TWI480288B - 牛顆粒細胞群落刺激因子及其變體之調配物 - Google Patents

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Description

牛顆粒細胞群落刺激因子及其變體之調配物
顆粒細胞群落刺激因子(G-CSF)係生長激素超基因家族中之一成員。G-CSF刺激特定骨髓前體細胞增殖及分化成顆粒細胞。此外，G-CSF係活體內嗜中性白血球增殖及成熟之有效刺激物(Cohen等，Proc. Natl. Acad. Sci. 1987;84: 2484-2488；亦參見Heidari等，Vet. Immol. Imunopathol. 2001;81:45-47)。G-CSF亦可誘導成熟嗜中性白血球在活體外之功能活化或「促發(priming)」(Weisbart,R. H.等，Annals of Internal Medicine 1989;110:297-303)。已知G-CSF促發人類顆粒細胞及藉由趨化肽N-甲醯基-甲硫胺醯基-亮胺醯基-苯丙胺酸之刺激增強釋放超氧化物(S. Kitagawa等，Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987;144:1143-1146及C. F. Nathan,Blood 1989;74:301-306)及活化由人類嗜中性白血球IgA調節之胞噬作用(Weisbart,R.H.等，Nature 1988;332:647-649)。
已發現G-CSF可用於治療可因增加嗜中性白血球而受益之適應症。G-CSF亦可單獨或與其他化合物(如，其他細胞激素)組合用於培養基中之細胞生長或擴增，例如，用於骨髓移植。
已描述重組人類G-CSF(hG-CSF)之cDNA選殖及表現，及該重組hG-CSF展現大部份(但非全部)天然分子之生物性質(Souza. L.等，Science 232,61-65(1986))。cDNA及基因組DNA純系之序列分析已可推衍出胺基酸序列，並顯示該蛋白質係204個胺基酸之長度，其中30個胺基酸係信號序列。成熟蛋白質係174個胺基酸之長度且不具有潛在N-連接糖基化位點，但具有用於O-連接糖基化之數個可能位點。
含有hG-CSF之醫藥製劑已為本技藝知曉且包括多種調配物。例如，hG-CSF之各種調配物描述於Piedmonte等,Advanced Drug Delivery Reviews,60:50-58(2008)；Herman等,in Formulation,Characterization,and Stability of Protein Drugs,Rodney Pearlman and Y: John Wang編輯，Plenum Press,New York(1996)；Michaelis等之美國專利案5,919,757及Sato等之美國專利案6,908,610中。傳統上，表面活性劑係包含於hG-CSF調配物中且可在可能失去穩定性之介面處保護hG-CSF，防止其在加工期間發生表面分離及防止其改變構形穩定性。
已描述重組牛G-CSF(bG-CSF)之cDNA選殖及表現。例如，成熟bG-CSF之聚核苷酸及多肽序列揭示於美國專利案5,849,883中，該案亦描述選殖、單離及純化多肽及其等類似物之方法。成熟bG-CSF係長度174個胺基酸且與hG-CSF具有82%同源性。如上述Heidari等之文獻描述bG-CSF之表現、純化及生物活性。
將bG-CSF投與至牛可提供治療益處。因此，含有bG-CSF之醫藥調配物適宜利用其治療潛能。然而，根據相關技藝已知之傳統方法發展之bG-CSF醫藥調配物會產生不適宜之產物性質，如：使bG-CSF多肽及/或調配物聚集及失去穩定性。
因此，需要一種具有適宜性質(如：盡可能降低之產物聚集性及去穩定性)之穩定bG-CSF醫藥調配物。因此，本發明提供展現所需性質且亦提供相關優點之含有bG-CSF多肽或其等變體之穩定水性醫藥調配物。
本發明提供包含bG-CSF多肽或其變體、緩衝物質及賦形劑之穩定水性調配物，其中該調配物實質上不含聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單月桂酸酯。本發明亦提供使用該調配物之凍乾或粉末形式之方法及製備該調配物之方法。
根據本發明牛顆粒細胞群落刺激因子(bG-CSF)之穩定水性調配物含有bG-CSF多肽或其變體。如本文所使用，「牛G-CSF多肽」(或稱為「bG-CSF多肽」、「牛G-CSF」或「bG-CSF」)及其變體應包括彼等具有CSF、bG-CSF類似物、bG-CSF突變體、改變之糖基化bG-CSF、PEG共軛bG-CSF、bG-CSF同功異型物、bG-CSF擬似物、bG-CSF片段、雜合bG-CSF蛋白質、融合蛋白質、寡聚物及多聚體、同系物、糖基化模式變體、變體、剪接變體及其等蛋白變體中之至少一種生物活性之彼等多肽及蛋白質，而不論該生物活性是否相同及不論其等合成或製造方法，該等方法包括(但不限制於)在活體外、活體內，藉由核酸分子之微注射法、合成、轉基因及基因活化方法進行之重組法(由cDNA、基因組DNA、合成DNA或核酸之其他形式製造)。此外，術語bG-CSF多肽或其變體涵蓋包含一或多個胺基酸取代、添加或切除之bG-CSF多肽。參見美國專利案5,849,883中關於牛G-CSF類似物之實例。成熟bG-CSF多肽之序列係174個胺基酸長度，如下：TPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLCAAHKLCHPEELMLLRHSLGIPQAPLSSCSSQSLQLTSCLNQLHGGLFLYQGLLQALAGISPELAPTLDTLQLDVTDFATNIWLQMEDLGAAPAVQPTQGAMPTFTSAFQRRAGGVLVASQLHRFLELAYRGLRYLAEP
此外，具有起始甲硫胺酸胺基酸殘基之bG-CSF多肽係如下：MTPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLCAAHKLCHPEELMLLRHSLGIPQAPLSSCSSQSLQLTSCLNQLHGGLFLYQGLLQALAGISPELAPTLDTLQLDVTDFATNIWLQMEDLGAAPAVQPTQGAMPTFTSAFQRRAGGVLVASQLHRFLELAYRGLRYLAEP
已描述在bG-CSF中之各種不同胺基酸位置進行之取代法。取代法包括(但不限制於)調節醫藥穩定性、增加激動劑活性、增加蛋白酶抗性、將多肽轉變成拮抗劑等之彼等物，其等均涵蓋於術語bG-CSF多肽或其變體中。
術語bG-CSF多肽或其變體亦包括糖基化bG-CSF，如(但不限制於)在任何胺基酸位置經糖基化之多肽、多肽之N-連接糖基化形式或多肽之O-連接糖基化形式。含有單個核苷酸變化之變體亦視為bG-CSF多肽之生物活性變體。含有單個核苷酸變化之變體亦視為bG-CSF之生物活性變體。此外，亦包括剪接變體。術語bG-CSF多肽或其變體亦包括任何一個或多個bG-CSF的bG-CSF雜二聚體、均二聚體、雜多聚體或均多聚體或任何其他多肽、蛋白質、碳水化合物、聚合物、小分子、連接子、配體或藉由化學方式連接或表現為融合蛋白質之任何類型之其他活性分子(參見，例如，美國專利案6,261,550、6,166,183、6,204,247、6,261,550及6,017,876)，以及含有(例如)特定切除或其他修改但仍保留生物活性之多肽類似物(參見，例如，美國專利案6,261,550、6,004,548及6,632,426)。bG-CSF多肽及其變體描述於(例如)美國專利申請案12/507,237中(現在稱為美國專利申請公開案2010/0035812)，該案係以引用之方式併入本文。於一些實施例中，將一或多種非天然編碼胺基酸併合至bG-CSF中以下一或多處位置中：8、62、69、125、133、136及其等任何組合(成熟bG-CSF多肽或在具有起始甲硫胺酸胺基酸殘基之bG-CSF多肽中之對應胺基酸)。於一些實施例中，由非天然編碼胺基酸對乙醯基苯丙胺酸(pAF)取代以下一個位置之天然編碼胺基酸：S8、S62、L69、G125、T133、A136及其等任何組合(成熟bG-CSF多肽或在具有起始甲硫胺酸胺基酸殘基之bG-CSF多肽中之對應胺基酸)。
