DE2428955C3 - Verfahren zur Abtrennung der enzymatischen Komponente mit in vivo antikoagulierender und in vitro koagulierender Wirkung aus dem Gift der Schlange Ancistrodon rhodostoma und daraus hergestellte Mittel - Google Patents
Verfahren zur Abtrennung der enzymatischen Komponente mit in vivo antikoagulierender und in vitro koagulierender Wirkung aus dem Gift der Schlange Ancistrodon rhodostoma und daraus hergestellte MittelInfo
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Description
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abtrennung der enzymatischen
Komponente mit in vitro koagulierender und in vivo antikoagulierender Wirkung von der anderen Komponente
mit in vivo koagulierender Wirkung und von den Proteinanteilen aus dem Gift der Schlange Ancistrodon
rhodostoma.
Es ist allgemein bekannt, daß das Gift dieser Schlange
in charakteristischer Weise koaguiierende Eigenschaften
in vitro besitzt, jedoch antikoagulierende Eigenschaften in vivo. Diese Tatsache findet eine Erklärung
darin, daß in Schlangengiften neben anderen Protein-Komponenten zwei Typen von Enzymen anwesend
sind, welche beide mit in vitro koagulierender Wirkung ausgestattet sind, von denen jedoch eines, wenn es in
Tierblut injiziert wird, eine vollständig entgegengesetzte Wirkung zeigt, nämlich eine Ungerinnbarkeit des
Blutes.
Daraus geht hervor, daß solche Verfahren außerordentlich wichtig sind, mit denen die Komponente des
Schlangengiftes mit in vivo antikoagulierender Wirkung von der Komponente mit in vivo koagulierender
Wirkung getrennt und mit hoher Reinheit isoliert werden kann, wobei diese Komponente dann mit
außerordentlich guten Resultaten für die Herstellung von Mitteln mit pharmakologischer Wirkung verwendet
werden kann.
Bisher wurde die Abtrennung von enzymatischen Komponenten des Schlangengiftes durch Chromatografie
mit lonenaustauscherharzen und/oder mit Fraktionierverfahren durch Ausfällung mit Salzen oder durch
geeignete Lösungsmittel durchgeführt. Diese bekannten Methoden besitzen jedoch den Nachteil, daß dafür ein
erheblicher Arbeitsaufwand aufgebracht werden muß und trotzdem kein zufriedenstellender Reinheitsgrad
erhalten werden kann. Erst mit unvernünftig hohem Aufwand an Zeit und Material ließe sich die Reinheit
verbessern.
Daher liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, die Nachteile der bekannten Verfahren zu
vermeiden und ein Verfahren zu schaffen, mit dem die Abtrennung der enzymatischen Komponente mit in
vivo antikoagulierender Wirkung aus dem Schlangengift relativ einfach und vor allem schneller als bisher
möglich ist und wobei das so erhaltene Enzym wesentlich größere Reinheit besitzt.
Die Lösung der Aufgabe besteht darin, daß das Schlangengift, gelöst in einem für die chromatografische
Abtrennungsbehardlung geeigneten Medium, eine Sau-Ie
passiert, welche mit einem festen nicht im wäßrigen Lösungsmitteln löslichen Träger für die selektive
Absorption des in vivo antikoagulierend und in vitro koagulierend wirkenden Enzyms gefüllt ist, wobei der
Träger mit einem Substrat oder Hemmkörper für dieses Enzym verbunden ist, und daß ein erstes Eluierungsmittel
bei pH 6—7 und mit einer Molarität von weniger oder gleich 0,05 M durch die Füllung der Säule gegeben
wird, in die das Gift eingeführt wurde, wobei das Eluat in aufeinander folgenden Portionen gesammelt wird, bis
die Eluierung von mehr als 95% der Proteinanteile des Giftes und der in vitro koagulierend wirkenden
Fraktion, welche verschieden ist von der im in der nachstehenden Weise gewonnenen zweiten Eluat
anwesenden Fraktion, erhalten ist, und daß ein zweites
Eluierungsmittel bei einem pH größer als 9 und mit einer Molarität von größer oder gleich 0,3 M durch die
Säule gegeben wird, wobei das Eluat in aufeinander folgenden Portionen gesammelt wird, bis die Eluierung
des in vivo antikoagulierend wirkenden Enzyms, welches in der Säule absorbiert war, zusammen mit
weniger als 5% der Proteinanteile erhalten ist.
