DE3014076A1 - Neue heparin-fraktionen mit erhoehter antikoagulans-wirkung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Heparin-Fraktionen mit stark erhöhten antikoagulierenden Eigenschaften.

Diese Heparin-Fraktionen können aus gereinigten handelsüblichen Heparinpräparaten, insbesondere aus solchen, die für eine Therapie gemäß der derzeitigen Standards geeignet sind und die ein Molekulargewicht von ca. 5000 bis ca. 40000 oder sogar bis ca. 50000 umfassen, erhalten werden, indem man eine wässrige gepufferte Lösung dieser Heparinpräparate, deren pH-Wert von 6,5 bis 7,5 reicht und die ein Salz enthalten, welches der gepufferten Lösung eine Ionenstärke verleiht, die geringer ist als die einer entsprechenden 0,6 molaren gepufferten Natriumchloridlösung, mit einem Anionenaustauscherharz in Kontakt bringt, aus diesem Harz die Heparin-Fraktionen, die durch die obengenannte gepufferte Lösung, die frei ist von Heparin und eine Ionenstärke besitzt, die geringer ist als die der genannten 0,6 molaren gepufferten Natriumchloridlösung, eluiert, und dann die noch zurückgehaltene Fraktion mit einer entsprechenden gepufferten Lösung eluiert, die eine Ionenstärke besitzt, die zumindestens gleich, vorzugsweise

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aber höher ist als die der genannten 0,6 molaren gepufferten Natriumchloridlösung.

Bevorzugte anionische Harze zur Verwendung bei der Herstellung der Fraktionen gemäß der Erfindung sind solche auf der Basis eines Cellulose- oder Dextran-Gerüstes, die Aminoalkyl- oder Ämino-hydroxy-alkyl-Gruppen tragen, wie z.B. die unten näher bezeichneten.

Wie nachfolgend gezeigt werden wird, sind die erfindungsgemäßen Fraktionen mit stark antikoagulierenden Eigenschaften dadurch charakterisiert, daß sie auf dem oben definierten anionischen Harz fixiert werden können und mit Hilfe einer gepufferten Natriumchloridlösung, die einen pH-Wert von 6,5 bis 7,5 und eine Ionenstärke besitzt, die geringer ist als die einer 0,6 normalen gepufferten Natriumchloridlösung, nicht eluierbar sind.

Gemäß einer ersten bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind sie insbesondere erhältlich (oder im wesentlichen genauso gut erhältlich) aus 10 ml einer Ausgangslösung, die 1 g handelsübliches Heparin in einer gepufferten Lösung (0,05 M Phosphat; pH 6,8; 0,4 M an Natriumchlorid), indem man diese 10 ml Lösung auf eine Säule (Höhe-28 cm. Durchmesser 2 cm) eines Harzes, das mit dem gleichen Puffer im Gleichgewicht steht, aufbringt, wobei dieses Harz ein Cellulose- oder Dextran-Gerüst besitzt und anionische Grup-

äfchyl
pen trägt, wie z.B. Di/aminoäthylgruppen mit der Struktur

-C₂H₄NH(C₂Hg)₂ oder Diäthyl-2-hydroxypropyl-ammonium-Gruppen mit der Struktur:

C₀H₁- OH

I I

-C₉H₄ N⁺ CH₉ — CH

I 1

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Vorzugsweise wird die Lösung auf ein Harz, welches unter den Handelsnamen "DEAE-SEPHACEL", "QAE-SEPHADEX", "DEAE-CELLULOSE" oder "TEAE-CELLULOSE" vetrieben wird und im Gleichgewicht steht mit dem gleichen Puffer, aufgebracht, die Ausgangslösung des Heparins mit Hilfe der gleichen gepufferten Lösung chromatographisch entwickelt mit einer Elutionsrate von 36 ml/h bei einer Temperatur von 4⁰C, die ersten 500 ml des Eluates abgetrennt und entfernt, dann die Natriumchlorid-Konzentration gradientenweise erhöht (vorzugsweise so, daß während der Elution der nächsten ca. 800 ml Elutionslösung die Natriumchlorid-Konzentration von 0,4 bis 1,4 M steigt) und die gewünschten Heparin-Fraktionen, die in diesen eluierten Fraktionen mit einer Natriumchlorid-Konzentration größer als 0,65 M, vorzugsweise von ca. 0,70 bis ca. 0,90 M,enthalten sind, gewinnt.