於一實施例中，bG-CSF多肽或其變體係具有以下序列之bG-CSF-S8pAF：MTPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLCAAHKLCHPEELMLLRHSLGIPQAPLSSCSSQSLQLTSCLNQLHGGLFLYQGLLQALAGISPELAPTLDTLQLDVTDFATNIWLQMEDLGAAPAVQPTQGAMPTFTSAFQRRAGGVLVASQLHRFLELAYRGLRYLAEP
其中在位置S8處進行單一對乙醯基苯丙胺酸(pAF)取代。
於一實施例中，bG-CSF多肽或其變體係具有以下序列之bG-CSF-S62pAF：MTPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLCAAHKLCHPEELMLLRHSLGIPQAPLSSCSSQSLQLTSCLNQLHGGLFLYQGLLQALAGISPELAPTLDTLQLDVTDFATNIWLQMEDLGAAPAVQPTQGAMPTFTSAFQRRAGGVLVASQLHRFLELAYRGLRYLAEP
其中在位置S62處進行單一對乙醯基苯丙胺酸(pAF)取代。
於一實施例中，bG-CSF多肽或其變體係具有以下序列之bG-CSF-L69pAF：MTPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLCAAHKLCHPEELMLLRHSLGIPQAPLSSCSSQSLQLTSCLNQLHGGLFLYQGLLQALAGISPELAPTLDTLQLDVTDFATNIWLQMEDLGAAPAVQPTQGAMPTFTSAFQRRAGGVLVASQLHRFLELAYRGLRYLAEP
其中在位置L69處進行單一對乙醯基苯丙胺酸(pAF)取代。
於一實施例中，bG-CSF多肽或其變體係具有以下序列之bG-CSF-G125pAF：MTPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLCAAHKLCHPEELMLLRHSLGIPQAPLSSCSSQSLQLTSCLNQLHGGLFLYQGLLQALAGISPELAPTLDTLQLDVTDFATNIWLQMEDLGAAPAVQPTQGAMPTFTSAFQRRAGGVLVASQLHRFLELAYRGLRYLAEP
其中在位置G125處進行單一對乙醯基苯丙胺酸(pAF)取代。
於一實施例中，bG-CSF多肽或其變體係具有以下序列之bG-CSF-T133pAF：MTPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLCAAHKLCHPEELMLLRHSLGIPQAPLSSCSSQSLQLTSCLNQLHGGLFLYQGLLQALAGISPELAPTLDTLQLDVTDFATNIWLQMEDLGAAPAVQPTQGAMPTFTSAFQRRAGGVLVASQLHRFLELAYRGLRYLAEP
其中，在位置T133處進行單一對乙醯基苯丙胺酸(pAF)取代。
於一實施例中，bG-CSF多肽或其變體係具有以下序列之bG-CSF-A136pAF：MTPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLCAAHKLCHPEELMLLRHSLGIPQAPLSSCSSQSLQLTSCLNQLHGGLFLYQGLLQALAGISPELAPTLDTLQLDVTDFATNIWLQMEDLGAAPAYQPTQGAMPTFTSAFQRRAGGVLVASQLHRFLELAYRGLRYLAEP
其中，在位置A136處進行單一對乙醯基苯丙胺酸(pAF)取代。
本發明之調配物可包括連接至連接子、聚合物或生物活性分子之bG-CSF多肽或其變體。該連接子、聚合物及生物活性分子描述於美國專利申請案12/507,237(現時之美國專利申請公開案2010/0035812)中。「鏈」或「連接子」於本文中係用於表示一般因化學反應而形成且一般係共價鏈之基團或鍵。對水解作用穩定之鏈意指在水中實質上穩定且在適用之pH值下(包括，但不限制於在生理條件下)於延長之時間(可能甚至無限期長時間)內不與水反應之鏈。對水解作用不穩定或可降解之鏈意指在水或水溶液，包括例如，血液中可降解之鏈。對酶不穩定或可降解之鏈意指可被一或多種酶降解之鏈。如相關技藝所理解，PEG及相關聚合物可包括在聚合物主鏈中或聚合物主鏈與聚合物分子之一或多個末端官能基之間之連接基團中之可降解鏈。例如，藉由PEG羧酸或活化PEG羧酸與生物活性劑上之醇基反應所形成之酯鏈一般會在生理條件下水解，釋放該活性物質。其他可經水解作用降解之鏈包括，但不限制於，碳酸鏈；由胺與醛反應產生之亞胺鏈；由醇與磷酸基反應形成之磷酸酯鏈；作為醯肼與醛之反應產物之腙鏈；作為醛與醇之反應產物之縮醛鏈；作為甲酸根與醇之反應產物之原酸酯鏈；藉由胺基(包括，但不限制於，在諸如PEG之聚合物之末端處之胺基)與肽之羧基形成之肽鏈；及藉由胺基磷酸基(包括但不限制於在聚合物末端之胺基磷酸基)與寡核苷酸之5'羥基形成之寡核苷酸鏈。
於一些實施例中，bG-CSF多肽或其變體連接至水溶性聚合物。如本文所使用，術語「水溶性聚合物」係指可溶於水性溶劑中之任何聚合物。水溶性聚合物與bG-CSF多肽或其變體之鍵聯可導致變化，包括(但不限於)延長或調節血清半衰期、相對於未經修飾形式延長或調節治療半衰期、調節免疫原性、調節物理締合特性(如聚集及多聚體形成)、改變受體結合、改變對一或多種結合配偶體之結合、及改變受體之二聚化或多聚化。該水溶性聚合物可能有或可能沒有本身之生物活性，及可用作連接子，將bG-CSF連接至其他物質，包括(但不限於)一或多種bG-CSF多肽或其變體，或一或多種生物活性分子。適宜聚合物包括(但不限於)聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、其單C1至C10烷氧基或芳氧基衍生物(描述於美國專利案5,252,714中)、單甲氧基-聚乙二醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚乙烯醇、聚胺基酸、二乙烯醚馬來酸酐、N-(2-羥丙基)-甲基丙烯醯胺、葡聚糖、葡聚糖衍生物(包括硫酸葡聚糖)、聚丙二醇、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇、肝素、肝素片段、多醣、寡醣、聚醣、纖維素及纖維素衍生物(包括，但不限於，甲基纖維素及羧甲基纖維素)、澱粉及澱粉衍生物、多肽、聚烷二醇(polyalkylene glycol)及其衍生物、聚烷二醇及其衍生物之共聚物、聚乙烯乙基醚及α-p-聚[(2-羥乙基)-DL-天冬醯胺，及類似者，或其混合物。此等水溶性聚合物之實例包括(但不限於)聚乙二醇及血清白蛋白。WO 03/074087及WO 03/074088描述蛋白質或小分子與羥烷基澱粉(HAS)之共軛結合。羥烷基澱粉之實例包括(但不限於)羥乙基澱粉。羥烷基澱粉與另一分子之共軛物例如可包含HAS之醛基與另一分子之反應性基團之間之共價鍵聯。
於一些實施例中，該水溶性聚合物係聚(乙二醇)部分。於一些實施例中，聚(乙二醇)部分具有約0.1 kDa至約100 kDa之間之分子量。於另一實施例中，該水溶性聚合物具有約0.1 kDa至約50 kDa之間之分子量。於一些實施例中，該水溶性聚合物具有約10 kDa至約30 kDa之間之分子量。於另一實施例中，該水溶性聚合物具有約15 kDa至約25 kDa之間之分子量。於又一實施例中，該水溶性聚合物具有約20 kDa之分子量。熟習本項技術者將理解，基於該部分之特異性及多分散性計，具有「約20 kDa」分子量之水溶性聚合物包括約15%(即，約17 kDa至約23 kDa)之分子量變異性。
於一實施例中，該bG-CSF多肽或其變體係具有以下序列之bG-CSF-S8pAF：MTPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLCAAHKLCHPEELMLLRHSLGIPQAPLSSCSSQSLQLTSCLNQLHGGLFLYQGLLQALAGISPELAPTLDTLQLDVTDFATNIWLQMEDLGAAPAVQPTQGAMPTFTSAFQRRAGGVLVASQLHRFLELAYRGLRYLAEP
