel szemben. Ezenkívül az az előnyük is megvan, hogy a pufferanyagok megfelelő megválasztásával olyan oldatok bocsáthatók rendelkezésre, melyeknek pH-ja előnyös módon 4-5 vagy 7-8, ezzel szemben a technika állása szerinti ismert oldatoknak a proteinstabilitás miatt előnyösen 2,5-3,5 kell legyen a pH-ja.

A találmány szerint előállított készítményeknek ezenkívül az is előnyük, hogy mentesek olyan proteinszerű vagy polimer segédanyagoktól, melyeknek a használata orvosi szempontból problematikus lehet. Annak a ténynek alapján, hogy most már 7-8 pH-értékű folyékony G-CSF-tartalmú gyógyszerformák állíthatók elő, melyeknek pH-ja a vér pH-értékének (7,2-7,4) közelében van, ezeknek a készítményeknek továbbá az is előnye, hogy elviselhetők és messzemenően fájdalommentesen adhatók be.

Előnyös továbbá, hogy a segédanyagok megfelelő kiválasztásával elkerülhetők a folyékony gyógyszerformákban az eddig szükséges nagy tenzidmennyiségek. A G-CSF stabilizálására kis, 0,5 mg/ml vagy kevesebb, előnyösen 0,01-0,1 mg/ml tenzidmennyiség is elegendő. Előnyös módon olyan (mg/ml) tenzidkoncentrációk használhatók, amelyek kisebbek vagy legfeljebb egyenlők a térfogategységre eső (mg/ml) G-CSF-proteinmennyiséggel. Ez különösen olyan folyékony gyógyszerformáknál előnyös, amelyek a G-CSF szubkután alkalmazására szolgálnak. Ezenkívül a találmány szerinti intézkedésekkel különösen a gyógyszerkészítmények céljára szolgáló labilis, nem glikozilált G-CSF-molekulák megfelelő stabilizálása válik lehetővé. A segédanyagok célszerű megválasztása útján igen jól elviselhető G-CSF-tartalmú gyógyszerformák bocsáthatók rendelkezésre, amelyek proteinstabilitás szempontjából kitűnő minőségű készítmények.

A találmány szerinti, G-CSF-tartalmú gyógyszerkészítmények a hatóanyagot gyógyítóhatás eléréséhez elegendő mennyiségben tartalmazzák. Általában 0,01-5 mg/ml, előnyösen 0,1-1,5 mg/ml hatóanyagkoncentrációt használunk.

A találmány szerint gyógyszerészeti segédanyagként és pufferanyagként ecetsavat, citromsavat, tejsavat, maleinsavat és foszforsavat vagy ezek fiziológiásán elfogadható sóit, használjuk. A segédanyagoldatok előállításánál ezek a pufferanyagok vagy a megfelelő sav vagy azok alkálifém-, alkáliföldfém- vagy ammóniumsója alakjában használhatók. Ezenkívül az oldat további, szokásos gyógyszerészeti segédanyagokat is tartalmazhat. A különböző segédanyagok vagy a hatóanyag hozzáadásának sorrendje a folyékony gyógyszerformák előállítása során messzemenően független a találmányunk szerinti tárolás alatti stabilizáló hatástól és azt a szakember szabja meg. Az oldat kívánt pH-értéke bázisok, mint például alkálifém-hidroxidok, alkáliföldfém-hidroxidok vagy ammónium-hidroxid hozzáadásával állítható be. Előnyösen nátrium-hidroxidot használunk e célra. A kívánt pH-érték beállítása elvileg bázikus oldatok hozzáadásával történhet. Ilyen értelemben általában az erős bázisok gyenge savakkal képezett sói, mint például a nátrium-acetát, nátrium-citrát, dinátrium- vagy dikálium-hidrogén-foszfát vagy a nátriumkarbonát jönnek szóba. Abban az esetben, ha a gyógyszerészeti segédanyagoldat pH-ja lúgos, akkor a beállítás, a kívánt 4-5 vagy 7-8 pH-értékre, savval végzett titrálással történik. Sav gyanánt fiziológiásán elviselhető szervetlen vagy szerves savak, mint például sósav, foszforsav, ecetsav, citromsav vagy olyan anyagok általában szokásos oldatai jönnek számításba, amelyek savas pH-júak. Előnyös anyagok e tekintetben az erős savak gyenge bázisokkal képezett sói, mint például a nátrium-dihidrogén-foszfát vagy a kálium-dihidrogénfoszfát.

A találmány szerinti gyógyszerészeti segédanyagként vagy pufferanyagként arginint és argininsókat is használunk.

Az ecetsav, citromsav, tejsav, maleinsav és foszforsav pufferanyagok koncentrációja a kész, adagolható gyógyszerformákban minden esetben körülbelül 2-100 mM. Tekintettel arra, hogy az előbbiekben említett savakat a gyógyszerészeti segédanyagoldatoknál gyakran sóik alakjában és ritkábban a szabad sav alakjá3

HU 219 548 Β bán használjuk, ezért a következőkben az egyszerűség kedvéért mindig e savak anionjainak koncentrációját adjuk meg, tehát például az acetát-, citrát-, laktát-, maleát- vagy foszfátkoncentrációt. A pufferanyagok összkoncentrációja nem lépheti túl az 1000 mM, előnyösen a 80 mM értéket. A pufferanyagok összkoncentrációja előnyösen mintegy 5-40 mM.

