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nach der Verarbeitung Heparin zuzusetzen, um das potentiell gefährliche Thrombin zu neutralisieren.
Tullis und Mitarb. (New Eng. J. Med., Bd. 273, [1965], S. 667-674) haben eine etwas ähnliche Plasmafraktion hergestellt und untersucht, die sie als "Prothrombinkomplex" bezeichnet haben. Beim Verfahren von Tullis wird lonenaustauscherharz behandeltes Plasma an DEAE-Cellulose adsorbiert, mit PhosphatNatriumchlorid bei ansteigendem NaCl-Gradienten eluiert, an DEAE-Cellulose erneut adsorbiert und schliesslich eluiert, Die Eluierung wird mit einem Nakiumphosphat/Natriumchlorid-Puffer bewirkt, der mit EDTA stabilisiert ist. Klinische Untersuchungen mit dem "Prothrombinkomplex" sind in der genannten Literaturstelle beschrieben, doch sind andere, den Komplex charakterisierende Daten nicht verfügbar.
Der überwiegende Teil des Blutes, der im allgemeinen für Transfusionen verwendet wird und dafür zur Verfügung steht, wird gegen Koagulation durch Behandlung mit einem Citrat-Antikoagulationsmittel geschützt. Ein solches Blut kann nur beschränkte Zeit verwendet werden. Nachdem dieser Zeitraum verstrichen ist, muss das Blut verworfen werden, oder es kann zur Fraktionierung in bestimmte brauchbare Komponenten benützt werden. Tatsächlich ist die Hauptquelle des Gesamtblutes für die Umwandlung in Plasma durch Fraktionierung Blut, dessen Haltbarkeitsdatum überschritten ist und das durch Citrat-Antikoagulationsmittel geschützt ist. Es ist daher wichtig, dass Verfahren für die Fraktionierung von Plasma, wie zur Gewinnung eines Faktor IX enthaltenden Konzentrates, auf mit Citrat-Antikoagulationsmittel konserviertes Blut abgestellt sind.
Aus der deutschen Offenlegungsschrift 1949314 ist ein Verfahren zur Isolierung eines Prothrombinkomplexes bekannt, der aus den Koagulationsfaktoren II, VII, IX und X besteht, welche aus Menschenplasma erhaltener Cohn-Fraktion III gewonnen worden sind. Das Verfahren sieht die Adsorption dieser 4 Faktoren auf Calciumphosphat, Abtrennung des Calciumphosphats durch Zentrifugieren, Eluierender Faktoren mit 0, 1- bis 0, 2-molarer Natriumeitratlösung, Einstellendes pH-Wertes auf 6, 8 mit Essigsäure und Fällung verunreinigender Plasmaproteine unter Zusatz von Äthanol zum Eluat bis zur Einstellung einer Äthanolkonzentration im Gemisch zwischen 14 und 20% vor.
Die erwünschten Koagulationsfaktoren werden dann unter Zusatz von Äthanol zu dem auf PH 5, 2 einge-
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den Mengen, in welchen diese Faktoren im ursprünglichen Plasma vorliegen ; der Anteil dieser beiden Faktoren ist somit von jenem des normalen Plasmas verschieden. Über die Konzentration der Faktoren VII und X wird keine Aussage gemacht, wenn man davon absieht, dass angegeben ist, dass diese Faktoren in "hoher Aktivität" vorliegen.
Das gemäss der vorgenannten Literaturstelle verwendete Adsorbiermittel, d. h. Calciumphosphat, unterscheidet sich wesentlich von dem Adsorbiermittel, das beim erfindungsgemässen Verfahren verwendet wird. Das Eluierungsmittel des bekannten Verfahrens ist Natriumcitrat. Natriumcitrat stellt keinen flüchtigen Puffer dar. Ausserdem sind beim vorgenannten Verfahren verschiedene zusätzliche Stufen vorgesehen, wie zwei Fällungen mit Äthanol. Ferner ist gemäss den Ausführungsbeispielen der genannten Literaturstelle ein Zusatz von Heparin zum ursprünglichen Eluat und ein erneuter Zusatz zur Endlösung vorgesehen. Solche fakultativ vorgesehene Zusätze sind unerwünscht, weil dadurch Heparin in einem Produkt vorliegt, das dazu dienen soll, die Koagulation zufördern.
Beim Verfahren gemäss der Erfindung wird ein Konzentrat der 4 Koagulationsfaktoren gebildet, in dem die Menge jedes Faktors in annähernd dem gleichen Verhältnis vorliegt wie im normalen Plasma. Ferner wird beim erfindungsgemässenverfahren kein Thrombin gebildet. Obgleich es möglich ist, die Thrombinakti- vität mit Heparin zu neutralisieren, wird es als bevorzugt anzusehen sein, das Thrombin hier nicht an erster Stelle zu haben. Heparin ist in einem Faktor IX enthaltenden Konzentrat unerwünscht, da es potentiell für den Patienten gefährlich ist und da es Schwierigkeiten bei der Bestimmung der Koagulationsfaktoren in dem
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nur diesen Überwachungsvorgang schwierig gestalten, sondern auch die so erhaltenen Ergebnisse unzuverlässig machen.