其中，在位置S8處進行單一對乙醯基苯丙胺酸(pAF)取代且該取代基係連接至聚(乙二醇)部分。例如，若聚(乙二醇)部分具有約20 kDa之分子量，則此實施例中之bG-CSF多肽或其變體可標識為「bG-CSF-S8pAF-20K PEG」，其表示由20 kDa聚(乙二醇)部分連接至處於位置S8之pAF取代基。
於一實施例中，bG-CSF多肽或其變體係具有以下序列之bG-CSF-S62pAF：MTPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLCAAHKLCHPEELMLLRHSLGIPQAPLSSCSSQSLQLTSCLNQLHGGLFLYQGLLQALAGISPELAPTLDTLQLDVTDFATNIWLQMEDLGAAPAVQPTQGAMPTFTSAFQRRAGGVLVASQLHRFLELAYRGLRYLAEP
其中在位置S62處進行單一對乙醯基苯丙胺酸(pAF)取代，且該取代基係連接至聚(乙二醇)部分。例如，若該聚(乙二醇)部分具有約20 kDa之分子量，則此實施例中之bG-CSF多肽或其變體可標識為「bG-CSF-S62pAF-20K PEG」，表示20 kDa聚(乙二醇)部分連接至處於位置S62之pAF取代基。
於一實施例中，bG-CSF多肽或其變體係具有以下序列之bG-CSF-L69pAF：MTPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLCAAHKLCHPEELMLLRHSLGIPQAPLSSCSSQSLQLTSCLNQLHGGLFLYQGLLQALAGISPELAPTLDTLQLDVTDFATNIWLQMEDLGAAPAVQPTQGAMPTFTSAFQRRAGGVLVASQLHRFLELAYRGLRYLAEP
其中在位置L69處進行單一對乙醯基苯丙胺酸(pAF)取代，且該取代基係連接至聚(乙二醇)部分。例如，若該聚(乙二醇)部分具有約20 kDa之分子量，則此實施例中之bG-CSF多肽或其變體可標識為「bG-CSF-L69pAF-20K PEG」，表示20 kDa聚(乙二醇)部分連接至處於位置L69之pAF取代基。
於一實施例中，bG-CSF多肽或其變體係具有以下序列之bG-CSF-G125pAF：MTPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLCAAHKLCHPEELMLLRHSLGIPQAPLSSCSSQSLQLTSCLNQLHGGLFLYQGLLQALAGISPELAPTLDTLQLDVTDFATNIWLQMEDLGAAPAVQPTQGAMPTFTSAFQRRAGGVLVASQLHRFLELAYRGLRYLAEP
其中，在位置G125處進行單一對乙醯基苯丙胺酸(pAF)取代且該取代基係連接至聚(乙二醇)部分。例如，若該聚(乙二醇)部分具有約20 kDa之分子量，則此實施例中之bG-CSF多肽或其變體可標識為「bG-CSF-G125pAF-20K PEG」，表示20 kDa聚(乙二醇)部分連接至處於位置G125之pAF取代基。
於一實施例中，bG-CSF多肽或其變體係具有以下序列之bG-CSF-T133pAF：MTPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLCAAHKLCHPEELMLLRHSLGIPQAPLSSCSSQSLQLTSCLNQLHGGLFLYQGLLQALAGISPELAPTLDTLQLDVTDFATNIWLQMEDLGAAPAVQPTQGAMPTFTSAFQRRAGGVLVASQLHRFLELAYRGLRYLAEP
其中在位置T133處進行單一對乙醯基苯丙胺酸(pAF)取代，且該取代基係連接至聚(乙二醇)部分。例如，若該聚(乙二醇)部分具有約20 kDa之分子量，則此實施例中之bG-CSF多肽或變體可標識為「bG-CSF-T133pAF-20K PEG」，表示20 kDa聚(乙二醇)部分連接至處於位置T133之pAF取代基。
於一實施例中，bG-CSF多肽或其變體係具有以下序列之bG-CSF-A136pAF：MTPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLCAAHKLCHPEELMLLRHSLGIPQAPLSSCSSQSLQLTSCLNQLHGGLFLYQGLLQALAGISPELAPTLDTLQLDVTDFATNIWLQMEDLGAAPAVQPTQGAMPTFTSAFQRRAGGVLVASQLHRFLELAYRGLRYLAEP
其中在位置A136處進行單一對-乙醯基苯丙胺酸(pAF)取代，且該取代基係連接至聚(乙二醇)部分。例如，若該聚(乙二醇)部分具有約20 kDa之分子量，則此實施例中之bG-CSF多肽或變體可標識為「bG-CSF-A136pAF-20K PEG」，表示20 kDa聚(乙二醇)部分連接至處於位置A136之pAF取代基。
如本文所使用，在包含bG-CSF多肽或其變體之調配物用語中之術語「穩定性」或「穩定」係指bG-CSF多肽或其變體在指定之製造、製備、運輸及儲存條件下發生熱及化學伸展、聚集、降解、變性、片段化或去穩定化程度。本發明之「穩定」調配物在指定製造、製備、運輸及儲存條件下維持結構完整性，進而保持宜大於80%、85%、90%、95%、98%、99%或99.5%之生物活性。調配物之穩定性可藉由熟習本項技術者已知且在本文中進一步論述之方法獲得之聚集、去聚乙二醇化、降解、變性或片段化程度來評估。
如本文所使用，在包含bG-CSF多肽或其變體之調配物用語中之術語「水性」係指水、一或多種水溶性有機溶劑或其混合物。術語「有機溶劑」於本文中以其習知概念用於表示液態有機化合物，一般而言，呈液體(較佳係相當無黏性之液體)形式之單體有機材料，其分子結構含有氫原子、碳原子及視需要包含之其他原子，且可溶解固體、氣體或液體。
本發明之醫藥調配物可包含醫藥可接受載劑。醫藥可接受載劑一部份係由所投與之特定組合物，及用於投與該組合物之特定方法所決定(參見，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,17th 版(1985))。適宜醫藥可接受載劑包括，但不限制於，緩衝物質及賦形劑，如含有鹽水、緩衝鹽水、右旋糖、水、甘油、乙醇及/或其組合之彼等物質。適宜載劑可係含有琥珀酸鹽、磷酸鹽、硼酸鹽、HEPES、檸檬酸鹽、組胺酸、咪唑、乙酸鹽、碳酸氫鹽及其他有機酸之緩衝物質。適宜載劑可為含有如下物質之賦形劑：多元糖醇、諸如精胺酸、賴胺酸、甘胺酸、穀胺醯胺、天冬胺酸、組胺酸、丙胺酸、鳥胺酸、亮胺酸、苯丙胺酸、穀胺酸、蘇胺酸等之胺基酸；有機糖類或糖醇類，如：乳糖、海藻糖、萊豆糖、甘露糖醇、山梨醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油及類似者，包括諸如肌醇之環多醇；聚乙二醇；胺基酸聚合物；含硫還原劑，如：尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巰基乙醇酸鈉、硫甘油、α-單硫甘油及硫代硫酸鈉；低分子量多肽(即，<10個殘基)；諸如人類血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白之蛋白質；諸如聚乙烯吡咯啶酮之親水性聚合物；單糖，如：木糖、甘露糖、果糖及葡萄糖；雙醣，如：乳糖、麥芽糖及蔗糖；三醣，如：棉子糖及諸如葡聚糖之多醣。
根據本發明可將檸檬酸鹽、組胺酸、馬來酸鹽、琥珀酸鹽、磷酸鹽或其組合用作緩衝物質。於一些實施例中，將檸檬酸鹽或琥珀酸鹽用作穩定之水性調配物中之緩衝物質。於一些實施例中，該緩衝物質具有約10 mM至約50 mM之間之莫耳濃度。於一實施例中，該緩衝物質具有約30 mM之莫耳濃度。該等緩衝物質可呈相應之游離酸或鹼、鹼土金屬或銨之鹽形式存在。調配物可另含有其他常見醫藥輔助物質。於製造液體醫藥調配物期間，各種輔助物質或活性物質之添加順序對根據本發明所發現之儲存穩定化作用沒有太大影響，且可由熟習本項技術者決定。
可將氯化鈉、海藻糖、山梨醇、精胺酸或其組合用作本發明之賦形劑。於一實施例中，該賦形劑係精胺酸。於一些實施例中，精胺酸具有約100 mM至約500 mM之莫耳濃度。於其他實施例中，精胺酸具有約200至約300 mM之莫耳濃度。於一些實施例中，精胺酸具有約250 mM之莫耳濃度。
