KR101752508B1 - 제8 인자 제형 - Google Patents
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Abstract
NaCl이 최종 제형에 존재하지 않거나 미량으로 존재하여, 동결건조 사이클 시간의 동반 감소 및 동결건조된 FVIII의 증가된 안정성을 허용하도록 제제화된, 제8 인자 (FVIII) 조성물.
Description
일반적으로, 본 발명은 NaCl이 최종 제형에 존재하지 않거나 미량으로 존재하여, 동결건조 사이클 시간의 동반 감소 및 동결건조된 제8 인자의 증가된 안정성을 허용하도록 제제화된, 제8 인자 조성물에 관한 것이다.
제8 인자 (FVIII)는 혈액 응고를 야기하는 반응 캐스케이드에서 보조인자로서 작용하는, 혈장에서 발견되는 단백질이다. 혈액 내 FVIII 활성의 양의 결핍은 주로 남성에 영향을 미치는 유전 질환인 A형 혈우병으로서 공지된 응고 장애를 초래한다. A형 혈우병은 현재 인간 혈장으로부터 유래되거나 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조된 FVIII의 치료학적 제제로 치료된다. 이러한 제제는 출혈 에피소드에 반응하여 (요구에 따른 치료요법(on-demand therapy)) 또는 제어되지 않는 출혈을 예방하기 위해 빈번한 규칙적 간격으로 (예방) 투여된다.
FVIII은 치료학적 제제에서 상대적으로 불안정한 것으로 공지되어 있다. 혈장에서, FVIII은 FVIII에 비해 큰 몰 과량으로 혈장에 존재하고 조기 분해로부터 FVIII을 보호하는 것으로 생각되는 또 다른 혈장 단백질인 폰빌레브란트 인자 (vWF)와 통상적으로 복합체를 형성한다. 또 다른 순환 혈장 단백질인 알부민이 또한 생체내에서 FVIII을 안정화하는 역할을 할 수 있다. 현재 판매되는 FVIII 제제는 그러므로 제조 공정 동안 및 저장 동안 FVIII을 안정화하기 위해 알부민 및/또는 vWF의 사용에 주로 의존한다.
그러나, 현재 판매되는 FVIII 제제에서 사용되는 알부민 및 vWF는 인간 혈장으로부터 유래되므로 이러한 물질의 사용은 특정 결점을 갖는다. FVIII과 비교하여 큰 몰 과량의 알부민이 이러한 제제에서 FVIII의 안정성을 증가시키기 위해 일반적으로 첨가되기 때문에, 이들 제제에서 FVIII 단백질 그 자체를 특징화하는 것이 곤란하다. FVIII로의 인간-유래된 알부민의 첨가는 또한 재조합적으로-생성된 FVIII 제제와 관련하여 단점인 것으로 이해된다. 이는 이러한 첨가된 알부민이 없다면 바이러스 전달의 이론적 위험이 재조합적으로-유래된 FVIII 제제에서 감소되기 때문이다.
알부민 또는 vWF 없이 (또는 상대적으로 낮은 수준의 이들 부형제 함유) FVIII을 제제화하는 여러 시도가 기재되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,565,427호 (제EP 508 194호) (프로이덴베르크(Freudenberg) (베링베르케(Behringwerke)에 양도됨))에는 부형제, 예컨대 염화나트륨 및 수크로스 이외에 디터전트 및 아미노산, 구체적으로 아르기닌 및 글리신의 특정 조합을 함유하는 FVIII 제제가 기재되어 있다. 디터전트인, 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80은 0.001 내지 0.5％ (v/v)의 양으로 존재한다고 기재되어 있으나, 아르기닌 및 글리신은 0.01 내지 1 mol/l의 양으로 존재한다. 수크로스는 0.1 내지 10％의 양으로 존재한다고 기재되어 있다. 이 특허의 실시예 2는 (1) 0.75％ 수크로스, 0.4 M 글리신 및 0.15 M NaCl, 및 (2) 0.01 M 시트르산나트륨, 0.08 M 글리신, 0.016 M 리신, 0.0025 M 염화칼슘 및 0.4 M 염화나트륨의 용액은 16시간에 걸쳐 용액에서 안정하지 않았으나, (3) 1％ 수크로스, 0.14 M 아르기닌, 0.1 M 염화나트륨 및 (4) 1％ 수크로스, 0.4 M 글리신, 0.14 M 아르기닌, 0.1 M 염화나트륨 및 0.05％ 트윈(TWEEN)™. 80 (폴리소르베이트 80)의 용액은 안정성을 나타내었다고 단언한다.
미국 특허 제5,763,401호 (제EP 818 204호) (나이엘(Nayer) (바이엘(Bayer)에 양도됨))에는 또한 알부민 없이 15 내지 60 mM 수크로스, 50 mM 이하의 NaCl, 5 mM 이하의 염화칼슘, 65 내지 400 mM 글리신 및 50 mM 이하의 히스티딘을 포함하는 치료학적 FVIII 제형이 기재되어 있다. 아래 특정 제형은 주장하는 바에 따르면 안정한 것으로 확인되었다: (1) 150 mM NaCl, 2.5 mM 염화칼슘 및 165 mM 만니톨; 및 (2) 1％ 수크로스, 30 mM 염화나트륨, 2.5 mM 염화칼슘, 20 mM 히스티딘 및 290 mM 글리신. 더 많은 양의 당을 함유하는 제형 (10％ 말토스, 50 mM NaCl, 2.5 mM 염화칼슘 및 5 mM 히스티딘)은 주장하는 바에 따르면 제형 (2)과 비교하여 동결건조된 상태에서 불량한 안정성을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
미국 특허 제5,733,873호 (제EP 627 924호) (오스터베르크(Osterberg) (파마시아앤드업존(Pharmacia & Upjohn)에 양도됨))에는 0.01 내지 1 mg/ml의 계면활성제를 포함하는 제형이 개시되어 있다. 이 특허에는 하기 범위의 부형제를 갖는 제형이 개시되어 있다: 0.01 mg/ml 이상, 바람직하게는 0.02 내지 1.0 mg/ml의 양의 폴리소르베이트 20 또는 80; 0.1 M 이상의 NaCl; 0.5 mM 이상의 칼슘 염; 및 1 mM 이상의 히스티딘. 보다 구체적으로, 아래 특정 제형이 개시되어 있다: (1) 14.7, 50 및 65 mM 히스티딘, 0.31 및 0.6 M NaCl, 4 mM 염화칼슘, 0.001, 0.02 및 0.025％ 폴리소르베이트 80 (0.1％ PEG 4000 또는 19.9 mM 수크로스 함유 또는 비함유); 및 (2) 20 mg/ml 만니톨, 2.67 mg/ml 히스티딘, 18 mg/ml NaCl, 3.7 mM 염화칼슘 및 0.23 mg/ml 폴리소르베이트 80.
저농도 또는 고농도의 염화나트륨을 사용하는 다른 시도가 또한 기재되어 있다. 미국 특허 제4,877,608호 (제EP 315 968호) (리(Lee) (롱프랑 로라(Rhone-Poulenc Rorer)에 양도됨))에는 상대적으로 낮은 농도의 염화나트륨을 갖는 제형, 즉 0.5 mM 내지 15 mM NaCl, 5 mM 염화칼슘, 0.2 mM 내지 5 mM 히스티딘, 0.01 내지 10 mM 리신 히드로클로라이드 및 10％ 이하의 당을 포함하는 제형이 개시되어 있다. "당"은 10％ 이하의 말토스, 10％ 수크로스 또는 5％ 만니톨일 수 있다.
미국 특허 제5,605,884호 (제EP 0 314 095호) (리(Lee) (롱프랑 로라에 양도됨))에는 상대적으로 높은 농도의 염화나트륨을 갖는 제형의 사용이 교시되어 있다. 이들 제형은 0.35 M 내지 1.2 M NaCl, 1.5 내지 40 mM 염화칼슘, 1 mM 내지 50 mM 히스티딘, 및 10％ 이하의 "당", 예컨대 만니톨, 수크로스 또는 말토스를 포함한다. 0.45 M NaCl, 2.3 mM 염화칼슘 및 1.4 mM 히스티딘을 포함하는 제형이 예시되어 있다.
국제 특허 출원 제WO 96/22107호 (로저(Roser) (콰드란트 홀딩스 캠브리지 리미티드(Quadrant Holdings Cambridge Limited)에 양도됨))에는 당 트레할로스를 포함하는 제형이 기재되어 있다. 이들 제형은 (1) 0.1 M NaCl, 15 mM 염화칼슘, 15 mM 히스티딘 및 1.27 M (48％) 트레할로스; 또는 (2) 0.011％ 염화칼슘, 0.12％ 히스티딘, 0.002％ 트리스(Tris), 0.002％ 트윈™. 80, 0.004％ PEG 3350, 7.5％ 트레할로스 및 0.13％ 또는 1.03％ NaCl을 포함한다.
미국 특허 제5,328,694호 (제EP 511 234호) (슈빈(Schwinn) (옥타파르마 아게(Octapharma AG)에 양도됨))에는 100 내지 650 mM 이당류 및 100 mM 내지 1.0 M 아미노산을 포함하는 제형이 기재되어 있다. 구체적으로, 다음 제형이 개시되어 있다: (1) 0.9 M 수크로스, 0.25 M 글리신, 0.25 M 리신 및 3 mM 염화칼슘; 및 (2) 0.7 M 수크로스, 0.5 M 글리신 및 5 mM 염화칼슘.
선행 기술의 다른 치료학적 FVIII 제형은 일반적으로 FVIII을 안정화하기 위해 알부민 및/또는 vWF를 포함하며, 그러므로 본 개시와 관련이 없다. 동결 건조된 생성물에 대한 제제화 및 공정 개발 문제에 초점을 맞춘 광범위한 문헌이 있지만, 동결 건조된 FVIII의 연구는 증량제로서 NaCl의 사용에 기초한 제형의 연구로 제한된다.
제형 개발의 주요 문제점은 일반적으로 정제 공정에 의해 도입되는 벌크 약물 물질 중 염화나트륨의 존재이다. 정제 공정의 결과로서, 다량 및/또는 다양한 양의 염화나트륨이 벌크 약물 물질 용액에 존재한다. 비결정화된 염화나트륨은 붕괴 온도를 낮추고, 정교한 제품과 유사한 제품으로 제품이 제조될 수 없게 할 수 있다. 더욱이, 무정형 염화나트륨은 생성물의 안정성을 위태롭게 할 수 있다. 본 개시는 FVIII을 연장된 기간 동안 안정하게 저장된 상태로 유지할 수 있는, NaCl이 제거되거나 미량으로 존재하는, 동결 건조를 위한 제형을 수반한다.
<발명의 요약>
본 개시의 FVIII 조성물은 한 실시양태에서 NaCl이 최종 제형에 존재하지 않거나 미량으로 존재하여, 동결건조 사이클 시간의 동반 감소 및 동결건조된 FVIII의 증가된 안정성을 허용하도록 제제화된다.
한 실시양태에서, (a) FVIII; (b) 하나 이상의 완충제; (c) 하나 이상의 항산화제; (d) 하나 이상의 안정화제; 및 (e) 하나 이상의 계면활성제를 포함하며, 완충제가 약 0.1 mM 내지 약 500 mM 범위의 pH 완충제를 포함하고 pH가 약 2.0 내지 약 12.0 범위이고; 항산화제가 약 0.005 내지 약 1.0 mg/ml의 농도로 존재하고; 안정화제가 약 0.005 내지 약 20％의 농도로 존재하고; 계면활성제가 약 0.001％ 내지 약 1.0％의 농도로 존재하고; 제형이 염화나트륨 (NaCl)을 배제하거나 오직 미량의 NaCl을 포함하는 것인, a) 재조합 FVIII 폴리펩티드; b) a)의 생물학상 활성인 유사체, 단편 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 포함하는 FVIII의 안정한 동결건조된 제약 제형이 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 완충제가 시트레이트, 글리신, 히스티딘, 헤페스(HEPES), 트리스 및 이들 작용제의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 상기 언급된 제형이 제공된다. 한 실시양태에서, 완충제는 히스티딘이다.
또 다른 실시양태에서, pH가 약 6.0 내지 약 8.0 또는 약 6.5 내지 약 7.5 범위인 상기 언급된 제형이 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 완충제는 히스티딘이고, pH는 약 7.0이다.
한 실시양태에서, 항산화제가 글루타티온인 상기 언급된 제형이 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 항산화제는 약 0.1 내지 약 0.5 mg/ml의 농도 범위로 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 항산화제는 약 0.2 mg/ml 농도의 글루타티온이다. 또 다른 실시양태에서, 완충제는 히스티딘이고, pH는 약 7.0이고; 항산화제는 약 0.2 mg/ml 농도의 글루타티온이다.
또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 안정화제가 수크로스, 트레할로스 및 라피노스, 및 이들 안정화제의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 상기 언급된 제형이 제공된다. 한 실시양태에서, 안정화제는 약 5％ 농도의 트레할로스 및 약 4 mM 농도의 염화칼슘이다. 또 다른 실시양태에서, 안정화제는 약 5％ 농도의 수크로스 및 약 4 mM 농도의 염화칼슘이다.
한 실시양태에서, 계면활성제가 디기토닌, 트리톤(Triton) X-100, 트리톤 X- 114, 트윈-20, 트윈-80 및 이들 계면활성제의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 상기 언급된 제형이 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 계면활성제는 약 0.03％의 트윈-80이다.
한 실시양태에서, 완충제가 약 pH 7.0에서 약 25 mM 농도의 히스티딘이고; 항산화제가 약 0.2 mg/ml 농도의 글루타티온이고; 안정화제가 약 5％ 농도의 트레할로스 또는 수크로스 및 약 4 mM 농도의 염화칼슘이고; 계면활성제가 약 0.03％의 트윈-80인 상기 언급된 제형이 제공된다.
또 다른 실시양태에서, NaCl이 부형제로서 첨가되지 않은 것인 상기 언급된 제형이 제공된다. 또 다른 실시양태에서, NaCl은 투석 또는 용매 교환 크로마토그래피에 의한 제거 후 미량으로 존재한다.
안정한 동결건조된 FVIII의 제조 방법이 본 개시에 제공된다. 한 실시양태에서, (a) 상기 언급된 제형을 제조하는 단계; 및 (b) 단계 (a)의 제형을 동결건조하는 단계를 포함하는, 안정한 동결건조된 FVIIII의 제조 방법이 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 동결건조된 FVIII의 안정성이 염화나트륨의 존재하에 동결건조된 FVIII 제형과 비교하여 더 높은 것인 상기 언급된 방법이 제공된다.
또 다른 실시양태에서, (a) FVIII; (b) 하나 이상의 완충제; (c) 하나 이상의 항산화제; (d) 하나 이상의 안정화제; 및 (e) 하나 이상의 계면활성제를 포함하며, 완충제가 약 0.1 mM 내지 약 500 mM 범위의 pH 완충제를 포함하고 pH가 약 2.0 내지 약 12.0 범위이고; 항산화제가 약 0.005 내지 약 1.0 mg/ml의 농도로 존재하고; 안정화제가 약 0.005 내지 약 20％의 농도로 존재하고; 계면활성제가 약 0.001％ 내지 약 1.0％의 농도로 존재하는 것인, a) 재조합 FVIII 폴리펩티드; b) a)의 생물학상 활성인 유사체, 단편 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 포함하는 FVIII의 안정한 동결건조된 제약 제형이 제공된다.
도 1. 제제화 및 동결-건조 동안 FVIII의 손실. 오차 막대는 반복 측정으로부터 계산된 표준 오차이다.
도 2. 만니톨/트레할로스 (도 2A) 및 글리신/트레할로스 (도 2B) 기재 제형 내 동결-건조된 rAHF의 저장 안정성 및 시간 동력학의 제곱근.
도 3. 선택된 제형 내 동결-건조된 rAHF의 분해에 대한 속도 상수: 제형 스크리닝 연구.
도 4. 글리신:트레할로스 기재 제형의 안정성에 대한 글루타티온, 히스티딘 및 헤페스의 효과: 공정중 활성 손실 및 25℃에서 9개월 저장 동안의 활성 손실. "기본" 제형은 pH 7에서 rAHF (103 IU/mL), 글리신 (8％), 트레할로스 (2％), NaCl (200 mM), 10 mM 트리스, 0.025％ 폴리소르베이트 80, 4 mM CaCl2이다. 다른 제형은 글루타티온 (0.2 g/L), 및 헤페스 완충제 (10 mM), 히스티딘 완충제 (50 mM) 또는 철 착화제 데페록사민 (0.25 mg/L)이 첨가된 "기본" 제형으로 구성된다. 사용된 공정은 본질적으로 표 5에 제공된 것과 동일하였다.
도 5. 동결-건조된 rAHF의 분해 속도 상수. 제형 및 공정의 세부사항은 표 5 및 6에 제공된다. 속도 상수는 시간 (개월)에 따른 시간 동력학의 제곱근으로부터의 것이다. 오차 막대는 회귀 분석에 의해 제공된 표준 오차를 나타낸다.
<발명의 상세한 설명>
정의
하기 본원에서 사용되는 용어 및 그의 파생형은 별도의 표시가 없는 경우 아래와 같이 정의될 수 있다:
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속한 분야의 통상의 기술을 가진 자에 의해 흔히 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 하기 참고문헌이 당업자에게 본 개시에서 사용되는 많은 용어의 일반적인 정의를 제공한다: 문헌 [Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2d ed. 1994)]; [THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walker ed., 1988)]; [THE GLOSSARY OF GENETICS, 5TH ED., R. Rieger, et al. (eds.), Springer Verlag (1991)]; 및 [Hale and Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY (1991)].
본원에서 인용된 각각의 공개, 특허 출원, 특허 및 기타 참고문헌은 이것이 본 개시와 불일치하지 않는 한도까지 그 전문이 참고로 포함된다.
본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용되는 단수 형태 "a," "an" 및 "the"는 문맥이 명확하게 달리 언급하지 않는 한 복수 언급을 포함한다는 것이 본원에서 주목된다.
본원에서 사용되는 하기 용어들은 달리 명시하지 않는 한 이에 속한 의미를 갖는다.
펩티드 화합물과 관련하여 용어 "포함하는"은 화합물이 주어진 서열의 아미노 및 카르복시 말단 중 어느 하나 또는 둘 모두에서 추가 아미노산을 포함할 수 있다는 것을 의미한다. 물론, 이들 추가 아미노산은 화합물의 활성을 유의하게 방해하지 않아야 한다. 본 개시의 조성물과 관련하여 용어 "포함하는"은 조성물이 추가 구성성분을 포함할 수 있다는 것을 의미한다. 이들 추가 구성성분은 조성물의 활성을 유의하게 방해하지 않아야 한다. FVIII 제형과 관련하여 "포함하는"은 염화나트륨 (NaCl)을 완전히 배제하거나 또는 오직 미량의 NaCl을 포함한다.
용어 "약리학상 활성인"은 이렇게 기재된 물질이 의학적 파라미터 또는 질병 상태에 영향을 미치는 활성을 갖는 것으로 결정된다는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "발현하다", "발현하는" 및 "발현"은 유전자 또는 DNA 서열 내의 정보가 상응하는 유전자 또는 DNA 서열의 전사 및 번역에 관여된 세포 기능을 활성화시킴으로써 나타나게 되는, 예를 들어, 단백질을 생성하게 되는 것을 의미한다. DNA 서열은 세포 내에서 또는 세포에 의해 발현되어 "발현 산물", 예컨대 단백질을 형성한다. 발현 산물 그 자체, 예를 들어 생성된 단백질은 또한 "발현된" 것으로 언급될 수 있다. 발현 산물은 세포내, 세포외 또는 분비된 것으로서 특징화될 수 있다. 용어 "세포내"는 세포 내부를 의미한다. 용어 "세포외"는 세포 외부, 예컨대 막횡단 단백질을 의미한다. 물질은 세포 상 또는 세포 내부의 어딘가로부터 세포 외부에서 유의한 측정치로 나타난 경우 세포에 의해 "분비된다".
본원에서 사용되는 "폴리펩티드"는 펩티드 결합을 통해 연결된 아미노산 잔기, 그의 구조적 변이체, 관련된 천연 구조적 변이체 및 합성 비천연 유사체를 포함하는 중합체를 지칭한다. 합성 폴리펩티드는 예를 들어 자동화 폴리펩티드 신세사이저를 이용하여 제조된다. 용어 "단백질"은 전형적으로 큰 폴리펩티드를 지칭한다. 용어 "펩티드"는 전형적으로 짧은 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에서 사용되는 폴리펩티드의 "단편"은 전장 폴리펩티드 또는 단백질 발현 산물보다 더 작은 폴리펩티드 또는 단백질의 임의의 부분을 지칭하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 "유사체"는 구조가 실질적으로 유사하고 동일한 생물학적 활성을 갖지만 다양한 정도의 활성을 가질 수 있는 둘 이상의 폴리펩티드 중 임의의 폴리펩티드, 전체 분자 또는 그의 단편을 지칭한다. 유사체는 다른 아미노산에 대한 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가를 수반하는 하나 이상의 돌연변이에 기초하여 그의 아미노산 서열의 조성이 상이하다. 치환은 대체될 아미노산 및 이를 대체할 아미노산의 물리화학적 또는 기능적 관련도에 기초하여 보존적 또는 비보존적일 수 있다.
본원에서 사용되는 "변이체"는 통상적으로 분자의 부분이 아닌 추가 화학적 모이어티를 포함하도록 변형된 폴리펩티드, 단백질 또는 그의 유사체를 지칭한다. 이러한 모이어티는 분자의 용해도, 흡수, 생물학적 반감기 등을 조정할 수 있다. 모이어티는 별법으로 분자의 독성을 감소시키고, 분자의 임의의 바람직하지 못한 부작용 등을 제거하거나 감쇠시킬 수 있다. 이러한 효과를 매개할 수 있는 모이어티는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (1980)]에 개시되어 있다. 분자로의 이러한 모이어티의 커플링을 위한 절차는 당분야에 익히 공지되어 있다. 예를 들어 및 제한 없이, 한 측면에서 변이체는 단백질에 생체내 더 긴 반감기를 부여하는 화학적 변형을 갖는 혈액 응고 인자이다. 다양한 측면에서, 폴리펩티드는 글리코실화, PEG화(pegylation) 및/또는 폴리시알릴화에 의해 변형된다.
FVIII
본원에서 용어 "제8 인자" 또는 "FVIII" 또는 "rAHF"는 무손상 B 도메인의 적어도 한 부분을 갖고 천연 FVIII과 관련된 생물학적 활성을 나타내는 임의의 FVIII 분자를 지칭한다. 본 개시의 한 실시양태에서, FVIII 분자는 전장 FVIII이다. FVIII 분자는 FVIII:C를 코딩하는 DNA로 혼성화할 수 있는 DNA 서열에 의해 코딩되는 단백질이다. 이러한 단백질은 도메인 A1-A2-B-A3-C1-C2 사이에 또는 그 내에 다양한 부위에서 아미노산 결실을 함유할 수 있다 (미국 특허 제4,868,112호). FVIII 분자는 또한 하나 이상의 아미노산 잔기가 부위 지정 돌연변이유발에 의해 대체된 천연 FVIII의 유사체일 수 있다.