Nach der Erfindung wird ein lyophilisiertes, lagerstabiles Konzentrat aus Humanplasma zur Blutungsregelung bei Hämophilie und andern Fällen von Defizienz eines oder mehrerer Faktoren II, VII, IX und X, das von Heparin, Thrombin, der aktivierten Form des Faktors X, Depressoraktivität undAntikomplementaktivität frei ist und die Koagulationsfaktoren II, VII, IX und X in nicht aktivierter Form in Anteilen enthält, die im wesentlichen die gleichen sind wie im Humanplasma, eine Faktor IX - Rekonstitutionspotenz von wenigstens etwa 2000% des normalen Plasmas und eine Faktor IX - spezifische Aktivität von wenigstens etwa 0, 5 klinischen Einheiten je mg Protein sowie eine biologische Postinfusions-Faktor IX - Halbwertzeit von etwa 20 bis 50 h aufweist, dadurch hergestellt, dass man die selektive Eluierung der die Koagulationfaktoren n, VII,
IX und X enthaltenden Fraktion mittels einer Lösung eines flüchtigen Puffers, vorzugsweise
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Ammoniumcarbonat, bei einem pH-Wert von 7, 3 bis 8, 2 bei von 0, 3 bis 0, 75 Mol ansteigender Molarität bewirkt und die Eluatfraktion, in welcher die vorgenannten Koagulationsfaktoren in nicht aktivierter Form in etwa den gleichen Mengenverhältnissen wie im Humanplasma vorliegen, beim anschliessenden Lyophilisieren nicht nur konzentriert sondern auch gleichzeitig entsalzt und damit den Puffer entfernt.
Obgleich das gesamte citratisierte Humanplasma oder irgendeine Fraktion desselben, welche alle die Koagulationsfaktoren II, VII, IX und X enthält, als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemässe Verfahren angewendet werden kann, ist das bevorzugte Material Überstand I, Cohn-Verfahren 6 (Supernatant I, Cohn
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kannten wasser- oder pufferdispergierbaren Ionenaustauscherharze, die schwach basische Gruppen mit einer Anziehungskraft für Ionen entgegengesetzter Polarität aufweisen. Beispiele sind Cellulose- und Poly-
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Di-(Trockengewicht) ; DEAE-Sephadex 3, 5 0, 5 Milliäquivalente/g ; und TEAE-Sephadex 0, 55 bis 0, 75 Müll- äquivalente/g.
Ein anderes solches Harz ist Whatman DEAE-Cellulose-52, mikrogranular (W & R Balston Ltd., Hardstone, Kent, England). Das bevorzugte, als Ausgangsmaterial eingesetzte Ionenaustauscherharz ist DEAE-Sephadex, d. h. ein Ionenaustauscherharz, das im wesentlichen aus einer vernetzten Dextrankette besteht, die Diäthylaminoäthylgruppen an die Glukoseeinheiten der Polysaccharidketten gebunden aufweist.
Dieses im Handel erhältliche Harz wird von der Firma Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Piscataway, N. J., U. S. A. hergestellt.
Eine Lösung des als Ausgangsmaterial verwendeten Plasmas wird auf das ausgewählte Ionenaustauscher- harz aufgebracht, wobei die Koagulationsfaktoren n, VII, IX und X daran mit kleinen Fraktionen der andern Plasmaproteine adsorbiert werden. Die nicht adsorbierten Proteine können gesammelt und dem Plasmafraktionierungsverfahren wieder zugeführt werden, wodurch vom Ausgangsplasma nichts verlorengeht. Das Harz wird dann mit einer Lösung eines flüchtigen Puffers, relativ niedriger Molarität, z. B. bis zu 0, 3 molar, gewaschen, bis das Harz von nicht adsorbierten Proteinen freigewaschen ist. Das Harz wird dann mit einer Lösung eines flüchtigen Puffers ansteigender Molarität und einem vorzugsweise im wesentlichen konstanten
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rität zwischen 0, 3 und 0, 75 molar eluiert.
Der Puffer wird dann aus dem Eluat durch Gefriertrocknen entfernt.
Das Verhältnis von lonenaustausoherharz, z. B. DEAE-Sephadex, zum Volumen des Ausgangsplasmas, z. B. Überstand I, kann innerhalb eines weiten Bereiches variieren. Die Anwendung eines hohen Verhältnisses des Ionenaustauscherharzes wird zu höheren Ausbeuten des Koagulationskomplexes mit niedrigerem Reinheitsgrad bei grösserem Verlust der andern Plasmaproteine, die üblicherweise in nachfolgenden Stufen gewinnbar sind, führen. Die Anwendung eines niedrigen Verhältnisses von Ionenaustauscherharz wird zu einer niedrigeren Ausbeute an Produkt mit höherem Reinheitsgrad führen.
Obgleich DEAE-Sephadex das bevorzugte anionische Ionenaustauscherharz ist, ist es offensichtlich, dass andere anionische Adsorbenzien mit ähnlichen Adsorptionscharakteristika ebenfalls angewendet werden können.
Die Eluierungsstufe mit flüchtigem Puffer mit Gradientenpufferkonzentration ist ausserordentlich wichtig. Ammoniumbicarbonat wird bevorzugt, doch können auch andere flüchtige Puffer, z. B. Ammoniumacetat, bei etwa dem gleichen pH-Wert verwendet werden. Die aussergewöhnliche Selektivität, die durch die Anwendung der Salzeluierung mit ansteigendem Gradienten in Verbindung mit der Flüchtigkeit des Puffers erreicht wird, beinhaltet kritische Aspekte des erfindungsgemässen Verfahrens aus den folgenden Gründen :
1. Der Puffer, der ein flüchtiges Salz darstellt, ist aus dem getrockneten Produkt vollständig entfern- bar, so dass ein vollständig salzfreies Proteinpräparat entsteht. Dies ist deshalb von Vorteil, weil da- durch das für die klinische Anwendung vorgesehene Präparat leicht isotonisch eingestellt werden kann.
Es ist auch für die Stabilität des Produktes wichtig.