傳統上，蛋白質之醫藥調配物包括表面活性劑。包括表面活性劑可在可能去穩定之介面保護蛋白質，以防處理期間相遇之表面，及避免其熱動力學構形穩定性改變。表面活性劑係本技藝所熟知，例如聚山梨醇酯表面活性劑。聚山梨醇酯表面活性劑之一個實例係聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單月桂酸酯，亦已知商標名Tween 20。然而，含有痕量聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單月桂酸酯之bG-CSF調配物之研究顯示，在25℃培育5天後，聚集物增加至3.2%(由尺寸排除層析法(SEC)測量)。因此，本發明之調配物實質上不含表面活性劑、聚山梨醇酯表面活性劑及/或聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單月桂酸酯。如本文所使用，術語「實質上不含」表面活性劑、聚山梨醇酯表面活性劑及/或聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單月桂酸酯係指調配物含有小於0.033%、小於0.001%、小於0.0005%、小於0.0003%或小於0.0001%表面活性劑、聚山梨醇酯表面活性劑及/或聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單月桂酸酯。本發明之調配物實質上不含表面活性劑、聚山梨醇酯表面活性劑及/或聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單月桂酸酯，以獲得具有所需性質，如最少之產物聚集及最低之去穩定化及(若適宜)降低之去聚乙二醇化之穩定調配物。
本文所使用之術語「生物活性分子」意指可影響生物體(包括，但不限於，病毒、細菌、噬菌體、轉位子、普里昂(prion)、昆蟲、真菌、植物、動物及人類)相關之生物系統、路徑、分子或相互作用之任何物理或生物化學性質之任何物質。特別地，如本文所使用，生物活性分子包括(但不限於)任何可用於診斷、治癒、減輕、治療或預防人類或其他動物之疾病或其他用於增強人類或動物之物理或精神狀況的物質。生物活性分子之實例包括(但不限於)肽、蛋白質、酶、小分子藥物、疫苗、免疫原、硬藥、軟藥、碳水化合物、無機原子或分子、染料、脂質、核苷酸、放射性核種、寡核苷酸、類毒素、毒素、原核細胞及真核細胞、病毒、多醣、核酸，及自病毒、細菌、昆蟲、動物或任何其他細胞或細胞類型獲得或衍生之部分，脂質體、微粒與微胞。
本發明之醫藥調配物包括彼等除bG-CSF多肽或其變體外，亦視需要含有一或多種其他活性成份之調配物。如本文所使用，術語「活性成份」或「治療成份」係指治療活性化合物，及其任何前藥及該化合物及前藥之醫藥可接受鹽、水合物及溶劑化物。其他活性成份可與bG-CSF多肽或其變體組合，且可分開投與或存在於同一醫藥調配物中投與。其他活性成份之指定量可藉由熟習本項技術者基於bG-CSF療法輕易確定。
本發明之醫藥調配物包括彼等除bG-CSF多肽或其變體外亦視需要含有一或多種其他非活性成份之調配物。如本文所使用，術語「非活性成份」係指無治療活性化合物，及其任何前藥及該化合物及前藥之醫藥可接受鹽、水合物及溶劑化物。其他非活性成份可與bG-CSF多肽或其變體組合，且可分開投與或製成同一醫藥調配物中。其他非活性成份之指定量可藉由熟習本項技術者基於bG-CSF療法輕易確定。
穩定之水性調配物中之bG-CSF多肽或其變體含量應足以獲得治療作用。如本文所使用，「治療有效量」係指可對動物提供所需效益時之用量，且包括治療性及預防性投與。該用量將因個體而不同，且係視許多因素而定，包括病患之整體身體狀況及待治療病況之基本起因。用於治療之bG-CSF多肽或其變體之用量可提供可接受之變化速率且使所需反應維持於有效益程度下。本發明組合物之治療有效量可由一般技術者利用可公開取得之材料及製程輕易確定。例如，調配物中之bG-CSF多肽或其變體含量可為約0.5至約12克/升，較佳約5克/升。
根據本發明，可於各種pH值下調配bG-CSF多肽或其變體之穩定水性調配物。於一些實施例中，該穩定水性調配物可具有約5.7至約6.6之間之pH值。於一實施例中，該穩定水性調配物具有約6.0至約6.3之間之pH。調配物之所需pH值可藉由添加諸如鹼金屬氫氧化物、鹼土金屬氫氧化物或氫氧化銨調整。較佳係使用氫氧化鈉調整pH。原則上可藉由添加鹼性溶液來調整所需pH值。一般而言，可使用強鹼與弱酸之鹽類，如：乙酸鈉、檸檬酸鈉、磷酸氫二鈉或二鉀或碳酸鈉。若輔助物質之醫藥溶液具有鹼性pH值，則其可利用酸滴定調整至達到4至5或7至8之所需pH範圍。生理上可耐受之無機或有機酸可包括諸如(例如)氫氯酸、磷酸、乙酸、檸檬酸之酸類或具有酸性pH值之物質的習知溶液。就此而言，一些實例物質為強酸與弱鹼之鹽類，如，例如，磷酸二氫鈉或磷酸二氫鉀。
如以下實例所證實，本發明之bG-CSF調配物在應力(stressed)儲存條件及加速儲存條件下展現所需低度之bG-CSF多肽或其變體聚集物濃度。如本文所使用，應力儲存條件係於調配物樣品在25℃下培育5天後進行評估。如本文所使用，加速儲存條件係於調配物樣品在40℃下培育1天後進行評估。儲存條件亦可針對本發明之目的，在其他各種溫度及持續時間下評估。例如，儲存條件可於調配物樣品在25℃下培育28天後或於調配物樣品在40℃下培育3天後評估。
bG-CSF多肽或其變體之聚集物濃度係於應力儲存條件及加速儲存條件之後分析。於一些實施例中，本發明之bG-CSF調配物在應力儲存條件下具有小於約2.1%(重量/重量百分比)之bG-CSF多肽或其變體聚集物濃度。於其他實施例中，本發明之bG-CSF調配物在應力儲存條件下具有小於約1.5%(重量/重量百分比)之bG-CSF多肽或其變體聚集物濃度。於一些實施例中，本發明之bG-CSF調配物在加速儲存條件下具有小於約1.5%(重量/重量百分比)之bG-CSF多肽或其變體聚集物濃度。
此外，可採用強制攪拌試驗法或凍融試驗法評估本發明調配物之穩定性質。例如，強制攪拌試驗法可包括：在玻璃燒杯中利用磁力攪拌器，在設定速度(如，60rpm)下混合調配物樣品。可持續攪拌一段指定時間，如：兩小時，以確定調配物樣品之特性。凍融循環可包括：樣品於約-75℃下冷凍1小時後，在室溫下於解凍約1小時，直至沒有觀察到冰為止。
此外，如以下實例所證實，本發明之bG-CSF調配物可在應力儲存條件及加速儲存條件下展現所需之bG-CSF多肽或其變體之去穩定化及/或去聚乙二醇化性質。如本文所使用，術語「去聚乙二醇化」可指鍵結至bG-CSF多肽或其變體之聚乙二醇化部分之結合穩定性，亦即此等聚乙二醇化部分是否可隨時間(例如，呈水溶液方式儲存期間)仍維持與多肽之鍵結，或其等是否會(例如)因酯鍵水解而趨於解離。
於一些實施例中，bG-CSF多肽或其變體之穩定水性調配物可藉由將檸檬酸鹽用作緩衝物質及將精胺酸用作賦形劑來調配。於一實施例中，該水性調配物可藉由將檸檬酸單水合物(Fisher，C/6200/60或等效物)用作緩衝物質及將L-精胺酸(Sigma，A8094或等效物)用作賦形劑來製備。該水性調配物可藉由添加1.6±0.1克檸檬酸單水合物及10.9±0.1克L-精胺酸至200 ml高品質水中來製備。此後，利用氫氯酸將pH調整至6.0±0.1，及可利用高品質水將混合物稀釋至250 mL。所得之調配物可包含30 mM檸檬酸鹽、250 mM精胺酸及在6.0之pH下之bG-CSF多肽或其變體。
本發明之水性製劑可藉由習知凍乾法製成凍乾物或粉末。本發明之製劑係藉由將凍乾物溶於水或其他水溶液中再製得。術語「凍乾」(亦稱為冷凍乾燥)係用於自所關注之蛋白質製劑中移除水之常用蛋白質製造技術。凍乾法係先將待乾燥之材料冷凍，隨後在真空環境中藉由昇華作用移除冰或冷凍溶劑之製程。賦形劑可包含於預凍乾調配物中，以增強在冷凍乾燥製程期間之穩定性及/或改良凍乾物在儲存時之穩定性。例如，參見Pikal,M. Biopharm. 3(9)26-30(1990)及Arakawa等，Pharm. Res. 8(3):285-291(1991)。
