DE2322552A1 - Verfahren zum trennen eines polypeptids von mikroorganismen - Google Patents

Verfahren zum trennen eines polypeptids von mikroorganismen

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Description

DR. JUR. DfPL-CHEM. WAITER BEtL r Λ
ALFRED HOEFPENER 3, Mai 1973
DR. JUR. DIPL.-CHEM. H.-J. WOLPF DR. JUR. HANS CHR. BEIL
Ml FRANKFURTAM MAIN-HOCHST
Unsere Nr. 18 665
Pharmacia Aktiebolaget Uppsala / Schweden
Verfahren zum Trennen eines Polypeptids von Mikroorganismen
Vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Abtrennen eines Polypeptids von Mikroorganismen aus einer das Polypeptid im Gemisch mit Substanzen von verunreinigender Art enthaltenden Flüssigkeit, wobei das Polypeptid die Fähigkeit be-sitzt, zumindest ein Immunoglobulin an dessen Fc-Teil zu binden.
Die Erfindung ist hauptsächlich dadurch gekennzeichnet, daß die das Polypeptid enthaltende Flüssigkeit mit einer festen Phase in Berührung gebracht wird, welche eine polymere Substanz enthält, die in der Flüssigkeit unlöslich ist und die zumindest ein Immunoglobulin oder dessen Fc-Fragment enthält, wobei der Fc-Teil des Immunoglobulins oder das Fc-FraKment fähig sind, das Polypeptid zu binden, so daß das Polypeptid an den Fc-Teil des Immunoglobulins oder an das Fc-Fragment, jedoch nicht die verunreinigenden Substanzen, gebunden vrerden,
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worauf die Flüssigkeit mit den restlichen Verunreinigur.^sri von der festen Phase abgetrennt wird, und das gebundene Poiyoeptid wahlweise, von der festen Phase ebenfalls abgetrennt v/ird.
Der im vorliegenden benutzte Begriff "Polypeptid" umfasst auch Proteine, die bekanntlich Polypeptide sind.
Das Verfahren gemäß vorliegender Erfindung unterscheidet sich von den für die gleichen Zwecke benutzten bekannten Verfahren dadurch, daß es komplizierte mehrstufige Arbeitsweisen Ί welche unter anderem Ionenaustauscherchromatographie verwenden, vermeidet. Nach dem neuen Verfahren wird auf eine sehr einfache Weise unter zweckmäßigen Bedingungen und in hoher Ausb jute das in Frage stehende Polypeptid in überraschend reiner Form erhalten. Das in Frage stehende Polypeptid ist außerordentlich wertvoll, da es Immunoglobuline spezifisch und reversibel zu binden vermag, und weil die Bindung am Fe-Teil des Immunoglobulins bewirkt wird.
Das in Frage stehende Immunoglobulin kann von verschiedenen Tierarten, in erster Linie von Wirbeltieren, vorzugsweise Säugetieren, stammen. Bekanntlich können Immunoglobuline verschiedenen Immun.oglobulxnklassen, wie z.B. der Klasse A (IgA), oder den Klassen D (IgD), E (IgE), G (IgG) und M (IgM) angehören. Ein wertvoller Aspekt der Erfindung ist, daß sie im Zusammenhang mit Polypeptiden, die fähig sind, sich selbst zu binden, auf Immunoglobuline angewandt werden kann, die zu der Klasse IgG gehören, da diese Klasse unter anderem quantitativ unter den Immunoglobulinen vorherrscht. Der Fc-Teil von Immunoglobulinen kann davon durch bekannte enzymatische Verfahren abgespalten werden. Der Fc-Teil eines spezifischen Immunoglobulins ist oft bei verschiedenen Tierarten strukturell ähnlich. Da beispielsweise das Polypeptid aus S. aureus mit dem Fc-Teil von IgG reagiert, ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren oft
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aus verschiedenen Tierarten gegenseitig zu ersetzen.