2. Durch die Gewinnung eines salzfreien Proteins erübrigt sich das Erfordernis umfangreicher Salzent- fernungsmassnahmen, wie Dialyse, Gelfiltration, Ultrafiltration usw. Dies ist für die technische An- wendung des Verfahrens in grossem Massstabe von Wichtigkeit.
3. Ammoniumbicarbonat ergibt eine Selektivität bei der Eluierung der gebundenen Proteine und ermög- licht die leichte Abtrennung unerwünschter Verunreinigungen, wie Ceruloplasmin. Als Ergebnis da- von werden die erwünschten Komponenten mit einem höheren Reinheitsgrad eluiert, als dies mit üblichen Eluierungslösungen erzielbar ist.
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Ein pH-Bereich von etwa 7, 3 bis 7, 8 wird für die Eluierungsstufen bevorzugt. Obgleich höhere pH-Werte bis zu 8, 2 angewendet werden können, kann bei höheren pH-Werten ein Einfluss in Richtung Instabilität des Produktes auftreten.
Die obigen Bedingungen machen eine weitere Fraktionierung möglich.
Die Schritte des Auflösen des getrockneten Proteins unter Einstellung einer für dieses bevorzugten Konzentration, die Art des Elektrolytpuffers und die Filtration sind sämtlich Standardstufen, die vom Sachverständigen beliebig variiert werden können.
Das beim oben beschriebenen Verfahren entstehendeProdukt ist ein lyophilisiertes Produkt, welches die Rumanfaktoren II, VII, IX und X in einem geeigneten Elektrolytpuffer, z. B. Natriumchlorid/Natriumcitrat- Puffer, enthält. Das Produkt ist frei von Thrombin, Thromboplastinaktivität, Antikomplementaktivität und Depressoraktivität. Es hat eine spezifische Aktivität von wenigstens etwa 0, 5 Faktor IX-Einheiten je mg
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durchschnittlichem gesammelten Plasma enthalten ist. Die Untersuchungsergebnisse werden als lyophilisierter Bezugsstandard zum Ausdruck gebracht, der 0, 7 Einheiten/ml nach Rekonstituierung enthält.
Untersuchungen
In vitro-Untersuchung hinsichtlich Faktor IX-Aktivität.
Die Untersuchung basiert auf der partiellen Thromboplastinzeitmethode gemäss Langdell, Wagner und Brinkhous (J. Lab. Clin. Med., Bd. 41, [1953], S. 637-647) und der Kaolingerinnungszeitmethode von Proctor und Rapaport (Am. J. Clin. Path., Bd. 36, [1961], S. 212-219). Platelet Faktor 3 wurde mittels einer Cephalinsuspension zugeführt. Eine maximale Oberflächenkontaktaktivierung wurde mit einem Celltpulver erzielt.
Alle andern Gerinnungsfaktoren (ausgenommen Faktor IX) wurden durch ein Substrat zugeführt, das Plasma eines Patienten mit schwerem Faktor IX-Mangel im Gemisch mit Bariumsulfat-adsorbiertem Rinderplasma enthielt. Die mengenmässige Ermittlung einer unbekannten Probe wurde durch Vergleich ihrer Gerinnungszeit beim Test mit jener vorgenommen, die durch Verdünnungen eines normalen Standards erhalten wurde.
Reagenzien
1. Calciumchloridlösung : 0, 05 molares CaCl2.
2. Veronalpuffer :
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<tb>
<tb> 2, <SEP> 94 <SEP> g <SEP> Natriumbarbital
<tb> 3, <SEP> 67 <SEP> g <SEP> Natriumchlorid <SEP>
<tb> 105 <SEP> ml <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> n <SEP> Salzsäure, <SEP> ergänzt <SEP> auf
<tb> 500 <SEP> ml <SEP> mit <SEP> destilliertem <SEP> Wasser.
<tb>
3. Cellt : Analytisches Filtrierhilfsmittel.
4. Cephalinsuspension : Hergestellt aus Kaninchenhirnthromboplastin nach Bell und Alton (Nature 174, [1954], S. 880-881).
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6. Verdünnungsflüssigkeit I (DF I) :
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<tb>
<tb> 50 <SEP> m1 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> molares <SEP> Natriumcitrat
<tb> 300 <SEP> ml <SEP> 0, <SEP> 15 <SEP> molares <SEP> Natriumchlorid.
<tb>
7. Verdünnungsflüssigkeit II (DF H) :
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<tb>
<tb> 20 <SEP> ml <SEP> Veronalpuffer
<tb> 60 <SEP> ml <SEP> 0, <SEP> 15 <SEP> molares <SEP> NaCl.
<tb>
8. Barium-suMatlertes Rinderplasma : Oxalatiertes Rinderplasma wird mit 100 mg/nil Bariumsulfat zur
Adsorption gebracht und in kleinen aliquoten Anteilen bei-20 C gelagert.
9. Substratplasma : 1 Teil citratisiertes Plasma von einem Patienten mit schwerem Faktor IX-Mangel (gelagert in kleinen aliquoten Anteilen bei -20oC) wird mit 3 Teilen Bariumsul- fatrinderplasma gemischt.
10. Bezugsstandard :
Lyophilisierter Plasmabezugsstandard Nr. 788-27.
Zugeordnete Potenz = 0, 7 Einheiten/ml.
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auf 1/10,1/50, 1/100 usw. verdünnt.
Unbekannte Produkte werden bei geeigneten Verdünnungen geprüft. 1/10 ml des resuspendierten Cepha-
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lin/Celits, 0, 1 ml Substratplasma und 0, 1 ml verdünntes unbekanntes oder Standardplasma werden in ein Glasröhrchen in das auf 37 C erwärmte Wasserbad gebracht und es wird eine Stopuhr in Gang gesetzt. Die Mischung wird während der 3 min dauernden Bebrütungsperiode mässig gekippt, um das Celit in Suspension zu halten. Am Ende der 3 min werden 0, 1 ml der Calciumchloridlösung zugesetzt und es wird eine zweite Stopuhr in Gang gesetzt. Das Röhrchen wird so lange gekippt, bis Gerinnung eintritt. Alle Versuche wurden als Duplikatversuche ausgeführt und die Gerinnungszeiten stellen Mittelwerte dar.
