SE443293B - Blodfraktionsframstellning - Google Patents

Description

'7800902-4 15 20 25 35 40 2 Av ritningen framgår att vid aktivering av faktor XII (sanno- likt genom kontakt med exempelvis kollagen) övergår denna till fak- tor XIIa, som påverkar faktor XI, som då övergår i aktiv form (Xla).

Faktorn Xla påverkar faktorn IX (antihämofilí B-faktor) och denna övergår då i närvaro av kalciumjoner till faktorn IXa. Faktorn IXa tillsammans med kalciumjoner, fosfolipid och faktorn VIII (anti- hämofili A-faktor) påverkar faktor X, som aktiveras till faktor Xa.

Denna faktor Xa påverkar tillsammans med kalciumjoner, fosfolipid och faktor V faktorn II (protrombin) att övergå i aktiverad form till faktor IIa (trombin), som i sin tur bringar fibrinogen att över- gå till fibrin.

Om nu en faktor saknas i blodet brytes hela reaktionsföljden och fibrinbildning uteblir eller sker endast långsamt eller i ringa utsträckning. Av de faktorer som är av speciellt intresse i detta hänseende är faktorn VIII, antíhämofili A-faktor. faktor finnes bland annat hos blödarsjuka (hämofili A) och sådana I Brist på faktorn VIII kan Brist på denna som lider av von Wi1lebrand's sjukdom. även vara förvärvad.

På grund av den stora betydelsen av faktor VIII har man sedan länge försökt att framställa den i mer eller mindre koncentrerad form. Man har genom fraktionering av blodplasma enligt Cohns frak- tioneringsmetod utvunnit fraktion I, i vilken det mesta av utgångs- plasmans aktivitet av faktor VIII återfinnes. Denna fraktion I be- står till största delen av fibrinogen, men även andra proteiner (koaguleringsfaktorer) äterfinnes i den. Ytterligare rening sker genom extraktíon med 1 M glycinlösning innehållande cítrat och eta- nol (enlígt Blombäck och Blombäck). Den erhållna fraktionen (frak- tion I-0) har sedan 1956 använts i Sverige för behandling av hämo- filí A.

Preparat med aktivitet av faktor VIII har även erhållits ur s k kryoprecipitat, dvs ur precipitat som bildats vid långsam upp- tining vid +4°C av färsk frusen plasma. Detta kryoprecipitat kan lösas vid +37°C. Preparat med aktivitet av faktor VIII har även framställts genom etanol- och polyetylenglykolfraktíonering.

Föroreningar har Plasman har härvid precípiterats i kyla med 3 % etanol. adsorberats på aluminiumhydroxíd, varefter polyctylenglykol till- satts och fibrinogen kunnat avlägsnas fran preparatet av faktor VIII.

Man har även använt glycinprecipitering, varvid man utgått från kryoprecipitat, som behandlats med polyetylenglykol. Man har även försökt använda agaros-gelfiltreringar. 10 15 20 25 30 35 40 7800902-4 3 Alla dessa kända framställningsförfaranden har den olägenheten att de är svåra att reproducera och att de ger låga utbyten.