Azt találtuk, hogy a folyékony gyógyszerforma bizonyos pH-tartománya bizonyos pufferanyagokkal kombinálva különösen stabilis oldatokat eredményez. Ha egy acetát- vagy laktátpuffert 5-4 mM koncentrációban használunk és az oldat pH-értékét körülbelül 2-5-re állítjuk be, akkor mechanikai terheléssel szemben különösen stabilis gyógyszerformához jutunk. Előnyös módon a következő pufferkoncentrációjú és pH-értékű oldatokat használjuk: 5-80 mM, különösen 10-30 mM acetát vagy laktát és 3,3-5 pH-érték.

A citrátot 5-40 mM, előnyösen 5-20 mM koncentrációban használjuk. Előnyösen citrát és foszfát pufferanyagok kombinációját használjuk oly módon, hogy a pufferanyagok összkoncentrációja 10-40 mM, előnyösen 5-30 mM. A folyékony gyógyszerforma pHértéke előnyösen körülbelül a 2,5-3,5 vagy a 7-7,5 tartományban van.

A maleátot előnyösen 5-40 mM koncentrációban használjuk. A folyékony gyógyszerforma pH-értéke előnyös módon körülbelül 2,5-3,5 vagy 7-7,5.

A foszfátot 5-80 mM, előnyösen 5-30 mM koncentrációban használjuk egymagában vagy egy másik pufferanyaggal kombinált formában. A folyékony gyógyszerforma pH-értéke, ha az csak foszfátpuffert tartalmaz, körülbelül 3,5-5 vagy 7-8.

Az arginin-foszfátot, arginin-kloridot és arginin-nitrát-puffert szintén 2-100 mM, előnyösen 5-80 mM koncentrációban használjuk. A folyékony készítmény pH-értéke, amely arginin pufferanyagot tartalmaz, körülbelül 7-8, előnyösen 7-7,5.

A fiziológiásán elviselhető pH-értékű és fiziológiásán elviselhető koncentrációjú, a találmányi leírásban leírt pufferrendszerek kiválasztása liofilizátumokból és porokból, ismételt feloldással készült G-CSF-oldatok esetében is ésszerű és előnyös.

Minthogy a liofilizátumok ismételt feloldása során rázást alkalmazunk, ezért itt a meghatározott pufferrendszerek és pH-értékek kiválasztása fontos. A találmánynak nem megfelelő pufferrendszerek vagy pH-értékek megválasztása aggregációk, zavarosodások képződéséhez, és ezzel minőségileg kisebb értékű termékekhez vezethet.

A szakember belátására van bízva, hogy a találmány szerinti pH-értékekhez és pufferrendszerekhez szükséges savak, sók, bázisok a liofilizátumban vannak-e elhelyezve vagy az oldásra használt vizes oldatban avagy mindkét komponensben.

A találmány szerinti vizes készítményekből a szokásos liofilizálással liofilizátumok vagy például porlasztószárítással porok állíthatók elő. Ezeknek vízben vagy vizes oldatokban végzett oldásával ismét a találmány szerinti készítményeket kapjuk meg. Azt találtuk, hogy az újra feloldott liofilizátumok, amelyek 7-7,5 pH-tartományú argininpuffert tartalmaznak, legalább 24 órán át eltarthatok.

A G-CSF-molekulák nevezett pufferanyagokkal lehetséges stabilizálása elvileg minden rekombinációs eljárással előállított G-CSF-molekulára és annak variánsára vonatkozik. A G-CSF vagy G-CSF-variáns fogalma a jelen találmány szerint magában foglalja a G-CSF minden természetben előforduló variánsát, valamint az ezekből rekombinációs DNA-technológiával módosított G-CSF-proteineket, különösen fúziós proteineket, amelyek a G-CSF-komponensen kívül még más proteinszekvenciákat is tartalmaznak. Különösen előnyös ebben az értelemben az 1-helyzetben N-végcsoportként metionincsoportot tartalmazó G-CSF-mutein, amely prokariotikus sejtekben expresszionálásra alkalmas. Ugyancsak alkalmas a rekombináns, metioninmentes G-CSF-variáns, amely a WO 9111520 számú nemzetközi szabadalmi leírás szerint állítható elő. „G-CSF-variáns” kifejezés alatt olyan G-CSF-molekulákat értünk, amelyeknél egy vagy több aminosav kimaradhat vagy más aminosavval helyettesíthető, mimellett a G-CSF lényeges tulajdonságai messzemenően megmaradnak. Alkalmas G-CSF-muteineket ír le például az EPA 456 200 számú európai szabadalmi leírás.

A folyékony gyógyszerformák mechanikai terheléssel szembeni stabilitásának mérésére különösen a G-CSF-tartalmú oldatok zavarosságának mérése alkalmas. Egy proteinoldat mechanikai feszültség behatása utáni zavarosságának értékelése egy egyszerűen kivitelezhető, különösen értékes vizsgálati módszer. A zavarosodás fellépése összefüggésben van a polimerek, oligomerek és aggregátumok képződésével. Az optikai úton történő értékelés egyes esetekben jobb, mint a dimerek és aggregátumok kimutatására szolgáló speciális módszerek, mint például a HPLC (nagynyomású folyadékkromatográfia), mert a nagyméretű aggregátumok a minta-előkészítés során a zavarosságmérési módszernél nem maradnak ki, hanem azok biztonsággal felismerhetők, és az eredeti mérőedényben azokat értékeljük. A zavarosodási jelenségek mennyiségi meghatározása a kereskedelemben forgalmazott turbidiméterekkel, szórtfény-fotométerekkel stb. könnyűszerrel lehetséges. Az ilyen eredmények értékelése a gyógyszerkönyveknek a zavarossági határértékekre vonatkozó követelményeibe is belefoglalható, melyek alapján az oldatok átlátszóak, illetve gyengén zavarosnak minősülnek.