본 개시에 따라 용어 "재조합 제8 인자" (rFVIII)은 재조합 DNA 기술을 통해 얻어진 임의의 rFVIII (이종 또는 천연) 또는 그의 생물학상 활성인 유사체를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 용어는 상기 기재된 바와 같은 단백질 및 본 개시의 rFVIII을 코딩하는 핵산을 포함한다. 이러한 핵산에는 예를 들어 및 제한 없이, 유전자, pre-mRNA, mRNA, 다형성 변이체, 대립유전자, 합성 및 천연 돌연변이체가 포함된다. 용어 rFVIII에 포함되는 단백질에는 예를 들어 및 제한 없이, 상기 기재된 단백질 및 폴리펩티드, 상기 기재된 핵산에 의해 코딩되는 단백질, (1) 본원에 기재된 참조 핵산 또는 아미노산 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 대한 적어도 약 25, 약 50, 약 100, 약 200, 약 300, 약 400개 또는 그 초과의 아미노산 (성숙 천연 단백질에 대한 406개 아미노산의 전장 서열 이하)의 영역에 걸쳐 최소 약 60％, 약 65％, 약 70％, 약 75％, 약 80％, 약 85％, 약 90％, 약 91％, 약 92％, 약 93％, 약 94％, 약 95％, 약 96％, 약 97％, 약 98％ 또는 약 99％ 또는 그 초과의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고/거나; (2) 본원에 기재된 바와 같은 참조 아미노산 서열을 포함하는 면역원, 그의 면역원성 단편 및/또는 그의 보존적으로 변형된 변이체에 대해 생성된 항체, 예를 들어, 폴리클로날 또는 모노클로날 항체에 특이적으로 결합하는 종간 상동체 및 다른 폴리펩티드가 포함된다.
본원에서 사용되는 "내인성 FVIII"은 치료를 받도록 의도된 포유동물로부터 유래하는 FVIII을 포함한다. 상기 용어는 또한 상기 포유동물에 존재하는 트랜스진(transgene) 또는 임의의 다른 외래 DNA로부터 전사된 FVIII을 포함한다. 본원에서 사용되는 "외인성 FVIII"은 상기 포유동물로부터 유래하지 않는 FVIII을 포함한다.
FVIII 분자는 단일 유전자 산물로부터 발생한 폴리펩티드의 불균일 분포로서 천연적으로 및 치료학적 제제에 존재한다 (예를 들어, 문헌 [Andersson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 2979 2983, May 1986] 참조). 본원에서 사용되는 용어 "제8 인자"는 혈장으로부터 유래되거나 또는 재조합 DNA 기술의 사용을 통해 생성된 모든 이러한 폴리펩티드를 지칭하고, FVIII 모방체, fc-FVIII 접합체, 수용성 중합체로 화학적으로 변형된 FVIII 및 FVIII의 다른 형태 또는 유사체가 포함되나 이에 제한되지 않는다. FVIII을 함유하는 치료학적 제제의 상업적으로 이용가능한 예로는 헤모필 엠(HEMOFIL M) 및 리콤비네이트(RECOMBINATE) (백스터 헬스케어 코포레이션 (Baxter Healthcare Corporation; 미국 일리노이주 데어필드)로부터)의 상표명으로 시판되는 것이 포함된다. 다른 제제는 분자의 B 도메인 부분이 결핍된 FVIII 분자의 단일 하위집단을 주로 포함한다.
본 개시의 출발 물질은 인간 혈장으로부터 유래되거나, 또는 미국 특허 제4,757,006호; 미국 특허 제5,733,873호; 미국 특허 제5,198,349호; 미국 특허 제5,250,421호; 미국 특허 제5,919,766호; 제EP 306 968호에 기재된 바와 같은 재조합 공학 기술에 의해 생성될 수 있는 FVIII이다.
본 개시에 유용한 FVIII 분자에는 전장 단백질, 단백질의 전구체, 단백질의 생물학상 활성인 또는 기능적 서브유닛 또는 단편, 및 그의 기능적 유사체, 뿐만 아니라 하기 본원에 기재된 바와 같은 그의 변이체가 포함된다. FVIII에 대한 언급은 이러한 단백질의 모든 잠재적 형태를 포함하는 것으로 의도되고, 여기서 FVIII의 각 형태는 무손상 천연 B 도메인 서열의 적어도 한 부분 또는 전체를 갖는다.
본 개시의 rFVIII을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에는 제한 없이, (1) 엄격한 혼성화 조건 하에 본원에 기재된 바와 같은 참조 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 및 그의 보존적으로 변형된 변이체에 특이적으로 혼성화하고; (2) 본원에 기재된 바와 같은 참조 핵산 서열에 대한 적어도 약 25, 약 50, 약 100, 약 150, 약 200, 약 250, 약 500, 약 1000개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 (성숙 단백질의 1218개 뉴클레오티드의 전장 서열 이하)의 영역에 걸친 최소 약 95％, 약 96％, 약 97％, 약 98％, 약 99％ 또는 그 초과의 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는 것이 포함된다.
변이체 (또는 유사체) 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 잔기가 본 개시의 FVIII 아미노산 서열에 첨가된 삽입 변이체를 포함한다. 삽입은 단백질의 말단 중 어느 하나 또는 둘 모두에 위치될 수 있고/거나, FVIII 아미노산 서열의 내부 영역 내에 위치될 수 있다. 말단 중 어느 하나 또는 둘 모두에 추가 잔기를 갖는 삽입 변이체에는 예를 들어, 융합 단백질, 및 아미노산 태그 또는 다른 아미노산 표지를 포함하는 단백질이 포함된다. 한 측면에서, FVIII 분자는 특히 분자가 박테리아 세포, 예컨대 이. 콜라이(E. coli)에서 재조합적으로 발현되는 경우 N-말단 Met를 임의로 함유할 수 있다.
결실 변이체에서, 본원에 기재된 바와 같은 FVIII 폴리펩티드에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 제거된다. 결실은 FVIII 폴리펩티드의 한 말단 또는 두 말단에서 및/또는 FVIII 아미노산 서열 내의 하나 이상의 잔기의 제거로 수행될 수 있다. 그러므로, 결실 변이체는 FVIII 폴리펩티드 서열의 모든 단편을 포함한다.
치환 변이체에서, FVIII 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기는 제거되고 대안적 잔기로 대체된다. 한 측면에서, 치환은 천연적으로 보존적이고, 이 유형의 보존적 치환은 당분야에 익히 공지되어 있다. 별법으로, 본 개시는 또한 비보존적인 치환을 포함한다. 예시적인 보존적 치환은 문헌 [Lehninger, [Biochemistry, 2nd Edition; Worth Publishers, Inc., New York (1975), pp.71-77]]에 기재되어 있고 바로 아래에 설명되어 있다.
보존적 치환
측쇄 특징 아미노산
무극성 (소수성):
A. 지방족 A L I V P
B. 방향족 F W
C. 황-함유 M
D. 경계 G
비대전된-극성:
A. 히드록실 S T Y
B. 아미드 N Q
C. 술프히드릴 C
D. 경계 G
양으로 대전된 (염기성) K R H
음으로 대전된 (산성) D E
별법으로, 예시적 보존적 치환이 바로 아래 설명되어 있다.
보존적 치환 II
본래 잔기 예시적 치환
Ala (A) Val, Leu, Ile
Arg (R) Lys, Gln, Asn
Asn (N) Gln, His, Lys, Arg
Asp (D) Glu
Cys (C) Ser
Gln (Q) Asn
Glu (E) Asp
His (H) Asn, Gln, Lys, Arg
Ile (I) Leu, Val, Met, Ala, Phe,
Leu (L) Ile, Val, Met, Ala, Phe
Lys (K) Arg, Gln, Asn
Met (M) Leu, Phe, Ile
Phe (F) Leu, Val, Ile, Ala
Pro (P) Gly
Ser (S) Thr
Thr (T) Ser
Trp (W) Tyr
Tyr (Y) Trp, Phe, Thr, Ser
Val (V) Ile, Leu, Met, Phe, Ala
"천연" 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열은 전형적으로 영장류, 예를 들어 인간; 설치류, 예를 들어 래트, 마우스, 햄스터; 소, 돼지, 말, 양 또는 임의의 포유동물을 포함하나 이에 제한되지 않는 포유동물로부터 유래된다. 본 개시의 핵산 및 단백질은 재조합 분자 (예를 들어, 이종, 및 야생형 서열 또는 그의 변이체를 코딩함, 또는 비천연)일 수 있다. 참조 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열은 예를 들어, UniProtKB/Swiss-Prot P00451 (FA8_인간); 문헌 [Gitschier J et al., Characterization of the human Factor VIII gene, Nature, 312(5992): 326-30 (1984)]; [Vehar GH et al., Structure of human Factor VIII, Nature, 312(5992):337-42 (1984)]; 및 [Thompson AR. Structure and Function of the Factor VIII gene and protein, Semin Thromb Hemost, 2003:29;11-29 (2002)] (참고문헌들은 그 전문이 본원에 포함됨)을 포함한다.
본원에서 사용되는 "생물학상 활성인 유사체" 또는 "생물학상 활성인 변이체"는 상기 분자의 실질적으로 동일한 기능적 및/또는 생물학적 특성, 예컨대 결합 특성 및/또는 동일한 구조적 기초, 예컨대 펩티드성 골격 또는 기본 중합체성 단위를 갖는 분자의 임의의 유사체 또는 변이체를 포함한다.
본원에서 사용되는 "혈장-유래된 FVIII " 또는 "혈장성"은 응고 경로를 활성화하는 특성을 갖는, 포유동물로부터 얻은 혈액에서 발견되는 단백질의 모든 형태를 포함한다.
다양한 측면에서, rFVIII의 생성은 (i) 유전 공학에 의한 재조합 DNA의 생성, (ii) 예를 들어 및 제한 없이, 형질감염, 전기천공법 또는 미세주입에 의한 원핵생물 또는 진핵생물 세포로의 재조합 DNA의 도입, (iii) 상기 형질전환된 세포의 배양, (iv) 예를 들어 구성적으로 또는 유도시 rFVIII의 발현, 및 (v) 예를 들어 배양 배지로부터 또는 형질전환된 세포의 수확에 의한 상기 rFVIII의 단리, (vi) 정제된 rFVIII을 얻기 위한 당분야에 공지된 임의의 방법을 포함한다.
다른 측면에서, rFVIII은 약리학상 허용되는 rFVIII 분자를 생성하는 것을 특징으로 하는 적합한 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 시스템에서 발현에 의해 생성된다. 진핵생물 세포의 예는 포유동물 세포, 예컨대 CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep 및 HepG2이다.
또 다른 측면에서, 광범위하게 다양한 벡터가 rFVIII의 제조를 위해 사용되고, 진핵생물 및 원핵생물 발현 벡터로부터 선택된다. 원핵생물 발현을 위한 벡터의 예로는 플라스미드, 예컨대 및 제한 없이, pRSET, pET 및 pBAD가 포함되며, 여기서 원핵생물 발현 벡터에서 사용되는 프로모터에는 제한 없이 lac, trc, trp, recA 또는 araBAD 중 하나 이상이 포함된다. 진핵생물 발현을 위한 벡터의 예로는 (i) 프로모터, 예컨대 및 제한 없이, AOX1, GAP, GAL1 또는 AUG1을 이용한 효모에서의 발현을 위한 벡터, 예컨대 및 제한 없이, pAO, pPIC, pYES 또는 pMET; (ii) 프로모터, 예컨대 및 제한 없이 PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64 또는 polh를 이용한 곤충 세포에서 발현을 위한 벡터, 예컨대 및 제한 없이, pMT, pAc5, pIB, pMIB 또는 pBAC, 및 (iii) 프로모터, 예컨대 및 제한 없이 CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV 및 β-액틴을 이용한 포유동물 세포에서 발현을 위한 벡터, 예컨대 및 제한 없이 pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3 또는 pBPV, 및 한 측면에서, 바이러스의 시스템, 예컨대 및 제한 없이 우두 바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스 또는 레트로바이러스로부터 유래된 벡터가 포함된다.
"국제 단위" 또는 "IU"는 표준 검정, 예컨대 일단계 검정에 의해 측정된 바와 같은 FVIII의 혈액 응고 활성 (효력)의 측정치의 단위이다. 일단계 검정, 예컨대 문헌 [N Lee, Martin L, et al., An Effect of Predilution on Potency Assays of FVIII Concentrates, Thrombosis Research (Pergamon Press Ltd.) 30, 511 519 (1983)]에 기재된 바와 같은 검정이 당분야에 공지되어 있다. 또 다른 표준 검정은 비색 검정이다. 비색 검정, 예컨대 크로모게익스 아베 (Chromogeix AB; 스웨덴 묄른달)로부터 이용가능한 코티스트(Coatest) 제8 인자를 상업적으로 구입할 수 있다.
용어 "어닐링"은 제제의 건조 단계 전에 동결건조를 거치는 제약 제제의 동결건조 공정에서의 단계를 나타내는데 사용될 수 있으며, 여기서 동결된 제제의 온도는 더 낮은 온도로부터 더 높은 온도로 상승된 후 일정 기간 후 다시 냉각된다.
증량제는 동결건조된 후 제약 제제의 "케이크" 또는 잔류 고체 덩어리에 구조를 제공하고 붕괴로부터 이를 보호하는 화학적 실체이다. 결정화가능한 증량제는 염화나트륨 이외에 동결건조 동안 결정화될 수 있는 본원에 기재된 바와 같은 증량제를 의미할 수 있다. 헤스(HES)는 결정화가능한 증량제의 이 군에 포함되지 않는다.
동결-건조는 이것이 표시된 문맥에 의해 별도의 표시가 없는 경우, 제제 밖으로 물을 몰아내기 위해 제약 제제의 온도를 상승시키는 동결건조 공정의 부분을 나타내는데 사용될 수 있다. 동결건조 공정의 "동결" 단계는 동결-건조 단계 전에 수행되는 단계이다. "동결건조"는 별도의 표시가 없는 경우, 동결 단계 및 동결-건조 단계 둘 모두를 포함하는 동결건조의 전체 공정을 지칭할 수 있다.
별도의 언급이 없는 경우, 백분율 용어는 중량/부피 백분율을 표시하고, 온도는 섭씨 크기이다.
제형 및 동결건조 개발
최대 안정성을 달성하기 위해, 본 개시의 FVIII 조성물은 한 측면에서 동결건조된다. 동결건조 동안, FVIII은 수성상에 존재하는 것으로부터 무정형 고체상에 존재하는 것으로 전환되며, 이는 화학적 및/또는 형태적 불안정성으로부터 단백질을 보호하는 것으로 생각된다. 동결건조된 제제는 무정형 상을 함유할 뿐만 아니라 동결건조 동안 결정화하는 구성성분을 포함한다. 이러한 구성성분의 포함은 FVIII 조성물의 신속한 동결건조 및 더 정교한 케이크의 형성 (즉, 케이크 구조의 유지 및 이것이 동결건조된 용기의 측면으로부터의 최소 수축을 갖는 케이크)을 허용하는 것으로 생각된다. 본 개시의 제형에서, 안정화제는 동결건조된 생성물의 무정형 상에 존재하도록 선택되었으나, 증량제 (헤스 제외)는 동결 동안 결정화하도록 선택되었다.
한 측면에서, FVIII 및 안정화제 둘 모두는 동결건조된 케이크의 무정형 상에 분산된다. 한 측면에서, 안정화제의 덩어리는 또한 무정형 형태의 다른 부형제와 비교하여 크다. 또한, 한 측면에서, 무정형 상의 겉보기 유리 전이 온도 (Tg')는 동결-건조 동안 상대적으로 높고, 고체의 유리 전이 온도 (Tg)는 바람직하게는 저장 동안 마찬가지로 높다. 생성물 내 염화나트륨의 결정화는 바람직한 것으로 밝혀졌으며, 이는 무정형 염화나트륨이 무정형 상의 Tg'를 저하시킬 것이기 때문이다.
한 측면에서, 특정 조성물의 케이크의 붕괴를 회피하기 위해, 1차 건조는 동결 농축물의 겉보기 유리 전이 온도 미만의 생성물 온도에서 수행된다. 건조 시간의 증가가 또한 Tg'의 감소를 상쇄하기 위해 필요로 될 수 있다. 동결건조에 대한 추가 정보가 문헌 [Carpenter, J. F. and Chang, B. S., Lyophilization of Protein Pharmaceuticals, Biotechnology and Biopharmaceutical Manufacturing, Processing and Preservation, K. E. Avis and V. L. Wu, eds. (Buffalo Grove, Ill.: Interpharm Press, Inc.), pp. 199 264 (1996)], 미국 특허 제7,247,707호, 제7,087,723호, 제6,586,573호에서 찾을 수 있다.
동결건조는 당분야에서 흔한 기술을 이용하여 수행되고, 개발될 조성물을 위해 최적화되어야 한다 [문헌 [Tang et al., Pharm Res. 21:191-200, (2004)] 및 [Chang et al., Pharm Res. 13:243-9 (1996)]].
한 측면에서, 동결건조 사이클은 3개의 단계로 구성된다: 동결, 1차 건조 및 2차 건조 [문헌 [A.P. Mackenzie, Phil Trans R Soc London, Ser B, Biol 278:167 (1977)]]. 동결 단계에서, 용액은 얼음 형성을 개시하기 위해 냉각된다. 더욱이, 이 단계는 증량제의 결정화를 유도한다. 얼음은 1차 건조 단계에서 승화하며, 이는 챔버 압력을 진공을 이용하여 얼음의 증기압 미만으로 감소시키고 승화를 촉진하기 위해 열을 도입함으로써 수행된다. 마지막으로, 흡착되거나 결합된 물이 2차 건조 단계에서 감소된 챔버 압력 하에 및 상승된 선반 온도에서 제거된다. 공정은 동결건조된 케이크로서 공지된 물질을 생성한다. 그 후, 케이크는 주사를 위한 멸균수 또는 적합한 희석제로 재구성될 수 있다.
동결건조 사이클은 부형제의 최종 물리적 상태를 결정할 뿐만 아니라, 또한 다른 파라미터, 예컨대 재구성 시간, 외관, 안정성 및 최종 수분 함량에 영향을 미친다. 동결된 상태의 조성물 구조는 특정 온도에서 일어나는 여러 전이 (예를 들어, 유리 전이 및 결정화)를 통해 진행되고, 구조는 동결건조 공정을 이해하고 최적화하기 위해 사용될 수 있다. Tg 및/또는 Tg'는 용질의 물리적 상태에 대한 정보를 제공할 수 있고, 시차 주사 열량측정법 (DSC)에 의해 결정될 수 있다. Tg 및 Tg'는 동결건조 사이클의 설계시 고려되어야 하는 중요한 파라미터이다. 예를 들어, Tg'는 1차 건조를 위해 중요하다. 더욱이, 건조된 상태에서, 유리 전이 온도는 최종 생성물을 위한 아마 허용되는 저장 온도에 대한 정보를 제공한다.
한 측면에서, 활성 약물 이외에, 제형 구성성분은 안정화제, 계면활성제, 완충제, 및 저용량 약물의 경우 증량제를 포함한다. 다양한 측면에서. 단백질의 독특한 요구를 해결하는 특별한 구성성분, 예컨대 FVIII의 경우 Ca+2가 또한 포함된다. 많은 첨가제, 예컨대 당, 글리세롤, 특정 아미노산 및 아민은 모두 안정화제로서 기능할 수 있다. 안정성은 종종 "유리 역학"의 면에서 합리화되며, 즉 제형은 동결-건조 동안 '비-반응성' 무정형 고체 또는 유리를 틀림없이 형성할 것이며, 여기서 단백질은 분자적으로 분산되고, 단백질 및 잠재적 반응물의 이동성이 크게 제한되도록 고정 유리질 매트릭스에 커플링된다. 고정화는 적어도 정성적으로 안정화를 의미하며, 이는 임의의 분해 공정이 일부 유형의 분자 이동성을 필요로 할 것이기 때문이다. 동결된 농축물의 유리질 매트릭스 및 건조된 무정형 상은 각각 그의 유리 전이 온도, Tg' 및 Tg를 특징으로 한다. 유리 전이 온도 미만에서 이동성은 매우 제한되게 되고, 반대로 유리 전이 훨씬 초과에서 이동성은 신속한 화학적 및 물리적 분해 공정을 지지하기에 충분히 높게 된다. 일반적으로, 1차 건조 동안 생성물 온도 (Tp)는 동결 건조 동안 무정형 매트릭스의 붕괴를 회피하기 위해 (즉, 바람직하지 못한 물리적 변화를 회피하기 위해) Tg' 부근 또는 미만 (Tp< Tg')으로 제어되어야 하고, 신속한 분해를 회피하기 위해 저장 동안 Tg 미만으로 유지되어야 한다. 그러나, Tg 미만에서의 단순 저장이 허용되는 안정성을 반드시 보증하는 것은 아니다. 이당류는 효과적인 물 치환물 및 양호한 유리 형성제로서 기능하게 하는 특성을 갖는다. 전형적으로, 수크로스 및 트레할로스가 안정화제로서 사용된다.
본원에 기재된 바와 같은, 증량제는 단백질 제형에서 또 다른 중요한 부형제이다. 증량제의 기능은 "정교성"을 제공하고 보다 중요하게는 "분출"로부터 생성물을 보호하는 것이다. 즉, 저용량 약물의 경우, 약물 농도는 생성된 건조된 생성물 또는 케이크가 적은 기계적 강도를 가질 정도로 작을 수 있다. 그러므로, 유동하는 수증기로부터의 운동량 전이는 케이크를 붕해시키고 바이알 밖의 생성물 조각을 건조 챔버로 전이시킬 수 있다. 전형적으로, 높은 공융점을 갖는 가용성의 용이하게 결정화되는 물질은 붕괴로 인한 손상 없이 용이하게 동결 건조되기 때문에 증량제로서 잘 기능한다. 만니톨 및 글리신이 제약 생성물에서 흔히 사용된다. 증량제는 본질적으로 완전한 결정화를 보증하기 위해 주요 구성성분으로서 존재할 필요가 있다.
일반적으로 제형 및 부형제
부형제는 제조성 및/또는 최종 생성물 품질, 예컨대 약물 생성물 (예를 들어, 단백질)의 안정성 및 전달성을 부여하거나 향상시키는 첨가제이다. 이것의 포함에 대한 이유에 관계없이 부형제는 제형의 필수 구성성분이고, 그러므로 안전하고 환자에 의해 잘 관용될 필요가 있다. 단백질 약물의 경우, 부형제의 선택이 특히 중요하며, 이는 약물의 효능 및 면역원성 둘 모두에 영향을 미칠 수 있기 때문이다. 따라서, 단백질 제형은 적합한 안정성, 안전성 및 시장성을 부여하는 부형제의 적절한 선택으로 개발될 필요가 있다.