Gemäß einer anderen oder zweiten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind sie auch erhältlich (oder im wesentlichen genauso gut erhältlich) aus 30 ml einer Ausgangslösung, die 10 g handelsübliches Heparin enthält (50 mM Tris, Natriumazid 0,02 %, pH 7,0, und mit einer Ausgangskonzentration an Natriumchlorid von 0,4 M), indem man diese 30 ml Lösung auf eine Säule eines Ear ζ 6SZT^-We^-XCTTeIs anionische Gruppen enthält—ähnlich oder identisch mit den vorstehend genannten Harzen —(Durchmesser 18 cm, Höhe 6,8 cm), wobei dieses Harz im Gleichgewicht steht mit dem obengenannten Puffer, die Heparin-Ausgangslösung mit Hilfe der gleichen gepufferten Lösung mit einer Elutionsrate von 75 ml/h bei einer Temperatur von 4⁰C chromatographisch entwickelt, die ersten 300 ml der eluierten Flüssigkeit abtrennt und entfernt, dann die Natriumchlorid-Konzentration gradientenweise von 0,4 M auf 1,OM mit einer solchen Geschwindigkeit erhöht, daß man die obere Grenze nach 24 h erreicht, und die gewünschten Heparin-Fraktionen, die in diesen eluierten Fraktionen mit einer Natriumchlorid-Konzentration von 0,55 M, vorzugsweise von 0,59 M,

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enthalten sind, zurückgewinnt.

"Gemäß einer weiteren Alternative der Erfindung sind sie auch erhältlich (oder im wesentlichen genauso gut erhältlich) aus einer Ausgangslösung, die 650 mg Heparin (vorzugsweise mit einer Aktivität von ca. 160 + 20 Internationalen Einheiten (UI)/mg) in 2 ml einer gepufferten wässrigen Lösung (Natriumchlorid 0,3 M, pH 6,8) enthält, indem man 2 ml dieser Lösung auf eine "Pharmacia"-Säule von "Ultrogel Aca 54" (2,6 χ 100 cm), die mit dem gleichen Puffer im Gleichgewicht steht, aufbringt, diese Heparin-Ausgangslösung mit Hilfe der gleichen gepufferten Lösung mit einer Elutionsrate von 20 ml/h bei einer Temperatur von 4⁰C chromatographisch entwickelt, die eluierte Flüssigkeit in aufeinanderfolgende 5 ml-Fraktionen trennt und die gewünschten Heparin-Fraktionen, die in der 53. bis 86. so abgetrennten 5 ml-Fraktionen enthalten sind, zurückgewinnt.

Stärker raffinierte Heparin-Fraktionen gemäß der Erfindung sind auch die, welche erhalten werden (oder erhältlich sind) durch eine Kombination der obengenannten Ausführungsformen, z.B. indem man die "gewünschten Heparin-Fraktionen" aus der chromatographischen Ultrogel-Filtration zurückgewinnt, wie z.B. gemäß der zuletzt genannten Alternative, die genannten Heparin-Fraktionen vom Eluans abtrennt, z.B. durch alkoholische Fällung, dann in eine gepufferte Lösung einbringt, wie sie in den oben beschriebenen Arbeitsweisen verwendet wird, nach denen die gepufferte Lösung mit einem anionischen Harz in Kontakt gebracht wird nach irgendeiner der obengenannten Ausführungsformen, um die Fraktionen, die gemäß dem obengenannten Natriumchlorid-Gradienten abgetrennt wurden, zurückzuerhalten, und die in den eluierten Fraktionen enthalten "sind, die eine Natriumchlorid-Konzentration besitzen von

entweder größer 0,65 M, vorzugsweise mit einem Natriumchlorid-Gehalt von ca. 0,70 bis ca. 0,90 M, gemäß der obengenannten ersten bevorzugten Ausführungsform, oder

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größer als 0,55 M, vorzugsweise 0,59 M, gemäß der zweiten bevorzugten Ausführungsform.

