DE1247704B - Verfahren zur Herstellung einer hoch Chloesterin haltigen Kontroll-Standard-Loesung fuer die Bestimmung des Blutcholesterinspiegels - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESGHRIFT

Int. Cl.:

GOln

DeutscheKl.: 421-3/54

Nummer: 1247 704

Aktenzeichen: H 53560IX b/421

Anmeldetag: 18. August 1964

Auslegetag: 17. August 1967

Die Erfindung bezieht sich auf eine Methode zur Herstellung einer hoch Cholesterin haltigen Kontroll-Standard-Lösung für die Bestimmung des BlutchoIesterinspiegels auf dem Wege der Konzentrierung von cholesterinreichen Proteinbestandteilen des normalen Blutserums, ohne daß dabei die Konzentrationen der gewöhnlich vorhandenen nichtcholesterinartigen Bestandteile wesentlich geändert werden; damit werden Blutseren gewonnen, die einen ungewöhnlich hohen Gehalt an Cholesterin enthaltenden Bestandteilen aufweisen, deren Gehalt an cholesterinfreien Bestandteilen jedoch der übliche ist.

In den letzten Jahren hat man der Menge an Cholesterin im Serum eine ständig wachsende klinische Bedeutung zugemessen. Manche Ärzte glauben, daß eine direkte Beziehung zwischen einem erhöhten Cholesteringehalt im Serum und Gefäßstörungen, wie Arteriosklerose besteht. Diese Ansicht hat bewirkt, daß immer mehr Routineuntersuchungen zur Bestirnmung des Cholesteringehaltes durchgeführt werden, und dafür benötigt man Prüfungsmethoden, mit denen sich solche Bestimmungen leicht und schnell durchführen lassen, ohne daß die Empfindlichkeit oder Genauigkeit leidet.

Normalerweise sind nur extrem hohe Cholesteringehalte im Blut von klinischem Interesse. Der Arzt, der die Diagnose stellt, möchte wissen, ob das Blut seines Patienten normalen Cholesteringehalt oder extrem hohen Cholesteringehalt hat. Obgleichsichdie Ärzte nicht absolut einig sind, was man als extrem hohen Cholesteringehalt ansehen soll, so kann doch im allgemeinen davon ausgegangen werden, daß 100 bis 250 mg/% meßbaren Cholesterins den »Normalwert« oder »nicht erhöhten Wert« für die meisten Altersgruppen darstellt. Cholesteringehalte, die etwa 250 mg/% übersteigen, werden als genügend hoch angesehen, daß sich medizinische oder diätetische Maßnahmen zur Erniedrigung des Gehaltes rechtfertigen.

Zuverlässige Ergebnisse bei solchen chemischen analytischen Bestimmungen sind abhängig davon, daß ständig mittels Testprüfungen die Geräte und Reagenzien, die man bei den Untersuchungen benutzt, überprüft werden. Dies läßt sich am besten dadurch erreichen, daß man gleichzeitig Kontrollen durchführt, z. B. »Standard«-Seren mitanaylsiert. Diese Kontroll-Proben oder Standard-Seren enthalten bekannte Mengen des zu analysierenden Materials, beispielsweise an Cholesterin. Insbesondere bei der Bestimmung des Cholesteringehaltes sind solche Kontrolluntersuchungen notwendig, weü zwischen den verschiedenen analytischen Methoden, wie häu-Verfahren zur Herstellung einer hoch Cholesterin haltigen Kontroil-Standaf d-Lösung für die Bestimmung des Blutcholesterinspiegels

Anmelder:

Hyland Laboratories, Inc.,
Los Angeles, Calif. (V. St. A.)

Vertreter:

Dipl.-Ing.R.H.Bahr und Dipl.-Phys. Ε. Betzier, Patentanwälte, Herne, FreiHgrathstr. 19

Als Erfinder benannt:
Kingdon Lou,

North Hollywood, Calif. (V. St. A.) Beanspruchte Priorität:

V. St. v. Amerika vom 20. August 1963 (303 421)

fig berichtet wurde, Unterschiede bestehen. Da bei verschiedenen Routineuntersuchungen verschiedene Methoden der Cholesterinbestimmung angewendet werden, die untereinander verschiedene Fehlergrenzen und Fehlermöglichkeiten aufweisen, die sich aus der Instabilität der Reagenzien oder der resultierenden Färbung erklären, ist die Bereitstellung von geeigneten Kontroll-Proben und Standard-Seren besonders notwendig.