Jól elviselhető parenterális gyógyszerformák előállítására izotonizált segédanyagok hozzáadása célszerű, hacsak a hatóanyag és a stabilizálásra felhasznált segédanyagok azmotikus tulajdonságai következtében izotónia nem érhető el. E célra mindenekelőtt nem ionizált, jól elviselhető segédanyagokat, mint például mannitot, glicerint vagy egyéb cukoralkoholokat használunk.

A G-CSF esetében előnyösen mannitot alkalmazunk anélkül, hogy ez a G-CSF-stabilitásra lényeges hatást gyakorolna. A protein stabilitása ugyanígy mannitmentes készítmények esetében is adott, de ebben az esetben az oldatok hiányzó izotóniájuk miatt kevésbé elviselhetők.

HU 219 548 Β

Sók hozzáadása az izotónia elérésére azért nem előnyös, mert a nagy só- vagy ionkoncentráció elősegíti a G-CSF-aggregátum képződését. Ezért előnyösen sókat csak kis mennyiségben adunk a készítményhez. A pufferkoncentrációkat úgy kell megválasztanunk, hogy bár a pH-stabilizáló hatást elérjük, az ionkoncentrációt a lehető legalacsonyabban tartsuk. A pufferkoncentráció előnyösen a 80 mM-ig terjedő tartományban, előnyösen 30 mM-nál kisebb legyen.

A kész, beadható injekciós oldatok ezenkívül további szokásos segéd- és adalékanyagokat tartalmazhatnak. így az oldatokhoz antioxidánsok, mint például glutation, aszkorbinsav és hasonló anyagok, kaotrop segédanyagok, mint karbamid és aminosavak, így például arginin, lizin, ozmitin stb. adhatók.

A következőkben a találmányt reprezentatív kiviteli példákkal írjuk le részletesebben.

1. példa

Általános eljárás folyékony gyógyszerformák előállítására

A példákban felhasznált G-CSF-oldatokat úgy állítottuk elő, hogy a leírt segédanyagokat injekciós célra alkalmas vízben feloldottuk, ehhez az oldathoz hozzáadtuk a megadott mennyiségű G-CSF-et, és - szükség esetén - a pH-t kis mennyiségű pufferkomponenssel pontosan a kívánt értékre állítottuk be. Az oldatokat ezután, erre alkalmas sterilizált, 0,2 pm pórusméretű szűrőn leszűrtük és hidrolitikus I. osztályú injekciós üvegcsékbe töltöttük le, majd steril, teflonozott gumidugóval zártuk le. A letöltés előnyös módon nitrogénatmoszférában történt.

2. példa

Stabilitásmeghatározási vizsgálati módszerek

A lezárt és peremezett üvegcséket sötétben, meghatározott hőmérsékleten tároltuk, majd fordított fázisú HPLC-vel (RP-HPLC), gélkromatográfíával vagy méretkizárásos kromatográfiával (SEC-HPLC) és „Western Blof’-tal vizsgáltuk meg proteintisztaságra, valamint aggregátumok és dimerek fellépésére. Az alkalmazott módszereket a következőkben írjuk le.

2.1 Fordított fázisú HPLC

Az RP-HPLC vizsgálatot egy Nucleosil C18 (Knauer cég gyártmánya) oszlopon végeztük. A mobil fázis 0,12 térfogat% trifluor-ecetsav (TFA)/víz (A) és 0,1 térfogat% TFA/acetonitril (B) elegyéből állt. A kromatográfiát 0,5 ml/perc áramlási sebességgel és egy Atól B-felé csökkenő lineáris gradienssel végeztük.

A befecskendezett mennyiség receptúrától függően 3-6 pg G-CSF volt. A csúcsfelület-kiértékelés külső sztenderd felhasználásával 214 nm hullámhosszon történt.

2.2 Méretkizárásos (SEC) kromatográfia

A SEC kromatográfiához egy TSK G 2000 SW (7,5-300 mm méretű) elválasztóoszlopot használunk. Az elválasztások izokratikusan, szobahőmérsékleten és 0,6 ml/perc áramlási sebességű foszfátpufferben (22,2 mmol Na₂HPO₄; 107,7 mmol KH₂PO₄; pH=6,2) történtek. A beinjektált mennyiség 3-6 pg G-CSF volt. A kiértékelés egy külső sztenderd felhasználásával a csúcs alatti terület 214 nm hullámhosszon végzett felmérésével történt.

2.3 SDS-Page/Western Biot pg rhG-CSF-et nem redukáló körülmények között 12%-os poliakrilamid-SDS-gélhez adtunk és gélelektroforézisnek vetettük alá. A molekulatömegük szerint elválasztott G-CSF-monomereket, -dimereket vagy -aggregátumokat elektroflottinggal nitro-cellulózra visszük át. Egy speciális poliklonalénnel biotinilezett anti-G-CSFantitesttel (PAK<GCSF>IgG) végzett inkubálás útján azonosítottuk a proteinsávokat, és szteptavidin-alkalikus foszfatáz-konjugátum (SA-AP-konjugátum) felhasználásával 5-bróm-4-klór-3-indolil-foszfátot (BCIP)-t és nitrokék tetrazolint (NBT) mutattunk ki.