Gemäß der Erfindung kann das Polypeptid aus Mikroorganismen das sogenannte Protein A aus Staphylococcus aureus oder Fragmenten dieses Proteins bestehen, wobei die Fragmente von PoIypeptidart sind und die Fähigkeit besitzen, zumindest ein Immunoglobulin an dessen Fc-Teil zu.binden. Vorgenannte Polypeptide (Protein A und Fragmente), die sich von S. aureus ableiten, können zur IgG-Klasse gehörende Immunoglobuline an deren Fc-Teilen binden. Andere Beispiele sind Polypeptide aus Staphylococcus epidermidis und aus anderen Bakterienstärnmen. Gemäß der Erfindung sollte eine polymere Substanz benutzt v/erden, die in der Flüssigkeit unlöslich ist und die zumindest ein Immunoglobulin oder dessen Fc-Fraccrnent enthält. Das Immunoglobulin oder sein Fc-Fragment kann so nicht aus der festen Phase herausgelöst oder während Waschverfahren hiervon entfernt werden. Vorzugsweise ist das Immunoglobulin oder sein Fc-Fragment an die polymere Substanz durch Bindungen von kovalenter Art gebunden. So können die Immunoglobulinmoleküle oder ihre Fc-Fragmente durch Brücken, welche Bindungen von kovalenter Natur aufweisen, miteinander verbunden werden. Von besonderem Vorteil ist es, als flüssigkeitsunlösliche polymere Substanz, die zumindest ein Immunoglobulin oder dessen Fc-Fragment enthält ein Polymeres zu benutzen, das in der Flüssigkeit unlöslich ist und an das das Immunoglobulin oder dessen Fc-Fragment durch Bindungen von kovalenter Art gebunden ist.
Das Immunoglobulin oder dessen Fc-Frakment kann an das Polymere durch Verfahren gebunden werden, welche in herkömmlicher Weise benutzt werden, wenn Polypeptide, z.B. Proteine, an polymere
n)
Substanzen, z.B. mittels Halogencyan, IsocyanateAund dgl. gebunden werden. Die polymeren Substanzen, die im vorliegenden Verfahren verwendet werden, können solche sein, welche in der Regel für ähnliche Zwecke zugänglich sind, wie z.B. Cellulose,
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-H-
Agaros und vernetzte Polysaccharide, z.B. mit Epichlorhydrin
( R)
vernetztes Dextran (Sephadex ).
Die feste Phase kann in verschiedenen Formen vorliegen. In vielen Fällen kann es von Vorteil sein, die polymere Substanz in feinverteilter Form zu verwenden. Andere Beispiele umfassen ein Testrohr mit einer Wand aus dem Polymeren, an das ein Immunoglobulin oder dessen Fc-Fragrnent, z.B. IgG oder dessen Fc-Fragment, gebunden ist.
Die Substanzen von verunreinigender Natur, von denen das jeweilige Polypeptid nach dem Verfahren abgetrennt wird, können von weitgehend unterschiedlichen Eigenschaften sein. So können sie aus anderen Polypeptiden (z.B. Proteinen), Polysacchariden, Nucleinsäuren oder .Substanzen niedrigen Molekulargewichts aus den Mikroorganismen bestehen, aus denen das jeweilige Polypeptid hergestellt wurde.
Wie bereits zuvor erwähnt, wird das erfindungsgemäße Verfahren in Gegenwart einer Flüssigkeit ausgeführt. Die verwendete Flüssigkeit ist in erster Linie eine wäßerige Flüssigkeit, z.B. eine gepufferte übliche Salzlösung mit geeignetem pH-Wert, z.B. in der Nähe des Neutralpunkts.
Das jeweilige Polypeptid aus den Mikroorganismen, welches an die feste Phase erfindungsgemäß gebunden ist, kann unter milden Bedingungen, z.B. durch Veränderung des pH-Wertes oder der Ionenstärke, von der festen Phase leicht wieder befreit werden.