醫藥成份之噴霧乾燥法亦係熟悉相關技藝之技術者已知。例如，參見Borodhead,J.等人，於Drug Dev. Ind. Pharm,18(11&12),1169-1206(1992)中之「The Spray Drying of Pharmaceuticals」。除了小分子醫藥物質外，亦由各種不同生物材料進行噴霧乾燥，包括：酶、血清、血漿、微生物及酵母。噴霧乾燥法係一種適用技術，因為可採用單一步驟製程將液體醫藥製劑轉化為細小、無塵或聚集粉末。基本技術包含以下四個步驟：a)將進料溶液霧化成噴霧；b)噴霧-空氣接觸；c)乾燥該噴霧；及d)自乾燥用空氣中分離出乾燥產物。例如，美國專利案6,235,710及6,001,800描述藉由噴霧乾燥法製備重組之促紅細胞生成素。
本發明亦涵蓋使用含有bG-CSF多肽或其變體之調配物之方法。bG-CSF具有各種不同的生物活性，包括，但不限制於，與其受體結合、導致其受體二聚化、刺激嗜中性白血球產生、及刺激細胞增殖及分化。顆粒細胞群落刺激因子及bG-CSF之生物活性的一些實例係描述於上文中及美國專利案6,676,947、6,579,525、6,531,121、6,521,245、6,489,293、6,368,854、6,316,254、6,268,336、6,239,109、6,165,283、5,986,047、5,830,851、5,043,156及5,773,569中。含有本發明bG-CSF多肽或其變體之調配物可用於治療或預防很大範圍之疾病。「預防」係指降低接受者遭受或罹患本文中所述病變病況中任一者之可能性，且包括預防性投藥。術語「預防」尤其可應用於易患特定病變病況之病患。「治療」係指醫治疾病或病況並防止、逆轉該疾病之臨床作用，或減緩其進一步惡化或改善與該疾病或病況相關之症狀。
投與G-CSF產物可導致白血球細胞形成。因此，投與含有本發明bG-CSF多肽或其變體之調配物可用於防止存在受感染風險之動物受到感染。可將含有本發明bG-CSF多肽或其變體之調配物投與至罹患感染之動物。可藉由含有本發明bG-CSF多肽或其變體之調配物治療之感染包括，但不限制於，乳腺炎及運輸熱。可在(例如)分娩前之兩周至1天之間將含有本發明bG-CSF多肽或其變體之調配物投與動物，及可在分娩當天或在分娩後再次投與長達一週。於一些實施例中，接受投與含有本發明bG-CSF多肽或其變體之調配物的動物係牛，且分娩係指「產仔」。於一實施例中，可將含有本發明bG-CSF多肽或其變體之調配物投與圍產期的牛，用於預防乳腺炎。
根據本發明可藉由適用於蛋白質或肽之任何習知路徑投與含有本發明bG-CSF多肽或其變體之調配物，包括(但不限制於)：非經腸式，例如，注射法，包括但不限制於，經皮下或經靜脈內注射，或任何其他方式之注射或輸注。可藉由多種路徑投與含有bG-CSF多肽或其變體之調配物，包括，但不限制於，經口、經靜脈內、經腹膜內、經肌肉內、經皮、經皮下、局部、經舌下、經血管內、經乳房內或經直腸之方式。亦可經由脂質體投與含有bG-CSF多肽或其變體之調配物。此等投與路徑及適宜調配物基本上係為熟習本項技術者已知。亦可將含有bG-CSF多肽或其變體之調配物單獨或與其他適宜組分組合製成供吸入投藥之氣霧劑調配物(即，其可經「氣霧化」)。可將氣霧劑調配物置於加壓之可接受推進劑(如：二氯二氟甲烷、丙烷、氮氣及類似者)中。
適宜非經腸式投與(如(例如)經關節內(於關節內)、經靜脈內、經肌肉內、經皮、經腹膜內及經皮下路徑投與)之含有bG-CSF多肽或其變體之調配物包括水性及非水性、等滲無菌注射溶液，其中可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑及使調配物與計畫接受者之血液呈等滲性之溶質；及水性與非水性無菌懸浮液，包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑及防腐劑。含有bG-CSF多肽或其變體之調配物可存在於單劑量或多劑量密封容器中，如：安瓿及小瓶。含有bG-CSF多肽或其變體之調配物亦可存在於諸如預填充注射器之注射器中。
非經腸式投藥法及經靜脈內投藥法係投與本發明調配物之可行方法。特定言之，已用於與本用途中之調配物一起投與之天然胺基酸同系治療劑(包括，但不限制於，常用於EPO、GH、G-CSF、GM-CSF、IFN、介白素、抗體、FGF及/或任何其他經醫藥傳遞之蛋白質)之投與路徑提供可行投與路徑及含有本發明bG-CSF多肽或其變體之調配物。
於一些實施例中，本發明之調配物含有含量約0.5至約12克/升之bG-CSF多肽或其變體。就本發明而言，投與動物之劑量足以在動物中隨時間產生有益治療反應，或視用途而定可產生其他適宜活性。該劑量係藉由特定載體、或調配物之效能，及所採用之非天然胺基酸多肽之活性、穩定性或血清半衰期及動物之狀況，以及待治療動物之體重或表面積決定。劑量之多寡亦由伴隨在特定動物中投與特定載體、調配物或類似物所產生之任何不良副作用的存在、屬性及程度來決定。
就本發明而言，投與動物之劑量應足以隨時間在受試者中產生有益反應。一般而言，非經腸式投與本發明bG-CSF多肽或其變體之每劑量中醫藥總有效量係於約0.01 μg/kg/日至約100 μg/kg，或約0.5 mg/kg至約1 mg/kg動物體重之範圍內，但仍需經治療裁定。或者，非經腸式投與本發明bG-CSF多肽或其變體之每劑量中醫藥有效量為約1 mg至約25 mg，或約5 mg至約20 mg。例如，非經腸式投與本發明bG-CSF多肽或其變體之每劑量中醫藥有效量可為約14 mg。投藥頻率亦需經治療裁定。
可將醫藥有效量之bG-CSF多肽或其變體依單劑量或作為多劑量方案之一部分投與動物。例如，可依多劑量方案投與bG-CSF多肽或其變體，其中該方案係至少兩個劑量方案。於一實施例中，多劑量方案係兩個劑量方案。
於一實施例中，該多劑量方案包括在動物產仔前約1天至約14天時投與該動物第一劑量，並在動物產仔後約4天至約7天投與該動物第二劑量。於另一實施例中，多劑量方案包括在動物產仔前約7天投與該動物第一劑量，並在動物產仔當天投與該動物第二劑量。
亦涵蓋以下實施例：
1.　一種穩定水性調配物，其包含bG-CSF多肽或其變體、緩衝物質及賦形劑，其中該調配物實質上不含聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單月桂酸酯。
2.　如子項1之調配物，其中該bG-CSF多肽或其變體係連接至連接子、聚合物或生物活性分子。
3.如子項1或2之調配物，其中該bG-CSF多肽或其變體係連接至水溶性聚合物。
4.如子項3之調配物，其中該水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
5.如子項3或4之調配物，其中該水溶性聚合物具有約0.1 kDa至約100 kDa之間之分子量。
6.如子項3至5中任一項之調配物，其中該水溶性聚合物具有約0.1 kDa至約50 kDa之間之分子量。
7.如子項3至6中任一項之調配物，其中該水溶性聚合物具有約20 kDa之分子量。
8.如子項1至7中任一項之調配物，其中該bG-CSF多肽或其變體係bG-CSF-T133pAF-20K PEG。
9.如子項1至8中任一項之調配物，其中bG-CSF多肽或其變體係以約0.5至約12克/升之量存在。
10.如子項1至9中任一項之調配物，其中bG-CSF多肽或其變體係以約5克/升之量存在。
11、如子項1至10中任一項之調配物，其中該緩衝物質係檸檬酸鹽、組胺酸、馬來酸鹽、琥珀酸鹽、磷酸鹽或其等組合。
12.如子項1至11中任一項之調配物，其中該緩衝物質係檸檬酸鹽或琥珀酸鹽。
13.如子項1至12中任一項之調配物，其中該緩衝物質係檸檬酸鹽。
14.　如子項1至12中任一項之調配物，其中該緩衝物質係琥珀酸鹽。
15.　如子項1至14中任一項之調配物，其中該緩衝物質具有約10 mM至約50 mM之間之莫耳濃度。
16.　如子項1至15中任一項之調配物，其中該緩衝物質具有約30 mM之莫耳濃度。
17.　如子項1至16中任一項之調配物，其中該賦形劑係氯化鈉、海藻糖、山梨糖醇、精胺酸或其組合。
18.　如子項1至17中任一項之調配物，其中該賦形劑係精胺酸。
19.　如子項18之調配物，其中精胺酸具有約100 mM至約500 mM之間之莫耳濃度。
20.　如子項18或19之調配物，其中精胺酸具有約200至約300 mM之莫耳濃度。
21.　如子項18至20中任一項之調配物，其中精胺酸具有約250 mM之莫耳濃度。