2.4 NFS-60 biovizsgálat (biológiai hatékonyság)

A G-CSF in vitro aktivitásának meghatározása NFS-60 sejtek G-CSF-fel stimulált sejttenyészettel végzett sejtszámlálásán alapszik.

Alkalmas körülmények között a sejtek dehidrogenázaktivitása a közeg G-CSF-koncentrációjával hozható összefüggésbe. A dehidrogenázaktivitás könnyűszerrel mérhető növekedésének eléréséhez megfelelő hígítású G-CSF pufferoldatokat állítunk elő.

Az aktivitás mérése azután fotometriásan 570-690 nm-en történik, a (sárga színű) MTT tetrazoliniumsó (kék színű) formazánná végzett redukciójával.

A G-CSF in vitro aktivitását úgy számítjuk ki, hogy a minta sztenderdhez viszonyított adatait a párhuzamos egyenesek módszere szerint hasonlítjuk össze. A kiértékelést a Ph. Eur. (VIII. 13.) szerint végezzük.

2.5 OD 280fotometria (proteintartalom)

A G-CSF ultraibolya spektrumnak 280 nm-en van egy abszorpciós maximuma, amely triptofán-, tirozinvagy fenil-alanin-csoportokra vezethető vissza. A placebooldatokkal végzett összehasonlító mérés:

UV-spektrofotométerrel (például Uvikon 810 P vagy 941 típusú; Kontron

Instruments gyártmányú műszenei), szemi-mikro, 500 pl-es; 1 cm rétegvastagságú (például Hellma, Suprasil gyártmányú, 104.002B-QS katalógusszámú) küvettával történik.

2.6 Szór (fény-mérés, zavarosságmérés

A mérést a termék nem hígított, 2 cm átmérőjű küvettába töltött oldatával végezzük. A folyadék által eltérített, szórt fényt 90°-os szögben méljük. A mérés a DIN 38404C2 szerinti formazinsztenderd-szuszpenziókkal összehasonlításban történik. Az adatokat TE/F értékben adjuk meg. A mérés erre alkalmas zavarosságmérő fotométerrel, olkdézk a (Dr. Lángé, Düsseldorf cég gyártmányú LTP 5 típusú) zavarosságmérő fotométerrel történik.

3. példa

Mechanikai terhelhetőségi (zavarosodási) vizsgálatok

0,5 mg/1 ml koncentrációjú G-CSF-oldatokat állítottunk elő az alábbiakban nevezett pufferekkel végzett dialízissel. A mechanikai terhelés után fellépő zavarosság meghatározása céljából az 1 ml térfogatú mintákat az 1 hidrolitikai osztályba sorolt injekciós üvegcsékbe töltöttük és dugóval lezártuk. A mintákat 10 másodpercig maximális intenzitásra állított laboratóriumi rázóberende5

HU 219 548 Β zésben (például Heidolph gyártmányú készülékben) kezeltük. A mechanikai terhelést azonnal követte a Hitachi F 4000 típusú flureszcencia-spektrofotométerrel 360 nm EX- és EM-hullámhosszon végzett vizsgálat. A következőkben a 360 nm-en mért szórtfényintenzitás-adatokat adjuk meg a pH-érték és a felhasznált puffer függvényében. A megadott acetát- és citrátpuffer-molaritás adatok a felhasznált ecetsav- és citromsavmólokra vonatkoznak.

A megfelelő pH-értékeket nátronlúggal állítottuk be.

A foszfát/citrát puffereket a megfelelő mennyiségű cit- 10 romsavnak dinátrium-hidrogén-foszfáttal végzett pHbeállításával állítottuk elő. A foszfátpuffereket a megadott mólmennyiségű nátrium-dihidrogén-foszfátból állítjuk elő a pK-érték foszforsavval, illetve dinátrium-hidrogén-foszfáttal végzett beállítása útján.

4. példa

Az 1. példában leírtak szerint egy folyékony G-CSF gyógyszerformát állítunk elő és az oldat pH-ját 4,5-re állítjuk be. A készítmények az I. táblázatban megadott komponenseket tartalmazzák.

1. táblázat

4,5 pH-jú G-CSF-oldatok

	1.rcccptúra	2. receptúra
G-CSF	0,25 mg	0,25 mg
Mannit	25 mg	25 mg
Poliszorbát 80	0,02 mg	0,02 mg
Puffer	citrát/foszfát	foszfát
	5 mM	5 mM
Víz	ad 0,5 ml	ad 0,5 ml
pH	4,5	4,5

