DE69230243T2

DE69230243T2 - Enzymatische neutralisierung von heparin

Info

Publication number: DE69230243T2
Application number: DE69230243T
Authority: DE
Inventors: Robert Heft; N. Lewis; Joseph Zimmermann
Original assignee: Ibex Technologies Inc
Current assignee: Ibex Technologies Inc
Priority date: 1991-04-04
Filing date: 1992-04-03
Publication date: 2000-05-11
Anticipated expiration: 2012-04-04
Also published as: ATE186217T1; CA2083162C; US5338677A; DE69230243D1; ES2141106T3; GR3032469T3; EP0537325A1; US5262325A; AU1771392A; WO1992017203A1; JPH05507297A; AU658418B2; EP0537325B1; DK0537325T3; JP2542780B2; CA2083162A1

Description

Hintergrund der Erfindung

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung von Säugerblut und Säugerplasma mit einer im Handel lebensfähigen bakteriellen Heparinasezubereitung, um die von der Anwesenheit von Heparin herrührende Beeinträchtigung normaler Blutfunktionen zu beseitigen.
Heparin ist ein mit Schwefelsäure behandeltes Glycosaminoglykan, mit einem Rückgrat bestehend aus abwechselnd Hexuron-, entweder L-Iduron oder D-Glucuron und D- Glycocyaninresten, die über alternierende 1,4-Verbindungen verbunden sind. Die heterologe Natur von Heparin beruht auf dem unterschiedlichen Grad und der Lokalisierung von Sulfatsubstitutionen auf diesen Resten, was zu mindestens zehn verschiedenen Monosaccharidbildungsblöcken innerhalb des Polymers führt, wie von Lindal et al., Biosynthesis of Heparin, TIBS, 11(5):221-225 (1986) berichtet wurde. Die Heterogenität und der hohe Grad an Sulfatsubstitution, mehr als 2,6 Sulfatgruppen pro Disaccharideinheit, verleiht Heparin eine hohe Proteinbindungskapazität, was zur Inhibierung oder Aktivierung verschiedener Enzymsysteme führt (Sakamoto und Sakamoto, "Heparin Bone Metabolism: Effects of heparin an bone collagenase release and activity and an application of heparin-sepharose affinity chromatography for in-vitro study of bone resorption", in Chemistry and Biology of Heparin (Elsevier/North Holland Press, Amsterdam 1981)). Protein-Heparin-Verbindungen beruhen meist auf elektrostatischen Interaktionen, obwohl Verbindungen aufgrund von Tertiär- und Sekundärstrukturinteraktionen, die spezifischen Olgiosaccharidsequenzregionen entsprechen, ebenfalls beobachtet wurden. Die am sorgfältigsten untersuchte frequenzspezifische Interaktion ist die Stabilisierung des Antithrombin 3 (AT III)- Thrombinkomplexes, der zur Inhibierung der Koagulation führt, wie von Rosenberg und Damus, J. Biol. Chem., 248: 6490-6505 (1973) erläutert wird.
Heparin wird bei invasiven chirurgischen Verfahren und Dialyseverfahren verbreitet als Antikoagulans verwendet, um eine Gerinnung in intravenösen Gefäßen zu verhindern, und bei der Behandlung thrombolytischer Störungen. 5-10% aller hospitalisierten Patienten haben Heparin in ihrem Blut. Vor kurzem wurden Heparine mit niedrigem Molekulargewicht, chemische Derivate des nativen Heparins, als potentielle Antikoagulantien untersucht, wobei der primäre Wirkmechanismus die Inhibierung des Faktors Xa ist, wie von Choay et al., Thrombosis Res., 11: 240 (1980) berichtet.
Patienten unter Heparintherapie oder solche, die Heparin über intravenöse Infusion erhalten haben, werden zur Beurteilung ihres hämatologischen Status oder zur Beobachtung der Heparintherapie häufig mit verschiedenen Mitteln untersucht. So werden beispielsweise während extrakorporaler Verfahren aktivierte Gerinnsel-Zeit-Assays in 20-Minuten- Abständen durchgeführt, um die adäquate Heparinisierung sicherzustellen und eine Kontaktaktivierte Gerinnselbildung zu vermeiden. Heparin beeinträchtigt verschiedene hämatologische Routineanalysen. Die Anwesenheit von Heparin im Blut verhindert die Identifizierung von Koagulopathien durch Standardkoagulationsassays, die auf der Gerinnung als Endpunkt basieren. Diese umfassen die aktivierte Teilthromboplastinzeit-, Prothrombinzeit-, Faktorkomplement-Assays und die aktivierte Gerinnungszeit. Die elektrostatischen Interaktionen von Heparin mit wesentlichen Komponenten anderer Untersuchungen, wie das Polylysinsubstrat im Fibrinolyseassay, verursacht ähnliche Probleme.
Das Problem der Heparin-Beeinträchtigung wurde versucht auf verschiedenen Wegen zu umgehen. Um Heparin vor der Untersuchung aus der Probe zu entfernen, wurden Ionenaustauscherharze verwendet, wie durch Cumming et al., Thrombosis Res., 41: 43-56 (1986) beschrieben. Dieses Verfahren ist unspezifisch, wobei zusätzlich zum Heparin Koagulationsfaktoren und andere Blutproteine entfernt werden, was das Testergebnis beeinträchtigt. Das Verfahren ist außerdem zeitaufwendig und kann nicht so einfach als ein STAT-Test während einer Operation verwendet werden, wobei eine schnelle Datenerfassung nötig ist.