Beispiel 1
A. Herstellung eines Rohextrakts von Polypeptidfrap;menten von Protein A aus Staphylococcus aureus
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S. aureus, Stamm Cowan I, wurde gemäß den Empfehlungen von European J. Biochem. Bd. 29 (1972), S. 572 (Sjöquist et al), kultiviert.
Die Bakterien wurden durch Zentrifugieren abgetrennt und mit einer 0,9%igen wäßerigen NaCl-Lösung gewaschen. 100 g Bakterien (Naßgewicht) wurden in 150 ml einer physiologischen üblichen Salzlösung aufgeschlammt. 10 mg Trypsin (frei von Chymotrypsin) wurden zu dieser Lösung zugegeben. Der pH-Wert war 7,2. Die Enzymbehandlung wurde bei diesem pH-Wert und bei 300C 30 Minuten lang durchgeführt, wonach 20 mg eines Trypsininhibitors aus Sojabohnen zugegeben wurden. Die Suspension wurde sodann zentrifugiert. Die obenschwimmende Flüssigkeit wurde gewonnen und durch MiMpor-Filter steril filtriert. Die steril filtrierte Flüssigkeit enthielt Fragmente von Protein A mit Polypeptideigenschaften im Gemisch mit Substanzen mit verunreinigenden Eigenschaften. Zwecks Reinigung der Fragmente, die fähic sind, sich an den Fc-Teil von IgG-Molekülen zu binden, wurden diese mit Hilfe von Agaros, an das IgG gebunden war, abgetrennt.
B» Herstellung von Agaros, an das IgG gebunden ist
Zu diesem Versuch wurde Agaros in Form eines kommerziell zu-
(R)
gänglichen Präparats (Sepharosev 4 B, Handelsprodukt der Firma Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden) verwendet.
Teilchen, Das Agaros wurde in Form feiner (40 - 19O u) /"die in Wasser gequollen waren, verwendet. Die Teilchenmasse enthielt 4 Gew.-% Agaros.und wurde zunächst mit Wasser gewaschen. 100 ml der mit 50 ml Wasser versetzten gepackten Teilchenmasse wurden mit 10 g Bromcyan in 50 ml Wasser bei 200C unter Rühren vermischt, wobei der pH-Wert durch Zugabe von 5 η NaOH auf 10 bis 11 gehalten wurde» Nach 10 Minuten wurde die Teilchenmasse mit eiskaltem V/asser sorgfältig gewaschen, und sodann bei einem pH-Wert von 9,0 und bei 4°C mit einem Puffer aus 0,2 m Natriumcarbonat und
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Natriumhydrogencarbonat in Wasser.
Die mit Bromcyan aktivierte Teilchenmasse wurde in 120 ml vorgenannten ■ Puff ers vom pH-Wert 9,0, welcher 3,0 g .menschlichen IgG's (Produkt der Firma Kabi AB, Stockholm, Schweden) enthielt, bei 4°C unter Rühren aufgeschlammt.
Nach 4 Stunden wurde die Teilchenmasse abfiltriert und mit vorgenanntem Puffer vom pH-Wert 9,0 gewaschen, sodann in 1,5 Literr einer wäßerigen Lösung, welche 0,05 M 2-Amino-äthanol und 0,2 M Natriumcarbonat-Natriumhydrogencarbonat enthielt, eines pH-Wertes 9,0 suspendiert und bei 40C 18 Stunden lang gerührt. Die Teilchenmasse wurde sodann mit einem Puffer von 0,1 M Matriurnphosphat in Wasser, welcher 4 M Harnstoff enthielt und einen pH-Wert von 6,0 aufwies, und danach mit einem Puffer von 0,1 M Natriumphosphat in Wasser eines pH-Wertes von 6,0 gewaschen, bis der OD-Wert 280 nm der Waschflüssigkeit weniger als 0,01 betrug. Die Gelmasse wurde sodann mit einem Puffer von 0,1 M Glycin-HCl in Wasser eines pH-Werts von 3,0 und sodann wieder mit dem zuvorgenannten 0,1 M Natriumphosphatpuffer mit einem pH-wert 7»0 gewaschen. Das erhaltene Produkt.enthielt etwa 30 mg gebundenes IgG pro 1 ml der gepackten Partikelmasse.