Vorteilhaft ist der Träger zur Füllung der Säule eine Polymersubstanz, weiche eine Verbindung mit Aminogruppen eingeht.
Zweckmäßig enthält die Polymersubstanz Hydroxyl-Gruppen und wird mit Cyanbromid aktiviert
Für die Herstellung eines in vivo antikoagulierend wirkenden Mittels wird das so erhaltene Enzym mit
Wasser auf einen Gehalt von 25 NIH-Einheiten pro ml verdünnt, anschließend durch Filtration durch ein
Mikrofilter sterilisiert, Hilfsmittel für die Lyophilisierung zugegeben und nach Abfüllung in Ampullen
lyophilisiert
Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt
vor allem darin, daß das Verfahren zur Abtrennung relativ einfach ist und vor allem unter Verwendung
bekannter Substanzen und Stoffe durchgeführt werden kann. So wird vorteilhaft als Träger eine in wäßrigen
Lösungsmitteln unlösliche Polymersubstanz, wie z. B.
Dextran-Gel oder mit Cyanbromid vorbehandelte Zellulose verwendet, die mit einer Arginin-Lösung
versetzt wird, wobei sich eine Verbindung zwischen der festen Matrix und dem Arginin bildet Trotzdem wird tn
ein Enzym mit sehr hohem Reinheitsgrad erhalten, welches zur Verwendung bei der Herstellung von
pharmazeutischen Präparaten noch verdünnt werden kann, aber keiner weiteren Vprbesse"-ng der Reinheit
mehr unterworfen werden muß.
Als besonders geeignet als Trägermaterial hat sich ein
Dextran-Gel herausgestellt, welches aus feuchten Körnern der Größe 40—190 μ besteht und einen
Agarose-Anteil von ca. 4% besitzt und Protein mit einem Molekulargewicht von ca. 2OxIO6 ausschließt.
Das Produkt ist unter dem Handelsnamen »Sepharose« zu erhalten.
In den nachstehenden Beispielen ist das erfindungsgemäße Verfahren dargestellt, was aber nicht als eine
Einschränkung aufgefaßt werden soll. Außerdem wird die Herstellung eines pharmakologischen Präparates
mit antikoagulierender Wirkung unter Verwendung der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen
Komponente des Schlangengiftes dargestellt.
V)
Reinigung des koagulierenden Wirkstoffes
des Giftes der Ancistrodon rhodostoma
Eine chromatografische Säule mit einem Durchmes- r,s
ser von 0,7 cm mit 10 ml eines gepackten Gels, verbunden mit Arginin, wird vorbereitet. Die Säule wird
dann mit einem Tris-(hydroxymethylaminomethan)-phosphat 0,05 Puffer bei pH 7 (hiernach für Abkürzung
mit Tris- Phosphat bezeichnet) ins Gleichgewicht gebracht.
50 mg des lyophilisierten Giftes der Ancistrodon rhodostoma, gelöst in 1 ml desselben Puffers, wird zum
Ausgleich der Säule benutzt. Die in die Säule eingeführte Giftlösung wird danach mit dem Tris-Phos- w\
phat-0,05-M-Puffer bei pH 7 eluiert. Das Eluat wird in Fraktionen von ungefähr 2 ml gesammelt. Die ersten
30 ml des Eluats enthalten mehr als 90% des gesamten
Proteins, welches in dem in die Säule eingefüllten Gifts
vorhanden war, und ungefähr 180 Einheiten der »in vitro« koagulierenden Wirkstoffe. (1 willkürliche Einheit des koagulierenden Wirkstoffes ist für die Zwecke
der folgenden Experimente so definiert, daß diejenige Menge des Enzyms, welche die beginnende sichtbare
Bildung von Fibrinfiebern unter Umrühren in 15 Sekunden bei Raumtemperatur in einer 0,5%igen
Lösung von menschlichem Fibrinogen erzeugen. Diese Einheit unterscheidet sich von den eingangs genanrten
NIH-Einheiten, welche als Trombinic-Einheit nach dem N.LH.-Standard definiert sind.) Nach dem Durchlauf der
ersten 30 ml des Eluats wird die Lösung gewechselt und mit einem 0,2-M-Tris-HCl-Puffer bei pH 93 eluiert
Dann wird das Eluat des neuen Puffers ebenfalls in Portionen von 2 ml gesammelt Weniger als 10% des in
den 50 mg des in die Säule eingefüllten Giftes anwesenden Proteins und ungefähr 420 koagulierende
Einheiten sind in den ersten 20 ml dieses neuen Eluats enthalten.