Um Heparin durch elektrostatische Interaktion und Ausfällung zu neutralisieren wurde Protaminsulfat verwendet, wie ebenfalls durch Cumming et al. (1986) berichtet. Die Protamin-Heparin-Reaktion ist stöchiometrisch und erfordert eine exakte Titration, um negative Effekte, die sich aus unvollständiger Neutralisation oder aus den antikoagulatorischen Eigenschaften des Protaminsulfats selbst ergeben, zu vermeiden. Dieses Verfahren ist aufwendig und fehleranfällig und erfordert große Probenvolumina für akkurate Titrationsmessungen. Protaminsulfat ist nicht in der Lage, die gerinnungshemmende Wirkung von Heparin mit niedrigem Molekulargewicht zu neutralisieren.
Ein weiterer Versuch besteht darin inhibiertes Thrombin durch zusätzliches Thrombin oder ein substituierendes Enzym, wie Reptilase, zu ersetzen, das in der Lage ist, eine ähnliche Reaktion zu katalysieren, wie bei Funk et al., Brit. J. Haematol., 21: 43-52 (1971) beschrieben ist. Dieses Verfahren kann auch erfolgreich für Assays, die Ereignisse nach der Fibrinbildung verfolgen sollen, sein. Es ist jedoch nicht zur Bestimmung von Koagulopathien im Gerinnungspathway vor der Thrombin-katalysierten Reaktion geeignet. Darüber hinaus können die Auswirkungen von Heparin auf andere Komponenten, wie Platelets, durch diese Ersatzenzyme nicht umgangen werden.
Die am meisten wünschenswerte Lösung für das Problem der Heparinbeeinträchtigung wäre ein Verfahren, das Heparin schnell und spezifisch aus Blutproben, unmittelbar vor dem Beginn des Tests, entfernen könnte. Der Zusatz, der verwendet wird, um dies zu erreichen, muß für einen breiten Bereich von Bedingungen wirksam sein. Heparin sollte nahezu umgehend neutralisiert werden, während das Reagenz selbst keinerlei Wirkung auf Blutkomponenten über eine längere Expositionszeit ausüben soll. Ein Reagenz mit diesen Eigenschaften könnte bei ACT-Assays zum Einsatz kommen, die unmittelbar nach Probengewinnung durchgeführt werden und an Proben, die im Hämatologielabor untersucht werden und vor Weiterverarbeitung bis zu einer Stunde stehen müssen. Das Reagenz muß über einen weiten Temperaturbereich, 2-37ºC, wirksam sein, um für Proben geeignet zu sein, wie Proben, die im Hämatologielabor auf Eis aufbewahrt werden, Proben von Patienten mit kardiovaskulärer Operation, deren Bluttemperatur bei 30ºC gehalten wird und Proben von Patienten, die Verfahren, wie Dialyse; unterworfen werden, welche bei normalen Körpertemperaturen, 37ºC, durchgeführt werden. Das Heparin-neutralisierende Reagenz sollte auch konzentrationsunabhängig sein, so daß eine einzige Dosis des Reagenz einen breiten Bereich an Heparinkonzentrationen wirksam neutralisieren wird, der über klinisch eingesetzte Mengen (bis zu 0,3 IU/ml für thrombolytische Therapie, bis zu 1,5 IU/ml für Dialysetherapie und bis zu 6 IU/ml für kardiovaskuläre Operationen) hinausgeht. Des weiteren sollten die Heparin enthaltenden behandelten Proben das gleiche Resultat liefern wie unbehandelte Proben, die nicht Heparin ausgesetzt worden waren. Ein mögliches Reagenz wäre ein Heparin spezifisch abbauendes Glucanaseenzym, das, wie durch den gewünschten Test gemessen, keinen anderen Effekt auf die Probe hatte.
Hutt und Kingdon, J. Lab. Clin. Med., 79: 1027 (1972) versuchten eine Heparinase von Flavobakterium heparinum zu verwenden, um Plasmaproben vor Durchführung der PTT- Analyse zu behandeln. Die Autoren stellten fest, daß es erforderlich war, die Heparinase aus den Rohextrakten von F. heparinum zu reinigen, um eine Beeinträchtigungswirkung von der bakteriellen Quelle zu vermindern. Diese Daten zeigten jedoch, daß sie den beeinträchtigenden Teil nicht vollständig entfernen konnten. Eine Proteinzubereitung, die 0,008 RT Heparinase enthielt, war nicht ausreichend, um 0,1 IU/ml Heparin zu neutralisieren, während eine Präparation, die 0,04 RT Heparinase enthielt, eine verlängerte PTT-Zeit verursachte. Der Erfolg dieser Zubereitung liegt in einer exakten Titration des Enzyms und würde durch die Menge an Heparin, die neutralisiert werden könnte, begrenzt werden.
Das US-Patent Nr. 4,795,703 an Folkman et al., beschreibt die Verwendung der Heparinase aus F. heparinum zur Entwicklung eines Verfahrens zur quantitativen Bestimmung von Heparin in humanen Blutproben unter Verwendung eines aktivierten Gerinnungszeit-Assays. In vergleichbarer Art und Weise war es nicht möglich einen beeinträchtigenden Teil aus den Enzympräparationen vollständig zu entfernen. Mit Heparinase behandelte, ursprünglich Heparin enthaltende Proben, zeigten ACT-Zeiten, die 16% über den von unbehandelten, nicht Heparin ausgesetzten Proben lagen. Dieser Effekt war für das Verfahren unschädlich, da quantitative Heparinbestimmungen auf dem Vergleich von Testergebnissen in Bezug auf eine Standardkurve beruhen, die vermutlich den Einfluß der Enzympräparation auf das Testergebnis mit berücksichtigte.
