DE2063070C3

DE2063070C3 - Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels mit fibrinstabilisierender Wirkung

Info

Publication number: DE2063070C3
Application number: DE2063070A
Authority: DE
Inventors: Hans 3550 Marburg Biel; Oswald Dr. 3550 Marbach Zwisler
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1970-12-22
Filing date: 1970-12-22
Publication date: 1975-07-24
Also published as: NL159582B; DE2063070A1; IL38403A; DK127227B; SE371930B; FR2119009B1; NL7117363A; GB1380056A; IL38403A0; AU432182B2; ES398016A1; BE777136A; CA957943A; CH575235A5; BR7108490D0; JPS5421402B1; AT310941B; AU3708871A; FR2119009A1; DE2063070B2

Description

40

♦5

Der fibrinstabilisierende Faktor — auch Faktor XlII genannt — spielt bei der Blutgerinnung eine wichtige Rolle. Fehlt er im Blut, so treten bei Verletzungen starke Nachblutungen auf, und die Wundheilung ver-Eögert sich. Der Faktor-XIII-Mangel kann erblich bedingt sein oder als Folge von Krankheiten auftreten, so bei Lebercirrhose, Karzinom, Leukämie Und Verbrauchskoagulopathie. Diese Zustände können lebensbedrohliche Formen annehmen, besonders bei Neugeborenen sowie bei Schwangeren, bei denen der Faktor-XIII-Mangel zu Fehlgeburten führt.

Durch Substitution können diese Mangelzustände behoben werden. Dabei hat man sich bisher damit geholfen, daß man Blut, Plasma odei Fibrinogen-Präparate verwendete. Hiervon muß jedoch jeweils ein größeres Volumen infundiert werden, was in vielen Fällen unerwünscht, zudem lästig und zeitraubend ist. Außerdem werden dem Patienten dabei zwangsläufig Begleitproteine und Blutgruppensubstanzen verabreicht, die zu Unverträglichkeiten führen können. Es ist daher ein Präparat erwünscht, das eine hohe fibrinstabilisierende Aktivität besitzt, weitgehend frei von Begleitproteinen ist und auch keine Blutgruppensubstanzen enthält

Es ist zwar bereits bekannt, daß der Faktor ΧΙΠ im Blutplasma und in Thrombozyten enthalten ist und aus ihm gewonnen werden kann. Seine Darstellung erfolgte durch Fällung mittels Ammonsulfat, Erhitzen und DEAE-Cellulose-Chromatographie. Die Konzentration des fibrinstabilisierenden Faktors in Plasma ist jedoch niedrig und die Ausbeute des angegebenen Verfahrens daher gering. Die Erhitzung, bei der der Faktor XIII vom Fibrinogen getrennt wird, ist nur mit kleineren Ansätzen durchführbar. Das Verfahren hat daher in die Technik keinen Eingang gefunden und keinerlei Bedeutung erlangt.

Auch ist Plasma als Ausgangsmaterial für die gewerbliche Gewinnung des Faktors XIII zu teuer. Aus dem gleichen Grunde sind die Thrombozyten keine Quelle für die industrielle Herstellung des Faktors XIII.

Es wurde nun gefunden, daß man den fibrinstabilisierenden Faktor XIII in guten Ausbeuten aus menschlichen Plazenten isolieren kann. Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels mit fibrinostabilisierender Wirkung, gekennzeichnet durch die im Patentanspruch wiedergegebenen Maßnahmen.

Geeignete Stabilisatoren [vgl. (f)] sind z. B. Humanalbumin oder hydrolytisch abgebaute, mittels Isocyanat quervernetzte Gelatine, wie sie unter dem geschützten Warenzeichen Haemaccel im Handel erhältlich ist.

35 Sedimentat.

Koeffizient

Molekulargewicht

Kohlenhydrat-

gehalt in %

Hexosen

Fukose

Hexosamin

(N-Acetyl-) Neuraminsäure

(N-Acetyl-) Aminosäurereste pro 100 Aminosäuren

Lysin

Histidin

Arginin

Asparaginsäure

Threonin

Serin

Glutaminsäure

Prolin

Glycin

Alanin

Valin

Methionin

Isoleucin

Leucin

Tyrosin

Phenylalanin ..