C*Abtrennung von Polypeptidfrakmenten aus Protein A von S. aureus
Eine Chromatographiesäule wurde mit 100 ml der gepackten Teilchenmasse, an die IgG gebunden ist, und die einen pH-Wert von 7,0 aufweist, aus der Stufe B oben gefüllt. 100 ml des Rohextrakts vom pH-Wert 7,0, welcher Polypeptidfrakmente aus Protein A von Stufe A oben enthielt, wurden langsam durch die Säule mit der Teilchenmasse bei 200C durchgeleitet, wobei die Durchflußgeschwindigkeit auf 50 ml/Std. eingestellt wurde. Die Teilchenmasse in der Kolonne wurde sodann mit einem 0,1 M Natriumphosphatpuffer in Wasser bei einem pH-Wert von 7,0 ge-
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waschen, bis der OD-Wert 2,80 nm der Waschflüssigkeit weniger als 0,02 betrug. Das erhaltene Produkt enthielt etwa 1 mg gebundene Polypeptide pro 1 ml der gepackten Teilchenmasse.
D Abtrennung von Polypeptidfrakmenten aus Protein A von der Teilchenmasse
Die an die Teilchenmasse gebundenen Polypeptide aus Stufe C oben wurden aus der Teilchenmasse durch Elution der Säule mit 100 ml 0,1 M Glycin-HCl-Puffer in Wasser bei pH 3>0 freigesetzt. Der polypeptidhaltige Glycin-HCl-Puffer, welcher den Fc-Teil von IgG-Molekülen zu binden vermag, wurde aufgefangen und durch Gelfiltration unter Verwendung von mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran (Handelsprodukt Sephadex G 25 ) entsalzt. Etwa 100 mg Polypeptid mit einem Molekulargewicht von etwa 7-000 wurden durch Gefriertrocknung isoliert. Durch Chromatographie konnte nachgewiesen werden, daß die Polypeptidfraktion mehrere eng verwandte Polypeptide enthielt, die alle die Eigenschaft hatten, die Fc-Teile der IgG-Moleküle zu binden. Es konnte unter anderem durch immunologische Tests gezeigt werden, daß die Polypeptidfraktion frei von Substanzen mit verunreinigenden Eigenschaften war.
Auf entsprechende Weise können Polypeptidfragmente, die fähig sind, den Fc-Teil von IgG-Molekülen zu binden, isoliert werden, injiem man zuerst das Protein A isoliert und dann das Protein A in Lösung bei beispielsweise pH 8,^2 mit Trypsin auf eine Weise, welche der zuvor beschriebenen analog ist, behandelt, wonach die Polypeptidfragmente mit den relevanten Eigenschaften auf die zuvor beschriebene Weise abgetrennt werden, in^jiem man sie an Agaros mit gebundenem IgG bindet und danach die Polypeptidfragmente abtrennt.
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Beispiel 2
Α« Herstellung eines Rohextrakts von Protein A aus Staphylococcus aureus
S. aureus, Stamm Cowan I, wurde gemäß den Empfehlungen in European J. Biochem., Bd. 29 (1972), S. 572 kultiviert. Das Protein A wurde aus den Bakterien mit Hilfe des Enzympräparats Lysostaphin freigesetzt. Durch Zentrifugieren wurde unlösliches Material abgetrennt, und die flüssige Phase wurde gesammelt. Der pH-Wert wurde mit HCl auf 3,5 eingestellt, unlösliches Material wurde durch Zentrifugieren abgetrennt, und die Flüssigkeit wurde gesammelt. Gemäß der vorgenannten Literaturstelle wurde sodann der pH-Wert mit NaOH auf 7,0 eingestellt* Die erhaltene Flüssigkeit ist ein Rohextrakt, der Protein A im Gemisch mit Substanzen von verunreinigender Art enthält.