Weder identifizierte eine der Gruppen die F. heparinum Gruppe, die für die Beeinflussung der Testergebnisse verantwortlich war, noch zeigten sie deren Aufarbeitung von der aktiven F. heparinum-Komponente, die für die Heparin-Neutralisation verantwortlich war. Die Autoren dieser Veröffentlichungen konnten nicht unterscheiden, ob ihre Zubereitungen ein zusätzliches Molekül von F. heparinum enthielten, das als ein Antikoagulans wirkte, oder ob Heparinase selbst gerinnungshemmende Eigenschaften aufweist, wenn es im Überschuß oder in Kombination mit Heparin verwendet wird. Die vor kurzem erfolgte Charakterisierung von Myxalin, einem Glycoprotein aus einer Gram negativen bakteriellen Quelle, zeigt, daß es gerinnungshemmende Eigenschaften, verbunden mit seinem Kohlenhydratteil, besitzt, wie von Akoum et al., Thrombosis Res., 60: 9-18 (1990) berichtet. Die Beweise deuten stark darauf hin, daß Heparinase ebenfalls ein Glycoprotein ist, wobei dessen Fähigkeit bekräftigt wird, vergleichbare Eigenschaften aufzuweisen.
Bohmer et al., Thrombosis Res., 60: 331-335 (1990) verwendeten eine Heparinase III aus einer unbestimmten, verfügbaren bakteriellen Quelle, um Heparin vor aPTT- und PT-Assays zu neutralisieren, und untersuchten deren Fähigkeit die Heparininhibierung des Thrombinvermittelten Fibrinogen-Abbaus zu neutralisieren. Um die gewünschte Heparinneutralisation zu erreichen wurde das Enzym mit filtriertem Plasma bei 37ºC für 5 min. und mit Gesamtblut bei 37ºC für 15 min. inkubiert. Der optimale Aktivitätsverlauf der Heparinase III, pH 7,6, [NaCl] = 0,03 und T = 45ºC (16) kann eine Inkubationszeit in dem dargelegten Protokoll erforderlich gemacht haben.
Keine dieser drei Gruppen zeigte Beweise für die Stabilität ihrer Heparinase-Formulierung, eine wesentliche Komponente eines klinischen Produkts.
Die WO 87/05333 betrifft ein spezifisches Verfahren für die Untersuchung von Heparin.
Yang et al. (1987) Appl. Biochem. & Biotechnol., 16, 35-50 betrifft die Herstellung einer Heparinase, die frei ist von Mucopolysaccharase-Verunreinigungen.
Eines der hauptsächlichen therapeutischen Anwendungsgebiete für Heparin ist die Verhinderung der Gerinnung während einer kardiovaskulären Operation, bei der das Blut des Patienten durch einen extrakorporalen Kreislauf fließt. Dabei wird etwa die zehnfache Menge der normalen thrombolytischen Dosis an Heparin verwendet, was eine postoperative Neutralisation durch Verabreichung von Protamin erforderlich macht. Da Protamin jedoch mit einigen Komplikationen verbunden ist und titriert werden muß, ist eine anderere Vorgehensweise der Heparin-/Protamin-Steuerung der Hämostase wünschenswert. Ein Verfahren kann der Ersatz der Protaminumkehrung durch Heparinase, die dem Patienten nach dem Bypass direkt injiziert wird, darstellen.
Langer und Mitarbeiter untersuchten die in-vivo-Auswirkungen von Heparinase in Tiermodellen, wie durch Klein et al., J. Lab. Clin. Med., 102: 828-837 (1982) und Langer et al., Trans. Am. Soc. Artific. Intern. Organs, 28: 387-390 (1982) berichtet wird. Heparinase mit einer spezifischen Aktivität von 0,58 IU/mg wurde Kaninchen injiziert, die Heparin erhalten hatten, und aPTT-Assays wurden verwendet, um die Gerinnung über eine gewisse Zeitspanne zu messen. Im Vergleich zu Kaninchen, die keine Heparinase erhielten, wurde eine beschleunigte Befreiung von Heparin festgestellt. Die Gerinnungzeiten betrugen 15 min. nach Heparinaseinjektion jedoch immer noch dreimal des Wertes der Grundlinie und erreichten erst eine Stunde später den Grundwert, die gleiche Zeitspanne, wie die Kontrolltiere, die keine Heparinaseinjektion erhielten. Langer war es möglich, eine verbesserte Umkehr zu erhalten, indem er Blut durch einen immobilisierten Heparinasereaktor leitete. Nach diesem Ergebnis gab die Langer-Gruppe die Idee einer direkten Heparinaseinjektion auf und konzentrierte sich auf die Entwicklung der extrakorporalen Verwendung der Heparinase zum Ersatz von Protamin.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Heparinasezubereitung zur Verfügung zu stellen, die in einem breiten Konzentrations-Bereich sowohl in vitro als auch in vivo Heparin schnell und vollständig neutralisiert.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Heparinasezubereitung zur Verfügung zu stellen, die frei von jeglichen Kontaminationen ist, die die Gerinnungszeiten verändern.
Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Heparinasezubereitung zur Verfügung zu stellen, die für eine längere Zeitspanne bei Raumtemperatur stabil ist.