한 실시양태에서, 동결건조된 제형은 완충제, 증량제 및 안정화제 중 하나 이상을 적어도 포함한다. 이 실시양태에서, 동결건조 단계 동안 또는 재구성 동안의 응집이 문제가 되는 경우에 계면활성제의 유용성이 평가되고 선택된다. 적절한 완충제가 동결건조된 생성물의 제조 동안 (예를 들어 희석, 멸균 여과, 충전 등) 및 재구성 후 pH의 안정한 대역 내에서 제형을 유지시키기 위해 포함된다. 액체 및 동결건조된 단백질 제형을 위해 고려되는 부형제 구성성분의 비교는 하기 표에 제공된다:
단백질을 위한 제형의 개발에서 주요 도전은 제조, 배송 및 저장의 스트레스로부터 생성물을 안정화하는 것이다. 제형 부형제의 역할은 이들 스트레스로부터 안정화를 제공하는 것이다. 부형제는 또한 그의 전달을 가능하게 하고 환자 편리성을 향상시키기 위해 고농도 단백질 제형의 점도를 감소시키는데 사용된다. 일반적으로, 안정화제는 다양한 화학적 및 물리적 스트레스로부터 단백질을 안정화하는 메카니즘에 기초하여 분류될 수 있다. 몇몇 안정화제는 특정 스트레스의 효과를 경감시키거나 특정 단백질의 특정 감수성을 조절하는데 사용된다. 다른 안정화제는 단백질의 물리적 및 공유결합적 안정성에 대한 더 일반적인 효과를 갖는다. 본원에 기재된 안정화제는 그의 화학적 유형 또는 제형에서 그의 기능적 역할에 의해 조직화된다. 안정화 방식의 간단한 설명은 각각의 안정화제 유형의 논의시 제공된다.
본원에 제공된 교시내용 및 지침이 주어지면, 당업자는 생물약제 (예를 들어, 단백질)의 안정성의 유지를 아마 촉진하는 본 개시의 생물약제 제형을 달성하기 위해 부형제의 어느 양 또는 범위가 임의의 특정 제형에 포함될 수 있다는 것을 알 것이다.
물론, 당업자는 본원에 기재된 부형제의 농도가 특정 제형 내에 상호의존성을 공유한다는 것을 이해할 것이다. 예로서, 한 측면에서, 증량제의 농도는 예를 들어 높은 단백질 농도가 존재하는 경우 또는 예를 들어 높은 안정화제 농도가 존재하는 경우 저하된다. 또한, 당업자는 증량제가 존재하지 않는 특정 제형의 등장성을 유지하기 위해 안정화제의 농도가 따라서 증가될 수 있다 (즉, 안정화제의 "등장화" 양이 사용될 것임)는 것을 이해할 것이다. 통상적인 부형제는 당분야에 공지되어 있고, 문헌 [Powell et al., Compendium of Excipients for Parenteral Formulations (1998), PDA J. Pharm. Sci. Technology, 52:238-311]에서 찾을 수 있다.
완충액 및 완충제
약리학상 활성인 단백질 제형의 안정성은 통상적으로 좁은 pH 범위에서 최대인 것으로 관측된다. 최적 안정성의 이러한 pH 범위는 제제화전 연구 동안 초기에 확인될 필요가 있다. 여러 접근법, 예컨대 가속화된 안정성 연구 및 열량측정 스크리닝 연구가 이러한 시도에서 유용하다 (문헌 [Remmele R.L. Jr., et al., Biochemistry, 38(16): 5241-7 (1999)]). 제형이 마무리되면, 단백질은 제조되고 그의 저장 수명에 걸쳐 유지되어야 한다. 그러므로, 완충제가 제형 내 pH를 제어하기 위해 거의 항상 사용된다.
완충성 종의 완충제 능력은 pKa와 동등한 pH에서 최대이고, pH가 증가될 때 감소되거나, 이러한 값으로부터 멀어질 때 감소된다. 완충 능력의 90％는 그의 pKa의 1 pH 단위 내에 존재한다. 완충제 능력은 또한 완충제 농도 증가에 따라 비례적으로 증가한다.
완충제를 선택할 때 여러 인자가 고려될 필요가 있다. 첫째 및 최초로, 완충제 종 및 그의 농도는 그의 pKa 및 바람직한 제형 pH에 기초하여 한정될 필요가 있다. 완충제가 단백질 및 다른 제형 부형제와 상용성이 있고 어떠한 분해 반응도 촉매하지 않는다는 것을 확실하게 하는 것이 동등하게 중요하다. 고려되는 세번째 중요한 측면은 완충제가 투여시 유도할 수 있는 고통 및 자극의 감각이다. 예를 들어, 시트레이트는 주사시 고통을 유발하는 것으로 공지되어 있다 (문헌 [Laursen T, et al., Basic Clin Pharmacol Toxicol., 98(2): 218-21 (2006)]). 고통 및 자극에 대한 잠재성은 제형이 투여시 혈액으로 신속하게 희석되는 IV 경로에 의한 투여시보다 상대적으로 더 긴 기간 동안 부위에서 약물 용액이 유지되는 피하 (SC) 또는 근육내 (IM) 경로를 통해 투여되는 약물의 경우 더 크다. 직접 IV 주입에 의해 투여되는 제형의 경우, 완충제 (및 임의의 다른 제형 구성성분)의 총량을 모니터링할 필요가 있다. 환자에서 심혈관 효과를 유도할 수 있는 인산칼륨 완충제의 형태로 투여되는 칼륨 이온에 대해 특히 주의해야 한다 (문헌 [Hollander-Rodriguez JC, et al., Am. Fam. Physician., 73(2): 283-90 (2006)]).
동결건조된 제형을 위한 완충제가 추가로 고려될 필요가 있다. 인산나트륨과 같은 몇몇 완충제는 동결 동안 단백질 무정형 상 밖으로 결정화되어 pH의 이동을 유발할 수 있다. 다른 일반적인 완충제, 예컨대 아세테이트 및 이미다졸은 동결건조 공정 동안 승화하거나 증발할 수 있으며, 이에 의해 동결건조 동안 또는 재구성 후 제형의 pH를 이동시킬 수 있다.
한 실시양태에서, 조성물에 존재하는 완충계는 생리학상 상용성이 있고 제약 제형의 바람직한 pH를 유지하도록 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 용액의 pH는 pH 2.0 내지 pH 12.0이다. 예를 들어, 다양한 실시양태에서, 용액의 pH는 2.0, 2.3, 2.5, 2.7, 3.0, 3.3, 3.5, 3.7, 4.0, 4.3, 4.5, 4.7, 5.0, 5.3, 5.5, 5.7, 6.0, 6.3, 6.5, 6.7, 7.0, 7.3, 7.5, 7.7, 8.0, 8.3, 8.5, 8.7, 9.0, 9.3, 9.5, 9.7, 10.0, 10.3, 10.5, 10.7, 11.0, 11.3, 11.5, 11.7 또는 12.0일 수 있다.
pH 완충성 화합물은 제형의 pH를 예정된 수준에서 유지하기에 적합한 임의의 양으로 존재할 수 있다. 완충제의 적절히 낮은 수준이 사용되는 경우, 결정화 및 pH 이동이 회피될 수 있다. 한 실시양태에서, pH 완충성 농도는 0.1 mM 내지 500 mM (1 M)이다. 예를 들어, pH 완충제는 적어도 0.1, 0.5, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.5, 1.7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200 또는 500 mM인 것으로 고려된다.
본원에서 설명된 바와 같은 제형을 완충하는데 사용되는 예시적인 pH 완충제로는 유기산, 글리신, 히스티딘, 글루타메이트, 숙시네이트, 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 트리스, 헤페스, 및 아스파르테이트, 히스티딘 및 글리신을 포함하나 이에 제한되지 않는 아미노산 또는 아미노산들의 혼합물이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 본 개시의 한 실시양태에서, 완충제는 히스티딘이다.
안정화제 및 증량제
본 제약 제형의 한 실시양태에서, 안정화제 (또는 안정화제들의 조합)가 저장-유도된 응집 및 화학적 분해를 방지하거나 감소시키기 위해 첨가된다. 재구성시 뿌연 또는 혼탁한 용액은 통상적으로 단백질이 침전되거나 적어도 응집된 것을 나타낸다. 용어 "안정화제"는 응집 또는 화학적 분해 (예를 들어, 자가분해, 탈아미드화, 산화 등)를 방지할 수 있는 부형제를 의미한다. 특정 실시양태에서, 고려되는 안정화제에는 수크로스, 트레할로스, 만노스, 말토스, 락토스, 글루코스, 라피노스, 셀로비오스, 겐티오비오스, 이소말토스, 아라비노스, 글루코사민, 프룩토스, 만니톨, 소르비톨, 글리신, 아르기닌 HCL, 폴리-히드록시 화합물, 예를 들어 다당류, 예컨대 덱스트란, 전분, 히드록시에틸 전분, 시클로덱스트린, N-메틸 피롤리덴, 셀룰로스 및 히알루론산, 염화나트륨, 염화칼슘이 포함되나 이에 제한되지 않는다 [문헌 [Carpenter et al., Develop. Biol. Standard 74:225, (1991)]]. 본 개시의 한 실시양태에서, 트레할로스가 안정화제로서 사용된다. 본 개시의 또 다른 실시양태에서, 수크로스가 안정화제로서 사용된다. 본 제형에서, 특정 실시양태에서, 안정화제는 약 0.1, 0.5, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.5, 1.7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 700, 900 또는 1000 mM의 농도로 혼입된다. 마찬가지로, 본 개시의 특정 실시양태에서, 안정화제는 약 0.005, 0.01, 0.02, 0.03, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.5, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.5, 1.7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20％ w/v의 농도로 혼입된다.
필요하다면, 제형은 또한 적절한 양의 증량제 및 삼투 조절제를 포함한다. 본 개시의 다양한 실시양태에서, 증량제에는 예를 들어 및 제한 없이, 만니톨, 글리신, 수크로스, 중합체, 예컨대 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈, 카르복시메틸셀룰로스, 락토스, 소르비톨, 트레할로스 또는 크실리톨이 포함된다. 한 실시양태에서, 증량제는 만니톨이다. 본 개시의 다양한 실시양태에서, 증량제는 약 0.1, 0.5, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.5, 1.7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 700, 900 또는 1000 mM의 농도로 혼입된다.
계면활성제
단백질은 공기-액체, 바이알-액체 및 액체-액체 (실리콘 오일) 계면에서 흡착 및 변성에 대해 감수성이 되게 하는 표면과 상호작용하는 높은 성향을 갖는다. 이 분해 경로는 단백질 농도에 반비례로 의존적인 것으로 관측되었고, 표면에 대한 흡착을 통해 가용성 및 불용성 단백질 응집물의 형성 또는 용액으로부터의 단백질의 손실을 유발한다. 용기 표면 흡착 이외에, 표면-유도된 분해는 생성물의 배송 및 취급 동안 경험되는 물리적 진탕으로 악화된다.
계면활성제는 표면-유도된 분해를 방지하기 위해 단백질 제형에서 흔히 사용된다. 계면활성제는 계면 위치에서 단백질을 경쟁하여 능가하는 능력을 갖는 (및/또는 구조적으로 변경된 단백질 분자의 적절한 리폴딩을 촉진하는) 양친매성 분자이다. 계면활성제 분자의 소수성 부분은 계면 위치를 차지하나 (예를 들어, 공기/액체), 분자의 친수성 부분은 벌크 용매를 향해 배향되어 유지된다. 충분한 농도 (전형적으로 디터전트의 임계 미셀 농도 주변)에서, 계면활성제 분자의 표면층은 단백질 분자가 계면에서 흡착하는 것을 방지하는 작용을 한다. 이에 의해, 표면-유도된 분해가 최소화된다. 본원에서 고려되는 계면활성제에는 제한 없이, 소르비탄 폴리에톡실레이트의 지방산 에스테르, 즉 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80이 포함된다. 상기 둘은 분자에 소수성 특징을 부여하는 지방족 쇄의 길이만 상이하다 (각각 C-12 및 C-18). 따라서, 폴리소르베이트-80은 폴리소르베이트-20보다 더 표면-활성이고 더 낮은 임계 미셀 농도를 갖는다.
디터전트가 또한 단백질의 열역학 형태적 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 비이온성 계면활성제는 일반적으로 단백질 안정화에서 유용하다. 이온성 계면활성제 (디터전트)는 통상적으로 단백질을 탈안정화한다. 본원에서 다시, 주어진 디터전트 부형제의 효과는 단백질 특이적일 것이다. 예를 들어, 폴리소르베이트는 몇몇 단백질의 안정성을 감소시키고 다른 것들의 안정성을 증가시키는 것으로 나타났다. 단백질의 디터전트 탈안정화는 부분적으로 또는 전체적으로 언폴딩된 단백질 상태에서 특이적 결합으로 속박할 수 있는 디터전트 분자의 소수성 꼬리의 면에서 합리화될 수 있다. 이들 유형의 상호작용은 더 확장된 단백질 상태를 향한 형태적 평형의 이동을 유발할 수 있다 (즉 폴리소르베이트 결합에 보충하여 단백질 분자의 소수성 부분의 노출을 증가시킴). 별법으로, 단백질 천연 상태가 일부 소수성 표면을 나타내는 경우, 천연 상태에 결합하는 디터전트가 상기 형태를 안정화할 수 있다.
폴리소르베이트의 또 다른 측면은 고유하게 산화적 분해에 대해 감수성이라는 것이다. 종종, 원료로서, 이는 단백질 잔기 측쇄, 특히 메티오닌의 산화를 유발하는 충분한 양의 과산화물을 함유한다. 안정화제의 첨가로부터 발생하는 산화적 손상에 대한 잠재성은 부형제의 가장 낮은 유효 농도가 제형에서 사용되어야 한다는 점을 강조한다. 계면활성제의 경우, 주어진 단백질에 대한 유효 농도는 안정화 메카니즘에 의존할 것이다.
계면활성제는 또한 동결 및 건조 동안 표면 관련된 응집 현상을 방지하기 위해 적절한 양으로 첨가된다 [문헌 [Chang, B, J. Pharm. Sci. 85:1325, (1996)]]. 그러므로, 예시적인 계면활성제에는 제한 없이, 천연 아미노산으로부터 유래된 계면활성제를 포함하는 음이온성, 양이온성, 비이온성, 양쪽이온성 및 양친매성 계면활성제가 포함된다. 음이온성 계면활성제에는 나트륨 라우릴 술페이트, 디옥틸 나트륨 술포숙시네이트 및 디옥틸 나트륨 술포네이트, 케노데옥시콜산, N-라우로일사르코신 나트륨 염, 리튬 도데실 술페이트, 1-옥탄술폰산 나트륨 염, 나트륨 콜레이트 수화물, 나트륨 데옥시콜레이트 및 글리코데옥시콜산 나트륨 염이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 양이온성 계면활성제에는 벤잘코늄 클로라이드 또는 벤제토늄 클로라이드, 세틸피리디늄 클로라이드 일수화물 및 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 양쪽이온성 계면활성제에는 CHAPS, CHAPSO, SB3-10 및 SB3-12가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 비이온성 계면활성제에는 디기토닌, 트리톤 X-100, 트리톤 X-114, 트윈-20 및 트윈-80이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 계면활성제에는 또한 라우로마크로골 400, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 수소화된 피마자유 10, 40, 50 및 60, 글리세롤 모노스테아레이트, 폴리소르베이트 40, 60, 65 및 80, 대두 레시틴 및 다른 인지질, 예컨대 디올레일 포스파티딜 콜린 (DOPC), 디미리스토일포스파티딜 글리세롤 (DMPG), 디미리스토일포스파티딜 콜린 (DMPC) 및 디올레일 포스파티딜 글리세롤 (DOPG); 수크로스 지방산 에스테르, 메틸 셀룰로스 및 카르복시메틸 셀룰로스가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 그러므로, 이들 계면활성제를 개별적으로 또는 혼합물로서 상이한 비율로 포함하는 조성물이 추가로 제공된다. 본 개시의 한 실시양태에서, 계면활성제는 트윈-80이다. 본 제형에서, 계면활성제는 약 0.01 내지 약 0.5 g/L의 농도로 혼입된다. 다양한 실시양태에서, 제공된 제형에서, 계면활성제 농도는 0.005, 0.01, 0.02, 0.03, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1.0 g/L이다. 마찬가지로, 본 개시의 특정 실시양태에서, 계면활성제는 약 0.001, 0.002, 0.003, 0.004, 0.005, 0.01, 0.02, 0.03, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.5, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1.0％ w/v의 농도로 혼입된다.
염
염은 종종 단백질 용해도, 물리적 안정성 및 등장성에 중요할 수 있는 제형의 이온 강도를 증가시키기 위해 첨가된다. 염은 다양한 방법으로 단백질의 물리적 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 이온은 단백질의 표면 상의 대전된 잔기에 결합함으로써 단백질의 천연 상태를 안정화할 수 있다. 별법으로, 염은 단백질 골격에 따라 펩티드 기 (-CONH-)에 결합함으로써 변성된 상태를 안정화할 수 있다. 염은 또한 단백질 분자 내 잔기 간의 척력 정전기적 상호작용을 차폐함으로써 단백질 천연 형태를 안정화할 수 있다. 단백질 제형에서 염은 또한 단백질 응집 및 불용성을 초래할 수 있는 단백질 분자 간의 인력 정전기적 상호작용을 차폐할 수 있다. 염 (즉, 전해질)은 일반적으로 유의하게 Tg'를 감소시켜, 이에 의해 제형을 동결 건조하는 것을 더 곤란하게 하고 종종 불가능하게 한다. 이러한 이유로, 단백질 구조적 안정성을 유지시키기에 충분한 염만이 제형에 포함되어야 하고, 통상적으로 이러한 수준의 전해질은 매우 낮다.
특정 실시양태에서, 제형의 염 농도는 0.0 (즉, 염 없음), 0.001, 0.002, 0.003, 0.004, 0.005, 0.006, 0.007, 0.008, 0.009, 0.010, 0.011, 0.012, 0.013, 0.014, 0.015, 0.020, 0.050, 0.080, 0.1, 1, 10, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 300 내지 500 mM이다. 본 개시의 한 실시양태에서, 0.0 mM NaCl (즉, NaCl 없음)이 제형에 포함된다. 당업자는 본 개시의 다양한 실시양태에 따라 NaCl이 생략되거나 제거되나 한편 미량의 NaCl이 존재할 수 있다 (즉, 투석 또는 크로마토그래피 절차를 통한 NaCl 제거의 한계로 인해)는 것을 이해할 것이다. 그러므로, 다양한 실시양태에서, "NaCl의 배제"는 NaCl이 제형에 결코 첨가되지 않는다는 것을 의미하고, "미량의 NaCl"은 NaCl이 (예를 들어, 투석, 용매 교환 크로마토그래피 등에 의해 가능한 정도로) 제형으로부터 제거되었다는 것을 의미한다.
기타 통상적인 부형제 구성성분
아미노산
아미노산은 완충제, 증량제, 안정화제 및 항산화제로서 단백질 제형에서 다양한 용도를 발견하였다. 그러므로, 한 측면에서, 히스티딘 및 글루탐산이 각각 5.5 내지 6.5 및 4.0 내지 5.5의 pH 범위에서 단백질 제형을 완충하는데 사용된다. 히스티딘의 이미다졸 기는 pKa = 6.0을 갖고, 글루탐산 측쇄의 카르복실 기는 4.3의 pKa를 가지며, 이에 의해 이들 아미노산은 그의 각 pH 범위에서 완충하기에 적합하다. 글루탐산은 이러한 경우에 특히 유용하다. 히스티딘은 판매되는 단백질 제형에서 흔히 발견되고, 이러한 아미노산은 주사시 고통을 주는 것으로 공지된 완충제인 시트레이트에 대한 대안을 제공한다. 흥미롭게는, 히스티딘은 또한 액체 및 동결건조된 제형 둘 모두에서 높은 농도로 사용되는 경우 응집과 관련하여 안정화 효과를 갖는 것으로 보고되었다 (문헌 [Chen B, et al., Pharm Res., 20(12): 1952-60 (2003)]). 히스티딘은 또한 높은 단백질 농도 제형의 점도를 감소시키는 것으로 관찰되었다. 그러나, 동일한 연구에서, 저자들은 스테인리스 스틸 용기에서 항체의 동결-해동 연구 동안 히스티딘 함유 제형에서 증가된 응집 및 변색을 관찰하였다. 히스티딘에서의 또 다른 주의 사항은 금속 이온의 존재하에 광산화를 거친다는 것이다 (문헌 [Tomita M, et al., Biochemistry, 8(12): 5149-60 (1969)]). 제형에서 항산화제로서 메티오닌의 사용은 유망한 것으로 보이며; 이는 수많은 산화적 스트레스에 대해 효과적인 것으로 관찰되었다 (문헌 [Lam XM, et al., J Pharm Sci., 86(11): 1250-5 (1997)]).
다양한 측면에서, 아미노산 글리신, 프롤린, 세린, 아르기닌 및 알라닌 중 하나 이상을 포함하는 제형이 제공되며, 이는 우선적 배제의 메카니즘에 의해 단백질을 안정화하는 것으로 나타났다. 글리신은 또한 동결건조된 제형에서 흔히 사용되는 증량제이다. 아르기닌은 응집을 억제하는데 효과적인 작용제인 것으로 나타났고, 액체 및 동결건조된 제형 둘 모두에서 사용되었다.
제공된 제형에서, 아미노산 농도는 0.1, 1, 10, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 300 내지 500 mM이다. 본 개시의 한 실시양태에서, 아미노산은 글리신이다.
항산화제
단백질 잔기의 산화는 수많은 상이한 공급원으로부터 발생한다. 특정 항산화제의 첨가 이외에, 산화적 단백질 손상의 방지는 생성물의 제조 공정 및 저장에 걸친 수많은 인자, 예컨대 대기 산소, 온도, 광 노출 및 화학적 오염의 주의적 제어를 수반한다. 본 개시는 그러므로 제한 없이, 환원제, 산소/자유-라디칼 스캐빈져 또는 킬레이트제를 포함하는 제약 항산화제의 사용을 고려한다. 한 측면에서, 치료학적 단백질 제형에서 항산화제는 수용성이고, 생성물 저장 수명에 걸쳐 활성을 유지한다. 환원제 및 산소/자유-라디칼 스캐빈져는 용액 내 활성 산소 종을 제거함으로써 작용한다. 킬레이트제, 예컨대 EDTA는 자유-라디칼 형성을 촉매하는 미량의 금속 오염물질에 결합함으로써 효과적이다. 예를 들어, EDTA는 시스테인 잔기의 금속 이온 촉매된 산화를 억제하기 위해 산성 섬유모세포 성장 인자의 액체 제형에서 사용되었다. 본 개시의 한 실시양태에서, 글루타티온이 제형에 포함된다. 본원에 제공된 제형의 다양한 실시양태에서, 항산화제 농도는 0.005, 0.01, 0.02, 0.03, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1.0 mg/mL이다.