Man sollte beachten, daß
a) das zweite Eluat deshalb den größeren Anteil der koaguiierenden Wirkstoffe enthält und nur eine
kleine Fraktion des Proteins des Ancistrodon rhodostoma-Giftes.
b) Die koagulierenden Wirkstoffe, welche im ersten Eluat anwesend sind, unterscheiden von den im
zweiten Eluat vorhandenen koagulierer.den Wirkstoffen und sind nicnt in diese konvertierbar, was
aus dem nachfolgenden Versuch hervorgeht
Die am stärksten wirkende Fraktion in bezug auf die koagulierende Wirkung des ersten Eluats in Tris-Phosphat-0,05-M-Puffer bei pH 7 wird noch einmal in die in
diesem Beispiel bereits beschriebene Säule zurückgegeben und wieder mit 0,05-M-Puffer bei pH 7,0
ausgeglichen. Die Eluierung wird dann mit dem gleichen Puffer durchgeführt Die gesamten koagulierenden
Wirkstoffe, welche in die Säule eingegeben worden sind, werden nunmehr mit den ersten 20 ml eluiert. Das
darauffolgende Eluat mit Tris-HCl-O^-M-Puffer bei pH
93 zeigt diesmal keinerlei signifikante koagulierende Wirkung.
Ähnliche Resultate, wie die hier vorbeschriebenen, wurden in einer großen Anzahl von Versuchen erhalten,
welche nach derselben Methode durchgeführt worden sind, wie sie vorbeschrieben ist, in denen jedoch die
Zusammensetzung des Puffers, welcher für die erste und zweite Eluierung verwendet wurde, variiert worden ist.
Für die erste Eluierung, worin der größere Anteil der »in vitro« koagulierenden Wirkstoffe in der Säule zurückgehalten wird, sind Tris-Phosphat-Puffer mit einer
Molarität weniger oder gleich 0,05 M und einem pH zwischen 6 und 7 verwendet worden. Für die zweite
Eluierjng, welche den größtren Anteil der »in vitro«
koagulierenden Wirkstoffe aus der Säule entfernt, sind Puffer mit einer Molarität größer oder gleich 03 M und
einem pH zwischen 6 und 7 oder größer als 9 verwendet worden. Ein spezifisches Beispiel der unterschiedlichen
Methoden für die Absorption und Eluierung in bezug auf die vorstehend beschriebenen Versuche sei hiernach
wiedergegeben.
Reinigung eines »in vitro« koagulierenden Wirkstoffes des Giftes der Ancistrodon rhodostoma und
Vervollständigung eines Präparates mit »in vivo« antikoagulierender Eigenschaft und geeignet für therapeutische Verwendung.
Eine cbromatografische Säule mit einem Durchmesser von 0,7 cm, welche 10 ml eines Gels wie in Beispiel 1
enthält, wird wie im vorhergehenden Beispiel beschrieben, vorbereitet. Die Säule wird dann mit einem
0,01-M-Tris-Phosphat-Puffer bei pH 6,0 ins Gleichgewicht gebracht 500 mg eines lyophilisierten Giftes der
Ancistrodon rhodostoma wird in 5 ml desselben Puffers (0,01-M-Tris-Phosphat bei pH 6) gelöst und die Lösung
wird anschließend durch die Säule gegeben.