	3.receptúra	4.receptúra
G-CSF	0,25 mg	0,25 mg
Mannit	-	25 mg
Poliszorbát 80	0,02 mg	0,02 mg
Puffer	foszfát	acetát
	5 mM	10 mM
Víz	ad 0,5 ml	ad 0,5 ml
PH	4,5	4,5

a) Proteintisztasági mérési eredmények nyugalmi állapotban történő tárolásnál

Az 1 -4. folyékony receptúrák RP HPLC-vel, SEC 15 HPLC-vel és Western Blottal végzett analízise azt mutatja, hogy a változatlan proteintisztasági fok nagyobb, mint 99%, és G-CSF-dimerek vagy -aggregátumok nem mutathatók ki. Ezeket az eredményeket az 1-4. receptúrák hat hónapos, 4-8 °C-on végzett tárolása, 20 négy hétig +30 °C-on végzett tárolása és négy hétig +40 °C-on végzett tárolása után kaptuk. Az eredmények azt mutatják, hogy a 4,5 pH-jú G-CSF-oldatok különböző körülmények között, nyugalmi állapotban végzett tárolás alatt messzemenően stabilisnak tekinthetők.

b) Proteintisztasági mérési eredmények mechanikai terhelés után

A puffer és az oldat megfelelő pH-értékének megválasztása nyugalmi állapotban végzett tárolás alatti kémiai-fizikai stabilitás tekintetében különbözik a mechanikai terhelés utáni stabilitástól. pH=4,5-nél ez a stabilitás acetát- és foszfátpufferek esetében fennáll, de citrát/foszfát pufferkeverékek esetében nem. A kapott eredményeket az alábbi táblázat tünteti fel.

II. táblázat

	Zavarosság 6 hónapos, 4-8 °C-on végzett árolás után	Zavarosság mechanikai terhelés után az előállítást követően azonnal 4-8 °C-on 40 °C-on
1. receptúra	nincs	erős	erős	erős
2.receptúra	nincs	nincs	nincs	nincs
3.receptúra	nincs	nincs	nincs	nincs
4.receptúra	nincs	nincs	nincs	nincs

5. példa

A 3. példában leírt módon különböző pufferrendszerekkel és minden esetben 0,005% (a 2. és 3. ábrán 0,05%) Polysorbat 80-nal G-CSF-oldatokat állítottunk elő. Mindegyik vizsgált pufferrendszer esetében 2-7,5 közötti pH-értékű különböző oldatokat állítottunk elő 0,5 pH-értéklépcsők szerint (így pufferrendszerenként 13 oldatot). A fentiekben leírt módszerekkel (3. példa) az oldatok mechanikai terhelhetőségét fényszóródási mérésekkel vizsgáltuk. A következő pufferrendszereket vizsgáltuk meg (a G-CSF-tartalom és az egyéb segédanyag-tartalom ugyanaz, mint a 3. példában):

5.1 acetát, 10 mM

5.2 acetát, 20 mM

5.3 acetát, 40 mM

5.4 foszfát, 20 mM

5.5 foszfát/citrát, összesen 20 mM, 10 mM foszfáttal

5.6 laktát, 10 mM

5.7 maleát, 10 mM

5.8 citrát, 20 mM.

Az oldat pH-értékének függvényében, mechanikai terhelés után következett a szórt fény mérése. Az eredmények az 1-4. ábrákon láthatók. Ezeken mindegyik pufferrendszer esetében a pH-zavarosság-görbe

HU 219 548 Β egyedi lefutása látható. A citrát különösen a 4-6,5 pHtartományban nem alkalmas; a citrát/foszfát puffer a 4,5-6,5 pH-tartományban alkalmatlan; az acetát körülbelül 5-7 pH-tartományban, és a foszfát körülbelül 5-6,75 pH-tartományban alkalmatlan. A laktát ugyanúgy viselkedik, mint az acetát, a maleát pedig, mint a citrát/foszfát.

6. példa

0,35 mg/ml koncentrációjú, 0,5 mg/ml Tween 80-at tartalmazó G-CSF-oldatok mechanikai stabilitásának vizsgálata a pufferkoncentráció és a pH-érték függvényében

Körülbelül 5 mg/ml koncentrációjú G-CSF-oldatokat a következőkben leírt pufferoldatokkal 0,35 mg/ml hatóanyag-koncentrációra hígítottunk. Minden pufferoldat 0,05% Polysorbat 80-at tartalmazott. A pufferoldatokat úgy állítottuk elő, hogy a mindenkori bázikus sókomponenst a megadott mólkoncentrációban készítettük elő, és a pH-értéket a megfelelő savval a megadott értékre állítottuk be. Az így kapott G-CSF pufferoldatokat 10 ml-es mennyiségben az 1. hidrolitikus osztályba tartozó injekciós üvegcsékbe töltöttük le, erre alkalmas dugóval lezártuk és 10 másodpercen át egy laboratóriumi rázóberendezésben (például a Heidolph cég berendezésében) maximális intenzitással ráztuk. Körülbelül 10 perces állásidő után (egy Dr. Lángé cég gyártmányú, LTP 5 típusú szórtfény-fotométerrel) meghatároztuk (90°-os mérésszöggel) a zavarossági (TE/F) értéket egy (a Német Gyógyszerkönyv szerinti) formazinsztenderdhez képest.