Kontroll-Seren, die einen Cholesteringehalt haben, der in dem normalen Bereich liegt, sind ohne Schwierigkeiten erhältlich. Solche »Normalkontroll-Proben« können in großen Mengen erhalten werden in der Weise, daß man einfach eine Anzahl von Seren mit normalein Cholesteringehalt zusammengibt. Jedoch gab es bisher keine »hoch Cholesterin haltige Kontroll-Probe«, d. h. eine Probe, die einen im physiologischen Sinne hohen Cholesteringehalt hat. Eine solche hoch Cholesterin haltige Kontroll-Probe muß mehr als 300 mg/% Cholesterin enthalten. Eine solche hoch Cholesterin haltige Kontroll-Probe enthält ferner die cholesterinfreien Bestandteile des Serums in üblicher Menge und ist daher, abgesehen von dem erhöhten Cholesteringehalt, dem natürlichen Serum analog. Man kann Kontroll-Proben mit im physiologischen Sinne hohem Cholesteringehalt nicht einfach durch z. B. Konzentrieren eines üblichen Serums

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oder durch Zugabe eines Konzentrates zu normalem Serum gewinnen. Zwar enthalten die resultierenden Zusammensetzungen Cholesterin in größeren als normalen Mengen, jedoch sind auch die cholesterinfreien Bestandteile (z. B. die anorganischen Bestandteile und gewisse Kohlehydrate und Proteine) des Serums in einer höheren Menge als üblich vorhanden.

Es wird vorwiegend stets von cholesterinhaltigen Bestandteilen des Serums gesprochen und nicht von Cholesterin. Dies geschieht, weil Cholesterin als solches im Serum nicht auftritt. Cholesterin ist nur in organischen Lösungsmitteln löslich. Daher tritt Cholesterin im Serum immer nur in Kombination mit solchen Substanzen auf, die es in einem wäßrigen Medium löslich machen können. In den meisten Fällen handelt sich es bei diesen Substanzen um Proteine. Demzufolge ist der physiologische Zustand des Cholesterins, in dem dieses im Blut vorliegt, eine Kombination mit Protein, hauptsächlich in Form eines sogenannten ^-Lipoproteins. Bisher hat man angenommen, es sei nicht möglich, eine Kontroll-Probe mit hohem Cholesteringehalt durch Zugabe von ^-Lipoproteinen zu normalem Serum zu erhalten. Die /^-Lipoproteine sind äußerst instabil, und bei den Versuchen, sie aus dem Serum abzuscheiden, ergab sich in der Regel eine irreversible Denaturierung des Proteins. Dabei spaltete sich dann entweder wasserunlösliches Cholesterin ab, oder es bildete sich ein wasserunlöslicher Cholesterin-Protein-Niederschlag. Trotz seiner Unlösüchkeit in Wasser hat man jedoch Cholesterin zur Gewinnung von Kontroll-Proben mit hohem Cholesteringehalt eingesetzt, und zwar deswegen, weil der klinische Bedarf für solche Kontroll-Proben vorhanden, aber keine zweckmäßigeren Substanzen existieren. Eine hoch Cholesterin haltige Probe dieser Art hat eine Reihe von offensichtlichen Nachteilen. Da das Cholesterin in dem Serum unlöslich ist, muß man die Kontroll-Probe sowohl erhitzen als auch stark rühren, damit man eine gleichmäßige suspensionsartige Dispersion des Cholesterins erhält. Dazu benötigt man spezielle Geräte und außerdem erhebliche Zeit; die Ergebnisse sind bestenfalls nur mittelmäßig genau und sind nur mit geringer Genauigkeit reproduzierbar.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Methode zur Herstellung von hoch Cholesterin haltigen Kontroll-Standard-Lösungen für analytische Zwecke in Vorschlag zu bringen, wobei praktisch das gesamte Cholesterin in einem physiologischen Zustand vorliegt; erfindungsgemäß ist das Verfahren - dadurch gekennzeichnet, daß man zu einem Serum, dessen Cholesteringehalt nicht erhöht ist, Kalziumionen und ein wasserlösliches Salz eines sulfatierten Polygalakturonsäuremethylestermethylglykosids zugibt, die resultierende Ausfällung von (S-Lipoprotein sammelt, diese Ausfällung, zweckmäßig durch Dialyse, reinigt und die gereinigte Ausfällung in einer den gewünschten hohen Cholesteringehalt sichernden Menge in einem Serum löst, dessen Cholesteringehalt nicht erhöht ist.