B, Herstellung von'Agaros mit gebundenem IgG
Bei diesem Versuch wurde Agaros in Form des Handelsproduktes
Sepharosev J 4 B de:
Schweden verwendet.
C R)
Sepharose k B der Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala,
Das Agaros wurde in Form feiner (40 - 190 u), in Wasser gequollener Teilchen verwendet. Die Teilchenmasse enthielt 4 Gew.-i Agaros, sie wurde zunächst mit Wasser gewaschen. 100 ml der mit 50 ml Wasser versetzten gepackten Teilchenmasse wurden mit 10 g Bromcyan in 50 ml Wasser bei 200C unter Rühren vermischt, wobei der pH-Wert durch Zugabe von 5 η NaOH auf 10 bis gehalten wurde. Nach 10 Minuten wurde die Teilchenmasse mit eiskaltem Wasser sorgfältig gewaschen, und sodann bei einem pH-Wert von 9,0 und bei 4°C mit einem Puffer aus 0,2 M Natriumcarbonat und Natriumhydrogencarbonat in Wass-er.
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Die mit Bromcyan aktivierte Teilchenmasse wurde in 120 ml vorgenannten Puffers vom pH-Wert 9,0, welcher 3,0 g menschlichen IgG1S (Produkt der Firma Kabi AB, Stockholm, Schweden) enthielt, bei 4°C unter Rühren aufgeschlammt.
Nach h Stunden wurde die Teilchenmasse abfiltriert und mit vorgenanntem Puffer vom pH-Wert 9,0 gewaschen, sodann in 1,5 Litern einer wäßerigen Lösung, welche 0,05 M 2-Amino-Ä'thanol und 0,2 M Natriumcarbonat-Natriumhydrogencarbonat enthielt, eines pH-Wertes 9,0 suspendiert und bei M0C 18 Stunden lang gerührt. Die Teilchenmasse wurde sodann mit einem Puffer von 0,1 M Natrium phosphat in Wasser, welcher 4 M Harnstoff enthielt und einen pH-Wert von 6,0 aufwies, und danach mit einem Puffer von O5I M Natriumphosphat in Wasser eines pH-Wertes von 7,0 gewaschen,bis der OD-Wert 280 nm der Waschflüssigkeit weniger als 0,01 betrug. Die Gelmasse wurde sodann mit einem Puffer von 0,1 M Natriumphosphatpuffer mit einem pH-Wert 7,0 gewaschen. Das erhaltene Produkt enthielt etwa 30 mg gebundenes IgG pro 1 ml der gepackte Partikelmasse.
C* Abtrennung von Protein A aus Rohextrakten von S. aureus
Eine Chromatographiesäule wurde mit 100 ml der gepackten Teilchenmasse, an die IgG gebunden ist und die einen pH-Wert von 7,0 aufweist, aus der Stufe B oben gefüllt. 500 ml des Rohextrakts vom pH-Wert 7,0, welcher Protein A aus Stufe A oben enthielt, wurden langsam durch die Säule mit der Teilchenmasse bei 20°C durchgeleitet, wobei die D^ichflußgeschwindigkeit auf 50 ml/Std. eingestellt wurde. Die Teilchenmasse in der Kolonne wurde sodann sorgfältig mit einem 0,1 M Natriumphosphatpuffer in Wasser mit einem pH-Wert von 7,0 gewaschen, bis der OD-Wert 2,80 nm der Waschflüssigkeit weniger als 0,02 betrug. Das erhaltene Produkt enthielt etwa 3 mg gebundenes Protein A pro 1 ml gepackter Teilchenmasse.