Det har nu visat sig, att man kan framställa koncentrat av någon eller några av blodfaktorerna från II, V och VIII eller plasma fri från någon eller några av faktorerna VII, IX, X, XI och XII, genom att ett reducerande ämne, som utgöres av ditiotreitol (DTT), ditioerytritol (DTE) eller liponsyra, sättes till blod eller plasma, varvid mängden reducerande ämne är minst 0,1 mg/ml plasma och varvid mängden och reaktionstiden avpassas efter önskad produkt, varefter blodet resp. plasma eventuellt fraktionernas på i och för sig känt sätt. Fraktionering kan ske enligt Cohn, men även andra kända metoder är användbara, t ex ammoniumsulfatutfäll~ ning, etermetoden, rivanolmetoden (2-etyl-6,9-diaminoakridin- -laktat), fällning med högpolymera ämnen och kromatografiska metoder, såsom gelfiltrering, jonbyteskromatografi eller affini- tetskromatografi. I en lämplig utföringsform tillsättes reduk- tionsmedlet till blod, som företrädesvis innehåller antikoagule- rande medel, såsom trinatriumcitrat (3,8 %) eller direkt till plasma. Blodet centrifugeras och den erhållna plasman behandlas enligt Cohn för utfällning av fraktion I, dvs. kyles och en etanol-buffertblandning tillsättes, varvid pH hålles vid 7,0-7,4, företrädesvis vid cirka 7,2. Den erhållna fällníngen avcentrifu- geras och ovanvätskan behandlas i princip vidare enligt Cohn för utfällning av fraktion II+III. Detta sker genom att till den kylda ovanvätskan under kylning sättes etanol vid ett pH av 6,8-7,2, företrädesvis 7,0. Efter avcentrifugering av ovanvätskan tvättas fällningen med en utspädd vattenlösning av alkohol, vanligen etanol, med sådan koncentration (25 S i 0,09 M NaCl), att fällningen icke upplöses. Efter tvättníngen löses fällningen (fraktion II+IlI) í kyld fysiologisk koksaltlösníng och nedfryšes omedelbart.

Exempel 1. Humant blod med antikoagulerande medel centrifugeras.

Till 235 ml plasma sättes 94 mg reducerande medel (DTT, som vatten- Inkubering: 5 min, 37°C, varefter jodättiksyra Därefter lösning, 20 mg/ml). i vattenlösning tillsättes, 3 mol jodättiksyra/mol DTT. följer Cohn fraktionering: Etëlsëiefkk Plasman (235 ml) kyles till 0°C. 41,6 ml av en 53,3-procentíg etanollösning kyles och tillsättes droppvis under 20 min. Kylbadet hålles då på -3°C, och temperaturen får gå ned till -3° under alko- holtillsatsen. pH på suspensionen: 7,3. Omröring i 60 min vid -3,5°C. Centrifugering: 30 min, 1800 varv, -3°C. Ovanvätskaz volym 10 15 20 7sno9o2-4 4 270 ml.

EIêEEiQILIIïIIII 260 ml ovanvätska fraktion I kyles till -SOC. av: 156,3 ml 55,3-procentig EtOH + 0,6 ml 95 % EtOH + 0,34 ml frak- tion II+III buffert kyles och tillsättes droppvís. Suspensíonen, En blandning med pH 6,7, får stå 45 min under omröring vid -SOC. Centrifugering: 30 min, 1800 varv, -SOC. Ovanvätskan hälles av och fällningen II+III tvättas med 250 ml 25-procentig BtOH i 0,09 M NaCl, under 10 min, omröring med glasstav. Centrifugering: 30 min, 2200 varv, -5°C.

Tvättvätskan avhälles och fraktion II+III upplöses i 40 ml kyld (0°C) 0,15 M NaCl, fördelas i mindre portioner och fryses omedelbart ned i -1o°c.

Aktiviteten för faktor VIII [och övriga koagulationsfaktorer) bestämmes på känt sätt. Cirka 8?-90 % av ursprungsplasmans aktiví~ 'et erhållna koncentratet. .illsats av det reducerande ämnet, tet av faktor VIII återfinnes i Det har även visat sig, av speciellt ditiotreitol, till bl IX, X, XI och XII kraftigt i de; jlasma, som erhålles från detta blod. Även direkt tillsats av det reducerande ämnet till normal trinatriumcitrathaltig plasma inaktiverar dessa faktorer. Denna aktivitet återkommer delvis vid oxidation, varför det är lämpligt att vid framställningen av sådan plasma blockera återoxidationen, sänker halten av faktorerna VII, -t ex med jodättiksyra.