단백질 산화를 방지하기 위한 다양한 부형제의 유효성 이외에, 단백질에 다른 공유결합적 또는 물리적 변화를 유도하는 항산화제 그 자체에 대한 잠재성이 관심사이다. 예를 들어, 환원제는 분자내 디술피드 연결의 파괴를 유발할 수 있으며, 이는 디술피드 셔플링(shuffling)을 초래할 수 있다. 전이 금속 이온의 존재하에, 아스코르브산 및 EDTA는 수많은 단백질 및 펩티드에서 메티오닌 산화를 촉진시키는 것으로 나타났다 (문헌 [Akers MJ, and Defelippis MR. Peptides and Proteins as Parenteral Solutions. In: Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins. Sven Frokjaer, Lars Hovgaard, editors. Pharmaceutical Science. Taylor and Francis, UK (1999)]; [Fransson J.R., J. Pharm. Sci. 86(9): 4046-1050 (1997)]; [Yin J, et al., Pharm Res., 21(12): 2377-83 (2004)]). 나트륨 티오술페이트는 rhuMab HER2에서 광 및 온도 유도된 메티오닌-산화의 수준을 감소시키는 것으로 보고되었으나; 티오술페이트-단백질 부가물의 형성이 또한 이 연구에서 보고되었다 (문헌 [Lam XM, Yang JY, et al., J Pharm Sci. 86(11): 1250-5 (1997)]). 단백질의 특정 스트레스 및 민감성에 따라 적절한 항산화제를 선택한다. 특정 측면에서 고려되는 항산화제에는 제한 없이, 환원제 및 산소/자유-라디칼 스캐빈져, 금속 착화제, 예컨대 EDTA 및 나트륨 티오술페이트가 포함된다.
금속 이온
일반적으로, 전이 금속 이온은 단백질에서 물리적 및 화학적 분해 반응을 촉매할 수 있기 때문에 단백질 제형에서 바람직하지 못하다. 그러나, 특정 금속 이온은 단백질에 대한 보조인자인 경우 제형에 및 배위 착체를 형성하는 경우 단백질의 현탁액 제형에 포함된다 (예를 들어, 인슐린의 아연 현탁액). 최근에, 아스파르트산의 이소아스파르트산으로의 이성질체화를 억제하기 위한 마그네슘 이온의 사용 (10 내지 120 mM)이 제안되었다 (제WO 2004039337호).
금속 이온이 단백질에서 안정성 또는 증가된 활성을 제공하는 두 가지 예는 인간 데옥시리보뉴클레아제 (rhDNase, 풀모자임(Pulmozyme)®) 및 FVIII이다. rhDNase의 경우에, Ca+2 이온 (100 mM 이하)은 특이적 결합 부위를 통해 효소의 안정성을 증가시켰다 (문헌 [Chen B, et al., J Pharm Sci., 88(4): 477-82 (1999)]). 사실상, EDTA에 의한 용액으로부터의 칼슘 이온의 제거는 탈아미드화 및 응집의 증가를 초래하였다. 그러나, 이 효과는 오직 Ca+2 이온에서 관찰되었고; 다른 2가 양이온 Mg+2, Mn+2 및 Zn+2는 rhDNase를 탈안정화하는 것으로 관찰되었다. 유사한 효과가 FVIII에서 관찰되었다. Ca+2 및 Sr+2 이온은 단백질을 안정화하였으나, Mg+2, Mn+2 및 Zn+2, Cu+2 및 Fe+2와 같은 다른 이온은 효소를 탈안정화하였다 (문헌 [Fatouros, A., et al., Int. J. Pharm., 155, 121-131 (1997)]). FVIII에 의한 개별 연구에서, 응집 속도의 유의한 증가가 Al+3 이온의 존재하에 관찰되었다 (문헌 [Derrick TS, et al., J. Pharm. Sci., 93(10): 2549-57 (2004)]).
방부제
동일한 용기로부터 1회 초과의 추출을 수반하는 다회 사용 비경구 제형을 개발시 방부제가 필수적이다. 그의 1차 기능은 약물 생성물의 저장 수명 또는 사용 기간 전반에 걸쳐 미생물 성장을 억제하고 생성물 멸균성을 확실하게 하는 것이다. 흔히 사용되는 방부제에는 제한 없이, 벤질 알콜, 페놀 및 m-크레졸이 포함된다. 방부제는 긴 사용 역사를 갖고 있지만, 방부제를 포함하는 단백질 제형의 개발은 도전적일 수 있다. 방부제는 거의 항상 단백질에 대한 탈안정화 효과 (응집)를 갖고, 이는 다중 용량 단백질 제형에서의 그의 용도의 제한에서 주요 인자가 되었다 (문헌 [Roy S, et al., J Pharm Sci., 94(2): 382-96 (2005)]). 실제상, 방부제는 희석제 제형에 포함되고, 동결 건조되는 제형에 포함되지 않아야 한다.
현재까지, 대부분의 단백질 약물은 오직 단일-사용으로 제제화되었다. 그러나, 다중 용량 제형이 가능한 경우, 이는 환자 편리성 및 증가된 시장성을 가능하게 하는 추가 장점을 갖는다. 좋은 예는 보존된 제형의 개발이 보다 편리한 다회-사용 주사 펜 제형의 상업화를 가져온 인간 성장 호르몬 (hGH)이다. hGH의 보존된 제형을 함유하는 이러한 펜 장치 4종 이상이 현재 시판되고 있다. 노르디트로핀(Norditropin)® (액체, 노보 노르디스크(Novo Nordisk)), 뉴트로핀(Nutropin) AQ® (액체, 제넨테크(Genentech)) & 제노트로핀(Genotropin) (동결건조된 - 이중 챔버 카트리지, 파마시아앤드업존)은 페놀을 함유하나, 소마트로프(Somatrope)® (일라이 릴리(Eli Lilly))는 m-크레졸로 제제화된다.
보존된 투여량 형태의 제형 개발 동안 여러 측면이 고려될 필요가 있다. 약물 생성물 중 유효 방부제 농도가 최적화되어야 한다. 이는 단백질 안정성을 손상하지 않고 항미생물 유효성을 부여하는 농도 범위로 투여량 형태 내 주어진 방부제를 시험하는 것을 필요로 한다. 예를 들어, 시차 주사 열량측정법 (DSC)을 이용하여 인터류킨-1 수용체 (I형)를 위한 액체 제형의 개발에서 3종의 방부제가 성공적으로 스크리닝되었다. 방부제는 판매되는 제품에서 흔히 사용되는 농도에서 안정성에 대한 방부제의 영향에 기초한 순서로 등급매겨졌다 (문헌 [Remmele RL Jr., et al., Pharm Res., 15(2): 200-8 (1998)]).
방부제를 함유하는 액체 제형의 개발은 동결건조된 제형보다 더 도전적이다. 동결-건조된 생성물은 방부제 없이 동결건조되고 사용시 방부제 함유 희석제로 재구성될 수 있다. 이는 방부제가 단백질과 접촉하는 시간을 단축시켜, 관련된 안정성 위험을 유의하게 최소화한다. 액체 제형에서, 방부제 유효성 및 안정성은 전체 생성물 저장 수명 (약 18 내지 24개월) 전반에 걸쳐 유지되어야 한다. 중요한 주목할 점은 방부제 유효성이 활성 약물 및 모든 부형제 구성성분을 함유하는 최종 제형에서 나타나야 한다는 것이다.
몇몇 방부제는 주사 부위 반응을 초래할 수 있으며, 이는 방부제를 선택할 때 고려할 필요가 있는 또 다른 인자이다. 노르디트로핀 내 방부제 및 완충제의 평가에 초점을 맞춘 임상 시험에서, 통증 지각이 m-크레졸을 함유하는 제형과 비교하여 페놀 및 벤질 알콜을 함유하는 제형에서 저하되는 것으로 관찰되었다 (문헌 [Kappelgaard A.M., Horm Res. 62 Suppl 3:98-103 (2004)]). 흥미롭게는, 흔히 사용되는 방부제 중에서 벤질 알콜은 마취 특성을 보유한다 (문헌 [Minogue SC, and Sun DA., Anesth Analg., 100(3): 683-6 (2005)]). 다양한 측면에서, 방부제의 사용은 임의의 부작용보다 중요한 이익을 제공한다.
제조 방법
본 개시는 제약 제형의 제조 방법을 추가로 고려한다.
본 방법은 다음 단계 중 하나 이상을 포함한다: 본원에 기재된 바와 같은 안정화제를 동결건조 전에 상기 혼합물에 첨가하고, 증량제, 삼투 조절제 및 계면활성제 (각각은 본원에 기재된 바와 같음)로부터 선택된 1종 이상의 작용제를 동결건조 전에 상기 혼합물에 첨가한다.
동결건조된 물질에 대한 표준 재구성 관행은 순수 또는 멸균 주사용수 (WFI)의 일정 부피 (전형적으로 (그러나 필수적은 아님), 동결건조 동안 제거되는 부피와 동등함)를 보충 첨가하는 것이나, 항박테리아제의 희석 용액이 때때로 비경구 투여를 위한 약제의 제조에서 사용된다 [문헌 [Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, 18:1311-1354 (1992)]]. 따라서, 본 개시의 동결건조된 FVIII 조성물에 희석제를 첨가하는 단계를 포함하는, 재구성된 FVIII 조성물의 제조 방법이 제공된다.
동결건조된 물질은 다양한 수성 담체, 예를 들어, 멸균 주사용수, 다중 용량 사용을 위한 방부제를 갖는 물, 또는 적절한 양의 계면활성제를 갖는 물 (예를 들어, 수성 현탁액의 제조에 적합한 부형제와 부가혼합하여 활성 화합물을 함유하는 수성 현탁액)로 수용액으로서 재구성될 수 있다. 다양한 측면에서, 이러한 부형제는 현탁화제, 예를 들어 및 제한 없이, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 알긴산나트륨, 폴리비닐피롤리돈, 트라가칸트 검 및 아카시아 검이고; 분산제 또는 또는 습윤제는 천연 포스파티드, 예를 들어 및 제한 없이, 레시틴, 또는 지방산과 알킬렌 옥시드의 축합 생성물, 예를 들어 및 제한 없이, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 또는 장쇄 지방족 알콜과 에틸렌 옥시드의 축합 생성물, 예를 들어 및 제한 없이, 헵타데카에틸렌옥시세탄올, 또는 지방산 및 헥시톨로부터 유래된 부분 에스테르와 에틸렌 옥시드의 축합 생성물, 예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레에이트, 또는 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유래된 부분 에스테르와 에틸렌 옥시드의 축합 생성물, 예를 들어 및 제한 없이, 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레에이트이다. 다양한 측면에서, 수성 현탁액은 또한 하나 이상의 방부제, 예를 들어 및 제한 없이, 에틸, 또는 n-프로필, p-히드록시벤조에이트를 함유한다.
투여
인간 또는 시험 동물에게 조성물을 투여하기 위해, 한 측면에서, 조성물은 하나 이상의 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 어구 "제약상" 또는 "약리학상" 허용되는은 하기 기재된 바와 같은 당분야에 익히 공지된 경로를 이용하여 투여시 안정하고, 단백질 분해, 예컨대 응집 및 절단 생성물을 억제하고, 또한 알레르기성 반응 또는 다른 유해 반응을 생성하지 않는 분자 실체 및 조성물을 지칭한다. "제약상 허용되는 담체"는 임의의 및 모든 임상적으로 유용한 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등 (상기 개시된 작용제 포함)이 포함된다.
제약 제형은 경구로, 국소로, 경피로, 비경구로, 흡입 분무에 의해, 질로, 직장으로 또는 두개내 주사에 의해 투여된다. 본원에서 사용되는 용어 비경구는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 지장막 하조내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 정맥내, 피부내, 근육내, 유선내, 복강내, 경막내, 안구후, 폐내 주사 및/또는 특정 부위에서의 수술적 이식에 의한 투여가 또한 고려된다. 일반적으로, 조성물은 발열원, 뿐만 아니라 수용자에게 유해할 수 있는 다른 불순물을 본질적으로 함유하지 않는다.
조성물의 단일 또는 다중 투여는 치료하는 의사에 의해 선택될 투여 수준 및 패턴으로 수행된다. 질병의 예방 또는 치료를 위해, 적절한 투여량은 상기 정의된 바와 같은 치료될 질병의 유형, 질병의 경중도 및 과정, 약물이 예방학적 또는 치료학적 목적을 위해 투여되는가, 이전 치료요법, 환자의 임상 병력 및 약물에 대한 반응, 및 담당 의사의 판단에 의존한다.
키트
추가 측면으로서, 본 개시는 대상체에게 투여하기 위한 그의 사용을 용이하게 하는 방식으로 포장된 하나 이상의 동결건조된 조성물을 포함하는 키트를 포함한다. 한 실시양태에서, 이러한 키트는 방법의 실행에서 화합물 또는 조성물의 사용을 기재하는 용기에 부착되거나 패키지에 포함된 라벨을 갖는 용기, 예컨대 밀봉된 병 또는 그릇에 포장된, 본원에 기재된 제약 제형 (예를 들어, 치료학적 단백질 또는 펩티드를 포함하는 조성물)을 포함한다. 한 실시양태에서, 제약 제형은 용기 내 헤드스페이스의 양 (예를 들어, 액체 제형과 용기의 상단 사이의 공기의 양)이 매우 작게 되도록 용기에 포장된다. 바람직하게는, 헤드스페이스의 양은 무시가능하다 (즉, 거의 없음). 한 실시양태에서, 키트는 치료학적 단백질 또는 펩티드 조성물을 갖는 제1 용기 및 조성물을 위한 생리학상 허용되는 재구성 용액을 갖는 제2 용기를 함유한다. 한 측면에서, 제약 제형은 단위 투여량 형태로 포장된다. 키트는 특정 투여 경로에 따라 제약 제형을 투여하기에 적합한 장치를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 키트는 제약 제형의 사용을 기재하는 라벨을 함유한다.
투여량
본원에 기재된 상태의 치료 방법에 수반된 투여량 처방계획은 약물 작용을 변형시키는 다양한 인자, 예를 들어 환자의 연령, 상태, 체중, 성별 및 식이, 임의의 감염의 경중도, 투여 시간 및 다른 임상적 인자를 고려하여 담당 의사에 의해 결정될 것이다. 예로서, 본 개시의 재조합 FVIII의 전형적인 용량은 대략 30 IU/kg 내지 50 IU/kg이다.
한 측면에서, 본 개시의 제형은 초기 볼루스에 의해, 이어서 약물 생성물의 치료학적 순환 수준을 유지하기 위해 연속 주입에 의해 투여된다. 또 다른 예로서, 본 발명의 화합물은 1회 용량으로서 투여된다. 당업자는 좋은 의료 행위 및 개별 환자의 임상 상태에 의해 결정되는 바와 같은 유효 투여량 및 투여 처방계획을 용이하게 최적화할 것이다. 투여 빈도는 작용제의 약동학 파라미터 및 투여 경로에 의존한다. 최적의 제약 제형은 투여 경로 및 바람직한 투여량에 의존하여 당업자에 의해 결정된다. 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) pages 1435-1712]을 참조하며, 상기 문헌의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 이러한 제형은 투여되는 작용제의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출 속도 및 생체내 청소 속도에 영향을 준다. 투여 경로에 의존하여, 적합한 용량은 체중, 체표면적 또는 기관 크기에 따라 계산된다. 적절한 투여량은 적절한 용량-반응 데이터와 함께 혈액 수준 투여량을 결정하기 위한 확립된 검정의 사용을 통해 확신될 수 있다. 최종 투여량 처방계획은 약물 작용을 변형시키는 다양한 인자, 예를 들어 약물의 특정 활성, 손상의 경중도 및 환자의 반응도, 환자의 연령, 상태, 체중, 성별 및 식이, 임의의 감염의 경중도, 투여 시간 및 기타 임상적 인자를 고려하여 담당 의사에 의해 결정된다. 연구가 수행됨에 따라 다양한 질병 및 상태를 위한 적절한 투여량 수준 및 치료의 지속시간에 관한 추가 정보가 나올 것이다.
하기 실시예는 제한하려는 것이 아니라 오직 본 개시의 특정 실시양태를 예시하는 것으로 의도된다.
도 2. 만니톨/트레할로스 (도 2A) 및 글리신/트레할로스 (도 2B) 기재 제형 내 동결-건조된 rAHF의 저장 안정성 및 시간 동력학의 제곱근.
도 3. 선택된 제형 내 동결-건조된 rAHF의 분해에 대한 속도 상수: 제형 스크리닝 연구.
도 4. 글리신:트레할로스 기재 제형의 안정성에 대한 글루타티온, 히스티딘 및 헤페스의 효과: 공정중 활성 손실 및 25℃에서 9개월 저장 동안의 활성 손실. "기본" 제형은 pH 7에서 rAHF (103 IU/mL), 글리신 (8％), 트레할로스 (2％), NaCl (200 mM), 10 mM 트리스, 0.025％ 폴리소르베이트 80, 4 mM CaCl2이다. 다른 제형은 글루타티온 (0.2 g/L), 및 헤페스 완충제 (10 mM), 히스티딘 완충제 (50 mM) 또는 철 착화제 데페록사민 (0.25 mg/L)이 첨가된 "기본" 제형으로 구성된다. 사용된 공정은 본질적으로 표 5에 제공된 것과 동일하였다.
도 5. 동결-건조된 rAHF의 분해 속도 상수. 제형 및 공정의 세부사항은 표 5 및 6에 제공된다. 속도 상수는 시간 (개월)에 따른 시간 동력학의 제곱근으로부터의 것이다. 오차 막대는 회귀 분석에 의해 제공된 표준 오차를 나타낸다.
<발명의 상세한 설명>
정의
하기 본원에서 사용되는 용어 및 그의 파생형은 별도의 표시가 없는 경우 아래와 같이 정의될 수 있다:
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속한 분야의 통상의 기술을 가진 자에 의해 흔히 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 하기 참고문헌이 당업자에게 본 개시에서 사용되는 많은 용어의 일반적인 정의를 제공한다: 문헌 [Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2d ed. 1994)]; [THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walker ed., 1988)]; [THE GLOSSARY OF GENETICS, 5TH ED., R. Rieger, et al. (eds.), Springer Verlag (1991)]; 및 [Hale and Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY (1991)].
본원에서 인용된 각각의 공개, 특허 출원, 특허 및 기타 참고문헌은 이것이 본 개시와 불일치하지 않는 한도까지 그 전문이 참고로 포함된다.
본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용되는 단수 형태 "a," "an" 및 "the"는 문맥이 명확하게 달리 언급하지 않는 한 복수 언급을 포함한다는 것이 본원에서 주목된다.
본원에서 사용되는 하기 용어들은 달리 명시하지 않는 한 이에 속한 의미를 갖는다.
펩티드 화합물과 관련하여 용어 "포함하는"은 화합물이 주어진 서열의 아미노 및 카르복시 말단 중 어느 하나 또는 둘 모두에서 추가 아미노산을 포함할 수 있다는 것을 의미한다. 물론, 이들 추가 아미노산은 화합물의 활성을 유의하게 방해하지 않아야 한다. 본 개시의 조성물과 관련하여 용어 "포함하는"은 조성물이 추가 구성성분을 포함할 수 있다는 것을 의미한다. 이들 추가 구성성분은 조성물의 활성을 유의하게 방해하지 않아야 한다. FVIII 제형과 관련하여 "포함하는"은 염화나트륨 (NaCl)을 완전히 배제하거나 또는 오직 미량의 NaCl을 포함한다.
용어 "약리학상 활성인"은 이렇게 기재된 물질이 의학적 파라미터 또는 질병 상태에 영향을 미치는 활성을 갖는 것으로 결정된다는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "발현하다", "발현하는" 및 "발현"은 유전자 또는 DNA 서열 내의 정보가 상응하는 유전자 또는 DNA 서열의 전사 및 번역에 관여된 세포 기능을 활성화시킴으로써 나타나게 되는, 예를 들어, 단백질을 생성하게 되는 것을 의미한다. DNA 서열은 세포 내에서 또는 세포에 의해 발현되어 "발현 산물", 예컨대 단백질을 형성한다. 발현 산물 그 자체, 예를 들어 생성된 단백질은 또한 "발현된" 것으로 언급될 수 있다. 발현 산물은 세포내, 세포외 또는 분비된 것으로서 특징화될 수 있다. 용어 "세포내"는 세포 내부를 의미한다. 용어 "세포외"는 세포 외부, 예컨대 막횡단 단백질을 의미한다. 물질은 세포 상 또는 세포 내부의 어딘가로부터 세포 외부에서 유의한 측정치로 나타난 경우 세포에 의해 "분비된다".
본원에서 사용되는 "폴리펩티드"는 펩티드 결합을 통해 연결된 아미노산 잔기, 그의 구조적 변이체, 관련된 천연 구조적 변이체 및 합성 비천연 유사체를 포함하는 중합체를 지칭한다. 합성 폴리펩티드는 예를 들어 자동화 폴리펩티드 신세사이저를 이용하여 제조된다. 용어 "단백질"은 전형적으로 큰 폴리펩티드를 지칭한다. 용어 "펩티드"는 전형적으로 짧은 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에서 사용되는 폴리펩티드의 "단편"은 전장 폴리펩티드 또는 단백질 발현 산물보다 더 작은 폴리펩티드 또는 단백질의 임의의 부분을 지칭하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 "유사체"는 구조가 실질적으로 유사하고 동일한 생물학적 활성을 갖지만 다양한 정도의 활성을 가질 수 있는 둘 이상의 폴리펩티드 중 임의의 폴리펩티드, 전체 분자 또는 그의 단편을 지칭한다. 유사체는 다른 아미노산에 대한 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가를 수반하는 하나 이상의 돌연변이에 기초하여 그의 아미노산 서열의 조성이 상이하다. 치환은 대체될 아미노산 및 이를 대체할 아미노산의 물리화학적 또는 기능적 관련도에 기초하여 보존적 또는 비보존적일 수 있다.
본원에서 사용되는 "변이체"는 통상적으로 분자의 부분이 아닌 추가 화학적 모이어티를 포함하도록 변형된 폴리펩티드, 단백질 또는 그의 유사체를 지칭한다. 이러한 모이어티는 분자의 용해도, 흡수, 생물학적 반감기 등을 조정할 수 있다. 모이어티는 별법으로 분자의 독성을 감소시키고, 분자의 임의의 바람직하지 못한 부작용 등을 제거하거나 감쇠시킬 수 있다. 이러한 효과를 매개할 수 있는 모이어티는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (1980)]에 개시되어 있다. 분자로의 이러한 모이어티의 커플링을 위한 절차는 당분야에 익히 공지되어 있다. 예를 들어 및 제한 없이, 한 측면에서 변이체는 단백질에 생체내 더 긴 반감기를 부여하는 화학적 변형을 갖는 혈액 응고 인자이다. 다양한 측면에서, 폴리펩티드는 글리코실화, PEG화(pegylation) 및/또는 폴리시알릴화에 의해 변형된다.
FVIII
본원에서 용어 "제8 인자" 또는 "FVIII" 또는 "rAHF"는 무손상 B 도메인의 적어도 한 부분을 갖고 천연 FVIII과 관련된 생물학적 활성을 나타내는 임의의 FVIII 분자를 지칭한다. 본 개시의 한 실시양태에서, FVIII 분자는 전장 FVIII이다. FVIII 분자는 FVIII:C를 코딩하는 DNA로 혼성화할 수 있는 DNA 서열에 의해 코딩되는 단백질이다. 이러한 단백질은 도메인 A1-A2-B-A3-C1-C2 사이에 또는 그 내에 다양한 부위에서 아미노산 결실을 함유할 수 있다 (미국 특허 제4,868,112호). FVIII 분자는 또한 하나 이상의 아미노산 잔기가 부위 지정 돌연변이유발에 의해 대체된 천연 FVIII의 유사체일 수 있다.