Eine Umkehr der zwei aufeinanderfolgenden Trennungen, wie sie oben beschrieben wurden (d.h. erste Fraktionierung an DEAE-SEPHACEL oder einem analogen Harz, gefolgt durch eine Trennung an ULTROGEL) liegt selbstverständlich auch innerhalb des Umfangs der Erfindung.

Erfindungsgemäße Heparin-Fraktionen sind auch solche, die nach Fraktionierung von handelsüblichen Ausgangsheparinen durch irgendeine Arbeitsweise, und insbesondere durch die oben beschriebenen, eine maximale Aktivität/in vitro-Test zeigen, der in der Messung der Verringerung der Hydrolysegeschwindigkeit von S-2222 Substrat (Benzoyl-isoleucin-glutaminsäureglycin-arginin-para-nitroanilid-Hydrochlorid) durch den aktivierten Faktor X (Faktor Xa), der durch Aktivierung des Faktor X mit einem Faktor X-AktivC.ator erhalten wird, in Gegenwart von Plasma (welches als Quelle für beide Faktoren Faktor X und Antithrombin III fungiert) und in Gegenwart der zu testenden Heparin-Fraktionen besteht. Der verwendete Aktivator ist vorzugsweise derjenige, der unter dem Handelsnamen STYPVEN in einer 0,5 M Calciumchlorid-Lösung vertrieben wird.

Die bevorzugten Heparin-Fraktionen können auch zuiaindestens teilweise solche umfassen, die eine maximale Aktivität im in vitro-Test zeigen, der in der Messung der Verringerung der Hydrolysegeschwindigkeit von S-2238 chromogenem Substrat (S-2238 chromogenic substrate) (H-D-Phenylalanin-L-pipecolyl-L-arginin-p-nitroanilid-cli-Hydrochiorid) durch Thrombin in Gegenwart von Plasma (welches als Quelle für Antithrombin III fungiert) und der zu testenden Heparin-Fraktionen besteht.

S-2238 und S-2222 sind im Handel erhältlich (vertrieben durch die schwedische KABI-Company). Sie sind chromogene Substrate. Ihre Hydrolysegeschwindigkeit oder Grad der Hydrolyse wird durch Spektrophotometrie gemessen.

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Es wurde gefunden, daß bei Verwendung der oben beschriebenen Fraktionierungstechniken an ÜLTROGEL-Gels und an DEAE-SEPHACEL oder analogen Harzen die Fraktionen mit der höchsten Aktivität in den obigen in vitro-Tests in den oben definierten Elutions-Volumina enthalten sind.

In der ÜLTROGEL-Fraktioniertechnik sind diese Fraktionen insbesondere diejenigen die etwa von der 58. bis 60. bis zur 76. bis 80. 5ml-Fraktion wie oben definiert erhalten werden (diese. Fraktionen werden zusammengenommen als "LP2-Fraktion" bezeichnet).

Die besonders bevorzugten Heparin-Fraktionen sind diejenigen, die die höchste Aktivität im Hinblick auf das S-2222-Substrat zeigen, auch wenn sie keine Fraktionen mehr enthalten, die die höchste Aktivität im Hinblick auf das S-2238-Substrat zeigen.

Deshalb gehören die Heparin-Lösungen, die in der oben beschriebenen ULTROGEL-Fraktionierungstechnik von der 53. bis zur 58. bis 60. 5 ml-Fraktion (die "LP12-Fraktionen") gewonnen werden, zu den am meisten bevorzugten Heparin-Fraktionen gemäß der Erfindung. Sie besitzen eine hohe antikoagulierende Aktivität, was durch die thromboelastographische Methode und die konventionellen Antithrombin-Tests gezeigt wird.