Zusammenfassung der Erfindung

Eine von F. heparinum abgeleitete Heparinase-Formulierung, die allen Erfordernissen für ein klinisches Reagenz, das die Beeinträchtigung normaler Blutfunktionen durch Heparin eliminieren kann, genügt, wurde entwickelt. Die von F. heparinum abgeleitete Heparinase ist frei von einer Komponente, die die Gerinnung inhibiert. Sie ist unter normalen Herstellungs-, Liefer- und klinischen Aufbewahrungsbedingungen mindestens ein Jahr lang stabil. Die Heparinase hat ein optimales Aktivitätsprofil, das den physiologischen Bedingungen nahe kommt: pH = 6,5-7,0; [NaCl] = 0,1, und T = 37ºC. Die Zubereitung erreicht die beabsichtigte Neutralisation über einen breiten Bereich von Bedingungen, einschließlich all jener, die unter klinischen Bedingungen wahrscheinlich sind.
Die Heparinase ist in vitro nützlich, um die Beeinträchtigung von hämatologischen Assays aufgrund der Anwesenheit von Heparin zu verhindern. Die Heparinase ist auch nützlich für die in vivo-Neutralisation von Heparin während operativer Eingriffe. Die Vorteile dieser Zubereitung liegen darin, daß sie die Neutralisation schneller und vollständiger als früher verfügbare Zusammensetzungen erreicht, und über lange Zeitspannen stabil ist.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine graphische Darstellung der aktivierten Gerinnungszeit (Sek.) gegen die Zeit nach Heparinaseinjektion (min.) für ein Kontrollkaninchen, das 250 IU Heparin/kg, aber keine Heparinase (offene Kreise) erhielt, und ein Kaninchen, das 250 Heparin/kg erhielt, gefolgt von 5 min. später 2,5 IU Heparinase/kg (geschlossene Kreise). Die Basis-ACT ist als (...) gezeigt. Die ACT der behandelten Kaninchen wurde über 90 min. beobachtet.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Eine von F. heparinum abgeleitete Heparinaseformulierung, die allen Erfordernissen für ein klinisches Reagenz, das die Beeinträchtigung normaler Blutfunktionen durch Heparin eliminieren kann, genügt, wurde entwickelt. Es wurde festgestellt, daß Heparinase selbst keine gerinnungshemmenden Eigenschaften besitzt. Zu diesem Zweck wurde die Heparinase aus F. heparinum vollständig von einer Komponente, die die Gerinnung inhibiert, abgetrennt. Außerdem wurde ein Verfahren entwickelt, um Heparinase so zu formulieren, daß sie unter normalen Herstellungs-, Liefer- und klinischen Aufbewahrungsbedingungen für mindestens ein Jahr stabil ist. Heparinase aus F. heparinum hat ein optimales Aktivitätsprofil, das den physionlogischen Konditionen näher kommt, was dieses Enzym für die beabsichtigten Verabreichungen geeignet macht: pH = 6,5-7,5; [NaCl] = 0,1 und T = 37ºC. Die hier beschriebene Zubereitung erreicht die beabsichtigte Neutralisation über einen breiten Bereich an Bedingungen, einschließlich solcher, die in der Klinik wahrscheinlich sind. Ein Vergleich der hier gezeigten Ergebnisse mit veröffentlichten Informationen zeigt, daß diese gereinigte, stabilisierte Heparinase das erste im Handel erhältliche, auf einem Enzym basierende Produkt ist, das das Problem der Heparinbeeinträchtigung lösen kann.
Es gibt drei betriebsbedingte Komponenten: (1) die Herstellung von Gerinnungshemmungsfreier Heparinase, (2) die Stabilisierung und Formulierung der Gerinnungshemmungs-freien Heparinase und (3) die Verwendung der Gerinnungshemmungs-freien Heparinase zur Eliminierung der Beeinträchtigung in hämatologischen Assays aufgrund der Anwesenheit von Heparin. Die Heparinase ist auch für die in vivo-Neutralisation von Heparin während operativer Eingriffe nützlich.
Herstellung einer Gerinnungshemmungs-freien Heparinase:
Heparinase wird aus Kulturen des gramnegativen Bakteriums Flavobakterium heparinum isoliert. F. heparinum wird in einem geeigneten Heparin enthaltenden Nährmedium zur Induktion der Heparinasesynthese gemäß dem Verfahren von Galliher et al., Appl. Environ. Microbiol., 41(2): 360-365 (1981) oder einem vergleichbaren Verfahren wachsen gelassen. Die F. heparinum-Zellen werden konzentriert und die Heparinase wird durch Beschallung, Homogenisierung oder eine osmotische Schocktechnik in die Lösung freigesetzt. Die Heparinase wird dann aus dieser Lösung durch eine oder mehrere Standardreinigungsverfahren, umfassend Protaminsubstratpräzipitation, Ammoniumsulfatpräzipitation, Hydroxylapatitchromatographie, Anionenaustauschchromatographie oder Kationenaustauschchromatographie gereinigt, wobei eine Zubereitung mit einer spezifischen Aktivität von zwischen 10 und 35 IU Heparinase/mg Protein hergestellt wird. Dieses Material enthält einen Teil der die Gerinnung inhibiert, wie durch Standard-aPTT- und ACT-Assays gemessen.
Das Material wird weiter durch einen Affinitätschromatographieschritt unter Verwendung von Cellufinesulfat (AmiconTM) oder ein entsprechendes polysulfatiertes Harz gereinigt. Das Material wird dann dem Harz unter Bedingungen ausgesetzt, bei denen die Heparinase absorbiert wird, während der gerinnungshemmende Teil in Lösung bleibt, beispielsweise pH = 7,0, Leitfähigkeit zwischen 3 und 12 mmhos. Nach Waschen des Harzes um sorgfältig Spuren des gerinnungshemmenden Teils zu entfernen, wird die Heparinase durch Waschen in einem Puffer mit erhöhter Leitfähigkeit, beispielsweise pH 7, Leitfähigkeit > 16 mmhos, gewonnen. Funktionell gleichwertige Lösungen können für den pH 7,0 durch 3-12 und Lösungen mit mehr als 16 mmhos substituiert werden. Die so gewonnene Heparinasefraktion ist frei von dem kontaminierenden, gerinnungshemmenden Anteil.