본 개시에 따라 용어 "재조합 제8 인자" (rFVIII)은 재조합 DNA 기술을 통해 얻어진 임의의 rFVIII (이종 또는 천연) 또는 그의 생물학상 활성인 유사체를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 용어는 상기 기재된 바와 같은 단백질 및 본 개시의 rFVIII을 코딩하는 핵산을 포함한다. 이러한 핵산에는 예를 들어 및 제한 없이, 유전자, pre-mRNA, mRNA, 다형성 변이체, 대립유전자, 합성 및 천연 돌연변이체가 포함된다. 용어 rFVIII에 포함되는 단백질에는 예를 들어 및 제한 없이, 상기 기재된 단백질 및 폴리펩티드, 상기 기재된 핵산에 의해 코딩되는 단백질, (1) 본원에 기재된 참조 핵산 또는 아미노산 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 대한 적어도 약 25, 약 50, 약 100, 약 200, 약 300, 약 400개 또는 그 초과의 아미노산 (성숙 천연 단백질에 대한 406개 아미노산의 전장 서열 이하)의 영역에 걸쳐 최소 약 60％, 약 65％, 약 70％, 약 75％, 약 80％, 약 85％, 약 90％, 약 91％, 약 92％, 약 93％, 약 94％, 약 95％, 약 96％, 약 97％, 약 98％ 또는 약 99％ 또는 그 초과의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고/거나; (2) 본원에 기재된 바와 같은 참조 아미노산 서열을 포함하는 면역원, 그의 면역원성 단편 및/또는 그의 보존적으로 변형된 변이체에 대해 생성된 항체, 예를 들어, 폴리클로날 또는 모노클로날 항체에 특이적으로 결합하는 종간 상동체 및 다른 폴리펩티드가 포함된다.
본원에서 사용되는 "내인성 FVIII"은 치료를 받도록 의도된 포유동물로부터 유래하는 FVIII을 포함한다. 상기 용어는 또한 상기 포유동물에 존재하는 트랜스진(transgene) 또는 임의의 다른 외래 DNA로부터 전사된 FVIII을 포함한다. 본원에서 사용되는 "외인성 FVIII"은 상기 포유동물로부터 유래하지 않는 FVIII을 포함한다.
FVIII 분자는 단일 유전자 산물로부터 발생한 폴리펩티드의 불균일 분포로서 천연적으로 및 치료학적 제제에 존재한다 (예를 들어, 문헌 [Andersson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 2979 2983, May 1986] 참조). 본원에서 사용되는 용어 "제8 인자"는 혈장으로부터 유래되거나 또는 재조합 DNA 기술의 사용을 통해 생성된 모든 이러한 폴리펩티드를 지칭하고, FVIII 모방체, fc-FVIII 접합체, 수용성 중합체로 화학적으로 변형된 FVIII 및 FVIII의 다른 형태 또는 유사체가 포함되나 이에 제한되지 않는다. FVIII을 함유하는 치료학적 제제의 상업적으로 이용가능한 예로는 헤모필 엠(HEMOFIL M) 및 리콤비네이트(RECOMBINATE) (백스터 헬스케어 코포레이션 (Baxter Healthcare Corporation; 미국 일리노이주 데어필드)로부터)의 상표명으로 시판되는 것이 포함된다. 다른 제제는 분자의 B 도메인 부분이 결핍된 FVIII 분자의 단일 하위집단을 주로 포함한다.
본 개시의 출발 물질은 인간 혈장으로부터 유래되거나, 또는 미국 특허 제4,757,006호; 미국 특허 제5,733,873호; 미국 특허 제5,198,349호; 미국 특허 제5,250,421호; 미국 특허 제5,919,766호; 제EP 306 968호에 기재된 바와 같은 재조합 공학 기술에 의해 생성될 수 있는 FVIII이다.
본 개시에 유용한 FVIII 분자에는 전장 단백질, 단백질의 전구체, 단백질의 생물학상 활성인 또는 기능적 서브유닛 또는 단편, 및 그의 기능적 유사체, 뿐만 아니라 하기 본원에 기재된 바와 같은 그의 변이체가 포함된다. FVIII에 대한 언급은 이러한 단백질의 모든 잠재적 형태를 포함하는 것으로 의도되고, 여기서 FVIII의 각 형태는 무손상 천연 B 도메인 서열의 적어도 한 부분 또는 전체를 갖는다.
본 개시의 rFVIII을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에는 제한 없이, (1) 엄격한 혼성화 조건 하에 본원에 기재된 바와 같은 참조 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 및 그의 보존적으로 변형된 변이체에 특이적으로 혼성화하고; (2) 본원에 기재된 바와 같은 참조 핵산 서열에 대한 적어도 약 25, 약 50, 약 100, 약 150, 약 200, 약 250, 약 500, 약 1000개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 (성숙 단백질의 1218개 뉴클레오티드의 전장 서열 이하)의 영역에 걸친 최소 약 95％, 약 96％, 약 97％, 약 98％, 약 99％ 또는 그 초과의 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는 것이 포함된다.
변이체 (또는 유사체) 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 잔기가 본 개시의 FVIII 아미노산 서열에 첨가된 삽입 변이체를 포함한다. 삽입은 단백질의 말단 중 어느 하나 또는 둘 모두에 위치될 수 있고/거나, FVIII 아미노산 서열의 내부 영역 내에 위치될 수 있다. 말단 중 어느 하나 또는 둘 모두에 추가 잔기를 갖는 삽입 변이체에는 예를 들어, 융합 단백질, 및 아미노산 태그 또는 다른 아미노산 표지를 포함하는 단백질이 포함된다. 한 측면에서, FVIII 분자는 특히 분자가 박테리아 세포, 예컨대 이. 콜라이(E. coli)에서 재조합적으로 발현되는 경우 N-말단 Met를 임의로 함유할 수 있다.
결실 변이체에서, 본원에 기재된 바와 같은 FVIII 폴리펩티드에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 제거된다. 결실은 FVIII 폴리펩티드의 한 말단 또는 두 말단에서 및/또는 FVIII 아미노산 서열 내의 하나 이상의 잔기의 제거로 수행될 수 있다. 그러므로, 결실 변이체는 FVIII 폴리펩티드 서열의 모든 단편을 포함한다.
치환 변이체에서, FVIII 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기는 제거되고 대안적 잔기로 대체된다. 한 측면에서, 치환은 천연적으로 보존적이고, 이 유형의 보존적 치환은 당분야에 익히 공지되어 있다. 별법으로, 본 개시는 또한 비보존적인 치환을 포함한다. 예시적인 보존적 치환은 문헌 [Lehninger, [Biochemistry, 2nd Edition; Worth Publishers, Inc., New York (1975), pp.71-77]]에 기재되어 있고 바로 아래에 설명되어 있다.
보존적 치환
측쇄 특징 아미노산
무극성 (소수성):
A. 지방족 A L I V P
B. 방향족 F W
C. 황-함유 M
D. 경계 G
비대전된-극성:
A. 히드록실 S T Y
B. 아미드 N Q
C. 술프히드릴 C
D. 경계 G
양으로 대전된 (염기성) K R H
음으로 대전된 (산성) D E
별법으로, 예시적 보존적 치환이 바로 아래 설명되어 있다.
보존적 치환 II
본래 잔기 예시적 치환
Ala (A) Val, Leu, Ile
Arg (R) Lys, Gln, Asn
Asn (N) Gln, His, Lys, Arg
Asp (D) Glu
Cys (C) Ser
Gln (Q) Asn
Glu (E) Asp
His (H) Asn, Gln, Lys, Arg
Ile (I) Leu, Val, Met, Ala, Phe,
Leu (L) Ile, Val, Met, Ala, Phe
Lys (K) Arg, Gln, Asn
Met (M) Leu, Phe, Ile
Phe (F) Leu, Val, Ile, Ala
Pro (P) Gly
Ser (S) Thr
Thr (T) Ser
Trp (W) Tyr
Tyr (Y) Trp, Phe, Thr, Ser
Val (V) Ile, Leu, Met, Phe, Ala
"천연" 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열은 전형적으로 영장류, 예를 들어 인간; 설치류, 예를 들어 래트, 마우스, 햄스터; 소, 돼지, 말, 양 또는 임의의 포유동물을 포함하나 이에 제한되지 않는 포유동물로부터 유래된다. 본 개시의 핵산 및 단백질은 재조합 분자 (예를 들어, 이종, 및 야생형 서열 또는 그의 변이체를 코딩함, 또는 비천연)일 수 있다. 참조 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열은 예를 들어, UniProtKB/Swiss-Prot P00451 (FA8_인간); 문헌 [Gitschier J et al., Characterization of the human Factor VIII gene, Nature, 312(5992): 326-30 (1984)]; [Vehar GH et al., Structure of human Factor VIII, Nature, 312(5992):337-42 (1984)]; 및 [Thompson AR. Structure and Function of the Factor VIII gene and protein, Semin Thromb Hemost, 2003:29;11-29 (2002)] (참고문헌들은 그 전문이 본원에 포함됨)을 포함한다.
본원에서 사용되는 "생물학상 활성인 유사체" 또는 "생물학상 활성인 변이체"는 상기 분자의 실질적으로 동일한 기능적 및/또는 생물학적 특성, 예컨대 결합 특성 및/또는 동일한 구조적 기초, 예컨대 펩티드성 골격 또는 기본 중합체성 단위를 갖는 분자의 임의의 유사체 또는 변이체를 포함한다.
본원에서 사용되는 "혈장-유래된 FVIII " 또는 "혈장성"은 응고 경로를 활성화하는 특성을 갖는, 포유동물로부터 얻은 혈액에서 발견되는 단백질의 모든 형태를 포함한다.
다양한 측면에서, rFVIII의 생성은 (i) 유전 공학에 의한 재조합 DNA의 생성, (ii) 예를 들어 및 제한 없이, 형질감염, 전기천공법 또는 미세주입에 의한 원핵생물 또는 진핵생물 세포로의 재조합 DNA의 도입, (iii) 상기 형질전환된 세포의 배양, (iv) 예를 들어 구성적으로 또는 유도시 rFVIII의 발현, 및 (v) 예를 들어 배양 배지로부터 또는 형질전환된 세포의 수확에 의한 상기 rFVIII의 단리, (vi) 정제된 rFVIII을 얻기 위한 당분야에 공지된 임의의 방법을 포함한다.
다른 측면에서, rFVIII은 약리학상 허용되는 rFVIII 분자를 생성하는 것을 특징으로 하는 적합한 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 시스템에서 발현에 의해 생성된다. 진핵생물 세포의 예는 포유동물 세포, 예컨대 CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep 및 HepG2이다.
또 다른 측면에서, 광범위하게 다양한 벡터가 rFVIII의 제조를 위해 사용되고, 진핵생물 및 원핵생물 발현 벡터로부터 선택된다. 원핵생물 발현을 위한 벡터의 예로는 플라스미드, 예컨대 및 제한 없이, pRSET, pET 및 pBAD가 포함되며, 여기서 원핵생물 발현 벡터에서 사용되는 프로모터에는 제한 없이 lac, trc, trp, recA 또는 araBAD 중 하나 이상이 포함된다. 진핵생물 발현을 위한 벡터의 예로는 (i) 프로모터, 예컨대 및 제한 없이, AOX1, GAP, GAL1 또는 AUG1을 이용한 효모에서의 발현을 위한 벡터, 예컨대 및 제한 없이, pAO, pPIC, pYES 또는 pMET; (ii) 프로모터, 예컨대 및 제한 없이 PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64 또는 polh를 이용한 곤충 세포에서 발현을 위한 벡터, 예컨대 및 제한 없이, pMT, pAc5, pIB, pMIB 또는 pBAC, 및 (iii) 프로모터, 예컨대 및 제한 없이 CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV 및 β-액틴을 이용한 포유동물 세포에서 발현을 위한 벡터, 예컨대 및 제한 없이 pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3 또는 pBPV, 및 한 측면에서, 바이러스의 시스템, 예컨대 및 제한 없이 우두 바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스 또는 레트로바이러스로부터 유래된 벡터가 포함된다.
"국제 단위" 또는 "IU"는 표준 검정, 예컨대 일단계 검정에 의해 측정된 바와 같은 FVIII의 혈액 응고 활성 (효력)의 측정치의 단위이다. 일단계 검정, 예컨대 문헌 [N Lee, Martin L, et al., An Effect of Predilution on Potency Assays of FVIII Concentrates, Thrombosis Research (Pergamon Press Ltd.) 30, 511 519 (1983)]에 기재된 바와 같은 검정이 당분야에 공지되어 있다. 또 다른 표준 검정은 비색 검정이다. 비색 검정, 예컨대 크로모게익스 아베 (Chromogeix AB; 스웨덴 묄른달)로부터 이용가능한 코티스트(Coatest) 제8 인자를 상업적으로 구입할 수 있다.
용어 "어닐링"은 제제의 건조 단계 전에 동결건조를 거치는 제약 제제의 동결건조 공정에서의 단계를 나타내는데 사용될 수 있으며, 여기서 동결된 제제의 온도는 더 낮은 온도로부터 더 높은 온도로 상승된 후 일정 기간 후 다시 냉각된다.
증량제는 동결건조된 후 제약 제제의 "케이크" 또는 잔류 고체 덩어리에 구조를 제공하고 붕괴로부터 이를 보호하는 화학적 실체이다. 결정화가능한 증량제는 염화나트륨 이외에 동결건조 동안 결정화될 수 있는 본원에 기재된 바와 같은 증량제를 의미할 수 있다. 헤스(HES)는 결정화가능한 증량제의 이 군에 포함되지 않는다.
동결-건조는 이것이 표시된 문맥에 의해 별도의 표시가 없는 경우, 제제 밖으로 물을 몰아내기 위해 제약 제제의 온도를 상승시키는 동결건조 공정의 부분을 나타내는데 사용될 수 있다. 동결건조 공정의 "동결" 단계는 동결-건조 단계 전에 수행되는 단계이다. "동결건조"는 별도의 표시가 없는 경우, 동결 단계 및 동결-건조 단계 둘 모두를 포함하는 동결건조의 전체 공정을 지칭할 수 있다.
별도의 언급이 없는 경우, 백분율 용어는 중량/부피 백분율을 표시하고, 온도는 섭씨 크기이다.
제형 및 동결건조 개발
최대 안정성을 달성하기 위해, 본 개시의 FVIII 조성물은 한 측면에서 동결건조된다. 동결건조 동안, FVIII은 수성상에 존재하는 것으로부터 무정형 고체상에 존재하는 것으로 전환되며, 이는 화학적 및/또는 형태적 불안정성으로부터 단백질을 보호하는 것으로 생각된다. 동결건조된 제제는 무정형 상을 함유할 뿐만 아니라 동결건조 동안 결정화하는 구성성분을 포함한다. 이러한 구성성분의 포함은 FVIII 조성물의 신속한 동결건조 및 더 정교한 케이크의 형성 (즉, 케이크 구조의 유지 및 이것이 동결건조된 용기의 측면으로부터의 최소 수축을 갖는 케이크)을 허용하는 것으로 생각된다. 본 개시의 제형에서, 안정화제는 동결건조된 생성물의 무정형 상에 존재하도록 선택되었으나, 증량제 (헤스 제외)는 동결 동안 결정화하도록 선택되었다.
한 측면에서, FVIII 및 안정화제 둘 모두는 동결건조된 케이크의 무정형 상에 분산된다. 한 측면에서, 안정화제의 덩어리는 또한 무정형 형태의 다른 부형제와 비교하여 크다. 또한, 한 측면에서, 무정형 상의 겉보기 유리 전이 온도 (Tg')는 동결-건조 동안 상대적으로 높고, 고체의 유리 전이 온도 (Tg)는 바람직하게는 저장 동안 마찬가지로 높다. 생성물 내 염화나트륨의 결정화는 바람직한 것으로 밝혀졌으며, 이는 무정형 염화나트륨이 무정형 상의 Tg'를 저하시킬 것이기 때문이다.
한 측면에서, 특정 조성물의 케이크의 붕괴를 회피하기 위해, 1차 건조는 동결 농축물의 겉보기 유리 전이 온도 미만의 생성물 온도에서 수행된다. 건조 시간의 증가가 또한 Tg'의 감소를 상쇄하기 위해 필요로 될 수 있다. 동결건조에 대한 추가 정보가 문헌 [Carpenter, J. F. and Chang, B. S., Lyophilization of Protein Pharmaceuticals, Biotechnology and Biopharmaceutical Manufacturing, Processing and Preservation, K. E. Avis and V. L. Wu, eds. (Buffalo Grove, Ill.: Interpharm Press, Inc.), pp. 199 264 (1996)], 미국 특허 제7,247,707호, 제7,087,723호, 제6,586,573호에서 찾을 수 있다.
동결건조는 당분야에서 흔한 기술을 이용하여 수행되고, 개발될 조성물을 위해 최적화되어야 한다 [문헌 [Tang et al., Pharm Res. 21:191-200, (2004)] 및 [Chang et al., Pharm Res. 13:243-9 (1996)]].
한 측면에서, 동결건조 사이클은 3개의 단계로 구성된다: 동결, 1차 건조 및 2차 건조 [문헌 [A.P. Mackenzie, Phil Trans R Soc London, Ser B, Biol 278:167 (1977)]]. 동결 단계에서, 용액은 얼음 형성을 개시하기 위해 냉각된다. 더욱이, 이 단계는 증량제의 결정화를 유도한다. 얼음은 1차 건조 단계에서 승화하며, 이는 챔버 압력을 진공을 이용하여 얼음의 증기압 미만으로 감소시키고 승화를 촉진하기 위해 열을 도입함으로써 수행된다. 마지막으로, 흡착되거나 결합된 물이 2차 건조 단계에서 감소된 챔버 압력 하에 및 상승된 선반 온도에서 제거된다. 공정은 동결건조된 케이크로서 공지된 물질을 생성한다. 그 후, 케이크는 주사를 위한 멸균수 또는 적합한 희석제로 재구성될 수 있다.
동결건조 사이클은 부형제의 최종 물리적 상태를 결정할 뿐만 아니라, 또한 다른 파라미터, 예컨대 재구성 시간, 외관, 안정성 및 최종 수분 함량에 영향을 미친다. 동결된 상태의 조성물 구조는 특정 온도에서 일어나는 여러 전이 (예를 들어, 유리 전이 및 결정화)를 통해 진행되고, 구조는 동결건조 공정을 이해하고 최적화하기 위해 사용될 수 있다. Tg 및/또는 Tg'는 용질의 물리적 상태에 대한 정보를 제공할 수 있고, 시차 주사 열량측정법 (DSC)에 의해 결정될 수 있다. Tg 및 Tg'는 동결건조 사이클의 설계시 고려되어야 하는 중요한 파라미터이다. 예를 들어, Tg'는 1차 건조를 위해 중요하다. 더욱이, 건조된 상태에서, 유리 전이 온도는 최종 생성물을 위한 아마 허용되는 저장 온도에 대한 정보를 제공한다.
한 측면에서, 활성 약물 이외에, 제형 구성성분은 안정화제, 계면활성제, 완충제, 및 저용량 약물의 경우 증량제를 포함한다. 다양한 측면에서. 단백질의 독특한 요구를 해결하는 특별한 구성성분, 예컨대 FVIII의 경우 Ca+2가 또한 포함된다. 많은 첨가제, 예컨대 당, 글리세롤, 특정 아미노산 및 아민은 모두 안정화제로서 기능할 수 있다. 안정성은 종종 "유리 역학"의 면에서 합리화되며, 즉 제형은 동결-건조 동안 '비-반응성' 무정형 고체 또는 유리를 틀림없이 형성할 것이며, 여기서 단백질은 분자적으로 분산되고, 단백질 및 잠재적 반응물의 이동성이 크게 제한되도록 고정 유리질 매트릭스에 커플링된다. 고정화는 적어도 정성적으로 안정화를 의미하며, 이는 임의의 분해 공정이 일부 유형의 분자 이동성을 필요로 할 것이기 때문이다. 동결된 농축물의 유리질 매트릭스 및 건조된 무정형 상은 각각 그의 유리 전이 온도, Tg' 및 Tg를 특징으로 한다. 유리 전이 온도 미만에서 이동성은 매우 제한되게 되고, 반대로 유리 전이 훨씬 초과에서 이동성은 신속한 화학적 및 물리적 분해 공정을 지지하기에 충분히 높게 된다. 일반적으로, 1차 건조 동안 생성물 온도 (Tp)는 동결 건조 동안 무정형 매트릭스의 붕괴를 회피하기 위해 (즉, 바람직하지 못한 물리적 변화를 회피하기 위해) Tg' 부근 또는 미만 (Tp< Tg')으로 제어되어야 하고, 신속한 분해를 회피하기 위해 저장 동안 Tg 미만으로 유지되어야 한다. 그러나, Tg 미만에서의 단순 저장이 허용되는 안정성을 반드시 보증하는 것은 아니다. 이당류는 효과적인 물 치환물 및 양호한 유리 형성제로서 기능하게 하는 특성을 갖는다. 전형적으로, 수크로스 및 트레할로스가 안정화제로서 사용된다.
본원에 기재된 바와 같은, 증량제는 단백질 제형에서 또 다른 중요한 부형제이다. 증량제의 기능은 "정교성"을 제공하고 보다 중요하게는 "분출"로부터 생성물을 보호하는 것이다. 즉, 저용량 약물의 경우, 약물 농도는 생성된 건조된 생성물 또는 케이크가 적은 기계적 강도를 가질 정도로 작을 수 있다. 그러므로, 유동하는 수증기로부터의 운동량 전이는 케이크를 붕해시키고 바이알 밖의 생성물 조각을 건조 챔버로 전이시킬 수 있다. 전형적으로, 높은 공융점을 갖는 가용성의 용이하게 결정화되는 물질은 붕괴로 인한 손상 없이 용이하게 동결 건조되기 때문에 증량제로서 잘 기능한다. 만니톨 및 글리신이 제약 생성물에서 흔히 사용된다. 증량제는 본질적으로 완전한 결정화를 보증하기 위해 주요 구성성분으로서 존재할 필요가 있다.
일반적으로 제형 및 부형제
부형제는 제조성 및/또는 최종 생성물 품질, 예컨대 약물 생성물 (예를 들어, 단백질)의 안정성 및 전달성을 부여하거나 향상시키는 첨가제이다. 이것의 포함에 대한 이유에 관계없이 부형제는 제형의 필수 구성성분이고, 그러므로 안전하고 환자에 의해 잘 관용될 필요가 있다. 단백질 약물의 경우, 부형제의 선택이 특히 중요하며, 이는 약물의 효능 및 면역원성 둘 모두에 영향을 미칠 수 있기 때문이다. 따라서, 단백질 제형은 적합한 안정성, 안전성 및 시장성을 부여하는 부형제의 적절한 선택으로 개발될 필요가 있다.