Dann wird die Säule gewaschen, indem man 30 ml to eines 0,01-M-Tris-Phosphat-Puffers bei pH 6,0 durch die
Säule laufen läßt Das Eluat wird in Fraktionen von 2 ml gesammelt Dann wird die Lösung für die Eluierung
gewechselt und ein 03-M-Tris-Phosphat-Puffer bei pH 6,0 verwendet 75 ml dieser letztgenamiten Lösung wird
dann durch die Säule hindurchgegeben und das Eluat in zwei Fraktionen gesammelt
Das erste Eluat (0,01 M Tris-Phosphat bei pH 6) enthält mehr als 95% des Proteins, welches am Anfang
in den 500 mg des Giftes enthalten waren und ungefähr 2?00 Einheiten der koagulierenden Wirkstoffe. Das
zweite Eluat (03 M Tris-Phosphat bei r«H 6,0) enthält
weniger als 5% des Proteins, welches am Anfang in dem Gift enthalten war und enthält außerdem 6000 Einheiten
(willkürliche Einheiten) der »in vitro« koagulierenden Wirkstoffe. Man stellt nach Ultra-Filtration fest, daß das
darin enthaltene Proteinmaterial im wesentlichen homogen ist, wenn es mit der Ultrazentrifuge oder
durch Elektrophorese auf einem Gel analysiert wird.
Das zweite Eluat wird mit Wasser verdünnt, bis es 25
NIH-Einheiten (N.I.H. Trombinic Einheiten) pro ml
enthält Dann wird es sterilisiert durch Filtration über filtergeeigneter Porengröße, mit einem als Hilfsmittel
für die Lyophilisierung geeigneten Material versetzt und anschließend lyophilisiert Es ist üblich, das Material
nach Abfüllung in Ampullen in Mengen von 1 oder 2 ml entsprechend 25 oder 50 N.I.H.-Einheiten zu lyophilisieren.
Man stellt fest, daß das so lyophilisierte Material,
wenn es durch Zugabe von Wasser wieder aufgelöst wird, eine unveränderte »in vitro« koagulierende
Wirkung besitzt, sogar dann, wenn es mehrere Monate bei Raumtemperatur aufbewahrt worden ist. Wird
dieses Präparat in Mengen von 1 N.I.H.-Einheit pro kg Körpergewicht intravenös bei Kaninchen injiziert, so
ergibt sich ein sehr starker Abfe'l oder sogar ein völliges
Verschwinden des Blut-Fibrinogens innerhalb weniger Stunden, wobei signifikante Nebenerscheinungen und
sekundäre Wirkungen völlig fehlen.
Dies wird durch die nachfolgenden Versuche
dargestellt:
8 Kaninchen wurden in einen Stall gebracht, gewogen
und in vier Gruppen zu zwei Tieren abgeteilt. Jedem Tier wurde nun durch intravenöse Injektion Dosen des
gereinigten Materials gegeben, welche 1 N.I.H.-Einheit ü pro kg Körpergewicht gemäß der vorher festgestellten
»in vilro« Wirksamkeit entsprachen. Das den Tieren nach zwei Stunden nach der Injektion entnommene Blut
ist nicht mehr gerinnungsfähig. Weitere Blutentnahmen wurden nach 24 h, nach 48 h, nach 72 h und nach 96 h
nach dem folgenden Schema durchgeführt.
30
| Kaninchen | Zeit | 72 h | Kaninchen | Zeit | 72 h |
| Nr. | 96 h | Nr. | 96 h | ||
| 1 | 24 h | 72 h | 5 | 24 h | 72 h |
| 2 | 48 h | 96 h | 6 | 48 h | 96 h |
| 3 | 24 h | 7 | 24 h | ||
| 4 | 48 h | 8 | 48 h | ||
Bei den entnommenen Blutproben wurde die Fibrinogen-Armut bzw. das Fehlen des Fibrinogens
durch die gravimetrische Methode bestimmt Die erhaltenen Werte sind nachfolgend zusammengestellt,
und zwar ausgedrückt als mg Fibrinogen pro ml Plasma.
15
Kaninchen
Nr.
Zeit
in,; Fbrinogen/ml Plasma
24 h fehlt
24 h fehlt
24 h Beginn der Fibrinogen-
Bildung nicht meßbar 24 h Beginn der Fibrinogen-
Eildung nicht meßbar 48 h 62
48 h /
48 h 4.1
48 h 43
Kaninchen
Nr.