Das Standardbezugsplasma wurde mit jedem Satz der unbekannten Produkte geprüft. Auf Logarithmenpapier (log-log Papier) wurde eine Kurve gezeichnet, wobei auf der Ordinate die Gerinnungszeit und auf der Abszisse die Plasmakonzentrationen aufgetragen wurden. Die Gerinnungszeiten der verschiedenen Verdünnungen des Standardbezugsplasmas wurden aufgetragen und die günstigste Linie durch die Punkte gezogen. Die Faktor IX-Konzentrationen der unbekanntenproben wurden unter Bezugnahme auf diese Kurve bestimmt.
Die für die verschiedenen Konzentrationen erhaltenen Werte der unbekannten Proben wurden ermittelt.
In vitro-Bestimmung des Faktors n (Prothrombin) :
Die Faktor n-Bestimmung war ein typischer Owren Einstufentest. Die Ergebnisse werden in Einheiten/ml ausgedrückt, wobei eine Einheit Prothrombin als jene Prothrombinaktivität definiert ist, die in 1 ml eines gefrorenen Plasmastandards enthalten ist.
In vitro-Bestimmung von Thromboplastin und Thrombin :
Thromboplastin und Thrombin wurden gleichzeitig ermittelt, indem ein typischer Rekalzifizierungszeittest vorgenommen wurde. Die Gerinnungszeit in Sekunden wurde für die Probe und für einen Vergleich wie folgt ermittelt :
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<tb>
<tb> Probe <SEP> : <SEP> 0, <SEP> 1ml <SEP> Probe
<tb> (bei <SEP> verschiedenen <SEP> Verdünnungen
<tb> 0,1 <SEP> ml <SEP> citratisiertes <SEP> Plasma <SEP>
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> ml <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> molares <SEP> Calciumchlorid.
<tb>
Vergleich <SEP> : <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> ml <SEP> 0, <SEP> 15 <SEP> molares <SEP> Natriumchlorid
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> ml <SEP> citratisiertes <SEP> Plasma
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> ml <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> molares <SEP> Calciumchlorid.
<tb>
Die "Probe" wurde bei verschiedenen Verdünnungen mit destilliertem Wasser getestet, da hohe Konzentrationen an Neutralelektrolyt die Gerinnung auf Grund von vorliegendem Thromboplastin oder Thrombin hemmen.
Bestimmung der Antikomplementaktivität :
Die Antikomplementbestimmung wurde wie folgt ausgeführt :
Reagenzien :
1. CF Salzlösung : Caloium/Magneslum-Stammlosung :
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teil der Zellen dreimal mit normaler Salzlösung gewaschen und dann wird eine 2% igue Suspension mit CF Salzlösung als Verdünnungsmittel hergestellt.
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EMI6.5
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<tb>
<tb> :Röhrchen <SEP> Nr. <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8
<tb> Komplement <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 30
<tb> (in <SEP> ml) <SEP> :
<SEP> 0, <SEP> 12 <SEP> 0, <SEP> 11 <SEP> 0, <SEP> 10 <SEP> 0, <SEP> 09 <SEP> 0, <SEP> 08 <SEP> 0, <SEP> 07 <SEP> 0, <SEP> 06 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> CF <SEP> Salzlösung
<tb> (in <SEP> ml): <SEP> 0,48 <SEP> 0,49 <SEP> 0,50 <SEP> 0,51 <SEP> 0,52 <SEP> 0,53 <SEP> 0,54 <SEP> 0,55
<tb>
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;Test :
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<tb>
<tb> 0, <SEP> 2 <SEP> ml <SEP> Probe <SEP> (Verdünnungen <SEP> auf <SEP> das <SEP> Doppelte <SEP> mit
<tb> CF <SEP> Salzlösung <SEP> als <SEP> Verdünnungsmittel)
<tb> 0, <SEP> 2ml <SEP> CF <SEP> Salzlösung
<tb> 0, <SEP> 2 <SEP> ml <SEP> C' <SEP> (2 <SEP> Einheiten) <SEP>
<tb>
Die Verdünnungen wurden 1 h bei 37 C bebrütet ; 0, 4 ml sensitiviertes RBC wurde zu jeder Verdünnung zugesetzt.
Bebriltung erfolgte 30 min bei 37 C.
Endpunkt : die am stärksten verdünnte Probe zeigt eine Lysis von wenigstens 50%.
Vergleiche (30 min bei 37 C bebrütet) :
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0,Depressoraktivität :
Die Depressoraktivität wurde nach dem Depressor-Substanzen-Test gemessen, der in USP XVII, S. 843 beschrieben ist.
Die Eigenschaften der verschiedenen Ansätze des Konzentrats der Gerinnungsfaktoren, wie sie nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhalten worden sind, sind in Tabelle I angegeben.