한 실시양태에서, 동결건조된 제형은 완충제, 증량제 및 안정화제 중 하나 이상을 적어도 포함한다. 이 실시양태에서, 동결건조 단계 동안 또는 재구성 동안의 응집이 문제가 되는 경우에 계면활성제의 유용성이 평가되고 선택된다. 적절한 완충제가 동결건조된 생성물의 제조 동안 (예를 들어 희석, 멸균 여과, 충전 등) 및 재구성 후 pH의 안정한 대역 내에서 제형을 유지시키기 위해 포함된다. 액체 및 동결건조된 단백질 제형을 위해 고려되는 부형제 구성성분의 비교는 하기 표에 제공된다:
단백질을 위한 제형의 개발에서 주요 도전은 제조, 배송 및 저장의 스트레스로부터 생성물을 안정화하는 것이다. 제형 부형제의 역할은 이들 스트레스로부터 안정화를 제공하는 것이다. 부형제는 또한 그의 전달을 가능하게 하고 환자 편리성을 향상시키기 위해 고농도 단백질 제형의 점도를 감소시키는데 사용된다. 일반적으로, 안정화제는 다양한 화학적 및 물리적 스트레스로부터 단백질을 안정화하는 메카니즘에 기초하여 분류될 수 있다. 몇몇 안정화제는 특정 스트레스의 효과를 경감시키거나 특정 단백질의 특정 감수성을 조절하는데 사용된다. 다른 안정화제는 단백질의 물리적 및 공유결합적 안정성에 대한 더 일반적인 효과를 갖는다. 본원에 기재된 안정화제는 그의 화학적 유형 또는 제형에서 그의 기능적 역할에 의해 조직화된다. 안정화 방식의 간단한 설명은 각각의 안정화제 유형의 논의시 제공된다.
본원에 제공된 교시내용 및 지침이 주어지면, 당업자는 생물약제 (예를 들어, 단백질)의 안정성의 유지를 아마 촉진하는 본 개시의 생물약제 제형을 달성하기 위해 부형제의 어느 양 또는 범위가 임의의 특정 제형에 포함될 수 있다는 것을 알 것이다.
물론, 당업자는 본원에 기재된 부형제의 농도가 특정 제형 내에 상호의존성을 공유한다는 것을 이해할 것이다. 예로서, 한 측면에서, 증량제의 농도는 예를 들어 높은 단백질 농도가 존재하는 경우 또는 예를 들어 높은 안정화제 농도가 존재하는 경우 저하된다. 또한, 당업자는 증량제가 존재하지 않는 특정 제형의 등장성을 유지하기 위해 안정화제의 농도가 따라서 증가될 수 있다 (즉, 안정화제의 "등장화" 양이 사용될 것임)는 것을 이해할 것이다. 통상적인 부형제는 당분야에 공지되어 있고, 문헌 [Powell et al., Compendium of Excipients for Parenteral Formulations (1998), PDA J. Pharm. Sci. Technology, 52:238-311]에서 찾을 수 있다.
완충액 및 완충제
약리학상 활성인 단백질 제형의 안정성은 통상적으로 좁은 pH 범위에서 최대인 것으로 관측된다. 최적 안정성의 이러한 pH 범위는 제제화전 연구 동안 초기에 확인될 필요가 있다. 여러 접근법, 예컨대 가속화된 안정성 연구 및 열량측정 스크리닝 연구가 이러한 시도에서 유용하다 (문헌 [Remmele R.L. Jr., et al., Biochemistry, 38(16): 5241-7 (1999)]). 제형이 마무리되면, 단백질은 제조되고 그의 저장 수명에 걸쳐 유지되어야 한다. 그러므로, 완충제가 제형 내 pH를 제어하기 위해 거의 항상 사용된다.
완충성 종의 완충제 능력은 pKa와 동등한 pH에서 최대이고, pH가 증가될 때 감소되거나, 이러한 값으로부터 멀어질 때 감소된다. 완충 능력의 90％는 그의 pKa의 1 pH 단위 내에 존재한다. 완충제 능력은 또한 완충제 농도 증가에 따라 비례적으로 증가한다.
완충제를 선택할 때 여러 인자가 고려될 필요가 있다. 첫째 및 최초로, 완충제 종 및 그의 농도는 그의 pKa 및 바람직한 제형 pH에 기초하여 한정될 필요가 있다. 완충제가 단백질 및 다른 제형 부형제와 상용성이 있고 어떠한 분해 반응도 촉매하지 않는다는 것을 확실하게 하는 것이 동등하게 중요하다. 고려되는 세번째 중요한 측면은 완충제가 투여시 유도할 수 있는 고통 및 자극의 감각이다. 예를 들어, 시트레이트는 주사시 고통을 유발하는 것으로 공지되어 있다 (문헌 [Laursen T, et al., Basic Clin Pharmacol Toxicol., 98(2): 218-21 (2006)]). 고통 및 자극에 대한 잠재성은 제형이 투여시 혈액으로 신속하게 희석되는 IV 경로에 의한 투여시보다 상대적으로 더 긴 기간 동안 부위에서 약물 용액이 유지되는 피하 (SC) 또는 근육내 (IM) 경로를 통해 투여되는 약물의 경우 더 크다. 직접 IV 주입에 의해 투여되는 제형의 경우, 완충제 (및 임의의 다른 제형 구성성분)의 총량을 모니터링할 필요가 있다. 환자에서 심혈관 효과를 유도할 수 있는 인산칼륨 완충제의 형태로 투여되는 칼륨 이온에 대해 특히 주의해야 한다 (문헌 [Hollander-Rodriguez JC, et al., Am. Fam. Physician., 73(2): 283-90 (2006)]).
동결건조된 제형을 위한 완충제가 추가로 고려될 필요가 있다. 인산나트륨과 같은 몇몇 완충제는 동결 동안 단백질 무정형 상 밖으로 결정화되어 pH의 이동을 유발할 수 있다. 다른 일반적인 완충제, 예컨대 아세테이트 및 이미다졸은 동결건조 공정 동안 승화하거나 증발할 수 있으며, 이에 의해 동결건조 동안 또는 재구성 후 제형의 pH를 이동시킬 수 있다.
한 실시양태에서, 조성물에 존재하는 완충계는 생리학상 상용성이 있고 제약 제형의 바람직한 pH를 유지하도록 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 용액의 pH는 pH 2.0 내지 pH 12.0이다. 예를 들어, 다양한 실시양태에서, 용액의 pH는 2.0, 2.3, 2.5, 2.7, 3.0, 3.3, 3.5, 3.7, 4.0, 4.3, 4.5, 4.7, 5.0, 5.3, 5.5, 5.7, 6.0, 6.3, 6.5, 6.7, 7.0, 7.3, 7.5, 7.7, 8.0, 8.3, 8.5, 8.7, 9.0, 9.3, 9.5, 9.7, 10.0, 10.3, 10.5, 10.7, 11.0, 11.3, 11.5, 11.7 또는 12.0일 수 있다.
pH 완충성 화합물은 제형의 pH를 예정된 수준에서 유지하기에 적합한 임의의 양으로 존재할 수 있다. 완충제의 적절히 낮은 수준이 사용되는 경우, 결정화 및 pH 이동이 회피될 수 있다. 한 실시양태에서, pH 완충성 농도는 0.1 mM 내지 500 mM (1 M)이다. 예를 들어, pH 완충제는 적어도 0.1, 0.5, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.5, 1.7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200 또는 500 mM인 것으로 고려된다.
본원에서 설명된 바와 같은 제형을 완충하는데 사용되는 예시적인 pH 완충제로는 유기산, 글리신, 히스티딘, 글루타메이트, 숙시네이트, 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 트리스, 헤페스, 및 아스파르테이트, 히스티딘 및 글리신을 포함하나 이에 제한되지 않는 아미노산 또는 아미노산들의 혼합물이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 본 개시의 한 실시양태에서, 완충제는 히스티딘이다.
안정화제 및 증량제
본 제약 제형의 한 실시양태에서, 안정화제 (또는 안정화제들의 조합)가 저장-유도된 응집 및 화학적 분해를 방지하거나 감소시키기 위해 첨가된다. 재구성시 뿌연 또는 혼탁한 용액은 통상적으로 단백질이 침전되거나 적어도 응집된 것을 나타낸다. 용어 "안정화제"는 응집 또는 화학적 분해 (예를 들어, 자가분해, 탈아미드화, 산화 등)를 방지할 수 있는 부형제를 의미한다. 특정 실시양태에서, 고려되는 안정화제에는 수크로스, 트레할로스, 만노스, 말토스, 락토스, 글루코스, 라피노스, 셀로비오스, 겐티오비오스, 이소말토스, 아라비노스, 글루코사민, 프룩토스, 만니톨, 소르비톨, 글리신, 아르기닌 HCL, 폴리-히드록시 화합물, 예를 들어 다당류, 예컨대 덱스트란, 전분, 히드록시에틸 전분, 시클로덱스트린, N-메틸 피롤리덴, 셀룰로스 및 히알루론산, 염화나트륨, 염화칼슘이 포함되나 이에 제한되지 않는다 [문헌 [Carpenter et al., Develop. Biol. Standard 74:225, (1991)]]. 본 개시의 한 실시양태에서, 트레할로스가 안정화제로서 사용된다. 본 개시의 또 다른 실시양태에서, 수크로스가 안정화제로서 사용된다. 본 제형에서, 특정 실시양태에서, 안정화제는 약 0.1, 0.5, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.5, 1.7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 700, 900 또는 1000 mM의 농도로 혼입된다. 마찬가지로, 본 개시의 특정 실시양태에서, 안정화제는 약 0.005, 0.01, 0.02, 0.03, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.5, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.5, 1.7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20％ w/v의 농도로 혼입된다.
필요하다면, 제형은 또한 적절한 양의 증량제 및 삼투 조절제를 포함한다. 본 개시의 다양한 실시양태에서, 증량제에는 예를 들어 및 제한 없이, 만니톨, 글리신, 수크로스, 중합체, 예컨대 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈, 카르복시메틸셀룰로스, 락토스, 소르비톨, 트레할로스 또는 크실리톨이 포함된다. 한 실시양태에서, 증량제는 만니톨이다. 본 개시의 다양한 실시양태에서, 증량제는 약 0.1, 0.5, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.5, 1.7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 700, 900 또는 1000 mM의 농도로 혼입된다.
계면활성제
단백질은 공기-액체, 바이알-액체 및 액체-액체 (실리콘 오일) 계면에서 흡착 및 변성에 대해 감수성이 되게 하는 표면과 상호작용하는 높은 성향을 갖는다. 이 분해 경로는 단백질 농도에 반비례로 의존적인 것으로 관측되었고, 표면에 대한 흡착을 통해 가용성 및 불용성 단백질 응집물의 형성 또는 용액으로부터의 단백질의 손실을 유발한다. 용기 표면 흡착 이외에, 표면-유도된 분해는 생성물의 배송 및 취급 동안 경험되는 물리적 진탕으로 악화된다.
계면활성제는 표면-유도된 분해를 방지하기 위해 단백질 제형에서 흔히 사용된다. 계면활성제는 계면 위치에서 단백질을 경쟁하여 능가하는 능력을 갖는 (및/또는 구조적으로 변경된 단백질 분자의 적절한 리폴딩을 촉진하는) 양친매성 분자이다. 계면활성제 분자의 소수성 부분은 계면 위치를 차지하나 (예를 들어, 공기/액체), 분자의 친수성 부분은 벌크 용매를 향해 배향되어 유지된다. 충분한 농도 (전형적으로 디터전트의 임계 미셀 농도 주변)에서, 계면활성제 분자의 표면층은 단백질 분자가 계면에서 흡착하는 것을 방지하는 작용을 한다. 이에 의해, 표면-유도된 분해가 최소화된다. 본원에서 고려되는 계면활성제에는 제한 없이, 소르비탄 폴리에톡실레이트의 지방산 에스테르, 즉 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80이 포함된다. 상기 둘은 분자에 소수성 특징을 부여하는 지방족 쇄의 길이만 상이하다 (각각 C-12 및 C-18). 따라서, 폴리소르베이트-80은 폴리소르베이트-20보다 더 표면-활성이고 더 낮은 임계 미셀 농도를 갖는다.
디터전트가 또한 단백질의 열역학 형태적 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 비이온성 계면활성제는 일반적으로 단백질 안정화에서 유용하다. 이온성 계면활성제 (디터전트)는 통상적으로 단백질을 탈안정화한다. 본원에서 다시, 주어진 디터전트 부형제의 효과는 단백질 특이적일 것이다. 예를 들어, 폴리소르베이트는 몇몇 단백질의 안정성을 감소시키고 다른 것들의 안정성을 증가시키는 것으로 나타났다. 단백질의 디터전트 탈안정화는 부분적으로 또는 전체적으로 언폴딩된 단백질 상태에서 특이적 결합으로 속박할 수 있는 디터전트 분자의 소수성 꼬리의 면에서 합리화될 수 있다. 이들 유형의 상호작용은 더 확장된 단백질 상태를 향한 형태적 평형의 이동을 유발할 수 있다 (즉 폴리소르베이트 결합에 보충하여 단백질 분자의 소수성 부분의 노출을 증가시킴). 별법으로, 단백질 천연 상태가 일부 소수성 표면을 나타내는 경우, 천연 상태에 결합하는 디터전트가 상기 형태를 안정화할 수 있다.
폴리소르베이트의 또 다른 측면은 고유하게 산화적 분해에 대해 감수성이라는 것이다. 종종, 원료로서, 이는 단백질 잔기 측쇄, 특히 메티오닌의 산화를 유발하는 충분한 양의 과산화물을 함유한다. 안정화제의 첨가로부터 발생하는 산화적 손상에 대한 잠재성은 부형제의 가장 낮은 유효 농도가 제형에서 사용되어야 한다는 점을 강조한다. 계면활성제의 경우, 주어진 단백질에 대한 유효 농도는 안정화 메카니즘에 의존할 것이다.
계면활성제는 또한 동결 및 건조 동안 표면 관련된 응집 현상을 방지하기 위해 적절한 양으로 첨가된다 [문헌 [Chang, B, J. Pharm. Sci. 85:1325, (1996)]]. 그러므로, 예시적인 계면활성제에는 제한 없이, 천연 아미노산으로부터 유래된 계면활성제를 포함하는 음이온성, 양이온성, 비이온성, 양쪽이온성 및 양친매성 계면활성제가 포함된다. 음이온성 계면활성제에는 나트륨 라우릴 술페이트, 디옥틸 나트륨 술포숙시네이트 및 디옥틸 나트륨 술포네이트, 케노데옥시콜산, N-라우로일사르코신 나트륨 염, 리튬 도데실 술페이트, 1-옥탄술폰산 나트륨 염, 나트륨 콜레이트 수화물, 나트륨 데옥시콜레이트 및 글리코데옥시콜산 나트륨 염이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 양이온성 계면활성제에는 벤잘코늄 클로라이드 또는 벤제토늄 클로라이드, 세틸피리디늄 클로라이드 일수화물 및 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 양쪽이온성 계면활성제에는 CHAPS, CHAPSO, SB3-10 및 SB3-12가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 비이온성 계면활성제에는 디기토닌, 트리톤 X-100, 트리톤 X-114, 트윈-20 및 트윈-80이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 계면활성제에는 또한 라우로마크로골 400, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 수소화된 피마자유 10, 40, 50 및 60, 글리세롤 모노스테아레이트, 폴리소르베이트 40, 60, 65 및 80, 대두 레시틴 및 다른 인지질, 예컨대 디올레일 포스파티딜 콜린 (DOPC), 디미리스토일포스파티딜 글리세롤 (DMPG), 디미리스토일포스파티딜 콜린 (DMPC) 및 디올레일 포스파티딜 글리세롤 (DOPG); 수크로스 지방산 에스테르, 메틸 셀룰로스 및 카르복시메틸 셀룰로스가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 그러므로, 이들 계면활성제를 개별적으로 또는 혼합물로서 상이한 비율로 포함하는 조성물이 추가로 제공된다. 본 개시의 한 실시양태에서, 계면활성제는 트윈-80이다. 본 제형에서, 계면활성제는 약 0.01 내지 약 0.5 g/L의 농도로 혼입된다. 다양한 실시양태에서, 제공된 제형에서, 계면활성제 농도는 0.005, 0.01, 0.02, 0.03, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1.0 g/L이다. 마찬가지로, 본 개시의 특정 실시양태에서, 계면활성제는 약 0.001, 0.002, 0.003, 0.004, 0.005, 0.01, 0.02, 0.03, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.5, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1.0％ w/v의 농도로 혼입된다.
염
염은 종종 단백질 용해도, 물리적 안정성 및 등장성에 중요할 수 있는 제형의 이온 강도를 증가시키기 위해 첨가된다. 염은 다양한 방법으로 단백질의 물리적 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 이온은 단백질의 표면 상의 대전된 잔기에 결합함으로써 단백질의 천연 상태를 안정화할 수 있다. 별법으로, 염은 단백질 골격에 따라 펩티드 기 (-CONH-)에 결합함으로써 변성된 상태를 안정화할 수 있다. 염은 또한 단백질 분자 내 잔기 간의 척력 정전기적 상호작용을 차폐함으로써 단백질 천연 형태를 안정화할 수 있다. 단백질 제형에서 염은 또한 단백질 응집 및 불용성을 초래할 수 있는 단백질 분자 간의 인력 정전기적 상호작용을 차폐할 수 있다. 염 (즉, 전해질)은 일반적으로 유의하게 Tg'를 감소시켜, 이에 의해 제형을 동결 건조하는 것을 더 곤란하게 하고 종종 불가능하게 한다. 이러한 이유로, 단백질 구조적 안정성을 유지시키기에 충분한 염만이 제형에 포함되어야 하고, 통상적으로 이러한 수준의 전해질은 매우 낮다.
특정 실시양태에서, 제형의 염 농도는 0.0 (즉, 염 없음), 0.001, 0.002, 0.003, 0.004, 0.005, 0.006, 0.007, 0.008, 0.009, 0.010, 0.011, 0.012, 0.013, 0.014, 0.015, 0.020, 0.050, 0.080, 0.1, 1, 10, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 300 내지 500 mM이다. 본 개시의 한 실시양태에서, 0.0 mM NaCl (즉, NaCl 없음)이 제형에 포함된다. 당업자는 본 개시의 다양한 실시양태에 따라 NaCl이 생략되거나 제거되나 한편 미량의 NaCl이 존재할 수 있다 (즉, 투석 또는 크로마토그래피 절차를 통한 NaCl 제거의 한계로 인해)는 것을 이해할 것이다. 그러므로, 다양한 실시양태에서, "NaCl의 배제"는 NaCl이 제형에 결코 첨가되지 않는다는 것을 의미하고, "미량의 NaCl"은 NaCl이 (예를 들어, 투석, 용매 교환 크로마토그래피 등에 의해 가능한 정도로) 제형으로부터 제거되었다는 것을 의미한다.
기타 통상적인 부형제 구성성분
아미노산
아미노산은 완충제, 증량제, 안정화제 및 항산화제로서 단백질 제형에서 다양한 용도를 발견하였다. 그러므로, 한 측면에서, 히스티딘 및 글루탐산이 각각 5.5 내지 6.5 및 4.0 내지 5.5의 pH 범위에서 단백질 제형을 완충하는데 사용된다. 히스티딘의 이미다졸 기는 pKa = 6.0을 갖고, 글루탐산 측쇄의 카르복실 기는 4.3의 pKa를 가지며, 이에 의해 이들 아미노산은 그의 각 pH 범위에서 완충하기에 적합하다. 글루탐산은 이러한 경우에 특히 유용하다. 히스티딘은 판매되는 단백질 제형에서 흔히 발견되고, 이러한 아미노산은 주사시 고통을 주는 것으로 공지된 완충제인 시트레이트에 대한 대안을 제공한다. 흥미롭게는, 히스티딘은 또한 액체 및 동결건조된 제형 둘 모두에서 높은 농도로 사용되는 경우 응집과 관련하여 안정화 효과를 갖는 것으로 보고되었다 (문헌 [Chen B, et al., Pharm Res., 20(12): 1952-60 (2003)]). 히스티딘은 또한 높은 단백질 농도 제형의 점도를 감소시키는 것으로 관찰되었다. 그러나, 동일한 연구에서, 저자들은 스테인리스 스틸 용기에서 항체의 동결-해동 연구 동안 히스티딘 함유 제형에서 증가된 응집 및 변색을 관찰하였다. 히스티딘에서의 또 다른 주의 사항은 금속 이온의 존재하에 광산화를 거친다는 것이다 (문헌 [Tomita M, et al., Biochemistry, 8(12): 5149-60 (1969)]). 제형에서 항산화제로서 메티오닌의 사용은 유망한 것으로 보이며; 이는 수많은 산화적 스트레스에 대해 효과적인 것으로 관찰되었다 (문헌 [Lam XM, et al., J Pharm Sci., 86(11): 1250-5 (1997)]).
다양한 측면에서, 아미노산 글리신, 프롤린, 세린, 아르기닌 및 알라닌 중 하나 이상을 포함하는 제형이 제공되며, 이는 우선적 배제의 메카니즘에 의해 단백질을 안정화하는 것으로 나타났다. 글리신은 또한 동결건조된 제형에서 흔히 사용되는 증량제이다. 아르기닌은 응집을 억제하는데 효과적인 작용제인 것으로 나타났고, 액체 및 동결건조된 제형 둘 모두에서 사용되었다.
제공된 제형에서, 아미노산 농도는 0.1, 1, 10, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 300 내지 500 mM이다. 본 개시의 한 실시양태에서, 아미노산은 글리신이다.
항산화제
단백질 잔기의 산화는 수많은 상이한 공급원으로부터 발생한다. 특정 항산화제의 첨가 이외에, 산화적 단백질 손상의 방지는 생성물의 제조 공정 및 저장에 걸친 수많은 인자, 예컨대 대기 산소, 온도, 광 노출 및 화학적 오염의 주의적 제어를 수반한다. 본 개시는 그러므로 제한 없이, 환원제, 산소/자유-라디칼 스캐빈져 또는 킬레이트제를 포함하는 제약 항산화제의 사용을 고려한다. 한 측면에서, 치료학적 단백질 제형에서 항산화제는 수용성이고, 생성물 저장 수명에 걸쳐 활성을 유지한다. 환원제 및 산소/자유-라디칼 스캐빈져는 용액 내 활성 산소 종을 제거함으로써 작용한다. 킬레이트제, 예컨대 EDTA는 자유-라디칼 형성을 촉매하는 미량의 금속 오염물질에 결합함으로써 효과적이다. 예를 들어, EDTA는 시스테인 잔기의 금속 이온 촉매된 산화를 억제하기 위해 산성 섬유모세포 성장 인자의 액체 제형에서 사용되었다. 본 개시의 한 실시양태에서, 글루타티온이 제형에 포함된다. 본원에 제공된 제형의 다양한 실시양태에서, 항산화제 농도는 0.005, 0.01, 0.02, 0.03, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1.0 mg/mL이다.