Illa. táblázat

A nem rázott oldat zavarossága

	Acetát- puffcr	Foszfát- puffer	Citrát- puffer
TE/F	TE/F	TE/F
	pH=7,5	0,56	0,58	0,51
	pH=7	0,47	0,51	0,43
80 mmol	pH=5	0,55	0,47	0,48
	pH=4,5	0,36	0,47	0,46
	pH=4	0,39	0,46	0,41
	pH=3,5	0,3	0,54	0,41

	pH=7,5	0,57	0,4	0,45
	pH=7	0,51	0,37	0,39
40 mmol	pH=5	0,62	0,4	0,48
	pH=4,5	0,42	0,58	0,52
	pH=4	0,44	0,41	0,55
	pH=3,5	0,42	0,43	0,37

	pH=7,5	0,65	0,39	0,4
	pH=7	0,8	0,46	0,4
20 mmol	pH=5	0,62	0,49	0,39
	pH=4,5	0,47	0,42	0,39

	Acetát- puffer	Foszfát- puffer	Citrát- puffcr
TE/F	TE/F	TE/F
	pH=4	0,44	0,43	0,47
	pH=3,5	0,49	0,37	0,38

	pH=7,5	0,54	0,43	0,56
	pH=7	0,68	0,38	0,49
10 mmol	pH=5	0,42	0,41	0,55
	pH=4,5	0,37	0,45	0,43
	pH=4	0,35	0,36	0,44
	pH=3,5	0,4	0,43	0,42

	pH=7,5	0,83	0,57	0,35
	pH=7	0,63	0,37	0,37
5 mmol	pH=5	0,65	0,41	0,42
	pH=4,5	0,42	0,4	0,31
	pH=4	0,4	0,4	0,64
	pH=3,5	0,38	0,48	0,44

Illb. táblázat

A nem rázott oldat zavarossága

	Acetát- puffer	Foszfát- puffer	Citrát- puffer
TE/F	TE/F	TE/F
	pH=7,5	1,49	0,74	0,8
	pH=7	1,94	0,77	0,79
80 mmol	pH=5	0,73	0,75	2,8
	pH=4,5	0,42	0,68	2,1
	pH=4	0,45	0,57	0,81
	pH=3,5	0,32	0,66	0,57

	pH=7,5	1,52	0,7	0,74
	pH=7	1,24	0,58	0,57
40 mmol	pH=5	0,8	0,6	0,69
	pH=4,5	0,5	0,64	0,89
	pH=4	0,63	0,62	0,89
	pH=3,5	0,55	0,64	0,47

	pH=7,5	2,2	0,45	0,57
	pH=7	2,9	0,6	0,57
20 mmol	pH=5	0,7	0,77	0,95
	pH=4,5	0,55	0,48	0,6
	pH=4	0,56	0,5	0,74
	pH=3,5	0,43	0,4	0,55

	pH=7,5	1,22	0,59	0,75
	pH=7	1,4	0,46	0,65
10 mmol	pH=5	0,47	0,51	1,35

HU 219 548 Β

Illb. táblázat (folytatás)

	Acetát- pufifer	Foszfát- puffer	Citrát- puffer
TE/F	TE/F	TE/F
	pH=4,5	0,43	0,45	0,59
	pH=4	0,47	0,38	0,58
	pH=3,5	0,44	0,51	0,46

	pH=7,5	2	0,76	0,48
	pH=7	1,4	0,6	0,69
5 mmol	pH=5	0,47	0,51	0,69
	pH=4,5	0,43	0,44	0,44
	pH=4	0,47	0,44	0,81
	pH=3,5	0,44	0,5	0,44

Az adatokból az tűnik ki, hogy a foszfátpuffemek a vizsgált pH-tartományban, az egész 5-80 mM molaritástartományban kicsi a zavarossági értéke, és ez mechanikai terhelés alatt nő.

Az acetátpufferek 3,5-4,5 pH-tartományban mechanikus terhelés alatt is igen alacsony zavarossági értékeket mutatnak. 25

A citrátpufferek alkalmasak arra, hogy a 7-7,5 pHtartományban 5-40 mM koncentrációban stabilizáljanak.

7. példa

A 7,0-7,5 pH-tartományba eső, olyan folyadékreceptúrákat írunk le, amelyekhez izotonizáló adalékanyagok mellett részben további, az antioxidánsok és kaotrop segédanyagok csoportjába tartozó segédanyagokat adunk.

A következőkben leírt receptúrák előállítása céljából a megfelelő segédanyagokat injekciós oldatok készítésére alkalmas vízben oldottuk, az oldathoz hozzáadtuk a G-CSF-et és adott esetben a pH-értéket a megfe15 lelő pufferkomponensek hozzáadásával pontosan beállítottuk. Az oldatokat egy sterilizált, 0,2 μτη pórusméretű membránszűrőn sterilizáltuk és aszeptikus körülmények között az I hidrolitikus osztályba tartozó üvegből készült injekciós edényekbe töltöttük le, amelyeket ste20 ril, teflonozott gumidugókkal zártunk le. A letöltés nitrogénbevezetés mellett történt. Az injekciós üvegcséket sötétben, a meghatározott tárolási hőmérsékleten tároltuk a vizsgálat időpontjáig. A vizsgálat a 2. és 3. példában leírt módszerekkel történt.