Die erfindungsgemäß hergestellten hoch Cholesterin haltigen Kontroll-Proben zeichnen sich ferner dadurch aus, daß auch alle übrigen Bestandteile in physiologischem Zustand vorliegen.

Die erfindungsgemäß hergestellten hoch Cholesterin haltigen Kontroll-Proben zeichnen sich weiterhin dadurch aus, daß sie keinerlei unlösliches, nicht

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physiologisches Cholesterin enthalten, und es ist demnach nicht erforderlich, daß man sie vor Gebrauch erhitzt oder stark rührt.

Weitere Abänderungen und Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens sind aus der nachfolgenden speziellen Beschreibung und an Hand der Beispiele veranschaulicht.

Die Ausfällung von ^-Lipoprotein mittels Polyanionen ist in folgenden Veröffentlichungen beschrieben worden: J. Physiol. Paris, 49: S. 83 bis 86, 1957; The Am. Jour, of Clin. Path., 35, Nr. 3, S. 222 bis 226, 1961; Proc Soc Exptl. Biol. und Med., 104, Nr. 1, S. 618 bis 620, 1960.

Diese Veröffentlichungen befassen sich mit Methoden zur mengenmäßigen Bestimmung von Serumß-Lipoproteinen. Es war daher für die Zwecke, die gemäß den Veröffentlichungen angestrebt wurden, nicht erforderlich, daß das /3-Lipoprotein nicht denaturiert wurde. Die dort verwendeen Verfahrensmaßnahmen sind vielmehr darauf abgestellt, daß mit Sicherheit vollständiger Niederschlag aller in dem Serum enthaltener ^-Lipoprotein-Anteile erfolgt, und es ist dabei unerheblich, ob eine Denaturierung eintritt oder nicht. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung müssen jedoch die Versuchsbedingungen so ausgewählt sein, daß praktisch keinerlei Denaturierung eintritt, dagegen ist es nicht so wesentlich, ob das /^-Lipoprotein vollständig ausgefällt wird.
Die beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten polyanionischen Fällungsmittel müssen solche Eigenschaften haben, daß das resultierende Präzipitat in Serum löslich ist. Das heißt, daß die Ausfällung reversibel sein muß. Vielerlei Polyanionen haben diese gewünschte Eigenschaft nicht. Jedoch ist das Natriumsalz von sulfatiertem Polygalakturonsäuremethylestermethylglykosid (das im nachfolgenden als »Mepesulfate« bezeichnet ist), gut geeignet. Für eine erfolgreiche Anwendung von Mepesulfate ist die Anwesenheit von Kalziumionen wesentlich. Die Kalziumionen können als wasserlösliche Kalziumsalze, wie Kalziumacetat oder Kalziumchlorid zugegeben werden.

Die Kombination von Mepesulfate und Kalziumionen stellt das bevorzugte Fällungsmittel für /J-Lipoprotein beim erfindungsgemäßen Verfahren dar. Es wurde gefunden, daß 0,06 Mol an Kalziumion und 7 mg an Mepesulfate je Milliliter Serum eine optimale Ausfällung des /S-Lipoproteins ergeben. Mit Konzentration an Kalziumion etwa zwischen 0,04 und 0,25 Mol je Milliliter Serum und Mengen an Mepesulfate von 0,2 bis 0,8 mg je Milliliter Serum lassen sich erfindungsgemäß ausreichende Ausfällungen von ^-Lipoprotein erzielen. Dabei gilt, daß, je größer die Abweichung von der optimalen Kalziumkonzentration, die innerhalb des zuvor genannten Bereiches liegt, ist, desto kleiner die Abweichung von der optimalen Mepesulfate Konzentration sein sollte. Umgekehrt gilt, daß, je größer die Abweichung von der optimalen Mepesulfatkonzentration, die in dem zuvor genannten Bereich liegt, ist, desto geringer die Abweichung von der optimalen Kalziumkonzentration sein sollte.