Es wurde gefunden, daß die Heparin-Fraktionen, die die höchste Aktivität in den in vitro-Tests besitzen - und die ebenfalls eine antikoagulierende Wirkung, bestimmt durch die thromboelastographische Methode und durch Antithrombin-Aktivität, besitzen die weit · höher ist als die der handelsüblichen Ausgangsheparine - durchschnittliche Molekulargewichte in der Gegend von 17.000 bis 25.000 haben, bestimmt durch ihre gemessenen Retentionszeiten bei Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (mit einem "SPECTRA-PHYSICS

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35OO"-Chromatograph, an 250 χ 9 mm-Säulen, die mit Kieselerde (Silica)-Körnchen der Größe 10 bis 100 Mikron gefüllt -sind, und die unter dem Handelsnamen LICHROSPHER vertrieben werden, Elutionsmittel 0,02 M Natriumsulfat, Elutionsgeschwindigkeit 3 ml/min). Die gemessenen Retentionszeiten * wurden mit denen verglichen, die unter identischen Eluticnsbedingungen mit Polystyrolnatriumsulfonaten mit einem standardisierten Molekulargewicht von 1.600, 4.000, 6.500, 16.000, 31.000, 65.000 und 88.000 erhalten wurden.

Bevorzugte erfindungsgemäße Fraktionen sind diejenigen, welche im Hinblick auf den Paktor Xa eine spezifische Hemm-Aktivität (Anti-FXa spezifische Aktivität) von mindestens 300 Einheiten (u)/mg, vorzugsweise von mindestens 450 u/r.g und insbesondere von mindestens 500 u/mg Heparin zeigen. Diese Anti-FXa spezifische Aktivität wird in vitro durch eine Methode gemessen, die das S-2222 Substrat verwendet.

Unter diesen bevorzugten Fraktionen sind diese, welche eine in vitro "Antithrombin spezifische Aktivität" besitzen, die in Einheiten (u) pro mg Heparin ausgedrückt niedriger ist als die "Anti-FXa spezifische Aktivität", wenn die "Antithronbin spezifische Aktivität" nach ■ der nachstehend beschriebenen Methode gemessen wird, die das S-2238 chromogene Substrat verwendet. Vorzugsweise ist die "Anti-FXa spezifische Aktivität" größer als 500 u/mg, während die "Antithrombin spezifische Wirkung" kleiner ist als 400 u/mg.

Es wurde gefunden, daß Heparin-Fraktionen, die wie vorstehend beschrieben isolierbar sind, eine insgesamt gesteigerte antikoagulierende Aktivität besitzen, bestimmt durch die Throxnbin-Zeit und die Cephalin-Kaolin-Zeit, beide gem^JeS? %ti^cvrzi$ ^em-^:£:Lasma/

und in vivo, und durch die thromboelastographische Methode, / i ⁿ "Biologie des hemorragies et des thromboses" ^W and of thrombosis) von G. RABY, MASSON

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Publishers, Paris 1966, Seiten 185 bis 188. Sie zeigen insbesondere Wirksamkeit auf die Koagulationskinetik, ausgedrückt durch die Zunahme der "r" und "r + k"-Parameter, gemessen nach dör genannten thromboelastographischen Methode. .

Es wurde gefunden, daß die erfindungsgemäßen Fraktionen ein elektrophoretisches Bild ergeben, das von dem des Ausgangs-Heparins verschieden ist: Insbesondere sind unter bestimmten Bedingungen die elektrophoretischen Beweglichkeiten ihrer Komponenten wesentlich größer als die von handelsüblichem Heparin, insbesondere wenn ihre Lösungen in 0,1 M Bariumacetat, pH 5,8, 15 h lang bei einer Stromstärke von 1 inA einer Elektrophorese an Celluloseacetatstreifen (insbesondere solchen die im Handel unter der Bezeichnung MICROPHOR-Celluloseacetat bekannt sind), unterworfen werden.

