SE452250B - Sett att framstella ett koncentrat av protrombinkomplex - Google Patents

Description

452 250 I andra förfaranden har man även, när den erhållna produkten en gång erhållits, vidtagit åtgärden att stabilisera den genom till- sats av heparin och dess co-faktor genom användning av t.ex. ett komplett serum som källa för heparin-co-faktor.

De nyligen föreslagna koncentraten har emellertid en avsevärd an- del aktiverad faktor trots den slutliga tillsatsen av heparin.

Enligt föreliggande uppfinning åstadkommas ett förfarande för fram- ställning av koncentrat av protombinkomplex, vilket förfarande till- låter direkt framställning av ett icke "aktiverat" koncentrat, dvs stabilt och utan risk för patienterna.

Enligt uppfinningen âstadkommes även ett enkelt och billigt förfa- rande för framställning av ett sådant koncentrat.

Uppfinningen avser ett sätt att framställa ett koncentrat av pro- trombinkomplex, som praktiskt taget saknar aktiverat protrombin- komplex, varvid man som utgångsmaterial använder en källa, som samtidigt innehåller protombinkomplexet och antitrombin III, ut- sätter nämnda källa för inverkan av ett adsorptionsmedel, som be- står av aluminiumoxid, och eluerar protrombinkomplexet med ett elueringsmedel, bestående av en buffertlösning med alkaliskt pH- värde, vilket sätt kännetecknas av att man sätter heparin till ut- gångsmaterialet före adsorptionen och av att man utför elueringen av protrombinkomplexet, av antitrombin III och av heparinet samti- digt med en buffertlösning med ett pH-värde av 7,5-8,5.

Heparinet aktiverar anti-trombin III. Det aktiverade anti-trombi- net III skyddar och stabiliserar protrombinkomplexet.

Heparinet sättes företrädesvis till källan för protrombinkomplexet och källan för AT III före adsorptionen. Man kan även bringa hepa- rinet i kontakt med adsorberingsmedlet och därefter bringa detta i kontakt med utgângskällan.

Vid förfarandet enligt uppfinningen befinner sig sålunda protrom- binkomplexet skyddat under hela förfarandets förlopp.

Som utgångskälla användes företrädesvis den fraktion, som erhål- les från fryst plasma efter eliminering av kryofällningen, vilken 452 250 fraktion benämnes kryofattig plasma "cryo poor plasma" eller CPP .

Man kan emellertid även använda en nyberedd plasma, eventuellt frusen.

Man kan även som utgångssubstans använda COHN's fraktion III till vilken det är lämpligt att sätta antitrombinet AT III t.ex. i form av COHN's fraktion IV. Man kan även som utgångssubstans an- vända enbart fraktionen IV, ty denna fraktion IV är även en källa för protrombinkomplex.

När man utgår frân en plasma tillsätter man företrädesvis heparin så snabbt som möjligt och till och med om möjligt är före frysningen.

Den heparinmängd, som skall sättas till, är en funktion av kvali- teten pâ källan för protrombinkomplex. Denna mängd varierar i all- mänhet från ca 0,1 till ca 1 internationell enhet per milliliter källa.

Adsorptionen utföres på aluminiumoxidgel, som har visat sig vara speciellt lämplig för adsorptionen och elueringen av det skyddade protrombinkomplexet enligt uppfinningen.

Man genomför adsorptionen vid den temperatur, som är mest gynnsam.

Man arbetar i allmänhet vid en temperatur under rumstemperatur, t.ex. vid 0 - 15°C. Sålunda är temperaturen för aluminiumoxidgel företrädesvis ca 2 - 8°C.

Man utför elueringen med varje medel, som samtidigt kan eluera pro- trombinkomplexet och AT III. Man använder i allmänhet en buffert med lämplig jonstyrka.

Enligt en föredragen utföringsform absorberas källan, t.ex. en fraktion CPP, som fått en heparintillsats, pâ aluminiumoxidgel, varefter man utför elueringen mellan OOC och rumstemperatur.

Den eluerade fraktionen kan renas vid ca pH 7 tack vare en eller flera tillsatser av polyetylenglykol (PEG) (5 - 10%), som fäller ut de icke önskade proteinerna. Företrädesvis utföres utfällning- arna med PEG vid en temperatur under rumstemperatur, t.ex. 0 - 8°C och företrädesvis vid ca 2 - 4°C. 452 250 Efter det att fällníngen med de kontaminerande proteinerna elimi- nerats genom centrifugering bringas pH-värdet i övervätskan till ett värde av storleksordningen 4,8 - 5,2, PEG tillsättes till en koncentration av 12 - 20%, och fällningen, som innehåller protrom- binkomplexet, isoleras. Denna förutfällning utföres även vid låg temperatur. Det erhållna protrombinkomplexet âterupplöses därefter, varefter denna slutlösning eventuellt genomgår filtrerings-, för- delnings- och lyofiliseringsförfaranden.

Uppfinningen avser även det koncentrat av protrombinkomplex, som framställes enligt uppfinningen, och som praktiskt taget saknar aktiverat protrombinkomplex. Ett sådant koncentrat kan erhållas med det beskrivna förfarandet. Det skiljer sig från de hittills erhållna produkterna, som i allmänhet innehåller betydande eller mycket betydande mängder av komplexet i "aktiverat" tillstånd.

Koncentratet av protrombinkomplex enligt uppfinningen är användbart som läkemedel, isynnerhet för behandling av koaguleringsrubbnin- gar, isynnerhet brister pà faktor IX men även av sjukdomen hemor- ragi hos nyfödda, överskridande av dosen av coumarinläkemedel och leversjukdomar i framskridet stadium. Det administreras med de van- liga administreringssätten och de vanliga doserna.