Beispiel

Es wurde ein hoch Cholesterin haltiges Kontroll-Serum erfindungsgemäß wie folgt aus ACDPlasma hergestellt:

Claims (4)

Zu 41ACD Plasma (Cholesteringehalt 160 mg/%), die sich in einem Wasserbad von 37° C befanden, wurde unter leichtem Rühren 11 einer 12°/oigen Kalziumacetat-Monohydrat-Lösung zugefügt, und dann ließ man die Mischung auf Zimmertemperatur abkühlen. Da in diesem Beispiel Plasma als Ausgangsprodulct eingesetzt wurde, war es notwendig, das Fibrin zu entfernen. Wenn man Serum als Ausgangsmaterial verwendet, so hat natürlich vorher bereits die Fibrinabscheidung stattgefunden. Zu diesem Zwecke wurde unter Rühren allmählich 8000 Einheiten Thrombin zugefügt; dadurch wurde das Plasma zum Gerinnen gebracht und bildete ein festes Gel. Die Mischung wurde dann bei 37° C 30 Minuten gehalten, damit vollständige Gerinnung sichergestellt ist. Die klumpige Masse wurde mit einem Messer auseinandergeschnitten und dann so lange tiefgekühlt aufbewahrt, bis sie weiterverarbeitet wurde. Für die weitere Verarbeitung wurde die Masse aufgetaut, und das Fibrin wurde mittels Filtration durch ein Gewebefilter (cheesecloth) entfernt. Zu dem Filtrat wurde 11 einer 4%igen Lösung von Mepesulfate (dem Natriumsalz von sulfatiertem Polygalakturonsäuremethylestermethylglykosid) zugegeben, und die Mischung wurde dann bei 5° C über Nacht aufbewahrt. Die resultierende Masse wurde in der Kälte 75 Minuten zentrifugiert, um das ^-Lipoprotein zu sammeln. Die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen, und die Ausfällung wurde unter Zugabe von 115 ml von kalter (0,9%iger) Mepesulfate-Lösung nochmals suspendiert. Dann wurde über Nacht bei plus 5° C unter Verwendung einer 28,5 mm weiten und 762 mm langen Visking-Röhre gegen normale Salzlösung dialysiert. (Dabei handelt es sich um eine Röhre aus semipermeablem Kunststoff.) Die Suspension wurde aus dem DiaIysator entnommen, und es wurde nochmals Serum (das 200 mg/°/o Cholesterin enthielt) in einer solchen Menge zugegeben, daß sich ein Endvolumen von 2000 ml ergab. Das so gebildete Endprodukt hatte einen Cholesteringehalt von mg/%. Dann wurde diese hoch Cholesterin haltige Kontroll-Probe bis zur Verwendung aufbewahrt. Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung einer hoch Cholesterin haltigen Kontroll-Standard-Lösung für die Bestimmung des Blutcholesterinspiegels, dadurch gekennzeichnet, daß man zu einem Serum, dessen Cholesteringehalt nicht erhöht ist, Kalziumionen und ein wasserlösliches Salz eines sulfatierten Polygalakturonsäuremethylestermethylglykosids zugibt, die resultierende Ausfällung von ^-Lipoprotein sammelt, diese Ausfällung, zweckmäßig durch Dialyse, reinigt und die gereinigte Ausfällung in einer den gewünschten hohen Cholesteringehalt sichernden Menge in einem Serum löst, dessen Cholesteringehalt nicht erhöht ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kalziumionen in einer Menge von etwa von 0,04 bis etwa 0,25, vorzugsweise etwa 0,06 Mol je Milliliter Serum zugibt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das wasserlösliche Salz in einer Menge von 2,0 bis 8,0, zweckmäßig etwa 7,0 mg dem Serum zugibt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsprodukt ein Serum benutzt, dessen nicht erhöhter Cholesteringehalt unter 250 mg/% liegt, und daß man eine solche Menge an gereinigter Ausfällung zusetzt, daß das resultierende hoch Cholesterin haltige Serum einen Cholesteringehalt von mehr als 300 mg/% aufweist.