Va Cystein

Plasma

Faktor XIII aus Thrombozyten

8,4 S
300 000

1,2

6,3
2,5
5,5

10,4
7,2
7,2

12,7
5,7
7,9
4,1
⁷,5
2,0
4,8
7,3
5,0
3,9

7,4 S

150 000

bis 200 000

1,5 1,2 0,0

0,16 0,15

5,7 2,0 6,2

12,2 5,9 5,8

10,8 4,6 7,1 5,3 9,9 2,6 5,2 6,8 4,2 4,5 1,2

Plazenta

7,2S 165 000

1,47 0,98 0,0

0,28 0,21

5,1 1,9 6,2

12,2 6,2 6,1

11,0 4,9 7,0 5,3 9,7 2,6 5,0 6,7 4,4 4,6 1,1

Der im erfindungsgemäö erhältlichen Mittel ent- der pH-Wert auf 7,0 nachgestellt Durch Zugabe von haltene fibrinstabilisierende Faktor aus menschlichen frischem Natriumchlorid wird die Natriumchlorid-Plazenten unterscheidet sich nicht charakteristisch Konzentration auf 2% erhöht. Unlösliches wird durch voni Thrombozyten-Faktor XIIL. wohl aber vom Zentrifugieren entfernt. Der Überstand wird mittels Plasma-Faktor XIII. Die chemischen .und physika- 5 dreidimensional vemetztem Dextran fraktioniert und lisch-chemischen Daten sind in vorstehender Tabelle mit Tris-ihydroxymethylVaminomethan-HCl-Puffer, zusammengestellt der 0.0G5 Mol/l EDTA und 0,1% Natriumazid ent-

Die Aktivität des fibrinstabilisierenden Faktors hält, eluiert Das Eluat wird in einem Fraktions-

wird durch einen Verdünnungstest {vgl. Thromb. sammler aufgefangen. Die vereinigten aktiven Frak-

diathes. haemorrh., 23, 455 [1970]) bestimmt. Man io tionen enthalten etwa 1200 mg Eiweiß, das an

macht sich dabei die unterschiedliche Löslichkeit Diäthylenaminoäthyl-Cellulose mit einer von 100 bis

des vernetzten und (mangels fibrinstabiüsierenden 200 μ und einer Kapazität von 0,9 bis l,0mäq/g

Faktors) nicht vernetzten Fibrins in l%iger Chlor- adsorbiert wird. Dafür werden 24 ml Cellulose

essigsäure zunutze. Mit steigender. Verdünnungen gebraucht

der zu bestimmenden Losung werden zunächst aus 15 Für die Elution werden 50 ml einer Lösung auf

Faktor-XIil-freiem Fibrinogen mittels Thrombin Fi- 0,6% Natriumchlorid und 0,1% e-Aminocapronsäure

bringerinnsel erzeugt und mit 1 %iger Chloressigsäuie pH 7,0 verwendet. Das Eluat wird 24 Stunden gegen

inkubiert. Danach wird diejenige Verdünnung, in der 501 eines 0,015 %igen Natriumphosphatpuffers pH 7,0,

das Fibringerinnsel gerade noch erhalten bleibt, der 5 mg Glukose pro Milliliter enthält, dialysiert.

bestimmt. Diese ist die Faktor-XIII-Konzentration, ao Aus dem Endprodukt wurden 241 Abfüllungen mit

die zur Vernetzung gerade ausreicht. In der nächst- der Aktivität von jeweils 250 ml Frischplasma gewon-

höheien Verdünnung löst sich das Fibringerinnsel auf. nen. Diese Menge entspricht mehr als 1201 Blut.

Als Bezugssubstanz dient normales menschliches Da die Aktivität des Ausgangsmaterials nicht immer

Mischplasma. Die in 1 ml enthaltene Faktor-XIII- gleichbleibend ist, können auch die Ausbeuten

Aktivität ist als eine Einheit definiert. Die gesuchte »5 schwanken. Aus einem analogen Ansatz mit 45 1

fibrinstabilisierende Aktivität errechnet sich aus dem Plazentenextrakt wurden 147 Abfüllungen mit der

Verhältnis der Grenzwerte für die Verdünnung von Aktivität von jeweils 250 ml Frischplasma gewonnen,

Mischplasma und Testlösung. entsprechend einer Menge von mehr als 701 Blut.