Zeit
mg Rbrinogen/ml Plasma
| 1 | 72 h | 8.1 |
| 3 | 72 h | I |
| 40 5 | 72 h | 7.7 |
| 7 | 72 h | / |
| 2 | 96 h | 10.5 |
| 4 | 96 h | 15.6 |
| 6 | 96 h | 8,8 |
| 4 i 8 | 96 h | I |
Blutproben wurden zur Bestimmung der Fibrinogenarmut auch den unbehandeiten Kaninchen entnommen,
wobei folgende Resultate erhalten wurden:
Kaninchen
Nr.
mg Fibrinogen/ml Plasma
| I | 10 |
| 2 | 16 |
| 3 | 8.4 |
Claims (8)
1. Verfahren zur Abtrennung der enzymatischen Komponente mit in vitro koagulierender und in vivo
antilloagulierender Wirkung von der anderen Komponente mit in vivo koagulierender Wirkung
und von den Proteinanteilen aus dem Gift der Schlange Ancistrodon rhodostoma, dadurch
gekennzeichnet, daß das Schlangengift, gelöst in einem für die chromatografische Abtrennungsbehandlung
geeigneten Medium, eine Säule passiert, welche mit einem festen nicht im wäßrigen
Lösungsmitteln löslichen Träger für die selektive Absorption des in vivo antikoagulierend und in vitro
koagulierend wirkenden Enzyms gefüllt ist, wobei der Träger mit einem Substrat oder Hemmkörper
für dieses Enzym verbunden ist, und daß ein erstes Eluierungsmittel bei pH 6—7 und mit einer Molarität
von weniger oder gleich 0,05 M durch die Füllung der Säule gegeben wird, in die das Gift eingeführt
wurde, wobei das Eluat in aufeinander folgenden Portionen gesammelt wird, bis die Eluicrung von
mehr als 95% der Proteinanteile des Giftes und der in vitro koagulierend wirkenden Fraktion, welche
verschieden ist von der im in der nachstehenden Weise gewonnenen zweiten Eluat anwesenden
Fraktion, erhalten ist, und daß ein zweites Eluierungsmittel bei einem pH größer als 9 und mit einer
Molarität von größer oder gleich 03 M durch die Säule gegeben wird, wobei das Eluat in aufeinander
folgenden Portionen gesammelt wird, bis die Eluierung des in vivo antikoagulierend und in vitro
koagulierend wirkenden Enzyms, welches in der Säule absorbiert war, zusammen mit weniger als 5%
der Proteinanteile erhalten ist
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß der Träger zur Füllung der Säule eine Polymersubstanz ist, welche eine Verbindung mit
Aminogruppen eingeht
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymersubstanz Hydroxyl-Gruppen
enthält und mit Cyanbromid aktiviert wird.
4. Verfahren nach Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Polymersubstanz ein Dextran
oder ein Zellulose-Gel verwendet wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat oder der
Hemmkörper für das in vivo antikoagulierend und in vitro koagulierend wirkende Enzym eine Aminosäure
bzw. ein Derivat davon ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,
daß als Aminosäure Arginin verwendet wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Gift der Ancistrodon rhodostoma
lyophilisiert und gelöst ist in dem gleichen flüssigen Medium wie es für die Eluierung der Säule
verwendet wird.
8. In vivo antikoagulierend wirkendes Mittel,
dadurch gekennzeichnet, daß es dadurch erhalten wurde, daß das Enzym nach Anspruch I bis 7 mit
Wasser auf einen Gehalt von 25 NIH-Einheiten pro ml verdünnt, anschließend diese Flüssigkeit durch
Filtration durch Mikrofilter sterilisiert wurde, anschließend Hilfsmittel für die Lyophilisierung
zugegeben wurden und das Material nach der Abfüllung in Ampullen in Mengen von 1 oder 2 ml
pro Ampulle (25 oder 50 NIH-Einheiten) lyophilisiert wurde.
Applications Claiming Priority (1)
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Publications (3)
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