단백질 산화를 방지하기 위한 다양한 부형제의 유효성 이외에, 단백질에 다른 공유결합적 또는 물리적 변화를 유도하는 항산화제 그 자체에 대한 잠재성이 관심사이다. 예를 들어, 환원제는 분자내 디술피드 연결의 파괴를 유발할 수 있으며, 이는 디술피드 셔플링(shuffling)을 초래할 수 있다. 전이 금속 이온의 존재하에, 아스코르브산 및 EDTA는 수많은 단백질 및 펩티드에서 메티오닌 산화를 촉진시키는 것으로 나타났다 (문헌 [Akers MJ, and Defelippis MR. Peptides and Proteins as Parenteral Solutions. In: Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins. Sven Frokjaer, Lars Hovgaard, editors. Pharmaceutical Science. Taylor and Francis, UK (1999)]; [Fransson J.R., J. Pharm. Sci. 86(9): 4046-1050 (1997)]; [Yin J, et al., Pharm Res., 21(12): 2377-83 (2004)]). 나트륨 티오술페이트는 rhuMab HER2에서 광 및 온도 유도된 메티오닌-산화의 수준을 감소시키는 것으로 보고되었으나; 티오술페이트-단백질 부가물의 형성이 또한 이 연구에서 보고되었다 (문헌 [Lam XM, Yang JY, et al., J Pharm Sci. 86(11): 1250-5 (1997)]). 단백질의 특정 스트레스 및 민감성에 따라 적절한 항산화제를 선택한다. 특정 측면에서 고려되는 항산화제에는 제한 없이, 환원제 및 산소/자유-라디칼 스캐빈져, 금속 착화제, 예컨대 EDTA 및 나트륨 티오술페이트가 포함된다.
금속 이온
일반적으로, 전이 금속 이온은 단백질에서 물리적 및 화학적 분해 반응을 촉매할 수 있기 때문에 단백질 제형에서 바람직하지 못하다. 그러나, 특정 금속 이온은 단백질에 대한 보조인자인 경우 제형에 및 배위 착체를 형성하는 경우 단백질의 현탁액 제형에 포함된다 (예를 들어, 인슐린의 아연 현탁액). 최근에, 아스파르트산의 이소아스파르트산으로의 이성질체화를 억제하기 위한 마그네슘 이온의 사용 (10 내지 120 mM)이 제안되었다 (제WO 2004039337호).
금속 이온이 단백질에서 안정성 또는 증가된 활성을 제공하는 두 가지 예는 인간 데옥시리보뉴클레아제 (rhDNase, 풀모자임(Pulmozyme)®) 및 FVIII이다. rhDNase의 경우에, Ca+2 이온 (100 mM 이하)은 특이적 결합 부위를 통해 효소의 안정성을 증가시켰다 (문헌 [Chen B, et al., J Pharm Sci., 88(4): 477-82 (1999)]). 사실상, EDTA에 의한 용액으로부터의 칼슘 이온의 제거는 탈아미드화 및 응집의 증가를 초래하였다. 그러나, 이 효과는 오직 Ca+2 이온에서 관찰되었고; 다른 2가 양이온 Mg+2, Mn+2 및 Zn+2는 rhDNase를 탈안정화하는 것으로 관찰되었다. 유사한 효과가 FVIII에서 관찰되었다. Ca+2 및 Sr+2 이온은 단백질을 안정화하였으나, Mg+2, Mn+2 및 Zn+2, Cu+2 및 Fe+2와 같은 다른 이온은 효소를 탈안정화하였다 (문헌 [Fatouros, A., et al., Int. J. Pharm., 155, 121-131 (1997)]). FVIII에 의한 개별 연구에서, 응집 속도의 유의한 증가가 Al+3 이온의 존재하에 관찰되었다 (문헌 [Derrick TS, et al., J. Pharm. Sci., 93(10): 2549-57 (2004)]).
방부제
동일한 용기로부터 1회 초과의 추출을 수반하는 다회 사용 비경구 제형을 개발시 방부제가 필수적이다. 그의 1차 기능은 약물 생성물의 저장 수명 또는 사용 기간 전반에 걸쳐 미생물 성장을 억제하고 생성물 멸균성을 확실하게 하는 것이다. 흔히 사용되는 방부제에는 제한 없이, 벤질 알콜, 페놀 및 m-크레졸이 포함된다. 방부제는 긴 사용 역사를 갖고 있지만, 방부제를 포함하는 단백질 제형의 개발은 도전적일 수 있다. 방부제는 거의 항상 단백질에 대한 탈안정화 효과 (응집)를 갖고, 이는 다중 용량 단백질 제형에서의 그의 용도의 제한에서 주요 인자가 되었다 (문헌 [Roy S, et al., J Pharm Sci., 94(2): 382-96 (2005)]). 실제상, 방부제는 희석제 제형에 포함되고, 동결 건조되는 제형에 포함되지 않아야 한다.
현재까지, 대부분의 단백질 약물은 오직 단일-사용으로 제제화되었다. 그러나, 다중 용량 제형이 가능한 경우, 이는 환자 편리성 및 증가된 시장성을 가능하게 하는 추가 장점을 갖는다. 좋은 예는 보존된 제형의 개발이 보다 편리한 다회-사용 주사 펜 제형의 상업화를 가져온 인간 성장 호르몬 (hGH)이다. hGH의 보존된 제형을 함유하는 이러한 펜 장치 4종 이상이 현재 시판되고 있다. 노르디트로핀(Norditropin)® (액체, 노보 노르디스크(Novo Nordisk)), 뉴트로핀(Nutropin) AQ® (액체, 제넨테크(Genentech)) & 제노트로핀(Genotropin) (동결건조된 - 이중 챔버 카트리지, 파마시아앤드업존)은 페놀을 함유하나, 소마트로프(Somatrope)® (일라이 릴리(Eli Lilly))는 m-크레졸로 제제화된다.
보존된 투여량 형태의 제형 개발 동안 여러 측면이 고려될 필요가 있다. 약물 생성물 중 유효 방부제 농도가 최적화되어야 한다. 이는 단백질 안정성을 손상하지 않고 항미생물 유효성을 부여하는 농도 범위로 투여량 형태 내 주어진 방부제를 시험하는 것을 필요로 한다. 예를 들어, 시차 주사 열량측정법 (DSC)을 이용하여 인터류킨-1 수용체 (I형)를 위한 액체 제형의 개발에서 3종의 방부제가 성공적으로 스크리닝되었다. 방부제는 판매되는 제품에서 흔히 사용되는 농도에서 안정성에 대한 방부제의 영향에 기초한 순서로 등급매겨졌다 (문헌 [Remmele RL Jr., et al., Pharm Res., 15(2): 200-8 (1998)]).
방부제를 함유하는 액체 제형의 개발은 동결건조된 제형보다 더 도전적이다. 동결-건조된 생성물은 방부제 없이 동결건조되고 사용시 방부제 함유 희석제로 재구성될 수 있다. 이는 방부제가 단백질과 접촉하는 시간을 단축시켜, 관련된 안정성 위험을 유의하게 최소화한다. 액체 제형에서, 방부제 유효성 및 안정성은 전체 생성물 저장 수명 (약 18 내지 24개월) 전반에 걸쳐 유지되어야 한다. 중요한 주목할 점은 방부제 유효성이 활성 약물 및 모든 부형제 구성성분을 함유하는 최종 제형에서 나타나야 한다는 것이다.
몇몇 방부제는 주사 부위 반응을 초래할 수 있으며, 이는 방부제를 선택할 때 고려할 필요가 있는 또 다른 인자이다. 노르디트로핀 내 방부제 및 완충제의 평가에 초점을 맞춘 임상 시험에서, 통증 지각이 m-크레졸을 함유하는 제형과 비교하여 페놀 및 벤질 알콜을 함유하는 제형에서 저하되는 것으로 관찰되었다 (문헌 [Kappelgaard A.M., Horm Res. 62 Suppl 3:98-103 (2004)]). 흥미롭게는, 흔히 사용되는 방부제 중에서 벤질 알콜은 마취 특성을 보유한다 (문헌 [Minogue SC, and Sun DA., Anesth Analg., 100(3): 683-6 (2005)]). 다양한 측면에서, 방부제의 사용은 임의의 부작용보다 중요한 이익을 제공한다.
제조 방법
본 개시는 제약 제형의 제조 방법을 추가로 고려한다.
본 방법은 다음 단계 중 하나 이상을 포함한다: 본원에 기재된 바와 같은 안정화제를 동결건조 전에 상기 혼합물에 첨가하고, 증량제, 삼투 조절제 및 계면활성제 (각각은 본원에 기재된 바와 같음)로부터 선택된 1종 이상의 작용제를 동결건조 전에 상기 혼합물에 첨가한다.
동결건조된 물질에 대한 표준 재구성 관행은 순수 또는 멸균 주사용수 (WFI)의 일정 부피 (전형적으로 (그러나 필수적은 아님), 동결건조 동안 제거되는 부피와 동등함)를 보충 첨가하는 것이나, 항박테리아제의 희석 용액이 때때로 비경구 투여를 위한 약제의 제조에서 사용된다 [문헌 [Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, 18:1311-1354 (1992)]]. 따라서, 본 개시의 동결건조된 FVIII 조성물에 희석제를 첨가하는 단계를 포함하는, 재구성된 FVIII 조성물의 제조 방법이 제공된다.
동결건조된 물질은 다양한 수성 담체, 예를 들어, 멸균 주사용수, 다중 용량 사용을 위한 방부제를 갖는 물, 또는 적절한 양의 계면활성제를 갖는 물 (예를 들어, 수성 현탁액의 제조에 적합한 부형제와 부가혼합하여 활성 화합물을 함유하는 수성 현탁액)로 수용액으로서 재구성될 수 있다. 다양한 측면에서, 이러한 부형제는 현탁화제, 예를 들어 및 제한 없이, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 알긴산나트륨, 폴리비닐피롤리돈, 트라가칸트 검 및 아카시아 검이고; 분산제 또는 또는 습윤제는 천연 포스파티드, 예를 들어 및 제한 없이, 레시틴, 또는 지방산과 알킬렌 옥시드의 축합 생성물, 예를 들어 및 제한 없이, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 또는 장쇄 지방족 알콜과 에틸렌 옥시드의 축합 생성물, 예를 들어 및 제한 없이, 헵타데카에틸렌옥시세탄올, 또는 지방산 및 헥시톨로부터 유래된 부분 에스테르와 에틸렌 옥시드의 축합 생성물, 예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레에이트, 또는 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유래된 부분 에스테르와 에틸렌 옥시드의 축합 생성물, 예를 들어 및 제한 없이, 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레에이트이다. 다양한 측면에서, 수성 현탁액은 또한 하나 이상의 방부제, 예를 들어 및 제한 없이, 에틸, 또는 n-프로필, p-히드록시벤조에이트를 함유한다.
투여
인간 또는 시험 동물에게 조성물을 투여하기 위해, 한 측면에서, 조성물은 하나 이상의 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 어구 "제약상" 또는 "약리학상" 허용되는은 하기 기재된 바와 같은 당분야에 익히 공지된 경로를 이용하여 투여시 안정하고, 단백질 분해, 예컨대 응집 및 절단 생성물을 억제하고, 또한 알레르기성 반응 또는 다른 유해 반응을 생성하지 않는 분자 실체 및 조성물을 지칭한다. "제약상 허용되는 담체"는 임의의 및 모든 임상적으로 유용한 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등 (상기 개시된 작용제 포함)이 포함된다.
제약 제형은 경구로, 국소로, 경피로, 비경구로, 흡입 분무에 의해, 질로, 직장으로 또는 두개내 주사에 의해 투여된다. 본원에서 사용되는 용어 비경구는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 지장막 하조내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 정맥내, 피부내, 근육내, 유선내, 복강내, 경막내, 안구후, 폐내 주사 및/또는 특정 부위에서의 수술적 이식에 의한 투여가 또한 고려된다. 일반적으로, 조성물은 발열원, 뿐만 아니라 수용자에게 유해할 수 있는 다른 불순물을 본질적으로 함유하지 않는다.
조성물의 단일 또는 다중 투여는 치료하는 의사에 의해 선택될 투여 수준 및 패턴으로 수행된다. 질병의 예방 또는 치료를 위해, 적절한 투여량은 상기 정의된 바와 같은 치료될 질병의 유형, 질병의 경중도 및 과정, 약물이 예방학적 또는 치료학적 목적을 위해 투여되는가, 이전 치료요법, 환자의 임상 병력 및 약물에 대한 반응, 및 담당 의사의 판단에 의존한다.
키트
추가 측면으로서, 본 개시는 대상체에게 투여하기 위한 그의 사용을 용이하게 하는 방식으로 포장된 하나 이상의 동결건조된 조성물을 포함하는 키트를 포함한다. 한 실시양태에서, 이러한 키트는 방법의 실행에서 화합물 또는 조성물의 사용을 기재하는 용기에 부착되거나 패키지에 포함된 라벨을 갖는 용기, 예컨대 밀봉된 병 또는 그릇에 포장된, 본원에 기재된 제약 제형 (예를 들어, 치료학적 단백질 또는 펩티드를 포함하는 조성물)을 포함한다. 한 실시양태에서, 제약 제형은 용기 내 헤드스페이스의 양 (예를 들어, 액체 제형과 용기의 상단 사이의 공기의 양)이 매우 작게 되도록 용기에 포장된다. 바람직하게는, 헤드스페이스의 양은 무시가능하다 (즉, 거의 없음). 한 실시양태에서, 키트는 치료학적 단백질 또는 펩티드 조성물을 갖는 제1 용기 및 조성물을 위한 생리학상 허용되는 재구성 용액을 갖는 제2 용기를 함유한다. 한 측면에서, 제약 제형은 단위 투여량 형태로 포장된다. 키트는 특정 투여 경로에 따라 제약 제형을 투여하기에 적합한 장치를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 키트는 제약 제형의 사용을 기재하는 라벨을 함유한다.
투여량
본원에 기재된 상태의 치료 방법에 수반된 투여량 처방계획은 약물 작용을 변형시키는 다양한 인자, 예를 들어 환자의 연령, 상태, 체중, 성별 및 식이, 임의의 감염의 경중도, 투여 시간 및 다른 임상적 인자를 고려하여 담당 의사에 의해 결정될 것이다. 예로서, 본 개시의 재조합 FVIII의 전형적인 용량은 대략 30 IU/kg 내지 50 IU/kg이다.
한 측면에서, 본 개시의 제형은 초기 볼루스에 의해, 이어서 약물 생성물의 치료학적 순환 수준을 유지하기 위해 연속 주입에 의해 투여된다. 또 다른 예로서, 본 발명의 화합물은 1회 용량으로서 투여된다. 당업자는 좋은 의료 행위 및 개별 환자의 임상 상태에 의해 결정되는 바와 같은 유효 투여량 및 투여 처방계획을 용이하게 최적화할 것이다. 투여 빈도는 작용제의 약동학 파라미터 및 투여 경로에 의존한다. 최적의 제약 제형은 투여 경로 및 바람직한 투여량에 의존하여 당업자에 의해 결정된다. 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) pages 1435-1712]을 참조하며, 상기 문헌의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 이러한 제형은 투여되는 작용제의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출 속도 및 생체내 청소 속도에 영향을 준다. 투여 경로에 의존하여, 적합한 용량은 체중, 체표면적 또는 기관 크기에 따라 계산된다. 적절한 투여량은 적절한 용량-반응 데이터와 함께 혈액 수준 투여량을 결정하기 위한 확립된 검정의 사용을 통해 확신될 수 있다. 최종 투여량 처방계획은 약물 작용을 변형시키는 다양한 인자, 예를 들어 약물의 특정 활성, 손상의 경중도 및 환자의 반응도, 환자의 연령, 상태, 체중, 성별 및 식이, 임의의 감염의 경중도, 투여 시간 및 기타 임상적 인자를 고려하여 담당 의사에 의해 결정된다. 연구가 수행됨에 따라 다양한 질병 및 상태를 위한 적절한 투여량 수준 및 치료의 지속시간에 관한 추가 정보가 나올 것이다.
하기 실시예는 제한하려는 것이 아니라 오직 본 개시의 특정 실시양태를 예시하는 것으로 의도된다.
실시예 1
물질 및 방법
물질
사용된 부형제는 분석용 시약 등급이었다. D-만니톨, 트레할로스, 라피노스, 소르비톨 및 수크로스를 판슈틸 랩. 인크.(Pfanstiehl Lab. Inc.)로부터 구입하였다. 글리신을 채텀 케미칼스(Chattem Chemicals)로부터 얻었다. M-히드록시에틸 전분, 아르기닌 및 알라닌을 아지노모토 캄파니, 인크.(Ajinomoto Co., Inc.)로부터 얻었다. 염화나트륨, 염화칼슘 및 트리스 베이스를 말린크로트 인크.(Mallinckrodt Inc.)로부터 얻었다. 헤페스, L-히스티딘 및 폴리소르베이트-80을 각각 이. 엠. 사이언스(E. M. Science), 타나베, 캄파니 인크.(Tanabe, Co. Inc.) 및 스펙트럼 인터내셔날 인크.(Spectrum Int. Inc.)로부터 얻었다. 환원된 글루타티온을 시그마(Sigma)로부터 얻었다.
제형 제조
백스터 헬스케어 리미티드(Baxter Healthcare Ltd.)에 의해 공급된 벌크 약물 물질 (BDS)을 사용하여 본원에 기재된 제형을 제조하였다. BDS는 3130 IU/ml rAHF (즉, rFVIII); 50 mM 트리스 베이스, 0.4 M NaCl, 0.1％ 폴리소르베이트-80 (계면활성제), 4 mM CaCl2, pH 7로 구성되었다. CaCl2 및 계면활성제는 각각 천연 형태를 안정화하고 공정 손실을 감소시키기 위해 존재하였고, 용액 내 최적의 안정성을 위해 pH 7을 선택하였으나, 다른 pH가 또한 최적의 안정성을 제공할 수도 있다. BDS를 증류수에 의해 희석하고, 다양한 부형제와 혼합하여 일련의 제형 용액을 제조하고 pH 7로 중화하였다. 바이알에 충전하기 전에, 밀리포어(Millipore)로부터 얻은 0.22 μ 구멍 크기를 이용하여 단백질 함유 제형 용액을 여과한 후, 30 cc, 20 mm 피니시 I형 튜빙 바이알에 충전하였다 (5 mL). 바이알 및 마개 (플루로텍(Flurotec))를 다이쿄 세이코(Daikyo Seiko)로부터 구입하였다.
동결 건조
동결-건조를 듀라-스탑/듀라-드라이(Dura-Stop/Dura-Dry) 또는 리오스타(LyoStar) 동결-건조기 (FTS)에서 수행하였다. 동결-건조기 양자 모두는 각각 4.0 및 4.6 sq. ft.의 총 면적을 갖는 3개의 이동가능한 선반을 가졌다. 시차 정전용량 압력계 (MKS)를 이용하여 챔버 압력을 측정하였다. 바이알에서 바닥 중심에 위치된 30 게이지 구리-콘스탄탄 열전쌍을 통해 생성물 및 선반 온도를 측정하여, 가장자리 및 내부 바이알 둘 모두의 온도를 샘플링하였다. 사용된 상이한 공정의 세부사항은 적절한 결과 및 논의 섹션에 제공된다.
효력 검정
코아그-아-메이트(COAG-A-MATE) 기기 (오가논 테크니카 코포레이션 (Organon Teknika Corp.; 미국 노스캐롤라이나주 더럼))를 이용하여 검정을 수행하였다. 1-단계 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간 (APTT) 검정에 의해 기질로서 인간 FVIII 결핍 혈장 및 활성인자로서 미립자화된 실리카를 사용하여 FVIII 활성을 결정하였다. 두 상이한 분석자가 두 개별 바이알을 시험함으로써 FVIII 효력을 결정하였으며, 각각의 바이알을 2회 반복으로 시험하였다. 그러므로, 보고된 활성 데이터는 4개의 반복 결정의 평균이었다. 평균 값을 -70℃에서 저장된 상응하는 효력 값 샘플과 비교하고, "-70℃ 대조"의 퍼센트로서 보고하였다. 반복 결정으로부터의 통상적인 표준 편차는 약 5％이며, 이는 평균의 표준 오차가 약 2.5％임을 의미한다.
물 함량 검정
전기량측정 칼 피셔(Karl Fisher) 적정, AF7LC (피셔 사이언티픽(Fisher Scientific))에 의해 동결-건조된 케이크 내 수분 함량을 결정하였다. 동결-건조된 샘플을 이전에 건조된 메탄올 2 mL에 현탁하고, 메탄올이 바이알 내 모든 분말을 습윤화한 것을 확실하게 하기 위해 약 5분 동안 진탕하고, 미세 슬러리를 형성하였다. 대기로의 샘플의 노출을 최소화하기 위해 슬러리 2 mL 모두를 적정기로 신속하게 이동시켰다. 동일한 유형의 바이알 및 마개를 이용하여, 수많은 블랭크 실행을 오직 메탄올만으로 상기 기재된 바와 동일한 절차에 따라 수행하였다. 샘플 및 블랭크 적정 값의 차이로부터 동결-건조된 샘플 내 물의 양을 계산하였다. 3개의 상이한 바이알을 이용함으로써 모든 측정을 3회 반복하였다. 보고된 물 함량은 3개의 측정치의 평균이었고, ±0.1％ 또는 더 양호한 범위 내에서 정밀하였다.
열 분석
TA 기기 시차 주사 열량측정법 (DSC-2920)을 이용하여 동결-건조된 케이크의 유리 전이 온도 (Tg)를 측정하고, 1차 건조를 위해 통상적으로 추천되는 최대 온도인 붕괴 온도보다 약간 더 낮은 온도를 나타내기 위해 통상적으로 취해지는, 동결된 시스템에서 동결 건조된 농축물의 유리 전이 온도 (Tg')를 측정하였다. 0.796℃의 진폭, 60초의 기간 및 2℃/분의 선형 스캔 속도로 "전체 가열" 조건 하에 "조정된" 방식으로 DSC를 작동시켰다. 건조 샘플을 건조 백에서 취급하였으며, 이를 상대 습도를 2％ 미만에서 유지하기 위해 건조 질소 기체로 연속적으로 플러싱하였다. 동결-건조된 샘플 약 5 내지 10 mg을 두께 약 3 내지 4 mm의 디스크로 압축시킨 후, 알루미늄 팬에서 밀봉하였다. 동결된 용액에 대한 측정을 위해, 약 50 μL 용액을 Al DSC 팬으로 이동시키고 밀봉하였다. 모든 DSC 측정을 건조 질소 분위기 (50 mL/분)에서 수행하였다. 표준 절차에 따라 고순도의 인듐을 사용하여 온도 및 에너지의 보정을 수행하였다. 유리 전이를 역 신호에 의해 제공되는 바와 같은 전이의 중간점으로서 결정하였으며, 약 ±0.5℃ 내에서 재현가능하였다.
동결 건조 현미경법
동결-건조 현미경법을 이용하여 붕괴 온도 측정을 수행하였다. 샘플을 2개의 유리 커버 슬립 사이에 위치시키고, -50℃ 미만의 온도로 신속하게 동결하였다. 샘플을 함유하는 챔버를 약 200 mTorr로 배기하고, 증가하는 샘플 온도에서 현미경을 통해 동결-건조 공정을 관찰하였다. 건조된 영역 내 "케이크 구조"의 유지를 갖는 동결 건조가 붕괴 온도 미만에서 관찰되었다. 붕괴 온도 초과의 온도에서, 건조된 영역 내 구조의 손실이 관찰되었다. 붕괴 온도는 ±1℃ 내에서 재현가능하였다.
X선 분말 회절
X선 분말 회절 연구는 40 kv 및 40 mA의 튜브 로드에서 작동하는 CuKα 공급원 (λ = 1.54 Å)을 갖는 노렐코(Norelco) 분말 회절분석계를 이용하였다. 동결-건조된 샘플을 미세 분말로 완만하게 분쇄하고, 샘플홀더 상에 산포시키고, 로딩 전에 완만하게 가압하였다. 모든 스캔을 온도 및 습도의 주변 조건 하에 수행하였다. 샘플을 0.5°/분의 스캔 속도로 10°로부터 60° (2□)까지 스캔하였다.