Exempel Z. Humant blod med antikoagulerande medel (9 delar blod + 1 del 5,8-procentigt trinatriumcitratl centrifugeras och följande försök med plasma utföres: Plasman delas i 8 ml portioner, vilka förvärmes vid 37OC un- DTT tillsättes i olika koncentrationer, se tabell 1, Därefter tillsättes jodättiksyra, 3 mol der 5 min. och inkuberas 5 min, 57°C. per mol DTT och inkubering sker under 15 min vid 37°C.~ Plasma- proverna fördelas i portioner på ca 0,2 ml och fryses omedelbart ned vid -70°C. Utvärdering av olika koagulationsfaktorer sker pà känt sätt. 10 7800902-4 5 Tabell 1 Koagulatíonsfaktorer, % av kontroll Plasmaprover II F V F VII F IX F X F XI F XII A. Kontrollplasma 100 100 100 100 100 100 100 B. Kontrollplasma + jodättiksyra 99 95 108 82 96 90 106 C. Plasma + 0,1 mg DTT/ml plasma + jodättíksyra 101 94 87 129 59 47 78 D. Plasma + 0,2 mg DTT/ml plasma + jodättíksyra 69 90 21 16 6 9 18 E. Plasma + 0,4 mg DTT/ml plasma + jodättiksyra 41 85 6 8 0 0 0 F. Plasma + 0,6 mg DTT/ml plasma + jodättiksyra 33 90 0 0 0 0 0 Exempel 3. Humant blod med antikoagulerande medel (9 delar blod + 1 del 5,8-procentigt trínatríumcitrat) centrífugeras och följande försök med plasma utföres: U Plasman delas i 8 ml portioner, vilka förvärmes vid 37°C un- DTE tillsättes i olika koncentrationer (se tabell 2), Därefter tillsättes jodättík- syra (3 mol per mol DTE) och inkubering sker under 15 min vid 37oC. der 5 mín¿ varefter inkuberas í 5 min vid 37°C.

Plasmaproverna fördelas i portioner om cirka 0,2 ml och fryses omedelbart vid -7OOC. sker pà känt sätt: Utvärdering av olika koagulationsfaktorer 10 7800902-4 6 Tabell Z Koagulatíonsfaktorer, % av kontroll Plasmaprover F II F V F VII F VIII F IX F X F XI F XII A. Kontrollplasma 100 100 100 100 100 100 100 100 B. Kontrollplasma + jodättiksyra 100 105 90 115 93 8? 98 78 C. Plasma_+ 0,1 mg DTE/ml plasma + jodättiksyra 90 99 61 108 61 56 66 78 D. Plasma + 0,2 mg DTE/ml plasma + jodättiksyra 66 99 30 116 28 11 3 1 E. Plasma + 0,4 mg DTE/ml plasma + jodättiksyra S5 90 48 93 19 2 0 0 Exemgel 4. Humant blod med antikoagulerande medel (9 delar blod + 1 del 3,8-procentígt trinatriumcitrat) centrifugeras och följande försök med plasma utförest Plasman delas i 8 ml portioner, vilka förvärmes vid 37°C un- Liponsyra tillsättes i olika koncentrationer (se tabell Härefter tillsättes jod- der S min. 3), varefter inkuberas i 5 min vid 3700.

I ättiksyra (3 mol per mol liponsyra) och inkubering sker under 15 min vid s7°c. och fryses omedelbart vid -70°C.

Plasmaproverna fördelas i portioner om cirka 0,2 ml Utvärdering av olika koagulatíons- faktorer sker på känt sätt. 10 7800902-4 7 Tabell 3 Koagulationsfaktorer, % av kontroll Plasmaprover F II F V F VII F VIII F IX F X F XI F XII A. Kontrollplasma 100 100 100 100 100 100 100 100 B. Kontrollplasma + jodättiksyra 100 105 90 115 93 87 98 t 78 C. Plasma + 0,1 mg liponsyra/ml plasma + jod- ättiksvra 100 100 252 111 58 40 67 74 D. Plasma + 0,2 mg liponsyra/ml plasma + jod- ättiksyra 103 91 203 98 53 26 32 78 E. Plasma + 0,4 mg líponsyra/ml plasma + jod- ättiksyra 103 215 285 111 58 32 39 98 Det är även möjligt att fraktionera plasma, som är utarmad på faktorerna VII, IX, X, XI och XII. ligt Cohn för utfällning av fraktion II+III, såsom beskrivits. fraktion II+III innehåller då faktorerna Il, V och VIII. Till denna fraktion sattes en bestämd mängd aktiverad faktor XI (Xla), som er- hållits genom reaktion med ytaktiverad faktor XII pâ i och för sig känt sätt. Fosfolipider, såsom inosítinlipid, tillsättes därjämte.