Als Anwendung für den das erfindungsgemäß Aus beiden Ansätzen hat sich jedoch gezeigt, daß

erhaltene Arzneimittel, das den Faktor XIH enthält, 30 das erfindungsgemäße Verfahren technisch vorteilhaft

kommen alle Faktor-XIII-Mangelzustände in Frage, ist.

so bei angeborenem Mangel und daraus sich ergeben- Beispiel 2
den haemorrhagischen Syndromen, Blutungen und

Wundheilungsstörungen sowie bei vorübergehendem 50 kg gefrorene Plazenten vom Menschen werden

Faktor-XIII-Mangel, z. B. nach Operationen und dar- 35 fein zerkleinert und mit 501 einer 0,2%igen NaCl-

aus resultierender Wundheilungsverzögerung. Die Lösung verrührt. Das Gemisch wird auf +10⁰C

den Fakl or XIII enthaltende Lösung wird intravenös erwärmt und zentrifugiert. 451 dieses Extraktes

injiziert. Man geht zweckmäßig von einer Menge aus, werden mit einer 3 %igen Diaminoäthoxyacridin-

die der Faktor-XIII-Aktivität von 250 ml frischem Lösung bis zu einer Konzentration von 6 g Diamino-

Humanplasma entspricht. Je nach Bedarf kann bis 40 äthoxyacridinlactat pro 100 g Eiweiß versetzt, die

zur vierfachen Menge appliziert werden. dadurch entstandene Fällung in neutralem Wasser

. suspendiert und Natriumchloridlösung bis zu einer

B e ι s ρ 1 e 1 1 NaCl-Konzentration von 3 % zugegeben. Nach_15 Mi-

50 kg gefrorene Plazenten vom Menschen werden nuten Rühren werden bei 10⁰C 4,551 Äthanol

fein zerkleinert und mit 501 einer 0,5 %igen NaCl- 45 zugefügt und 1 Stunde gerührt. Der bei der Zen-

Lösung verrührt. Das Gemisch wird auf +10⁰C trifugation entstandene Rückstand wird verworfen,

erwärmt und zentrifugiert. 45 1 dieses Extraktes Der Überstand, in dem sich die fibrinstabilisierende

werden mit einer 3%igen Diaminoäthoxyacridin- Aktivität befindet, wird mit Aktivkohle geklärt, die

lactat-Lösung bis zu einer Konzentration von 8 g Natriumchloridkonzentration durch Zugabe von neu-

Diaminoäthoxyacridinlactat pro 100 g Eiweiß versetzt, 50 tralem Wasser auf 1% erniedrigt, die Lösung auf 0⁰C

die dadurch entstandene Fällung in neutralem Wasser abgekühlt und 3,7 1 Äthanol eingerührt. Der pH-Wert

suspendiert und Natriumchloridlösung bis zu einer wird auf pH 5,8 eingestellt. Nach dem Zentrifugieren

NaCl-Konzentration von 2 % zugegeben. Nach 15 Mi- wird der Überstand abgegossen und verworfen,

nuten Rühren werden b-M 20⁰C 4,551 Äthanol Der Rückstand wird in 100 ml EDTA-Natrium-

zugefügt und 1 Stunde gerührt. Der bei der Zentri 55 hydroxid-PufferpH7,0,der0,l%EDTA,l%Natrium-

fugation entstandene Rückstand wird verworfen. chlorid, 0,1% Natriumazid und 0,5% Glukose enthält

Der Überstand, in dem sich die fibrinstabilisierende und auf 0"C vorgekühlt wurde, aufgenommen. Nach

Aktivität befindet, wird mit Aktivkohle geklärt, die dem Lösen wird der pH-Wert auf 7,0 nachgestellt.

Natriumchloridkonzentration durch Zugabe von neu- Durch Zugabe von frischem Natriumchlorid wird

tralem Wasser auf 1% erniedrigt, die Lösung auf 0⁰C 60 die Natriumchlorid-Konzentration auf 2% erhöht,

abgekühlt und 3,7 1 Äthanol eingerührt. Der pH-Wert Unlösliches wird durch Zentrifugieren entfernt. Der

wird auf pH 5,8 eingestellt. Nach dem Zentrifugieren Überstand wird mittels dreidimensional vernetzten!

wird der Überstand abgegossen und verworfen. Dextran fraktioniert und mit Tris-(hydroxymethyl)-