22.　如子項1至21中任一項之調配物，其中該調配物具有約5.7至約6.6之間之pH。
23.　如子項1至22中任一項之調配物，其中該調配物具有約6.0至約6.3之間之pH。
24.　如子項1至23中任一項之調配物，其中該調配物在應力儲存條件下培育5天後，bG-CSF多肽或其變體之平均聚集物濃度小於約2.1重量/重量%。
25.　如子項1至24中任一項之調配物，其中該調配物於加速儲存條件下培育1天後，bG-CSF多肽或其變體之平均聚集物濃度小於約1.5重量/重量%。
26.如子項1至25中任一項之調配物，其視需要包含一或多種其他治療成份。
27.一種如子項1至26中任一項之調配物之凍乾物或粉末。
28.一種水溶液，其係由如子項27之凍乾物或粉末溶於水中所製成。
29.一種製備如子項1至26中任一項之調配物之方法，其包括形成包含bG-CSF多肽或其變體、緩衝物質及賦形劑之穩定水溶液，其中該調配物實質上不含聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單月桂酸酯。
30.一種治療罹患由bG-CSF所調節疾病之動物之方法，其包括將治療有效量之如子項1至26中任一項之調配物投與該動物。
31.如子項30之方法，其中該疾病係感染。
32.如子項31之方法，其中該感染係乳腺炎及其中該動物係圍產期的牛。
33.一種穩定之水性調配物，其包含bG-CSF多肽或其變體、檸檬酸鹽或琥珀酸鹽緩衝劑、精胺酸及視需要選用精胺酸之抗衡離子。
34.如子項33之調配物，其中該調配物實質上不含聚山梨醇酯表面活性劑。
35.如子項33或34之調配物，其中該bG-CSF多肽或其變體係連接至連接子、聚合物或生物活性分子。
36.如子項33至35中任一項之調配物，其中該bG-CSF多肽或其變體係連接至水溶性聚合物。
37.如子項36之調配物，其中該水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
38.如子項36或37之調配物，其中該水溶性聚合物具有約0.1 kDa至約100 kDa之間之分子量。
39.如子項36至38中任一項之調配物，其中該水溶性聚合物具有約0.1 kDa至約50 kDa之間之分子量。
40.如子項36至39中任一項之調配物，其中該水溶性聚合物具有約20 kDa之分子量。
41.如子項34至40中任一項之調配物，其中該聚山梨醇酯表面活性劑係單月桂酸鈉之聚氧乙烯衍生物。
42.如子項34至41中任一項之調配物，其中該聚山梨醇酯表面活性劑係聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單月桂酸酯。
43.如子項33至42中任一項之調配物，其中該bG-CSF多肽或其變體係bG-CSF-T133pAF-20K PEG。
44.如子項43之調配物，其中bG-CSF-T133pAF-20K PEG係以約0.5至約12克/升之量存在，該檸檬酸鹽緩衝劑具有約30 mM之莫耳濃度，精胺酸具有約250 mM之莫耳濃度，及其中該調配物具有約6.0之pH值。
45.如子項43或44之調配物，其中該調配物在25℃下培育28天後，bG-CSF-T133pAF-20K PEG之平均聚集物濃度小於約1.6重量/重量%。
46.如子項43至45中任一項之調配物，其中該調配物在40℃下培育3天後，bG-CSF-T133pAF-20K PEG之平均聚集物濃度小於約2.8重量/重量%。
47.如子項43至46中任一項之調配物，其中該調配物在強制攪拌試驗法後，bG-CSF-T133pAF-20K PEG之平均聚集物濃度為約1.6重量/重量%或更低。
48.如子項43至47中任一項之調配物，其中該調配物在五次凍融循環之後，bG-CSF-T133pAF-20K PEG之平均聚集物濃度小於約1.6重量/重量%。
49.如子項33至48中任一項之調配物，其中該針對精胺酸之抗衡離子係氯離子或硫酸根。
50.如子項33至49中任一項之調配物，其視需要包含一或多種其他治療成份。
51.一種如子項33至50中任一項之調配物之凍乾物或粉末。
52.一種水溶液，其係由如子項51之凍乾物或粉末溶於水中所製成。
53.一種製備如子項33至50中任一項之調配物之方法，其包括形成包含bG-CSF多肽或其變體、檸檬酸鹽緩衝劑、精胺酸及視需要選用針對精胺酸之抗衡離子之穩定水溶液。
54.如子項53之方法，其中該調配物實質上不含聚山梨醇酯表面活性劑。
55.如子項53或54之方法，其中該bG-CSF多肽或其變體係bG-CSF-T133pAF-20K PEG。
56.一種治療罹患由bG-CSF所調節疾病之動物之方法，其包括將治療有效量之如子項33至50中任一項之調配物投與該動物。
57.如子項56之方法，其中該疾病係感染。
58.如子項57之方法，其中該感染係乳腺炎及其中該動物係圍產期的牛。
59.一種實質上由bG-CSF多肽或其變體、檸檬酸鹽或琥珀酸鹽緩衝劑、精胺酸及視需要選用針對精胺酸之抗衡離子組成之穩定之水性調配物。
60.如子項59之調配物，其中該調配物實質上不含表面活性劑。
61.如子項59或60之調配物，其中該bG-CSF多肽或其變體係連接至連接子、聚合物或生物活性分子。
62.如子項59至61中任一項之調配物，其中該bG-CSF多肽或其變體係連接至水溶性聚合物。
63.如子項62之調配物，其中該水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
64.如子項62或63之調配物，其中該水溶性聚合物具有約0.1 kDa至約100 kDa之間之分子量。
65.如子項62至64中任一項之調配物，其中該水溶性聚合物具有約0.1 kDa至約50 kDa之間之分子量。
66.如子項62至65中任一項之調配物，其中該水溶性聚合物具有約20 kDa之分子量。
67.　如子項60至66中任一項之調配物，其中該表面活性劑係聚山梨醇酯表面活性劑。
68.　如子項60至67中任一項之調配物，其中該表面活性劑係單月桂酸鈉之聚氧乙烯衍生物。
69.　如子項60至68中任一項之調配物，其中該表面活性劑係聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單月桂酸酯。
70.　如子項59至69中任一項之調配物，其中該bG-CSF多肽或其變體係bG-CSF-T133pAF-20K PEG。
71.　如子項70之調配物，其中bG-CSF-T133pAF-20K PEG係以約0.5至約12克/升之量存在，該檸檬酸鹽緩衝劑具有約30 mM之莫耳濃度，精胺酸具有約250 mM之莫耳濃度，及其中該調配物具有約6.0之pH值。
72.　如子項70或71之調配物，其中該調配物在25℃下培育28天後，bG-CSF-T133pAF-20K PEG之平均聚集物濃度小於約1.6重量/重量%。
73.　如子項70至72中任一項之調配物，其中該調配物在40℃下培育3天後，bG-CSF-T133pAF-20K PEG之平均聚集物濃度小於約2.8重量/重量%。
74.　如子項70至73中任一項之調配物，其中該調配物在強制攪拌試驗法之後，bG-CSF-T133pAF-20K PEG之平均聚集物濃度為約1.6重量/重量%或更小。
75.　如子項70至74中任一項之調配物，其中該調配物在5次凍融循環之後，bG-CSF-T133pAF-20K PEG之平均聚集物濃度小於約1.6重量/重量%。
76.如子項59至75中任一項之調配物，其中該針對精胺酸之抗衡離子係氯離子或硫酸根。
77.如子項59至76中任一項之調配物，其視需要包含一或多種其他治療成份。
78.一種如子項59至77中任一項之調配物之凍乾物或粉末。
79.一種水溶液，其係由如子項78之凍乾物或粉末溶於水中所製成。
80.一種製備如子項59至77中任一項之調配物之方法，其包括形成實質上由bG-CSF多肽或其變體、檸檬酸鹽緩衝劑、精胺酸及視需要選用針對精胺酸之抗衡離子組成之穩定水溶液。
81.如子項80之方法，其中該調配物實質上不含表面活性劑。
82.如子項80或81之方法，其中該bG-CSF多肽或其變體係bG-CSF-T133pAF-20K PEG。
83.一種治療罹患由bG-CSF所調節疾病之動物之方法，其包括將治療有效量之如子項59至77中任一項之調配物投與該動物。
84.如子項83之方法，其中該疾病係感染。
85.如子項84之方法，其中該感染係乳腺炎及其中該動物係圍產期的牛。