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Ta belle
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<tb>
<tb> Test <SEP> Ergebnisse <SEP> *
<tb> Ansatz <SEP> A <SEP> : <SEP> Ansatz <SEP> B <SEP> : <SEP> Ansatz <SEP> C <SEP> : <SEP> Ansatz <SEP> D <SEP> : <SEP>
<tb> Faktor <SEP> IX <SEP> 480 <SEP> Ein- <SEP> 540 <SEP> Ein- <SEP> 500 <SEP> Ein- <SEP> 550 <SEP> Einheiten <SEP> heiten <SEP> heiten <SEP> heiten
<tb> Faktor <SEP> II <SEP> 700 <SEP> Ein- <SEP> 640 <SEP> Ein- <SEP> 510 <SEP> Ein- <SEP> 370 <SEP> Einheiten <SEP> heiten <SEP> heiten <SEP> heiten
<tb> Faktor <SEP> VII <SEP> 380 <SEP> Ein- <SEP> 500 <SEP> Ein- <SEP> 480 <SEP> Ein- <SEP> 570 <SEP> Einheiten <SEP> heiten <SEP> heiten <SEP> heiten
<tb> Faktor <SEP> X <SEP> 1100 <SEP> Ein- <SEP> 500 <SEP> Ein- <SEP> 470 <SEP> Ein- <SEP> 570 <SEP> Einheiten <SEP> heiten <SEP> heiten <SEP> heiten
<tb> Protein <SEP> 962 <SEP> mg <SEP> 606 <SEP> mg <SEP> 484 <SEP> mg <SEP> 340 <SEP> mg
<tb> Spezifische <SEP> 0,
5 <SEP> 0,89 <SEP> 1,03 <SEP> 1,6
<tb> Aktivität
<tb> pH-Wert <SEP> 6,9 <SEP> 6,8 <SEP> 6,8 <SEP> 7,2
<tb> Na <SEP> 242 <SEP> Milli- <SEP> 237 <SEP> Milli- <SEP> 240 <SEP> Milli <SEP> - <SEP> 237 <SEP> Milli- <SEP>
<tb> äquivalen-äquivalen-äquivalen-äquivalente/1 <SEP> te/1 <SEP> te/1 <SEP> te/1 <SEP>
<tb> Cl <SEP> - <SEP> 90 <SEP> Milli- <SEP> 94 <SEP> Milli- <SEP> 88 <SEP> Milli- <SEP> 87, <SEP> 1 <SEP> Milli- <SEP>
<tb> äquivalen- <SEP> äquivalen- <SEP> äquivalen- <SEP> äquivalen- <SEP>
<tb> te/1 <SEP> te/1 <SEP> te/1 <SEP> te/1 <SEP>
<tb> Citrat <SEP> 51 <SEP> Milli- <SEP> 48 <SEP> Milli- <SEP> 51 <SEP> Milli- <SEP> 50, <SEP> 2 <SEP> Milli-
<tb> (C6H507)
<SEP> äquivalen- <SEP> äquivalen- <SEP> äquivalen- <SEP> äquivalen- <SEP>
<tb> te/l <SEP> te/1 <SEP> te/1 <SEP> te/1 <SEP>
<tb> ThrombinThrombo- <SEP> keines <SEP> keines <SEP> keines <SEP> keines
<tb> plastin
<tb> Depressor- <SEP> unbean- <SEP> unbean- <SEP> unbean- <SEP> unbean- <SEP>
<tb> substanzen <SEP> standet <SEP> standet <SEP> standet <SEP> standet
<tb>
* = ausgedrückt als Werte je Röhrchen, oder als Volumseinheit nach
Rekonstitution mit 20 ml.
Ein Ansatz des Koagulationskomplexes, wie er erfindungsgemäss erhältlich ist, wurde nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt. Tests zeigten, dass die Partie frei von Depressoraktivität, Thrombin und Thromboplastin sowie von Antikomplementaktivität war. Der Ansatz wurde lyophilisiert, bei Zimmertemperatur gelagert und 3 Monate später sowie 6 Monate später erneut getestet. Es wurde keine Depressoraktivität und kein Thrombin oder Thromboplastin gefunden.
Um die Stabilität des erfindungsgemäss erhältlichen Komplexes zu zeigen, wurde eine grosse Anzahl von Flaschen von jeder der drei Partien auf drei verschiedene Temperaturniveaus gebracht und die Bestimmung wurde nach entsprechenden Zeiträumen durchgeführt. Die Stabilitätsdaten der Partie PR 2240 (1, 8% Feuchtigkeit), nach Rekonstitution jeder Flasche mit 20 ml Wasser, wird als Beispiel in Tabelle II angeführt.
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Tabelle II
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<tb>
<tb> Datum <SEP> der <SEP> Verstrichener <SEP> Einheiten <SEP> des <SEP> Faktors <SEP> IX <SEP> je <SEP> ml
<tb> Bestimmung <SEP> Zeitraum
<tb> 50C <SEP> Zimmer- <SEP> 400C <SEP>
<tb> temperatur
<tb> 9. <SEP> 2. <SEP> 1968 <SEP> zu <SEP> Beginn <SEP> 33, <SEP> 6 <SEP> 33, <SEP> 6 <SEP> 33, <SEP> 6 <SEP>
<tb> 19. <SEP> 3.
<SEP> 1968 <SEP> 5 <SEP> Wochen--M, <SEP> 6 <SEP>
<tb> 19. <SEP> 4. <SEP> 1968 <SEP> 9 <SEP> Wochen-35, <SEP> 4 <SEP> 29, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 9. <SEP> 5. <SEP> 1968 <SEP> 3 <SEP> Monate <SEP> 28, <SEP> 0
<tb> 20. <SEP> 5. <SEP> 1968 <SEP> 3, <SEP> 5 <SEP> Monate--28, <SEP> 7 <SEP>
<tb> 19. <SEP> 6. <SEP> 1968 <SEP> 4 <SEP> Monate <SEP> 34, <SEP> 2 <SEP> 32, <SEP> 6 <SEP> 32, <SEP> 6 <SEP>
<tb> 22. <SEP> 7. <SEP> 1968 <SEP> 5 <SEP> Monate--21, <SEP> 8 <SEP>
<tb> 8.8.1968 <SEP> 6 <SEP> Monate <SEP> 35,0 <SEP> - <SEP> -
<tb>
Die Stärke des erfindungsgemäss erhältlichen Komplexes wurde durch Rekonstitution eines Teils eines Ansatzes, der nach dem hier beschriebenen Verfahren hergestellt worden ist, und Bestimmung von Gerinnungsfaktoren ermittelt. Die Ergebnisse, ausgedrückt als % des Normalplasmas, sind in Tabelle III angeführt.