klinische Heparinase-Formulierung:

Langer et al. berichten in Science, 217: 261-263 (1982), daß Heparinase, die in üblicherweise für die Durchführung der Heparinasereaktion verwendeten gepufferten Salzlösungen aufbewahrt wird eine Halbwertszeit von einer Stunde bei 37ºC, 30 Stunden bei 23ºC und 125 Stunden bei 4ºC aufweist. Wie nachstehend beschrieben, wurden mehrere Verbindungen auf ihre Fähigkeit, eine lösliche Heparinasezubereitung zu stabilisieren, untersucht. Von diesen zeigte Ammoniumsulfat das beste Verhalten, indem die enzymatische Halbwertszeit der Heparinase 60fach gesteigert wurde. Natriumacetat und Natriumsulfat in hohen Konzentrationen stabilisieren ebenfalls die Heparinaseaktivität, jedoch nicht in dem Maß wie Ammoniumsulfat. Die stabilisierenden Mittel, vorzugsweise Ammoniumsulfat oder ein ähnliches anderes Salz, werden zur Heparinase in ein Verhältnis von 0,5-1,0 mg Ammoniumsulfat/IU gerinnungshemmungs-freie Heparinase zugesetzt. Die meisten klinischen Proben werden im Bereich von 0,05-3,0 IU gerinnungshemmungs-freie Heparinase enthalten.

Eliminierung von Heparinbeeinträchtigung:

Ein Aliquot frisch abgenommenes Gesamtblut oder aus Blut gewonnenes Plasma wird in ein Röhrchen, das lyophilisierte Heparinasezubereitung enthält, überführt. Das Enzym wird in der Probe gelöst und für bis zu 60 min. bei 4-37ºC inkubiert. Im allgemeinen ist die Heparinaseneutralisation innerhalb der Zeit vollständig, die zum Lösen des Enzyms benötigt wird, d. h. weniger als 15 Sek.. So neutralisieren beispielsweise 0,05 IU Heparinase das Heparin in einer 0,4 ml Gesamtblutprobe, die 4,8 IU Heparin enthält, in 15 Sek. vollständig. Die Blut- oder Plasmaprobe kann mit der lyophilisierten Heparinaseformulierung vor dem Beginn eines hämatologischen Tests für zwischen 1 und 36 Sek. bei einer Temperatur zwischen 2 und 41ºC inkubiert werden.
Nach der Inkubation ist die Probe bereit zur Weiterverarbeitung durch den gewünschten hämatologischen Assay. Der Assay kann unter Verwendung von Standardprotokollen durchgeführt werden. Das erhaltene Ergebnis wird einem Ergebnis, das von einer Probe, die von dem gleichen Patienten entnommen wurde, die weder Heparin noch Heparinase ausgesetzt worden war, entsprechen.
Heparinase kann in einer Dosierung von 0,01 IU Heparinase/IU Heparin abwechselnd intravenös in einen Säugerkörper injiziert werden. Innerhalb von 15 min. nach Heparinaseinjektion wird die Wirkung des Heparins auf die Hämostase neutralisiert sein.
Die vorliegende Erfindung wird weiter unter Bezugnahme auf die folgenden, nicht beschränkenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1: Heparinaseherstellung