Detta komplex har de farmakologiska egenskaper och den oskadlig- het, som är vanliga för andra koncentrat av renade protrombinkomp- lex, men skiljer sig isynnerhet genom frånvaron eller nästan frán- varo av oönskade trombotiska komplikationer.

Uppfinningen skall nu beskrivas närmare med hjälp av ett icke be- gränsande utföringsexempel.

Utgângskällan är nämnda fraktion CPP, det vill säga det som är kvar av en frusen och tinad plasma, från vilken man tagit bort kryofällningen.

Till denna fraktion sättes heparin så att man i blandningen har ca 0,5 enhet per milliliter plasma CPP.

Därefter utför man vid en låg temperatur mellan 0 och 8°C och före- trädesvis mellan 2 och 4°C adsorptionen på aluminiumoxidgel i ett förhållande av 10-20 ml aluminiumoxidgel per liter av detta hepa- rinplasma.

Q 452 250 Man rör om och centrifugerar sedan och tar till vara gelen.

Därefter utföres elueringen av gelen med hjälp av en lämplig klas- sisk elueringsbuffert. Som exempel kan man använda en buffert in- nehållande 0,25 M kaliumfosfat, 0,17 M trinatriumcitrat, 5 H20 och 0,083 M EDTA. pH-värdet justeras till omkring 7,5-8,5 och man kan utföra elueringen med en volym buffert av storleksordningen 1/30 av volymen av plasma CPP. Elueringen utföres på vanligt sätt, varvid gelen suspenderas i elueringsbufferten under omröring. Man utför därefter en centrifugering och tar till vara eluatet.

Därefter justeras eluatets pH-värde till ca 7, och temperaturen till ca 2 - 4°C, varefter man tillsätter 5 - 10 vikt/volymprocent PEG (polyetylenglykol). Man rör om och centrifugerar därefter och eliminerar fällningen för att ta till vara övervätskan.

Man sänker därefter övervätskans pH-värde till ett relativt lågt värde av storleksordningen 4,8-5,2, PEG tillsättes till en halt av 12-20% PEG, varvid man beaktar inledningsvis tillsatt PEG och volymökningen, man rör om och centrifugerar för att ta till vara fällningen. Detta steg utföres även vid låg temperatur.

Fällningen försättes därefter i upplösning, företrädesvis vid rums- temperatur, i en lösning innehållande t.ex. natriumklorid eller trinatriumcitrat, varvid upplösningsvolymen ligger vid ca 1/2 el- ler 1/3 av elueringsvolymen; Efter upplösning justeras pH-värdet så att man erhåller en klar lösning, vilket betyder en fullständig upplösning, vilket sker vid ett pH~värde av ca 7.

Därefter återstår att utföra en filtrering företrädesvis via mem- å bran, varvid åtminstone slutfiltreringen utföres på ett sterilt sätt.

Man fördelar därefter den erhållna produkten sterilt i önskade mängder och lyofiliserar därefter och detta omedelbart efter frys- ning.

Man erhåller sålunda ett koncentrat av faktor IX, som praktiskt ta~ get saknar oönskad aktivitet.

Claims (8)

452 250 Det ovan beskrivna exemplet är såsom framgår på intet sätt be- gränsande. Administreringen av det lyofiliserade koncentratet sker parente- ralt. Koncentratet är inte toxiskt vid de vanliga aktiva doserna. Det koncentrat, som erhålles enligt uppfinningen, kan användas vid behandling av koaguleringsrubbníngar, varvid man till en person, som lider av sådana rubbningar, administrerar en effektiv mängd av ett koncentrat av protrombinkomplex, såsom det definieras i före- liggande ansökan. Patentkrav

1. Sätt att framställa ett koncentrat av protrombinkomplex, som praktiskt taget saknar aktiverat protrombinkomplex, varvid man som utgângsmaterial använder en källa, som samtidigt innehåller protrombinkomplexet och antitrombin III, utsätter nämnda källa för inverkan av ett adsorptionsmedel, som består av aluminiumoxid, och eluerar protrombinkomplexet med ett elueringsmedel, bestående av en buffertlösning med alkaliskt pH-värde, k ä n n e t e c k - n a t av att man sätter heparin till utgångsmaterialet före ad- sorptionen och av att man utför elueringen av protrombinkomplexet, av antitrombin III och av heparínet samtidigt med en buffertlös- ning med ett pH-värde av 7,5 - 8,5.

2. Sätt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att halten heparin ligger mellan 0,1 och 1 internationella enheter per milli- liter källa. '

3. Sätt enligt något av krav 1 eller 2, k ä n n e t e c k n a t av att man som källa för protrombinkomplexet och antitrombin III använder en plasmafraktion, erhållen efter eliminering av kryo- fällningen. a... 452 250

4. Sätt enligt krav 1 eller 2, k ä n n e t e c k n a t av att man som utgångsmaterial använder nyberedd plasma.

5. Sätt enligt något av de föregående kraven, k ä n n e t e c k - n a t av att man såsom källa för protrombinkomplex och antitrom- bin III använder COHN's fraktion IV.

6. Sätt enligt ett eller flera av de föregående kraven, k ä n - n e t e c k n a t av att man utför adsorptionen vid en temperatur under rumstemperatur.

7. Sätt enligt ett eller flera av de föregående kraven, k ä n - n e t e c k n a t av att man utför elueringen vid en temperatur mellan OOC och rumstemperatur.

8. Sätt enligt krav 7, k ä n n e t e c k n a t av att man ut- för elueringen vid rumstemperatur.