IVa. táblázat

Folyékony G-CSF-készítmény; pH=7

	5.receptúra	6.receptúra	7.receptúra
G-CSF	0,35 mg	0,35 mg	0,35 mg
Poliszorbát	0,1 mg	0,1 mg	0,1 mg
Mannit	40 mg	40 mg	40 mg
Puffer	Na₂HPO₄12H₂O	Na₂HPO₄12H₂O	Na₂HPO₄12H₂O
	1,5 mg	1,5 mg	1,5 mg
Glutation	-	0,5 mg	-
Karbamid	-	-	5 mg
Injekciós oldathoz alkalmas víz	ad. 1 ml	ad. 1 ml	ad. 1 ml

IVb. táblázat

A folyékony G-CSF-receptúrák analízisadatai

	4 hetes tárolás 4 8 °C-on
I	II	III
5. receptúra	>99%	>99%	2,7%
6. receptúra	99%	99%	4,8%
7. receptúra	>99%	>99%	0,6%

1= a változatlan proteintisztasági fok RP HPLC-analízis szerint 11= a változatlan protein tisztasági fok SEC HPLC-analízis szerint 111= dimerek/aggregátumok a „Western Blot”-ban.

A IVb. táblázat analízisadatai azt mutatják, hogy pH=7-nél és a megadott foszfátpuffer-koncentrációk mellett stabilis oldatokat kapunk és a protein tisztasági foka négyhetes tárolás után messzemenően (több, mint 99%-ban) megmarad.

8. példa

Foszfátpuffert tartalmazó, találmány szerinti pH=4,5 értékű G-CSF-oldatokat állítunk elő (8. receptúra). Összehasonlítás céljából egy második, pH=6,5 értékű oldatot (9. receptúra) is előállítunk.

A gyógyszeroldatok előállítása céljából a segédanyagokat injekciós oldatok előállítására alkalmas vízben ol60 dottuk fel, majd az oldathoz hozzáadtuk a G-CSF-et.

HU 219 548 Β

Az oldatokat steril, 0,2 μιη pórusméretű membránszűrőn sterilen leszűrtük, az I hidrolitikus osztályba sorolt edényekbe töltöttük le, és ezeket teflonozott dugókkal lezártuk. Ezután az üvegeket 10 percen át laboratóriumi rázógépben (a Heidolph cég gyártmánya) kezeltük. Az oldatot a 2. és 3. példákban megadott módszerekkel vizsgáltuk.

Va. táblázat

A receptúrák összetétele

	8. receptúra	9. receptúra
G-CSF	0,350 mg	0,250 mg
Tween 80	0,1 mg	-
Tween 20	-	0,1 mg
Humán szérumalbumin	-	1 mg
Mannit	50 mg	50 mg
Foszfátpuffer	5 mM	5 mM
pH	4,5	6,5
Injekcióra alkalmas minőségű víz	ad. 1,0 ml	ad. 1,0 ml

Vb. táblázat Analitikai eredmények

	8. receptúra	9.receptúra
Mechanikai terhelés nélkül	0,8% dimer	1,1% dimer
	aggregátum nincs	aggregátum nincs
Mechanikai terhelés	1,1% dimer	2,7% dimer
	aggregátum nincs	6,9% aggregátum

A táblázatban feltüntetett adatokból látható, hogy a mechanikus terhelés által előidézett proteinaggregálódás és -dimerizálódás pH=6,5-nél nem akadályozható meg. Ezzel szemben pH=4,5-nél mechanikai terheléssel szemben stabilis oldatot kapunk akkor is, ha stabilizálószerként humán szérumalbumin van jelen.

9. példa

Hosszú időtartamú stabilitás

G-CSF injekciós oldatot állítottunk elő oly módon, hogy egy 50 mg/ml mannitot, 0,1 mg/ml Polysorbat 80at, és 0,5 mg foszforsavat tartalmazó, pH=4,5-re beállított nátrium-hidrogén-foszfátot keverés közben feloldottunk. Az előállítás és az oldat letöltése nitrogéngáz-átáramoltatás mellett történt. Az átlátszó oldatot 0,2 pm pórusméretű, sterilizált membránszűrővel sterilen szűrtük, ezt követően az I hidrolitikus osztályba sorolt oldatot üvegekbe töltöttük le, és ezeket az üvegeket erre alkalmas gumidugókkal lezártuk. A G-CSF-tartalmú gyógyszerkészítményeket +4 °C-tól +8 °C-ig terjedő, valamint +20 °C-tól 25 °C-ig terjedő hőmérsékleten 9 hónapon át tároltuk.

VI. táblázat

Hosszú időtartamú stabilitás 4-8 °C-on

	3 hónap	6 hónap	9 hónap
Biológiai aktivitás 80-125%	megfelelő
Western Biot
Aggregátum%	n.n.	n.n.	n.n.
Dimer%	<1%	<1%	<1
SDS Page
Kísérőcsúcs%	<1%	<1%	<1%
RP-HPLC
Termékcsúcs	>99%	>99%	>99%
SEC HPLC
Termékcsúcs	>98%	>98%	>98%
Kísérőcsúcsok	<1%	<1%	<1%
Zavarosság TE/F	0,7	0,7	0,7
OD280	0,359	0,362	0,357

10. példa

Körülbelül 5 mg/ml koncentrációjú G-CSF-oldatokat a következőkben leírt pufferoldatokkal 0,35 mg/ml hatóanyag-tartalomra hígítottunk. Mindegyik pufferoldat 0,05% Polysorbat 80-at tartalmazott. A pufferoldatokat úgy állítottuk elő, hogy a megadott, 5-80 mM mennyiségű arginint készítettünk elő, és azt foszforsavval vagy sósavval vagy citromsavval a pH-értékére állítottuk be. Az így nyert G-CSF pufferoldatokat az I hidrolitikus osztályba sorolt injekciós üvegekbe töltöttük, megfelelő minőségű dugóval lezártuk, és 10 másodpercen át laboratóriumi rázóberendezésben (például Heidolph gyártmányú készülékben) ráztuk. Körülbelül 10 perc állásidő után egy szórtfény-fotométerrel (mérésszög 90°) - ez a készülék a Dr. Lángé cég LTP 5 típusú szórtfény-fotométere volt - meghatároztuk a formazinsztenderddel (Német Gyógyszerkönyv) kalibrált zavarossági értéket (TE/F).