86.一種實質上由bG-CSF-T133pAF-20K PEG、檸檬酸鹽緩衝劑(其中該檸檬酸鹽緩衝劑具有約30 mM之莫耳濃度)、精胺酸(其中精胺酸具有約250 mM之莫耳濃度)及視需要選用針對精胺酸之抗衡離子組成之穩定水性調配物。
 實例1 緩衝劑及賦形劑篩選試驗法
可篩選背景中不含聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單月桂酸酯之bGCSF-T133-20K PEG調配物，利用多種緩衝劑及賦形劑(氯化鈉、海藻糖及精胺酸)評估產物穩定性。用於所有透析緩衝劑之標的pH係pH 6.0。為作比較，可製備含有10 mM磷酸鹽、180 mM甘露醇及60 mM海藻糖之pH 6.0調配物。可在存在或不存在氧氣下，評估該等調配物對蛋白質聚集及去聚乙二醇化之影響。
可藉由在2至8℃下，由1 mL bGCSF-T133-20K PEG於各調配物中透析來製備樣品。可先確定經透析樣品之蛋白質濃度，然後將蛋白質濃度校正至5 mg/mL。於透析及校正濃度之後，可將約3×1 ml透析後及經稀釋之集合液裝入5 mL玻璃小瓶中。可測試一組樣品以提供初始條件。可將第二組保存於25℃/60%RH下5天，然後測試。第三組樣品可於封閉在惰性氛圍(氮氣)下之冷凍乾燥室內脫氣，然後保存於25℃/60%RH下5天，然後測試。若5天後經SEC測量之聚集物濃度<2.0%，則使經脫氣及未脫氣之樣品於40℃下培育1天。
培育5天後，可測量各樣品之蛋白質濃度。表1出示蛋白質濃度。
表2出示各樣品之pH結果
可藉由SEC分析各調配物中之蛋白質濃度及去聚乙二醇化程度。表3出示SEC結果，並顯示所有樣品具有類似的聚集程度及去聚乙二醇化程度。
表4出示樣品在40℃下培育1天之SEC結果。聚集物組成分之比較結果說明含有精胺酸之調配物具有最低產物聚集。此外，若與篩選試驗法中所有其他調配物比較，參考調配物10 mM磷酸鹽、180 mM甘露醇及60 mM海藻糖pH 6具有最高聚集程度。
自此篩選試驗法之結果說明，不含聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單月桂酸酯之琥珀酸鹽、組胺酸、馬來酸鹽及檸檬酸鹽調配物在25℃下培育5天後均具有可忽略之聚集物增加程度(SEC測量為小於1%)。而且，經脫氣與未經脫氣樣品之間之蛋白質穩定性沒有差異。此外，受應力樣品在40℃下培育1天之SEC結果顯示，含有0.1 M精胺酸之調配物之聚集程度小於含有氯化鈉及海藻糖賦形劑之調配物。
實例2 聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單月桂酸酯對bG-CSF調配物之影響
評估聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單月桂酸酯對聚集之影響，以確定攪拌試驗法對後續調配物之影響。可在2至8℃下，由4 m bGCF-T133-20K PEG於pH 6.0下之10 mM磷酸鹽與150 mM NaCl中透析，製得樣品。透析後，將1%聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單月桂酸酯原液添加至經透析集合液中，隨後以pH 6.0之10 mM磷酸鹽與150 mM NaCl稀釋至5 mg/ml之最終蛋白質濃度。將來自各調配物之樣品依2×1 mL分裝入1 mL玻璃小瓶中，形成兩組樣品。將一組保存於2至8℃下並在初始條件下測試；可將第二組保存於40℃下1天。
表5出示SEC整合資料並顯示聚集程度隨著聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單月桂酸酯濃度增加而增加。樣品之SEC分析顯示bGCSF-T133-20K PEG聚集程度隨聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單月桂酸酯濃度而增加。因此，可自關於bGCSF-T133-20K PEG之後續調配物測試法中排除聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單月桂酸酯。
實例3 Box-Behnken反應表面設計(DOE#1)
可測試各種精胺酸濃度之影響及其他關鍵經驗調配物參數，以評估主要影響及其等相互作用。該實驗設計係Box-Behnken反應表面，其中在低、中間及高濃度下之各數值因子各不相同。此外，緩衝劑類型可係分類因子。檸檬酸鹽與琥珀酸鹽之參數組合可以重複，其各具有三個中心點。所有條件之Ph均設定為6.0。可納入包含10 mM磷酸鹽、150 mM NaCl及0.0033%聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單月桂酸酯，pH 6.0之對照條件，以與經驗結果比較。
可在pH 6.0±0.1下製備所有透析緩衝劑。由PEG-bGCSF於代表DOE#1試驗法中所有緩衝劑條件之18個緩衝劑條件中透析。在透析步驟中之蛋白質回收率一般可為78%，因此，在透析樣品組中均一致。透析後，經透析集合液之蛋白質濃度利用透析緩衝劑調整至Box-Behnken反應表面設計中所示之目標值。此可獲得24個調配物組合加三個檸檬酸鹽中心點及三個琥珀酸鹽中心點。可將各調配物依3×1 mL分裝入1 mL玻璃瓶中，形成三組樣品：一組可作為初始條件測試及隨後保存於2至8℃，第二組可保存於25℃下2週，及第三組可保存於40℃下1天。
分析產物濃度之變化，以評估產物穩定性。表6出示在培育之前及之後之樣品的產物濃度。在10 mM檸檬酸鹽、300 mM精胺酸(8 mg/mL)及10 mM琥珀酸鹽、300 mM精胺酸(8 mg/mL)下之樣品之增加程度最高(0.5至0.6 mg/mL)，但其差值小於所有其他樣品。
可分析pH變化來評估樣品之pH穩定性。所有樣品pH可於6.0至6.3範圍內。表7出示pH值及與0時間點時之差異。在整個DOE#1試驗法期間，樣品pH維持穩定。
可分析SEC聚集物、單體及去聚乙二醇化程度之變化，以評估蛋白質穩定性。表8、9及10分別出示各組合物之聚集、單體及去聚乙二醇化之組成。
該等SEC結果說明檸檬酸鹽樣品中之聚集物濃度相當沒有變化。除了含100 mM精胺酸之樣品外，琥珀酸鹽樣品亦具有低聚集物濃度，此意味著基於琥珀酸鹽之緩衝劑需要超過100 mM精胺酸才可以維持低度之蛋白質聚集。對照條件(10 mM磷酸鹽，150 mM NaCl及0.0033%(重量/體積)聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單月桂酸酯，pH 6及5 mg/mL)在40℃下培育1天後具有3.7%聚集物(參見表8)。
去聚乙二醇化係另一種蛋白質降解途徑。表10出示去聚乙二醇化產物之SEC結果，且說明琥珀酸鹽樣品中之去聚乙二醇化程度(0.4%至0.8%)比檸檬酸鹽樣品(0.3%)高。磷酸鹽對照組中之去聚乙二醇化程度比所有檸檬酸鹽調配物樣品高，且稍高於大部份琥珀酸鹽調配物。
由於檸檬酸鹽樣品在40℃下培育1天之SEC結果具有最少聚集物，故可使一DOE#1樣品子組在25℃下培育28天。藉由SEC分析以下樣品狀態：
1.　30 mM檸檬酸鹽，100 mM精胺酸，2 mg/mL
2.　30 mM檸檬酸鹽，500 mM精胺酸，2 mg/mL
3.　30 mM檸檬酸鹽，100 mM精胺酸，8 mg/mL
4.　30 mM檸檬酸鹽，500 mM精胺酸，8 mg/mL
5.　30 mM檸檬酸鹽，300 mM精胺酸，5 mg/mL
表11出示28天實驗之SEC結果。此外，可由RP-HPLC分析培育28天之樣品，以確定沒有產物降解。表12出示此等結果。
實例4 抗衡離子及注射器相容性評估
評估作為精胺酸抗衡離子之氯離子及硫酸根之比較。樣品條件可為30 mM檸檬酸鹽及300 mM精胺酸，5 mg/mL(pH 6)。此外，可將在裝有藥物產物之MONOJECT 3 mL聚丙烯注射器中之產物相容性與1 mL玻璃小瓶比較。可利用檸檬酸鈉及精胺酸HCl製備30 mM檸檬酸鹽、300 mM精胺酸pH 6(氯離子)緩衝劑，且使用6N HCl滴定該溶液。可利用檸檬酸單水合物、檸檬酸鈉及精胺酸鹼製備30 mM檸檬酸鹽、300 mM精胺酸pH 6(硫酸根)緩衝劑，且可藉由濃硫酸滴定該溶液。由Bgcsft133-20K PEG於該兩種緩衝劑中透析。可在0時間點時藉由SEC分析樣品。將一組樣品置於1 mL玻璃凍乾小瓶中，及將第二組置於3 mL注射器中，然後在40℃下培育長達3天。