100 l F. heparinum wurden in einen Chemap-Fermenter unter Verwendung einer Variation des Minimalmediums gezüchtet, das durch Galliher et al. in Appl. Environ. Microbiol., 41(2): 360-365 (1981) beschrieben wurde. Die Temperatur wurde bei 23ºC gehalten und der pH durch die entsprechende Zugabe von Ammoniumhydroxid auf pH 7,0 eingestellt. Nach 24 stündiger Inkubation wurde eine volumetrische Heparinaseaktivität von 2,5 IU/ml erreicht. Die Zellen wurden durch Zentrifugierung konzentriert und die Heparinase wurde aus dem periplastischen Raum durch eine Abwandlung des von Zimmermann et al. in US-A-51697 beschriebenen Verfahrens durch osmotischen Schock freigesetzt. Das Osmolat wurde durch Kationenaustauschchromatographie weiter verarbeitet, wie von Zimmermann et al. beschrieben. Die so erhaltene Heparinasefraktion wurde direkt auf eine Cellofinesulfatsäule (5,0 cm i. d. · 30 cm) geladen und durch nachfolgendes Waschen mit je einem Liter 10 mM Natriumphosphat, pH 7,0, 10 mM Natriumphosphat, 200 mM NaCl, pH 7,0, 10 mM Natriumphosphat, 400 mM Natriumchlorid, pH 7 und 10 mM Natriumphosphat, 1000 mM NaCl, pH 7,0 eluiert.
Die Ergebnisse des Affinitätschromatographieschrittes sind in Tabelle 1 gezeigt. Die Heparinaseaktivität wird in der Fraktion, die bei 0,4 M NaCl eluiert, gewonnen, während der gerinnungshemmende Teil in der ungebundenen Fraktion verbleibt. Die aus diesem Schritt gewonnene Heparinase ist für den beabsichtigten Gebrauch, zur Eliminierung der Wirkung von Heparin auf Blut, geeignet. Tabelle 1: Reinigung von Heparinase durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von CellofinesulfatTM (Amicon)
* gerinnungshemmende Aktivität wird durch Inkubieren einer bekannten Menge an Material mit normalem humanem Plasma für 15 min. bei 4ºC gemessen und ein aPTT-Test durchgeführt. Die Aktivität wird als Verhältnis des aPTT des Plasmas, der mit dem Material inkubiert wurde, zu dem normalen aPTT-Wert für diese Probe (üblicherweise 24-28 sec.) ausgedrückt.
Eine weitere Reinigung der Heparinase wurde durch Hydroxylaktivitätssäulenchromatographie erreicht. Die Heparinasefraktion, die in dem Cellofinesulfatchromatographieschritt gewonnen wurde, wurde zweimal gegen 10 Volumen 10 mM Natriumphosphat, pH 7,0 dialysiert und auf eine Biogel-HTPTM (BioRad)-Säule (1,6 cm i. d. · 10 cm) geladen. Das Protein wurde mit einem linearen Gradienten von 10-250 mM Natriumphosphat und 0-0,5 M Natriumchlorid über 20 Säulenvolumen eluiert. Heparinase wurde als einzelner Proteinpeak, der bei 16 mM Natriumphosphat und 0,19 M Natriumchlorid eluierte, gewonnen. Eine STS- PAGE-Analyse dieses Materials zeigt, daß es nahezu homogen (mehr als 98%) ist. Eine Zusammenfassung der Heparinasegewinnungsschritte, die Reinigungsdaten zeigt, und die Entfernung des gerinnungshemmenden Teils, ist in Tabelle 2 gezeigt. Homogene Heparinase, die durch den oben beschriebenen Hydroxylapatitschritt gewonnen wurde, war vergleichsweise der Lage, Heparin in humanem Blut und Plasma zu neutralisieren, was darauf hinweist, daß neben Heparinase kein andere in der Cellofinesulfatherstellung enthaltenes Protein für diese Verwendung benötigt wird. Tabelle 2: Reinigung von Heparinase aus Flavobakterium heparinum-Fermentationen.
*gerinnungshemmende Aktivität wird durch Inkubieren einer bekannten Menge an Material mit normalem humanem Plasma für 15 min. bei 4ºC gemessen und ein aPTT-Test durchgeführt. Die Aktivität wird als Verhältnis des aPTT des Plasmas, der mit dem Material inkubiert wurde, zu dem normalen aPTT-Wert für diese Probe (üblicherweise 24-28 sec.) ausgedrückt.

Beispiel 2: Stabilisierung der Heparinasezubereitung

Die Heparinasezubereitung ist unter normalen Herstellungs-, Liefer- und klinischen Lagerbedingungen für mindestens ein Jahr stabil. Die Stabilität ist zum Teil auf Additive, am meisten bevorzugt Ammoniumsulfat, zurückzuführen. Mehrere Verbindungen wurden auf ihre Fähigkeit, eine lösliche Heparinasezubereitung zu stabilisieren, untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Wirkung von Additiven auf die Stabilität von Heparinase in Lösung bei 23ºC.
Nachfolgend wurde die Wirkung von wechselnden Mengen an lyophilisiertem Ammoniumsulfat auf die Gerinnung untersucht. Ammoniumsulfatmengen von bis zu 2,5 mg/ml Blut hatten keine meßbare Wirkung auf die Gerinnung. Schon 0,2 mg Ammoniumsulfat pro 1,5 IU Heparinase ist in der Lage, die Halbwertszeit von lyophilisiertem Enzym auf mindestens 200 Tage bei 23ºC zu verlängern. In dieser Ausführungsform werden 0,5-2,0 IU Heparinase in Anwesenheit von 1,0 mg Ammoniumsulfat in Röhrchen lyophilisiert, die 0,2-5,0 ml Flüssigkeit enthalten können. Diese können eine Vielzahl von Röhrchen umfassen, im Bereich von Mikrotiterplatten bis 5,0 ml Polypropylenteströhrchen. In anderen Ausführungsformen kann Heparinase/Ammoniumphosphat direkt in Behälter lyophilisiert werden, die in verschiedenen im Handel erhältlichen hämatologischen Untersuchungskits enthalten sind, in Spritzen, die zum Gewinnen der zu untersuchenden Probe verwendet werden, in Transferpipetten oder in sterilen Röhrchen mit Septumverschluß, in denen die Zubereitung vor der Verwendung als injizierbares therapeutisches Mittel wieder in Lösung gebracht werden könnte.