Tabelle III
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<tb>
<tb> Faktor <SEP> II <SEP> 2550%
<tb> Faktor <SEP> VII <SEP> 2400%
<tb> Faktor <SEP> IX <SEP> 2500%
<tb> Faktor <SEP> X <SEP> 2350%
<tb>
(Spezifische Aktivität des Faktors IX : 1, 03 Einheiten/mg Protein.)
Der erfindungsgemäss erhältliche Komplex wurde geprüft und erfüllte alle Erfordernisse der Bestimmung gemäss USP XVII für Depressorsubstanzen. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV angegeben.
Tabelle IV
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<tb>
<tb> Dosis <SEP> Änderung <SEP> des <SEP> mittleren
<tb> arteriellen <SEP> Druckes
<tb> 0, <SEP> 05 <SEP> γ/mg <SEP> Histamin <SEP> (freie <SEP> Base) <SEP> i. <SEP> v. <SEP> -35
<tb> 0, <SEP> 10 <SEP> γ/mg <SEP> Histamin <SEP> (freie <SEP> Base) <SEP> i. <SEP> v. <SEP> -50
<tb> 0, <SEP> 15 <SEP> l'/mg <SEP> Histamin <SEP> (freie <SEP> Base) <SEP> i. <SEP> v. <SEP> -55
<tb> 0, <SEP> 10 <SEP> γ/mg <SEP> Histamin <SEP> (freie <SEP> Base) <SEP> i. <SEP> v. <SEP> -50
<tb> 0,10 <SEP> γ
/mg <SEP> Histamin <SEP> (freie <SEP> Base) <SEP> i. <SEP> v.-50
<tb> erfindungsgemäss <SEP> erhältliche <SEP> Probe
<tb> 0, <SEP> 2 <SEP> ml/kg, <SEP> i. <SEP> v.-5 <SEP>
<tb> 0, <SEP> 10 <SEP> y/mg <SEP> Histamin <SEP> (freie <SEP> Base) <SEP> i. <SEP> v. <SEP> -40
<tb> erfindungsgemäss <SEP> erhältliche <SEP> Probe
<tb> 0,2 <SEP> ml/kg, <SEP> i.v. <SEP> -5
<tb> 0, <SEP> 10 <SEP> l'/mg <SEP> Histamin <SEP> (freie <SEP> Base) <SEP> i. <SEP> v.-40
<tb>
(Die erfindungegemäss erhältliche Probe wurde auf 3, 0 ml verdünnt.)
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Die Thromboplastin-Thrombin-Bestimmung, wie sie oben beschrieben ist, ergab folgende Ergebnisse, wenn eine Probe des erfindungsgemäss erhältlichen Komplexes geprüft wurde :
Tabelle V
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<tb>
<tb> Gerinnungszeit
<tb> Geprüfte <SEP> Probe
<tb> in <SEP> sec <SEP>
<tb> Salzlösung <SEP> (Vergleich) <SEP> 135
<tb> Gemäss <SEP> der <SEP> Erfindung <SEP> erhältliche <SEP> Probe, <SEP> unverdünnt <SEP> 180
<tb> Gemäss <SEP> der <SEP> Erfindung <SEP> erhältliche <SEP> Probe, <SEP> verdünnt <SEP> im
<tb> Verhältnis <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 3 <SEP> 135
<tb> Gemäss <SEP> der <SEP> Erfindung <SEP> erhältliche <SEP> Probe, <SEP> verdünnt <SEP> im
<tb> Verhältnis <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 10 <SEP> 135
<tb>
Das Versagen der erfindungsgemäss erhältlichen Probe bei der Erhöhung der Gerinnungszeit von normalem Humanplasma zeigt das Fehlen von Thrombin, Thromboplastinsubstanzen und der aktivierten Form des Faktors X.
Klinische Ergebnisse :
Es wurden Bestimmungen beim Menschen mit dem erfindungsgemäss erhältlichen Koagulationskomplex ausgeführt, wobei die Bestimmungen bei Patienten mit einem Faktor IX-Mangel und bei Patienten mit einem Faktor VII-Mangel vorgenommen wurden. Die Koagulationsdaten einer dieser Versuchsreihen bei einem Patienten mit Faktor IX-Mangel sind in der Tabelle VI angegeben. Innerhalb von 48 h nach der Verabreichung des erfindungsgemäss erhältlichen Produktes mit einem Gehalt von 2030 Einheiten des Faktors IX waren keine Abnormitäten hinsichtlich Blutdruck, Puls, Temperatur und Atmung festzustellen. Ferner ergaben 2 Verabreichungen des erfindungsgemäss erhältlichen Koagulationskomplexes an denselben Patienten nach 13 Tagen keine Anzeichen einer Sensitivierung oder Antigenizität.
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Tabelle VI Dosierung : 290 ml (2030 Einheiten), Beginn 10. 10 h
Ende 12. 25 h
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<tb>
<tb> Probe <SEP> Datum <SEP> zeit <SEP> Verstrichene <SEP> Zeit <SEP> Gerinnungsfaktoren <SEP> (vlo)
<tb> Nr.