Det hela frystorkas därefter tillsammans med buffertmedel i sådana Denna fraktionering kan ske en- Denna mängder, att en lösning med optimalt pH och optimal jonstyrka er- hålles vid återbildning av medlet med hjälp av vatten.

Detta medel är speciellt lämpligt för bestämning av aktivite- ten av faktorerna X och IX i "intrínsic koagulationssystemet" och för bestämning av faktor VII och X'i system där man tillsätter väv- nadstromboplastin som kofaktor, "extrinsic koagulatíonssystemet".

Sådana medel har varit svårtillgängliga, eftersom man förut har varit tvungen att ha tillgång till plasma från människor med svår brist på dessa faktorer. Sådana människor är sällsynta.

Faktorerna VII, IX och X är proenzym i blod, som kan aktiveras på olika sätt (ett sätt visas på bifogad ritning). Den aktiverade faktorn X, faktor Xa, verkar som protrombinaktivator i koagulations- processen. Kongenital brist på faktorerna VII, IX och X är tämligen 10 20 7800902-4 S sällsynt, men halten av dessa faktorer sjunker hos patienter med vissa leversjukdomar och vid behandling av patienter med dikumarol, som tillföres vid blodproppssjukdomar.

Det är av mycket stor vikt att under dikumarolbehandlingens gång fastställa aktiviteten av de vitamin K-beroende faktorer som har kort halveringstid, dvs faktorerna VII, X och IX, eftersom des- sas aktivitet avtar märkbart under behandlingen. Hitintills har man endast haft tillgång till medel som till större eller mindre del be- stämmer summan av alla vitamin K-beroende faktorer; således även faktor II. ligen fordringen att kunna, beroende på vilken aktivator som använ- Det på beskrivet sätt erhållna medlet uppfyller väsent- des, bestämma summaeffekten av antingen faktorerna X och VII eller IX och X.

Exempel 5. Genom tillsats av reducerande ämne, t ex 0,2 mg DTT per ml plasma, vid en låg temperatur, t ex ZZOC, kan man delvis selek- tivt påverka nedsättníngen av koagulationsaktiviteten hos de olika faktorerna. I exempel 5 pâverkas ej aktiviteten av faktor IX i lika hög grad som aktiviteten av faktor X. Ett sådant medel blir värde- fullt vid specifík bestämning av faktor X i det s k intrinsic koagu- lationssystemet.

Claims (3)

9 7800902-4 B-llëlfïšßil!

1. l. Förfarande för framställning av koncentrat av nagon eller nagra av blodfaktorerna II, V och VIII eller plasma Fri från någon eller nagra av faktorerna VII, IX, X, XI och Xll, k ä n n e - t e c k n a t därav, att ett reducerande ämne, som utgöres av ditiotreitol, ditioerytritol eller liponsyra, sättes till blod eller plasma, varvid mängden reducerande ämne är minst 0,1 mg/ml plasma och varvid mängden och reaktionstíden avpassas efter önskad produkt, varefter blodet resp. plasma eventuellt fraktioneras på i och för sig känt sätt.

2. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t c c k n a t därav, att fraktioneringen sker enligt Cohn.

3. Förfarande enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a t därav, att blodet centrifugeras och att erhâllen plasma kyles och att en etanol-buffertblandning tillsättes vid pH 7,0-7,4, företrädesvis cirka 7,2, att till den kylda ovanvätskan sättes etanol vid ett pH av 6,8-7,2, företrädesvis cirka 7,0, och lämpligen under kylning, att erhållen fällning efter separering från ovanvätskan tvättas med vattenhaltig alkohol, företrädesvis etanol, och löses i företrädes- vis kyld, fysiologisk koksaltlösning för omedelbar användning eller för nedfrysning.