Beispiel 3: Neutralisierung von Heparin in Proben für ACT-Assays

Der aktivierte Gerinnungszeit-Assay (ACT-Assay) wird bei kardiovaskulären Operationen routinemäßig angewandt, um die gerinnungshemmenden Wirkungen von Heparin zu verfolgen. Als funktionelles Maß für den Intrinsic-Gerinnungsweg werden ACT-Messungen durch andere Faktoren als Heparin beeinflußt.
Kardiovaskuläre Eingriffe und extrakorporaler Kreislauf können zu Ereignissen von Thrombozytenstörungen, Hämodilution, disseminierter intravaskulärer Gerinnung oder Hypergerinnung, die die grundlegende Gerinnungszeit während der Dauer einer Operation verändern, führen. Die Annahme einer konstanten Grundlinien-ACT entsprechend dem präoperativen Wert, kann daher bezüglich der Verabreichung von Heparin oder Protamin zu falschen Schlüssen führen. Hämodilution beispielsweise führt zu einer verlängerten ACT und kann zu einer Überschätzung der für die Neutralisation benötigten Protaminmenge führen. Umgekehrt resultiert eine durch Kontaktaktivierung induzierte Hypergerinnung zu einer verkürzten ACT und kann zu einer Unterschätzung der Protaminmenge, die für die Neutralisation erforderlich ist, führen.
Eine schnelle Vorbehandlung von Proben zur Entfernung von Heparin vor der Bestimmung der ACT würde die Gewinnung von Grundgerinnungsinformation sogar bei Proben erlauben, die von Patienten stammen, die Heparin erhalten haben. 1,5 IU Heparinase wurden wie vorstehend beschrieben lyophilisiert, in einen Kanal der dual test high range cartridge, hergestellt von HemoTec., Inc. (Denver, CO). Die so erhaltene Absorptionspatrone liefert zwei Testergebnisse: Die aktivierte Gerinnungszeit einer unbehandelten Probe und die aktivierte Gerinnungszeit einer mit Heparinase behandelten Probe. Frisch abgenommenes Blut wurde entweder direkt mit dieser Absorptionspatrone untersucht, oder vor der Untersuchung mit 6 IU Heparin/ml inkubiert. Die in Tabelle 4 gezeigten Ergebnisse weisen darauf hin, daß Heparinase das in der 6 IU/ml Blutprobe enthaltene Heparin vollständig neutralisierte. Die mit sowohl Heparin als auch Heprarinase behandelte Probe ergab im Vergleich mit einer Probe, die keinem der Reagentien ausgesetzt worden war ein identisches Ergebnis. Ähnliche Ergebnisse wurden über den Bereich von 0-12 IU Heparin/ml erhalten. Die obere Grenze für die Heparindosis, die in Kardiovaskuläen operationen beobachtet wurde, ist 6 IU/ml. Tabelle 4 Neutralisation von Heparin in menschlichem Gesamtblut
Dieser Assay wird dem Kliniker während einer kardiovaskulären Operation wertvolle Informationen liefern, einschließlich Antworten zu dem folgenden:
1) Ist Heparin vor der Operation vorhanden?
2) Hat sich die Grundgerinnungszeit während des Eingriffs verändert?
3) Wurde Protaminumkehr von Heparin erreicht?
4) Ist nach der Operation Heparin-Rebound aufgetreten?
Die Ergebnisse einer klinischen Studie und Interpretationen möglicher Testergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5 Verwendung der Heparinase-aktivierten Gerinnungszeituntersuchung bei kardiovaskulärer Operation
normal = 105-130 Sekunden

Beispiel 5: Neutralisierung von Heparin in klinischen Proben für PT- und aPTT-Assays

PT/aPTT. Die Prothrombinzeit (PT) und aktivierte Teilthromboplastinzeit (aPTT)-Assays werden bei der Beurteilung der hämostatischen Funktion routinemäßig eingesetzt. PT wird durch Zugabe einer Präparation von Phospholipid, Gewebefaktor und Calcium zum titrierten Plasma des Patienten und Bestimmungen der Zeit bis zur Bildung eines Gerinnsels durchgeführt. Dieser Test mißt die Aggregationsaktivität der Faktoren VII, X, V und Fibrinogen. Die PT wird häufig dazu verwendet, um orale gerinnungshemmende Therapien, d. h. Cumann und Anti-Vitamin K-Medikamente zu verfolgen. Die aPTT-Untersuchung wird durch Zugabe einer Präparation von Celit, Phospholipid und Calcium zu dem titrierten Plasma des Patienten und Bestimmung der Zeit zur Bildung eines Gerinnsels durchgeführt. Diese Untersuchung mißt die Aggregationsaktivität der Faktoren XII, XI, IX, VIII, X, II, V und Fibrinogen. Die aPTT wird im allgemeinen als ein Gerinnungsscreeningtest für Faktorstörungen bei hospitalisierten Patienten verwendet.
Ein Verfahren zur Bestimmung von heparinunabhängiger aPTT- und PT-Messung würde die Beurteilung dieser Ergebnisse unterstützen. In entsprechender Weise zur Entwicklung des Heparinase-ACT-Tests, wurde die Verwendung von Heparinase zum Bereitstellen von Grund-aPTT/PT-Information untersucht. 1,5 IU Heparinase wurde in 1,5 ml Polypropylenröhrchen, wie vorstehend beschrieben, lyophilisiert. Diese Menge an Heparinase war in der Lage, die Wirkungen von bis zu 1,0 IU/ml Heparin in titriertem humanem Plasma vollständig umzukehren, wie in Tabelle 6 gezeigt. Die typische therapeutische Heparindosis beträgt 0,3 IU/ml. Tabelle 6 Neutralisierung von Heparin in humanem Plasma
Wann immer Grundgerinnungsdaten gewünscht werden, können einem Probenröhrchen vor der Standardgerinnungsanalyse 0,5-1,0 ml Plasmaaliquot zugesetzt und sorgfältig durch Umschwenken gemischt werden.