<tb> h <SEP> min <SEP> H <SEP> Vn <SEP> IX <SEP> X <SEP>
<tb> 0 <SEP> 22. <SEP> 2. <SEP> 1967 <SEP> 11. <SEP> 00h <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 75 <SEP> 64 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 95
<tb> 1 <SEP> 12. <SEP> 45 <SEP> h <SEP> 0 <SEP> 20 <SEP> 144 <SEP> 165 <SEP> 54, <SEP> 2 <SEP> 200 <SEP>
<tb> 2 <SEP> 13. <SEP> 10 <SEP> h <SEP> 0 <SEP> 45 <SEP> 136 <SEP> 122 <SEP> 49, <SEP> 2 <SEP> 213
<tb> 3 <SEP> 14. <SEP> 20 <SEP> h <SEP> 1 <SEP> 55 <SEP> 123 <SEP> 83 <SEP> 46, <SEP> 0 <SEP> 193
<tb> 4 <SEP> 15. <SEP> 30 <SEP> h <SEP> 3 <SEP> 5 <SEP> 105 <SEP> 87 <SEP> 44, <SEP> 5 <SEP> 170
<tb> 5 <SEP> 16.
<SEP> 25 <SEP> h <SEP> 4 <SEP> 0 <SEP> 105 <SEP> 103 <SEP> 48, <SEP> 5 <SEP> 176
<tb> 6 <SEP> 17. <SEP> 30 <SEP> h <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 110 <SEP> 75 <SEP> 39, <SEP> 2 <SEP> 185
<tb> 7 <SEP> 20. <SEP> 05 <SEP> h <SEP> 7 <SEP> 40 <SEP> 107 <SEP> 75 <SEP> 43, <SEP> 5 <SEP> 183
<tb> 8 <SEP> 22. <SEP> 30 <SEP> h <SEP> 10 <SEP> 5 <SEP> 106 <SEP> 62 <SEP> 29, <SEP> 0 <SEP> 183
<tb> 9 <SEP> 23. <SEP> 2. <SEP> 1967 <SEP> 2. <SEP> 00h <SEP> 13 <SEP> 35 <SEP> 94 <SEP> 48 <SEP> 24, <SEP> 3 <SEP> 125 <SEP>
<tb> 10 <SEP> 8. <SEP> 35 <SEP> h <SEP> 20 <SEP> 10 <SEP> 100 <SEP> 40 <SEP> 13, <SEP> 4 <SEP> 148 <SEP>
<tb> 11 <SEP> 11. <SEP> 20 <SEP> h <SEP> 22 <SEP> 55 <SEP> 100 <SEP> 33 <SEP> 13, <SEP> 1 <SEP> 151 <SEP>
<tb> 12 <SEP> 14. <SEP> 30 <SEP> h <SEP> 26 <SEP> 5 <SEP> 79 <SEP> 34 <SEP> 10, <SEP> 4 <SEP> 147
<tb> 13 <SEP> 16.
<SEP> 35 <SEP> h <SEP> 28 <SEP> 10 <SEP> 101 <SEP> 35 <SEP> 10, <SEP> 8 <SEP> 132
<tb> 14 <SEP> 24. <SEP> 2. <SEP> 1967 <SEP> 10. <SEP> 05 <SEP> h <SEP> 45 <SEP> 40 <SEP> 99 <SEP> 55 <SEP> 9, <SEP> 1 <SEP> 139
<tb> 15 <SEP> 13. <SEP> 00 <SEP> h <SEP> 48 <SEP> 35 <SEP> 101 <SEP> 51 <SEP> 9, <SEP> 6 <SEP> 138
<tb> 16 <SEP> 16. <SEP> 30 <SEP> h <SEP> 52 <SEP> 5 <SEP> 106 <SEP> 58 <SEP> 9, <SEP> 2 <SEP> 141
<tb> 17 <SEP> 25. <SEP> 2. <SEP> 1967 <SEP> 10. <SEP> 15 <SEP> h <SEP> 69 <SEP> 50 <SEP> 95 <SEP> 37 <SEP> 7, <SEP> 0 <SEP> 117
<tb> 18 <SEP> 26. <SEP> 2. <SEP> 1967 <SEP> 11. <SEP> 00 <SEP> h <SEP> 94 <SEP> 35 <SEP> 92 <SEP> 39 <SEP> 5, <SEP> 9 <SEP> 121
<tb> 19 <SEP> 27. <SEP> 2. <SEP> 1967 <SEP> 11. <SEP> 14 <SEP> h <SEP> 118 <SEP> 50 <SEP> 85 <SEP> 42 <SEP> 3, <SEP> 35 <SEP> 97
<tb> 20 <SEP> 28. <SEP> 2. <SEP> 1967 <SEP> 14.
<SEP> 10 <SEP> h <SEP> 143 <SEP> 45 <SEP> 80 <SEP> 47 <SEP> 2, <SEP> 9 <SEP> 98
<tb>
* = vorherbestimmter Faktor IX = 56, 4%.
Das Verschwinden der Kurve des Faktors IX post infusionem ist typisch biphasisch ; T 1/2 der ersten Komponente beträgt 7, 5 h ; T 1/2 der zweiten Komponente beträgt 47 h. Die Halbwertszeit des Faktors IX post infusionem bei verschiedenen Patienten variiert von etwa 20 bis etwa 50 h.
Verlässliche Koagulationsbestimmungen wurden für die 4 Koagulationskomponenten im Anschluss an die Verabreichung von 8 verschiedenen Partien jeweils an 2 oder mehreren Patienten vorgenommen. Bei jenen Patienten, die völlig normal anzusehen waren (einschliesslich blutende Patienten, jedoch ausgenommen
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gen des Faktors X post infusionem ist im allgemeinen etwas hoher als das der andern 3 Faktoren.