Der Rückstand wird in 100 ml Äthylendiamintetra- aminomethan-HCl-Puffer, der 0,005 Mol/l EDTA

essigsäure (EDTA)-Natriumhydroxid-Puffer pH 7,0, 65 und 0,1% Natriumazid enthält, eluiert. Das Eluat

der 0,1% EDTA, 1% Natriumchlorid, 0,1% Natrium- wird in einem Fraktionssammler aufgefangen. Die

azid und 0,5% Glukose enthält und auf 0⁰C vor- vereinigten aktiven Fraktionen enthalten etwa 1200 mg

gekühlt wurde, aufgenommen. Nach dem Lösen wird Eiweiß, das an Diäthylaminoäthyl-Cellulose mit einer

Standardkörnung von 100 bis 200 (im und einer Kapazität von 0,9 bis 1,0 mäq/g adsorbiert wird. Dafür werden 24 ml Cellulose gebraucht

Für die Elution werden 50 ml einer Lösung aus 0,6% Natriumchlorid und 0,1% «-Aminocapronsäure pH 7,0 verwendet. Das Eluat wird 24 Stunden gegen 501 eines 0,015 %igen Natriumphosphatpuffe-s pH 7,0, der 5 mg Glukose pro Milliliter enthält, dialysiert

Beispiel 3

50 kg gefrorene Plazenten vom Menschen werden fein zerkleinert und mit 501 einer l,ö%igen NaCl-Lösung verrührt. Das Gemisch wird auf +1O⁰C erwärmt und zentrifugiert 45 1 dieses Extraktes werden mit einer 3%igen Diaminoäthoxyacridin-Lösung bis zu einer Konzentration von 10 g Diaminoäthoxyacridinlactat pro 100 g Eiweiß versetzt, die dadurch entstandene Fällung in neutralem Wasser suspendiert und Matriumchloridlösung bis zu einer NaCl-Konzentration von 3% zugegeben. Nach 15 Minuten

Rühren werden bei 23°C 4,551 Äthanol zugefugt und 1 Stunde gerührt Der bei der Zentnfugaüon entstandene Rückstand wird verworfen.

Der Überstand, in dem sich die fibnnstabilisierende Aktivität befindet, wird mit Aktivkohle geklärt, die

ίο Natriumchloridkonzentration durch Zugabe von neutralem Wasser auf 1% erniedrigt, die Lösung auf 0⁰C abgekühlt und 3,71 Äthanol eingerührt. Der pH-Wert wird auf pH 6,5 eingestellt Nach dem Zentrifugieren wird der Überstand abgegossen und

verworfen. „„.,-,

Der Rückstand wird gemäß Beispiel 2 weiterverarbeitet

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels mit fibrinstabilisierender Wirkung, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) einen mittels NaCl-Lösung aus menschlichen Plazenten hergestellten, von festen Verunreinigungen befreiten Extrakt bei pH 5,0 bis 7,5 » mit einer etwa 3%igen Lösung von Diaminoäthoxyacridinlactat versetzt,

b) den ausgefallenen Niederschlag in neutralem wäßrigem Medium mit 1,5 bis 3% NaCl zerlegt, 12 bis 20 Volumprozent eines niederen Alkohols zudbt und den Niederschlag abcrennt,

c) den Überstand klärt, die Natriumchlorid-Konzentration durch Zugabe von Wasser auf 5 2% erniedrigt, die Lösung bei —5 bis ao + 5⁰C und pH 5,5 bis 6,5 mit 12 bis 20% eines niederen Alkohols versetzt,

d) den Rückstand in neutralem Äthylendiamintetraessigsäure-Alkalihydroxidpuffer, der außerdem geringe Mengen NaCl, NaN₃ und Glucose enthalten kann, bei etwa O⁰C löst, einen eventuell hinterbleibenden unlöslichen Rückstand entfernt und die Lösung mittels Gelfiltration fraktioniert,

e) die aktiven Fraktionen an einem Ionenaustauscher auf Cellulose-Basis Chromatographien, mit verdünnter, eine geringe Menge ε-Aminocapronsäure enthaltender neutraler NaCl-Lösung eluiert und das Eluat gegen neutralen 0,01- bis 0,02%igen Na-Phosphatpuffer, der eine geringe Menge Glucose enthält, dialysiert,

f) die dialysierte Lösung gegebenenfalls mit einem Stabilisator versetzt, sterilfiltriert, standardisiert und lyophil trocknet.

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