表13出示SEC結果。該等SEC結果說明保存於注射器中之樣品的聚集物形成量比玻璃小瓶中高2或3倍。產物去聚乙二醇化程度維持與0時間點時之樣品相同。就兩種抗衡離子而言，玻璃小瓶中之樣品在40℃下3天後具有最小聚集物變化。可在不影響聚集物形成下改用氯離子取代硫酸根作為抗衡離子。
實例5 三參數，2-級全因子(DOE#2)
可實施第二DOE試驗法以評估檸檬酸鹽緩衝劑中之pH、精胺酸濃度及蛋白質濃度之影響。表14出示用於DOE#2中之調配物條件。
由bGCSF-T133-20K PEG在5種緩衝劑條件中透析。將樣品1及2於含有30 mM檸檬酸鹽及200 mM精胺酸，pH 5.0之緩衝劑中透析。樣品3及4於含有30 mM檸檬酸鹽及200 mM精胺酸，pH 5.0之緩衝劑中透析。樣品5及6於含有30 mM檸檬酸鹽及250 mM精胺酸，pH 6.0之緩衝劑中透析。樣品7及8於含有30 mM檸檬酸鹽及300 mM精胺酸，pH 6.0之緩衝劑中透析。樣品9及10於含有30 mM檸檬酸鹽及300 mM精胺酸，pH 5.5之緩衝劑中透析。將各透析後之樣品調整至目標產物濃度，隨後依2×1 mL分裝入玻璃凍乾小瓶中，形成兩組樣品：將一組保存於2至8℃下作為對照，將第二組保存於40℃下3天。
表15出示SEC結果。聚集物變化係介於-0.1%至2.1%之間。較高聚集物係與較高產物濃度呈高度相關性。去聚乙二醇化變化係介於0.1%至0.8%之間。稍高之去聚乙二醇化與低pH下之低產物濃度呈相關性。隨著pH降低，去聚乙二醇化增大，且此趨勢係與預調配試驗法中之經驗觀察一致。
實例6 攪拌試驗法
可實施強制攪拌試驗法以評估調配物中之蛋白質穩定性。由bGCSF-T133-20K PEG(16.6 mg/mL蛋白質含於10 mM乙酸鈉、5%山梨醇中之pH4.0溶液)相對於30 mM檸檬酸鹽及250 mM精胺酸，pH 6.0透析，製備樣品。可利用30 mM檸檬酸鹽與250 mM精胺酸，pH 6.0緩衝劑稀釋一部份已透析材料至5 mg/mL之目標濃度。隨後經由0.22微米過濾器過濾集合液，隨後在玻璃燒杯中利用磁力攪拌器於60 rpm及室溫下混合2小時，進行強制攪拌法。可每隔30分鐘取樣。
在所有時間點下之所有樣品均為澄清、無色且沒有可視察到之顆粒。各時間點之蛋白質濃度、550 nm吸光度及pH測量值均示於表16中。
蛋白質濃度在整個混合期間維持穩定。pH在整個實驗期間維持一致。SEC測得之產物組成在整個試驗法期間亦一致，如表17所示。總而言之，來自此試驗法之結果說明蛋白質在整個強制攪拌期間維持穩定。
實例7 凍融試驗法
可實施凍融試驗法以確定各樣品之蛋白質濃度及pH。將樣品中之蛋白質進行多達5次冷凍及融解循環。經由0.22微米過濾器過濾樣品並分散於15 mL小瓶中。留出一份樣液作為對照。其餘三份樣液分別進行凍融循環，各循環包括在-75±5℃下冷凍蛋白質溶液1小時及在室溫下解凍約1小時直至不再觀察到冰組成為止。可緩慢旋搖樣品小瓶三次以混合樣品。可於第一、第二及第五次冷凍與融解循環後留出一份樣液用於測試。
在所有時間點下之所有樣品均為澄清、無色且沒有可視察之顆粒。各時間點之蛋白質濃度、550 nm吸光度及pH測量值均示於表18中。
每次凍融循環後之蛋白質濃度均維持穩定。此外，在5次凍融循環中之pH均維持一致。在所有時間點下經SEC測得之產物組成均類似且示於表19中。
<110>　美國禮來大藥廠
<120>　牛顆粒細胞群落刺激因子及其變體之調配物
<130>　X18988
<140>　100133501
<141>　2011-09-16
<150>　61/385,629
<151>　2010-09-23
<160>　14
<170>　專利第3.5版
<210>　1
<211>　174
<212>　PRT
<213>　普通牛
<400>　1
<210>　2
<211>　175
<212>　PRT
<213>　普通牛
<400>　2
<210>　3
<211>　175
<212>　PRT
<213>　普通牛
<220>
<221>　混合特徵
<222>　(9)..(9)
<223>　其中Xaa係對乙醯基苯丙胺酸
<400>　3
<210>　4
<211>　175
<212>　PRT
<213>　普通牛
<220>
<221>　混合特徵
<222>　(63)..(63)
<223>　其中Xaa係對乙醯基苯丙胺酸(pAF)
<400>　4
<210>　5
<211>　175
<212>　PRT
<213>　普通牛
<220>
<221>　混合特徵
<222>　(70)..(70)
<223>　其中Xaa係對乙醯基苯丙胺酸(pAF)
<400>　5
<210>　6
<211>　175
<212>　PRT
<213>　普通牛
<220>
<221>　混合特徵
<222>　(126)..(126)
<223>　其中Xaa係對乙醯基苯丙胺酸(pAF)
<400>　6
<210>　7
<211>　175
<212>　PRT
<213>　普通牛
<220>
<221>　混合特徵
<222>　(134)..(134)
<223>　其中Xaa係對乙醯基苯丙胺酸(pAF)
<400>　7
<210>　8
<211>　175
<212>　PRT
<213>　普通牛
<220>
<221>　混合特徵
<222>　(137)..(137)
<223>　其中Xaa係對乙醯基苯丙胺酸(pAF)
<400>　8
<210>　9
<211>　175
<212>　PRT
<213>　普通牛
<220>
<221>　混合特徵
<222>　(9)..(9)
<223>　其中Xaa係連接至聚(乙二醇)部分之對乙醯基苯丙胺酸(pAF)
<400>　9
<210>　10
<211>　175
<212>　PRT
<213>
<220>
<221>　混合特徵
<222>　(63)..(63)
<223>　Xaa可係任何天然形成胺基酸
<220>
<221>　混合特徵
<222>　(64)..(64)
<223>　其中Xaa係連接至聚(乙二醇)部分之對乙醯基苯丙胺酸(pAF)
<400>　10
<210>　11
<211>　175
<212>　PRT
<213>　普通牛
<220>
<221>　混合特徵
<222>　(70)..(70)
<223>　其中Xaa係連接至聚(乙二醇)部分之對乙醯基苯丙胺酸(pAF)
<400>　11
<210>　12
<211>　175
<212>　PRT
<213>　普通牛
<220>
<221>　混合特徵
<222>　(126)..(126)
<223>　其中Xaa係連接至聚(乙二醇)部分之對乙醯基苯丙胺酸(pAF)
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<220>
<221>　混合特徵
<222>　(137)..(137)
<223>　其中Xaa係連接至聚(乙二醇)部分之對乙醯基苯丙胺酸(pAF)
<400>　14

Claims (7)

  1. 一種穩定水性調配物，其包含bG-CSF-T133pAF-20K PEG、檸檬酸鹽或琥珀酸鹽緩衝劑、精胺酸及視需要包含精胺酸之抗衡離子，其中該調配物包含少於0.001%之表面活性劑。
  2. 如請求項1之調配物，其中針對精胺酸之抗衡離子為氯離子或硫酸根。
  3. 如請求項1或2之調配物，其中該表面活性劑為聚山梨醇酯表面活性劑。
  4. 如請求項1或2之調配物，其中bG-CSF-T133pAF-20K PEG係以約0.5至約12克/升之量存在，該該緩衝劑為檸檬酸鹽，該檸檬酸鹽緩衝劑具有約30mM之莫耳濃度，精胺酸具有約250mM之莫耳濃度，及其中該調配物具有約5.7至約6.6之pH值。
  5. 如請求項1或2之調配物，其視需要包括一或多種其他治療成份。
  6. 一種如請求項1至5中任一項之調配物之用途，其係用於製造用於治療罹患bG-CSF所調節疾病之動物之藥物。
  7. 如請求項6之用途，其中該疾病係乳腺炎，及該動物係圍產期牛(periparturient cow)。
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