A VII. táblázat a nem rázott és a rázott oldatok zavarossági értékeit tünteti fel. A különböző moláris (5., 10., 20., 40., 80 mmol) argininpuffer-koncentrációk mindig azonos eredményre vezetnek.

Meg kell állapítanunk, hogy a 7,0-7,5 pH-értékű argininpufferek egészen különleges módon, stabilizálóan hatnak a mechanikus terheléssel szemben. Az argininpufferek különösen előnyös módon olyan oldatokban használhatók fel, amelyeket liofilizátumok feloldása útján állítunk elő.

VII. táblázat

Argininpuffert tartalmazó készítmények zavarossági értéke

Puffer	Arginin/ foszforsav	Arginin/ sósav	Arginin/ citromsav
pH=7,5	0,40	0,42	0,51
pH=7,0	0,43	0,54	0,76

HU 219 548 Β

VII. táblázat (folytatás)

Puffer	Arginin/ foszforsav	Arginin/ sósav	Arginin/ citromsav
Rázás nélkül
pH=7,5	0,49	0,62	0,53
pH=7,0	0,58	0,69	0,84
Rázással

középérték-molaritás 5-80 mM.

Claims

1. Gyógyszerészetileg hatásos mennyiségű granulocitakolóniát stimuláló faktort (G-CSF-et) tartalmazó, stabilis gyógyszerkészítmény, mely az alkalmazott G-CSF-nél kisebb mennyiségű tenzidet, valamint az ecetsav, tejsav, citromsav, maleinsav, foszforsav vagy ezek sójából vagy arginin és ennek sójából alkotott csoport legalább egyikét tartalmazza, mint pufferanyagot, mimellett a felhasználásra kész oldatban a pufferanyag koncentrációja 2-100 mM.

2. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a foszfátkoncentráció 5-80 mM, és az elkészített, alkalmazható oldat pH-ja körülbelül 3,5-5 vagy 7-8 értékre van beállítva.

3. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a citrát vagy a maleát koncentrációja 5-40 mM, és az oldat pH-értéke 2,5-3,5 vagy 7-8 értékre van beállítva.

4. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a foszfát és citrát, mint pufferanyag összkoncentrációja 5-40 mM, és az oldat pH-ja 2,5-3,5 vagy 7-8 közötti értékre van beállítva.

5. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az acetát vagy a laktát koncentrációja 5-80 mM, és az oldat pH-értéke körülbelül 3,5-5 közöttire van beállítva.

6. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az arginin-foszfát-, arginin-klorid- vagy arginin-citrát-puffer koncentrációja 5-80 mM és az oldat pH-értéke körülbelül 7-8-ra, előnyösen 7-7,5 közöttire van beállítva.

7. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az oldat maximálisan 0,5 mg/ml, előnyösen 0,01-0,1 mg/ml tenzidmennyiséget tartalmaz.

8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az oldat még szokásos gyógyszerészeti segédanyagokat vagy izotonizálószert tartalmaz.

9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az oldat polimer és proteinszerű segédanyagoktól mentes.

10. Eljárás G-CSF-tartalmú, stabilis vizes gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy a G-CSF gyógyszerészetileg hatásos mennyiségét a felhasznált G-CSF-nél kisebb mennyiségű tenziddel, és legalább egy pufferanyaggal elegyítünk az ecetsav, tejsav, citromsav, maleinsav, foszforsav vagy ezek sóiból vagy arginin vagy argininsóból alkotott csoportból és a pufferanyag mennyiségét úgy választjuk meg, hogy a pufferanyag végső koncentrációja a felhasználásra kész oldatban 2-100 mM legyen.

11. Eljárás G-CSF-et tartalmazó vizes gyógyszerkészítmény stabilizálására, azzal jellemezve, hogy a zavarosodás meggátlására a felhasználásra kész oldathoz stabilizálószerként egy, az alkalmazott G-CSF mennyiségénél kisebb mennyiségű tenzidmennyiségen kívül legalább egy pufferanyagot alkalmazunk az ecetsav, tejsav, citromsav, maleinsav, foszforsav vagy ilyen savak sójából vagy arginin vagy ennek sójából alkotott csoportból, 2-100 mM végső koncentrációban.

12. Ecetsav, tejsav, citromsav, maleinsav, foszforsav vagy ezek sójának vagy argininnek és ennek sójának felhasználása pufferanyagként vizes G-CSF-tartalmú gyógyszerkészítmények zavarosodásának meggátlására, mimellett a felhasználásra kész oldatban a pufferanyagok végső koncentrációja 2-100 mM értékű, és a pufferanyagokat a G-CSF-mennyiségnél kisebb mennyiségű tenzidmennyiséggel együtt alkalmazzuk.

13. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy liofilizátum vagy por.

14. Az 1 -9. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, a 13. igénypont szerinti liofilizátumok vagy porok vízben vagy vizes oldatban való feloldásával előállítva.