Beispiel 7: In vivo-Neutralisation von Heparin

Die vorhergehenden nicht erfolgreichen Versuche, Heparin in vivo zu neutralisieren, berichtet von Klein et al. (1982) und Langer et al. (1982), scheinen das gleiche, vorstehend unter Bezug auf den F. heparinum gerinnungshemmenden Teil, beschriebene Phänomen wiederzugeben. Unter Verwendung der nach dem hier beschriebenen Verfahren gereinigten Heparinase wurde die in vivo-Untersuchung wiederholt und innerhalb von 15 min. vollständige Heparinumkehr erreicht. Die Testergebnisse sind in Fig. 1 gezeigt.
Einem 4 kg-Kaninchen wurden 250 IU/kg Heparin verabreicht, wodurch die aktivierte Gerinnungszeit (ACT) von 180 auf mehr als 999 sec. verlängert wurde. Innerhalb von 5 min. nach Heparinverabreichung wurden 2,5 IU/kg Heparinase injiziert und die ACT in regelmäßigen Abständen über die nachfolgende Stunde beobachtet. 15 min. nach der Heparinaseinjektion war die ACT auf den Grundwert zurückgekehrt, was eine vollständige Umkehr der gerinnungshemmenden Aktivität von Heparin anzeigte. Das Kontrollkaninchen, das dieselbe Menge an Heparin erhalten hatte, aber keine Heparinase, erreichte den Grund- ACT-Wert nach 1,5 Stunden.
Diese Daten zeigen die Möglichkeit zur Verwendung von direkten Heparinaseinjektionen als Verfahren um Heparin in kardiovaskulärer Operation umzukehren.

Claims

1. Bakterienheparinase-Zubereitung, die frei ist von einer Antikoagulanz-Komponente, bestimmt anhand des aktivierten Teilthromboplastinzeit-Assays, und eine optimale Aktivität bei einem pH-Wert von 6,5 bis 7,5, [NaCl] = 0,1, bei 37ºC aufweist.

2. Heparinase-Zubereitung nach Anspruch 1, die von F. heparinum abgeleitet ist.

3. Verfahren zur Herstellung einer Heparinäse-Zubereitung nach Anspruch 1, wobei die Heparinase durch Affinitätschromatographie unter Verwendung eines Polysulfat-Harzes aus F. heparinum-Kulturen gereinigt wird.

4. Verfahren zur Herstellung einer Heparinäse-Zubereitung nach Anspruch 3, wobei die teilweise gereinigte Heparinase auf das Affinitätsharz unter Bedingungen aufgetragen wird, bei denen die Heparinase durch das Harz zurückgehalten und eine Komponente von F. heparinum, die die Koagulation inhibiert, durch das Harz nicht zurückgehalten wird.

5. Verfahren zur Herstellung einer Heparinase-Zubereitung nach Anspruch 4, wobei die Heparinase von dem Affinitätsharz unter Erhöhen der Leitfähigkeit des Eluents abgelöst wird, so daß die eluierte Heparinase-Fraktion frei ist von einer F. heparinum Komponente, die die Koagulation inhibiert.

6. Verfahren zur Herstellung einer Heparinase-Zubereitung, wobei die Heparinase- Zubereitung von Anspruch 1 durch Lyophilisieren von Ammoniumsulfat mit Heparinase in einer Lösung in einem Verhältnis von zwischen 0,5 und 1,0 mg Ammoniumsulfat/IU Heparinase stabilisiert wird.

7. Verfahren zur Herstellung einer Heparinase-Zubereitung nach Anspruch 6, wobei 0,05 bis 3,0 IU Heparinase, die frei ist von Antikoagulanz, in Anwesenheit von 0,5-1,0 mg Ammoniumsulfat/IU Heparinase in Behältern lyophilisiert wird, die zur Gewinnung oder zur Inkubation von Blut- oder Plasmaproben geeignet sind.

8. Verfahren zur Herstellung einer Heparinase-Zubereitung nach Anspruch 7, wobei die Behälter ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Blutgewinnungsröhrchen, Pipettenspitzen, Flüssigkeitsübertragungsvorrichtungen und Spritzen.

9. Ex-Vivo-Verfahren zur Eliminierung der physiologischen Auswirkungen von Heparin auf Blutkomponenten, welches umfaßt, Behandeln von Heparin enthaltendem Blut oder Plasma mit einer Heparinase-Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 7.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Blut niedermolekulare Heparine enthält.

11. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Blut- oder Plasmaprobe vor dem Beginn einer hämatologischen Untersuchung mit der lyophilisierten Heparinase-Formulierung für zwischen 1 und 3600 Sekunden bei einer Temperatur zwischen 2 und 41ºC inkubiert wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Untersuchung auf die Bildung von Gerinsel an deren Endpunkt gründet.

13. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Untersuchung ein aktivierter Gerinselzeit- (ACT) Assay oder ein Prothrombinzeit- (PT) Assay oder ein aktivierter Teilthromboplastinzeit- (PTT) Assay ist.

14. Heparinase-Formulierung, die durch Lyophilisieren von 0,05 bis 300 IU Antikoagulanz freier Heparinase nach Anspruch 1 in Anwesenheit von 0,5-1,0 mg Ammoniumsulfat/IU Heparinase in einen Behälter und erneutem Solubilisieren der Heparinase mit einer physiologisch verträglichen Lösung zur Verwendung in der Medizin hergestellt wird.