실시예 2
NaCl 수준의 변동이 일반적으로 허용되지 않으며, 특히 상업적 제품에서 허용되지 않기 때문에, 그리고 구성성분의 결정화가 다른 구성성분에 비해 상기 구성성분의 증가된 농도에 의해 일반적으로 촉진되기 때문에, 동결 단계 동안 NaCl의 결정화를 가능하게 하기에 충분히 높고 공정에서 예상되는 최고 수준 초과의 값으로 수준을 증가시키기 위해 NaCl을 첨가하기로 결정하였다. 0.02％ (w/v) 폴리소르베이트-80, 10 mM 트리스, 4 mM 염화칼슘 및 2％ (w/v) 수크로스를 추가로 함유한 제형 중 다양한 농도의 염화나트륨의 동결을 연구하기 위해 조정된 시차 주사 열량계 (MDSC)를 이용하였다. 이 실험을 위해, 200 mM 염화나트륨을 사용하였다. 염화나트륨의 완전 결정화가 동결 동안 일어난 것을 확실하게 하기 위해 1 mM 내지 10000 mM, 또는 10 mM 내지 1000 mM 또는 100 mM 내지 500 mM, 또는 150 mM 내지 300 mM의 범위의 농도를 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 농도를 사용할 수 있었다.
한 바람직한 실시양태에서, 200 mM 염화나트륨을 함유하는 샘플을 사용하여, 염화나트륨의 부재하에 시스템의 Tg' (-36℃)에 접근한 동결된 고체의 (Tg') 값 (-39℃)을 초래하였으며, 이는 염화나트륨의 대부분이 결정화된 것을 제안하였다. 붕괴 온도 (동결 건조 현미경법을 통함)는 Tg' 값의 약 1℃ 내에 있었다. 150 mM 또는 그 미만의 염화나트륨을 함유하는 용액은 -50℃ 미만의 Tg' 값을 제공하였으며, 이는 비결정화된 염화나트륨 (즉 무정형 염화나트륨)의 존재를 나타내었다. 이러한 관찰은 바이알에서 동결 건조된 물질에 대한 제한된 연구에서 확인하였다. 동결건조된 경우, 200 mM 미만의 염화나트륨을 함유하는 용액은 Tg' 데이터에 의해 예측된 바와 같은 케이크 구조에서의 붕괴의 다양한 정도를 나타내었으나, ≥200 mM NaCl에서 붕괴가 방지되었고, 결정질 증량제와 NaCl은 유발하였다 (X선 분말 회절).
실시예 3
동결-건조의 상이한 단계에서 rAHF가 스트레스에 노출된 경우 rAHF의 안정성에 대한 상이한 농도의 rAHF의 효과를 검사하였다. 상이한 농도의 rAHF, 600 및 60 IU/mL (150 & 15 ㎍/ml에 상응함)를 함유하는 두 샘플을 어떠한 안정화제 없이 사용하였다. 이들 샘플에 대한 제형 조성물은 다음과 같았다: 8％ 만니톨 (증량제), 10 mM 트리스 완충제, 200 mM NaCl, 4 mM CaCl2, 0.02％ 폴리소르베이트-80, pH 7.0. 제3 샘플은 이들 구성성분 이외에 안정화제로서 2％ 수크로스를 사용한 제형을 사용하였다. 표 1에 기재된 사용된 건조 공정은 대부분의 제형에서 붕괴를 방지하기에 충분히 낮은 약 -42℃의 생성물 온도를 생성하였으나; 이 공정은 최적화되지 않았다.
동결-건조 공정 (표 1에 기재된 바와 같음)의 각각의 단계에서 각각의 샘플의 소량 분취액을 뽑고 rAHF의 활성을 결정함으로써 rAHF의 공정중 안정성에 대한 단백질의 농도의 효과를 평가하였다. 결과는 표 2에 요약되어 있다.
더 낮은 수준의 rAHF (60 IU/ml)를 함유하는 제형 (샘플 B 및 C)은 동결 동안 초기 rAHF 효력의 35-39％를 손실하였으나, 더 높은 rAHF (600 IU/ml)를 함유하는 제형 (샘플 A)은 오직 약 3％만을 손실하였다. 데이터에서 불확정성은 약 3％이므로; 높은 농도 제형을 동결하는 동안 활성 손실은 무시가능하였다는 것을 주목한다. 다음 열 처리 및 동결건조 동안, 더 높은 농도의 rAHF를 함유하는 제형은 또한 더 낮은 농도의 rAHF를 함유하고 수크로스를 함유하지 않은 제형보다 더 낮은 활성 손실을 가졌다. 이들 관찰은 더 높은 농도의 rAHF가 자가-보호 효과를 갖는다는 것을 제안하였다. 건조 동안 활성 손실은 모든 제형에서 유의하고 (18 내지 24％) 비교가능하였다. 저장 동안 안정성은 낮은 농도 샘플 (B)에서보다 높은 농도 샘플 (A)에서 약간 더 양호하였고, 수크로스 함유 제형 샘플 (C)에서 훨씬 더 양호하였다.
실시예 4
rAHF를 위한 바람직한 제형을 확인하기 위해 안정성 및 동결 건조 거동에 대해 제형 샘플을 스크리닝하였다. 한 실시양태에서, 제형은 증량제 (일반적으로 8％) 및 안정화제 (2％)의 다양한 조합을 수반하였으나, 당업자는 다른 농도의 증량제 및 안정화제도 유사하게 적합하다는 것을 이해할 것이다. 이러한 동일한 실시양태에서, 증량제로서 히드록시에틸 전분 (HES; 헤스) 또는 NaCl을 사용하는 제형은 각각 4％ 및 2.3％의 농도에서 사용하였으나, 다시 당업자는 이들 부형제에 대한 다른 농도도 유사하게 적합하다는 것을 이해할 것이다. 또한, 모든 제형은 다음 부형제 및 조건을 포함하였다: 220 mM NaCl, 0.03％ (v/v) 폴리소르베이트-80, 4 mM CaCl2, 10 mM 트리스 완충제 및 pH 7. 동결-건조 사이클은 표 3에 기재된 안정화제 및 증량제의 특정 조합을 사용하였다.
모든 제형은 초기 용액 중 100 IU/ml rAHF를 함유하였다. rAHF의 불안정성이 더 낮은 단백질 농도에서 최대화되므로, 안정성 차이의 더 용이한 평가를 허용하기 때문에 더 낮은 수준의 rAHF를 선택하였다. 잠재적 제형 후보물질을 확인하기 위한 제형 스크리닝은 두 기준 세트, (1) 물리적 특징 및 (2) 안정성을 이용하였다.
물리적 특징: 동결-건조된 생성물의 물리적 특징을 다음 기준에 의해 판단하였다: (1) 합당한 시간 내에 낮은 잔류 수분 (통상적으로 <1％)으로 붕괴 없이 동결 건조하는 능력, (2) 동결-건조된 고체의 유리 전이 온도, (3) 동결-건조된 생성물의 외관, 및 (4) 바이알 내용물을 멸균 주사용수 5 mL에서 용해시킴으로써 결정된 바와 같은 재구성 시간. 물리적 특징의 결과는 표 4에 나타낸다.
일반적으로, 모든 동결-건조된 고체는 허용되는 재구성 시간을 가졌다. 그러나, 모두가 바람직한 제형, 특히 만니톨-기재 제형보다 더 높은 잔류 수분 함량 및 더 낮은 유리 전이 온도를 가졌다. 또한, x선 분말 회절 데이터 (데이터는 나타내지 않음)는 만니톨 수화물 피크에 대한 증거를 나타내었으며, 이는 일부 만니톨이 탈용매화하기 곤란한 만니톨 수화물로 결정화된 것을 나타내었다. 또한, 적어도 만니톨 함유 시스템에 대해, 무정형 만니톨의 Tg는 오직 약 13℃이기 때문에 만니톨의 불완전 결정화는 무정형 상의 Tg를 유의하게 저하할 것이다.
공정중 안정성: 표 3에 기재된 공정을 이용하여, 만니톨/리신을 배제한 모든 제형을 제조하고 여과하고 충전하고 동결건조하였다. 초기 제형으로부터 rAHF 효력의 복원에 의해 공정중 안정성을 추정하였다. 도 1은 초기 활성에 비해 다양한 제형에서 공정 후 rAHF의 활성 퍼센트를 요약한다. 만니톨/글리세롤 제형 내 rAHF의 활성은 본질적으로 전체적으로 손실되었으며 (99.8％ 손실); 그러므로, 이러한 제형에 대한 데이터는 도면에 나타내지 않았다. 만니톨/소르비톨 및 글리신/라피노스를 함유하는 제형 내 rAHF의 활성은 또한 공정 동안 유의한 활성 손실을 겪었다. 글리세롤 및 소르비톨을 함유하는 제형 내 rAHF의 불량한 공정중 안정성은 동결된 시스템의 매우 낮은 유리 전이 온도 (Tg') (<-50℃) 및 2차 건조에서 시스템의 예상된 낮은 Tg'로 기인되었다. 소르비톨의 Tg는 -1.6℃ (20)이고, 글리세롤에 대한 Tg는 훨씬 더 낮았다.
저장 안정성: 동결-건조된 샘플을 선택된 시간 동안 상이한 온도 (-70℃, 5℃, 25℃, 40℃ 및 50℃, 60℃)에서 안정성 시험 상에 위치시켰다. 각각의 시점에, 활성 검정을 위해 각각의 샘플의 2개의 바이알을 제거하였다. 각각의 시점에 rAHF의 활성을 -70℃에서 유지된 대조 rAHF 샘플의 활성으로 표준화하였다. 이 절차는 검정에서 장기간 변동이 취소되었다는 것을 확실하게 하였다 (-70℃에서 저장된 샘플의 검정에서 시간 의존성은 나타나지 않았다). 무정형 고체에서의 분해에 일반적인 바와 같이, 분해는 "연신 시간" 동력학을 따랐으며, 하기 선형 식과 완전히 일치하였다.
상기 식에서,
P = 시간 t에서 FVIII의 활성
P0 = FVIII의 초기 효력 ( = -70℃ 대조의 효력)
k= 분해에 대한 속도 상수
t= 시간 (개월)
식 1은 각각 상이한 분해 속도를 갖는 유리질 상태에서 평형이 아닌 여러 가지 독립적 미세상태로부터의 분해와 일치하였다. 그러므로, 식 1로부터 결정된 속도 상수 (k)는 동결건조된 매트릭스 내 수많은 상이한 단백질 형태로부터 속도 상수의 조합을 나타내며, 이들 각각은 상이한 속도로 분해하였다. 일반적으로, 속도 식은 1 미만의 몇 거듭제곱된 시간에 대해 선형인 활성의 log를 수반하는 것으로 예상되며, 여기서 거듭제곱은 종종 1/2이나, 낮은 수준의 분해의 경우에 선형 식 (식 1)이 타당한 근사식이었다. 많은 샘플에서, 분해는 최소가 아니었고, 사실상 분해 정도가 특히 컸던 표 2에 제공된 예비 데이터는 식 1과 잘 부합하지 않았고, log 표현식을 필요로 하였다. 여기서 연구된 여러 샘플에 대해서는, 식 1의 log 버전으로 양호한 피트(fit)를 얻을 수 있었으나, 선형 표현식인 식 1은 실제로 거의 모든 경우에 데이터를 약간 더 양호하게 피팅하였다. 그러므로, 경험상, 식 1의 이용이 허용되었고, 이 표시로부터 유도된 속도 상수를 비교하는 것이 합당하였다. 데이터를 나타내는데 있어 식 1의 적합성은 -70℃ 대조 샘플에 비한 활성선 손실 퍼센트를 25℃, 40℃ 및 50℃에서 저장된 rAHF의 두 제형에 대해 시간의 제곱근의 함수로서 플롯팅한 도 2에 예시된다. 플롯팅된 결과의 선형성은 우수하였다.
25℃, 40℃ 및 50℃에서 다양한 제형 내 rAHF의 분해 속도 상수를 식 1을 이용하여 회귀 분석에 의해 얻었고, 도 3에 비교하였다. 결과는 NaCl 기재 제형이 NaCl이 결핍된 제형보다 덜 안정하였다는 것을 나타내었다.
최종 후보 제형의 선택: 다음 제형을 그의 바람직한 특징으로 인해 추가 분석으로 처리하였다: 만니톨/아르기닌, 글리신/트레할로스 및 만니톨/트레할로스. 만니톨/트레할로스 제형은 정교한 케이크를 생성하고 트레할로스가 매우 높은 유리 전이 온도 (약 117℃)를 갖기 때문에 바람직한 실시양태이며, 그러므로 예를 들어 저장 동안 마개로부터 물의 흡수를 통해 잔류 물이 증가한 경우, 유리 전이 온도 문제점에 덜 지배받을 것이다. 더욱이, 만니톨은 용이하게 결정화가능하고, 완전 결정화의 결핍도 만니톨에서보다 글리신에 대한 훨씬 더 낮은 Tg'의 직접적 결과로서 글리신의 불완전 결정화보다 Tg'에 대한 덜 심각한 충격을 주었다.
산화 최소화: 글루타티온 및 히스티딘의 역할
산화는 rAHF 생성물이 기능적 활성을 손실하는 경로이다. N-아세틸-L-시스틴, 리포산 및/또는 환원된 글루타티온은 본 개시의 바람직한 실시양태에서 사용하기에 적합한 안정화제이며, 글루타티온은 가장 효과적인 항산화제였다 (데이터는 나타내지 않음). 따라서, 0.2 mg/mL 환원된 글루타티온을 연구 하에 제형에 첨가하였다.
연구된 제형은 다음 완충제: 트리스, 히스티딘 및/또는 헤페스 중 하나 이상을 포함하였다.
히스티딘의 pKa는 pH 7에서 최적의 완충성에는 너무 낮았으나, 히스티딘은 철 킬레이트제로서 작용하여 이에 의해 철 촉매된 산화를 제한할 수 있는 것으로 추측되기 때문에 히스티딘은 매력적이었다. 헤페스보다 히스티딘의 또 다른 잠재적 장점은 헤페스 (11℃)보다 그의 고유한 더 높은 Tg (37℃)이며, 그러므로 최종 동결-건조된 케이크에서 더 높은 유리 전이 온도에 기여하였다. 글루타티온의 첨가는 저장 안정성을 개선시키며, 도 4에 나타낸 결과는 전형적인 것으로 일반적으로 이해된다. 도 4에서, 4개의 글리신/트레할로스 제형에 대해 25℃에서 9개월 저장 동안 손실 및 공정중 손실에 대해 비교를 수행하였다. 공정중 분해는 모든 제형에 대해 본질적으로 동일하였다. 히스티딘 또는 글루타티온 없는 "기본" 제형은 명확하게 저장 동안 최소 안정하였으나, 나머지 세 가지 제형 (이들 모두는 글루타티온을 포함함)은 25℃에서 저장 동안 동일한 수준의 분해를 나타내었다. 즉, "기본" 제형 + 철 킬레이트제, 데페록사민, 또는 "기본" 제형 + 10 mM 헤페스는 히스티딘을 갖는 제형과 동일한 안정성을 제공하였다.
간단한 제형 대안: NaCl 없이 이당류만의 제형
NaCl을 제거한 경우 제형의 동결-건조 특징 및 안정성을 검사하였다. NaCl 없이 완충제에 대해 BDS로부터 투석에 의해 NaCl을 제거하였다. 생성된 BDS는 한 실시양태에서 미량의 NaCl을 함유하였고, 또 다른 실시양태에서 NaCl을 함유하지 않았다. 완충제 조성물 및 제형 조성물, 뿐만 아니라 동결-건조된 생성물의 물리적 특징 및 사용된 공정은 표 6에 제공된다.
심지어 비-최적화된 동결-건조 사이클을 이용하여, NaCl을 제거하고 동결건조 전에 최종 제형의 제조 동안 부형제로서 NaCl을 첨가하지 않은 부형제 제형, 특히 트레할로스 기재 제형은 극히 낮은 잔류 수분 함량 및 높은 Tg 값을 갖는 생성물을 제공하였으며, 모두는 부형제로서 NaCl을 첨가한 제형에서 필요로 되는 시간보다 실질적으로 더 짧았다 (83 hr 대 113 hr, 표 5 및 6 참조).
도 5에 나타낸 바와 같이 BDS로부터 NaCl을 제거한 이당류만의 제형 내 rAHF의 저장 안정성을 부형제로서 NaCl을 BDS에 최소로 첨가한 제형에서의 안정성과 비교하였다. 모든 제형은 글루타티온 및 히스티딘을 함유하고, 오직 증량제 (만니톨) 및 NaCl의 존재, 뿐만 아니라 투석시 발생하는 손실 (또는 희석)로 인한 이당류만의 제형 내 약간 더 낮은 rAHF 농도가 상이하였다. NaCl을 제거하고 제제화 동안 부형제로서 NaCl을 BDS에 첨가하지 않은 제형은 NaCl을 부형제로서 첨가한 제형보다 더 신속하게 동결 건조되었고, 정교한 생성물을 초래하였다. 또한, 안정성은 NaCl 없이 유의하게 양호하며, 특히 40℃ 및 60℃에서 트레할로스 제형에서 양호하였다. 도 5의 데이터가 주어지고, 아레니우스(Arrhenius) 거동을 가정하여, 25℃에서의 속도 상수는 NaCl 함유 제형의 경우 3.0 (시간 (개월))이나, 트레할로스만의 제형에 대한 상응하는 속도 상수는 1.44였다. 이러한 차이는 NaCl 없는 트레할로스 제형의 경우 10％만큼 분해하는데 4-년 시간 기간이 필요하였으나 NaCl을 포함하는 제형의 경우 10％만큼 분해하는데 오직 11개월이 필요한 것으로 번역되었다. 요컨대, 실온 안정성은 투석에 의한 NaCl의 제거 및 제형 부형제로서 투석 후 NaCl을 첨가하지 않은 것에 따라 실현된 것이었으며, 동결건조 시간-기간이 단축되는 결과를 가져왔다.
상기를 고려하여, 본 개시의 한 실시양태에서 표 6에 따른 제형이 제공된다.
Claims (21)
- (a) 제8 인자(FVIII); (b) 하나 이상의 완충제; (c) 하나 이상의 항산화제; (d) 하나 이상의 안정화제; 및 (e) 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 제8 인자(FVIII)의 제약상 안정한 동결건조된 제형으로서,
상기 FVIII가
a) 재조합 FVIII 폴리펩티드;
b) a)에 대하여 90％ 초과의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고 a)와 동일한 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드
로 이루어진 군으로부터 선택되고;
상기 완충제가 시트레이트, 글리신, 히스티딘, 헤페스(HEPES), 트리스(Tris) 및 이들 작용제의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 0.1 mM 내지 500 mM 범위의 pH 완충제를 포함하고 상기 pH가 6.0 내지 8.0 범위이고;
상기 항산화제가 0.1 내지 0.5 mg/ml 농도의 글루타티온이고;
상기 안정화제가 0.005 내지 20％ w/v 농도의 수크로스, 트레할로스 및 라피노스 및 이들 안정화제의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
상기 계면활성제가 0.001％ w/v 내지 1.0％ w/v 농도의 디기토닌, 트리톤(Triton) X-100, 트리톤 X-114, 트윈(TWEEN)-20, 트윈-80 및 이들 계면활성제의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
상기 제형이 염화나트륨 (NaCl)을 배제하는 것인 제형. - 삭제
- 제1항에 있어서, 완충제가 히스티딘인 제형.
- 삭제
- 제1항에 있어서, pH가 6.5 내지 7.5 범위인 제형.
- 제1항에 있어서, 완충제가 히스티딘이고, pH가 7.0인 제형.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 항산화제가 0.2 mg/ml 농도의 글루타티온인 제형.
- 제1항에 있어서, 완충제가 히스티딘이고, pH가 7.0이고; 항산화제가 0.2 mg/ml 농도의 글루타티온인 제형.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 안정화제가 5％ w/v 농도의 트레할로스이고, 제형이 4 mM 농도의 염화칼슘을 추가로 포함하는 것인 제형.
- 제1항에 있어서, 안정화제가 5％ w/v 농도의 수크로스이고, 제형이 4 mM 농도의 염화칼슘을 추가로 포함하는 것인 제형.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 계면활성제가 0.03％ w/v의 트윈-80인 제형.
- 제1항에 있어서, 완충제가 pH 7.0에서 25 mM 농도의 히스티딘이고; 항산화제가 0.2 mg/ml 농도의 글루타티온이고; 안정화제가 5％ w/v 농도의 트레할로스 또는 수크로스이고; 계면활성제가 0.03％ w/v의 트윈-80이고; 제형이 4 mM 농도의 염화칼슘을 추가로 포함하는 것인 제형.
- (a) 제1항에 따른 제형을 제조하는 단계; 및
(b) 단계 (a)의 제형을 동결건조하는 단계
를 포함하는, 안정한 동결건조된 FVIII의 제조 방법. - 제17항에 있어서, 동결건조된 FVIII의 안정성이 NaCl의 존재하에 동결건조된 FVIII 제형과 비교하여 더 높은 것인 방법.
- (a) 제8 인자(FVIII); (b) 하나 이상의 완충제; (c) 하나 이상의 항산화제; (d) 하나 이상의 안정화제; 및 (e) 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 제8 인자(FVIII)의 제약상 안정한 동결건조된 제형으로서,
상기 FVIII가
a) 재조합 FVIII 폴리펩티드;
b) a)에 대하여 90％ 초과의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고 a)와 동일한 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드
로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 포함하고;
상기 완충제가 1 내지 50 mM 농도의 히스티딘을 포함하고 6.0 내지 8.0의 pH를 갖고;
상기 항산화제가 0.1 내지 0.5 mg/ml 농도의 글루타티온이고;
상기 안정화제가 1 내지 10％ w/v 농도의 트레할로스 또는 수크로스 및 1 내지 10 mM 농도의 염화칼슘이고;
상기 계면활성제가 0.01％ w/v 내지 0.05％ w/v 농도의 트윈-80이고;
상기 제형이 염화나트륨 (NaCl)을 배제하는 것인 제형. - (a) 제8 인자(FVIII); (b) 하나 이상의 완충제; (c) 하나 이상의 항산화제; (d) 하나 이상의 안정화제; 및 (e) 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 제8 인자(FVIII)의 제약상 안정한 동결건조된 제형으로서,
상기 FVIII가
a) 재조합 FVIII 폴리펩티드;
b) a)에 대하여 90％ 초과의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고 a)와 동일한 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드
로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 포함하고;
상기 완충제가 25 mM 농도의 히스티딘을 포함하고 7.0의 pH를 갖고;
상기 항산화제가 0.2 mg/ml 농도의 글루타티온이고;
상기 안정화제가 5 내지 10％ w/v 농도의 트레할로스 또는 수크로스 및 4 mM 농도의 염화칼슘이고;
상기 계면활성제가 0.03％ w/v 농도의 트윈-80이고;
상기 제형이 염화나트륨 (NaCl)을 배제하는 것인 제형. - 삭제
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