Das erfindungsgemäss herstellbare Produkt wurde von 14 klinischen Forschern bei der Behandlung plötzlich auftretender Situationen an über 65 Patienten angewendet. Diese waren Patienten, die entweder einen permanenten angeborenen Mangel an einem der Faktoren VII oder IX oder X aufwiesen, oder die einen temporär erworbenen Mangel aller 4 Faktoren (II, VII, IX und X) hatten, und die entweder gegenüber Plasma starke Reaktion zeigten oder das Plasmavolumen, das erforderlich gewesen wäre, nicht vertrugen, und die
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entweder an einem ernsten Blutverlust litten oder die einen Schutz während eines grösseren, unvorhergesehenen chirurgischen Eingriffes benötigten.
Die Art der Verabreichung des erfindungsgemäss erhältlichen Produktes kann in an sich bekannter Weise erfolgen. Im allgemeinen wird das lyophilisierte Produkt mit zur Injektion geeignetemWasser rekonstituiert, um eine isotonische Lösung herzustellen, die dem Patienten intravenös injiziert wird.
Bei spiel : Überstand I (Supernatant 1), Cohn Method 6 (siehe Cohn et al. JACS 68, [1946], S. 459 - 475) aus dem citratisierten Standardplasma wird an frisch ins Gleichgewicht gebrachtem DEAE Sephadex (siehe Römpp, Chemie-Lexikon, 6. AufL. Spalte 5832-3) in einer Menge von 10 g (Nassgewicht) je Liter Überstand I
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bis kein weiteres Protein mehr eluiert wird und die Waschflüssigkeit wird verworfen. Dann wird das DEAE Sephadexharz mit 0, 3 molarem Ammoniumbicarbonat bei einem pH-Wert von 7, 0 bis 7, 8 gewaschen, bis kein weiteres Protein mehr eluiert wird. Mit dieser Waschflüssigkeit wird blaues Ceruloplasmin eluiert, das verworfen wird.
Dann wird das DEAE Sephadexharz mit 0, 75 molarem Ammoniumbicarbonat bei PH 7, 6 bis 7, 8 eluiert, bis dieFaktor IX-Fraktion zusammen mit den Faktoren II, VII und X eluiert ist. Das Eluat wird gefroren und lyophilisiert. Das Ammoniumbicarbonat sublimiert und lässt ein salzfreies Proteinpulver zurück, das etwa 350 mg/l Überstand I entspricht. Es erfolgt eine Prüfung hinsichtlich Faktor IX und eine Lagerung in einem feuchtigkeitsdichten Behälter bei 5 C oder einer niedrigeren Temperatur.
Dieses Produkt kann in eine trockene Mischung umgewandelt werden, die einen Elektrolytpuffer enthält und für intravenöse Verabreichung wie folgt geeignet ist :
Man löst das lyophilisierte Proteinpulver in einem Verdünnungsmittel, das hinsichtlich Natriumcitrat
0, 05 molar und hinsichtlich Natriumchlorid 0, 088 molar ist, langsam bis zu einer Endkonzentration von
25 Einheiten des Faktors IX je ml auf. In dem Masse, wie sich das Pulver auflöst, wird der pH-Wert durch
Zusätze von n-Natronlauge auf einem Wert von 7, 0 bis 7, 5 gehalten. Der End-pH-Wert wird auf 7, 3 : h 0, 1 eingestellt. Die Lösung wird durch Filtration durch ein steriles Membranefilter mit einer Porosität von 0, 2 f. l sterilisiert und aseptisch in geeigneten Anteilen in sterile Fläschchen gefüllt, gefroren und lyophilisiert.
Die Lagerung erfolgt bei 5 C.
Für die Verabreichung an Menschen wird der Inhalt eines der oben angegebenen Fläschchen aseptisch in für Injektionszwecke geeignetem Wasser wieder aufgelöst. Alternativ kann das Produkt von der Sublimationsstufe steril abgefüllt und zu einem salzfreien Produkt lyophilisiert werden. In diesem Falle wird es mit einem geeigneten isotonischen Verdünnungsmittel vor der Injektion an Menschen rekonstituiert.
Die Beschreibung des obigen Verfahrens erfolgte an Hand von Einzelheiten, die derzeit bevorzugt werden. Es können jedoch zahlreiche Variationen vorgenommen werden, ohne vom Grundprinzip der Erfindung abzuweichen.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung eines lyophilisierten lagerstabilen Blutplasmakonzentrates aus Humanplasma, welches Konzentrat die Koagulationsfaktoren n, VII, IX und X enthält, wobei man das Humanplasma auf ein schwach basisches Ionenaustauscherharz, vorzugsweise bestehend aus vernetzten Dextranketten mit Diäthylaminoäthylgruppen, aufbringt und daran die vorgenannten Koagulationsfaktoren des Plasmas adsorbiert, worauf man das Harz mit der Lösung eines Puffers selektiv eluiert und dann die die Koagulations-
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selektive Eluierung der die vorgenannten Koagulationsfaktoren enthaltenden Fraktion mittels einer Lösung eines flüchtigen Puffers, vorzugsweise Ammoniumbicarbonat, bei einem pH-Wert von 7, 3 bis 8, 2 bei von 0, 3 bis 0, 75 Mol ansteigender Molarität bewirkt und die Eluatfraktion,
in welcher die vorgenannten Koagulationsfaktoren in nicht aktivierter Form in etwa den gleichen Mengenverhältnissen wie im Humanplasma vorliegen, beim anschliessenden Lyophilisieren nicht nur konzentriert sondern auch gleichzeitig entsalzt und damit den Puffer entfernt.