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- ίο -
D> Trennung von Protein A von der Teilchenmasse
Das an die Teilchenmasse gebundene Protein A aus Stufe C oben wurde hieraus durch Elution der Säule mit 100 ml 0,1 Γ4 Glycin-HCl-Puffer in Wasser bei pH 3»0 freigesetzt. Der gesammelte, Protein A enthaltende Glycin-HCl-Puffer wurde gegen destilliertes Wasser dialysiert, wonach das Protein A in fester Form durch Gefriertrocknung erhalten wurde. Es wurden etwa 250 mg Protein A in reiner Form erhalten. (Anstelle einer Dialyse kann auch durch eine Gelfiltration eine Entsalzung durchgeführt werden). Durch immunologische Tests konnte gezeigt werden, daß das Protein A frei von Substanzen von verunreinigender Art war.
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Claims (8)

  1. - li -
    Patentansprüche:
    ίϊ). Verfahren zum Abtrennen eines Polypeptids von Mikroorganismen aus einer Flüssigkeit, welche das Polypeptid im Geraisch mit Substanzen von verunreinigenden Eigenschaften enthält, wobei das Polypeptid zumindest ein Immunoglobulin an dessen Fc-Teil zu binden vermag, dadurch gekennzeichnet, daß die das Polypeptid enthaltende Flüssigkeit mit einer festen Phase in Berührung gebracht wird, die eine polymere Substanz enthält, welche in der Flüssigkeit unlöslich ist und welche zumindest ein Immunoglobulin oder dessen Fc-Fragment enthält, wobei der Fc-Teil des Immunoglobulins oder dessen Fc-Fragment das Polypeptid zu binden vermag, so daß das Polypeptid an den Fc-Teil des Immunoglobulins oder an dessen Fc-Fragment, jedoch nicht die Substanzen mit verunreinigenden Eigenschaften, gebunden werden, wonach die Flüssigkeit mit den restlichen Verunreinigungen von der festen Phase abgetrennt wird, und gegebenenfalls gebundenes Polypeptid von der festen Phase ebenfalls abgetrennt wird.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Immunoglobulin oder dessen Fc-Frggment verwendet, das von Wirbeltieren, vorzugsweise Säugetieren, stammt.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Immunoglobulin oder dessen Fc-Fragment verwendet, das ein solches aus der IgG-Klasse ist, oder das von zumindest einem derarigen Immunoglobulin abstammt.
  4. 4. Verfahren nach einem der vorhergenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid aus Mikroorganismen aus Staphylococcus aureus erhalten wurde.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid aus Mikroorganismen, erhalten aus Staphylococcus aureus, das sogenannte Protein A ist.
    409820/0670
  6. 6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Immunoglobulin oder dessen Fc-Frag.ment
    an die in der Flüssigkeit unlösliche polymere Substanz durch
    Bindungen kovalenter Art gebunden ist.
  7. 7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man eine polymere Substanz verwendet, die
    in der Flüssigkeit unlöslich ist, die zumindest ein Immunoglobulin oder dessen Fc-Fragment enthält und welche die Immunoglobulinmoleküle oder ihre Fc-Fragmente durch Brücken von
    Bindungen von kovalenter Art miteinander verbunden enthält.
  8. 8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man eine polymere Substanz verwendet, die
    in der Flüssigkeit unlöslich ist, die zumindest ein Immunoglobulin oder dessen Fc-Fragment enthält und die ein flüssigkeitsunlösliches Polymeres ist, an das das Immunoglobulin oder dessen Fc-Fragment durch Bindungen von kovalenter Art gebunden ist.
    9· Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die polymere Substanz in feinverteilter Form verwendet.
    Für: Pharmacia Aktiebolaget
    •Uppsala / Schweden
    (Dr.W.Beil)
    Rechtsanwalt
    409820/0670
DE2322552A 1972-11-06 1973-05-04 Verfahren zum Abtrennen von Protein A aus Staphylococcus aureus aus einer Flüssigkeit Expired DE2322552C2 (de)

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