Was andere besondere Eigenschaften der neuen erfindungsgemäßen Heparin-Fraktionen betrifft, so wurde weiterhin gefunden

- sie werden im wesentlichen vollkommen durch Antithrombin III fixiert, insbesondere an immobilisiertem Antithrombin III,

- sie hemmen zumindest teilweise die Blutfaktoren XI und XII, welche, wie gut bekannt, am Beginn der Kaskade der enzymatischen Reaktionen stehen, welche in der Blutkoagulation gipfeln,

- sie werden nicht im gleichen Ausmaß wie normales Heparin durch den Plättchenfaktor IV (platelet factor IV) inhibiert,

- ihre antikoagulierenden Eigenschaften in in vivo Versuchen sind 2,5- bis 5mal größer als die des Ausgangs-Heparins,

- die Glucosamingruppen, die sie enthalten, scheinen nur teilweise in der Form von N-Glucosaminsulfaten vorzuliegen,

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während der Rest der Glucosamin-Gruppen, wie durch NMR-Analyse festgestellt, in Form von N-Acetylglucosamin-Gruppen vorliegt.

Es wurde auch gefunden, daß sie frei sind von einem der wesentlichen Nebeneffekte, der ziemlich oft bei den herkömmlichen Heparinen festgestellt wird. Im einzelnen wurde gefunder., daß sie keine thrombocytopene Wirkung an Blut von Patienten zeigen, die gegen ein handelsübliches Standard-Heparin empfindlich sind und deshalb ein solches Syndrom entwickeln, wenn sie das handelsübliche Heparin erhalten.

Die erfindungsgemäßen Heparin-Fraktionen können auch durch weitere Verfahrensausgestaltungen erhalten werden, die sich im wesentlichen von den obengenannten dadurch unterscheiden, daß sie keinen regulären Gradienten (von niedriger Konzentration zu hoher Konzentration) für die Konzentration von Natriumchlorid oder analogen Komponenten erfordern.

So können die erfindungsgemäßen Heparin-Fraktionen durch ein Verfahren erhalten werden, welches nach einem ansatzweisen Verfahren arbeitet, welches eine leichtere Handhabung großer Mengen von Ausgangsmaterial ermöglicht, und damit eine Fraktionierung im großen Maßstab. Sie können auch durch chromatographische Verfahren an großen Säulen von anionischen Harz erhalten werden, dann aber mit einer Serie von aufeinanderfolgenden gepufferten Eluantien, die verschiedene Natrium— chlorid-Konzentrationen besitzen, wobei man, ausgehend von der niedersten Konzentration, die Konzentration stufenweise und weniger in Form eines Gradienten bis zur höchsten Konzentration verändert.

Grundlegend wurde gefunden, daß , welche Methode auch immer verwendet wird, die erfindungsgemäße Fraktion im wesentlichen in dem Eluat enthalten ist, welches erhalten werden kann, indem man das Harz mit einer Lösung des Elutionsmittels,

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dessen Natriumchlorid-Konzentration mindestens 600 inM beträgt, in Kontakt bringt, nachdem das Harz vorher mit einer - Lösung des Ausgangs-Heparins in Kontakt gebracht wurde, die in Form einer gepufferten lösung mit einem niederen Natriumchlorid-Gehalt vorliegt . , und Abtrennung von solchen Heparin-Praktionen, die mit Natriumchlorid-Lösungen bis zu einem Gehalt von im wesentlichen 6 00 mM eluiert werden können.

Gepufferte Lösungen mit einer Natriumchlorid-Konzentration, die- oberhalb der oben angezeigten Minimalgrenze liegt (650 mM), d.h. 800 mM oder sogar 1000 mM, können ebenfalls verwendet werden.

Selbstverständlich können auch viele andere Salze, deren Verwendung mit dem bestimmungsgemäßen Gebrauch der erfindungsgemäßen Heparin-Fraktionen, insbesondere in der Therapie, vereinbar ist, in dem Ausmaß anstelle von Natriumchlorid verwendet werden, indem sie zur Bildung wässriger Lösungen mit der entsprechenden Ionenstärke befähigt sind. Beispiele solcher Salze sind: Kaliumchlorid, Ammoniumsulfat, Alkaliphosphate usw.

Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele in detaillierterer Form beschrieben, die sich auf der einen Seite auf bevorzugte Ausführungsformen der Verfahrensalternativen zur Herstellung der erfindungsgemäßen Fraktionen, auf der anderen Seite auf die weitere Veranschaulichung der besonderen Eigenschaften, die von solchen Fraktionen gezeigt werden, beziehen. Bevor auf die Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung eingegangen wird, sollen die verschiedenen Prüfmethoden aufgezeigt werden.

A) : . Gehalt' ^von Heparin in hintereinander eluierten Fraktionen

Die Heparin-Konzentration der chromatographischen Fraktionen wurde zweckmäßigerweise durch polarimetrysehe Messungen mit Hilfe eines Perkin-Elmer 241 Polariiueters (Überlingen,

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Westdeutschland)/? Wobei bei 365 nm (Quecksilber-Spektral-

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linie) gemessen wurde, [a]_,_cc = 139 (für die oben erwähnten handelsüblichen Proben). Aus der Standardgleichung [α], = -τ—— , worin [α], die spezifische Drehung

Λ -L · C Λ

bei einer gegebenen Wellenlänge und Temperatur ist, [α] die beobachtete Drehung, 1 die Länge des Lichtweges durch die Testlösung in dm, und c die Konzentration des gelösten Stoffes in g pro 100 ml, wurde die folgende Beziehung abgeleitet: [α]/0,139 = die Konzentration des gelösten Stoffes (Heparin) in mg-ml

B) Bestimmung der Heparin-Aktivität an S-2222 Substrat (durch Messung der Hemmung, welche es auf die Aktivität des aktivierten Faktors X (FXa) im Hinblick auf S-2222 ausübt).

1. Die Herstellung der Reagentien

a) Herstellung einer Lösung des Substrates (S-2222)

25 mg des Substrates werden in 8,5 ml eines zweimal destillierten Wassers unter Rühren (magnetisches Rühren) gelöst. Diese Lösung ist, wenn sie nicht durch Mikroorganismen verunreinigt ist, sechs Monate bei 4°C stabil.

b) Herstellung der Aktivator-Zusammensetzung

Die Aktivator-Zusammensetzung wird aus den folgenden Lösungen erhalten:

- 0,2 mg der von WELLCOME (Großbritannien) unter dem Handelsnamen STYPVEN (Rüssel Viper Schlangengift (RW)) vertriebenen Zusammensetzung werden in 2 ml einer Lösung von 9 g/l Natriumchlorid gelöst (Lösung 1).

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- 555 mg Calciumchlorid werden in 10 ml destilliertem Wasser gelöst (Lösung 2).

- 1 ml der Lösung 1 wird mit 0,5 ml der Lösung 2 gemischt. Die Mischung, die die nachstehend verwendete "Aktivator-Zusammensetzung" bildet, ist mindestens 2 Tage lang bei 4°C stabil.

c) Herstellung des Puffers (pH 8,4 bei 25°C) Eine Lösung wird gebildet aus

Tris : 6,1 g (50 mM) Na₂EDTA : 2,8 g ( 7,5 mM) NaCl : 10,2 g (175 mM) destilliertes Wasser : 800 ml

- Der pH-Wert wird dann auf 8,4 bei 25°C mit 1 N Salzsäure eingestellt. Das Volumen der Lösung wird mit destilliertem Wasser auf 100 ml gebracht.

d) Bildung des "gepufferten Substrates".

1 Volumenteil von S-2222 (4 mM/1) wird mit 1 Volumenteil des oben beschriebenen Puffers gemischt. Die Mischung ist mindestens 3 h bei Raumtemperatur stabil.

e) Herstellung einer verdünnten Lösung von menschlichem Plasma (welche die Quelle für Antithrombin III (AT III) und des Faktors X ist)

9 Volumina Blut (aus gemischtem Blut von mindestens

10 normalen Spendern) wird mit einem Volumenteil einer Natriumcitratlösung (0,1 Mol/l) gemischt. Das Plasma wird erhalten durch 20 min langes Zentrifugieren bei 2000 g und 4°C. Es wird auf -20⁰C eingefroren.

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0,2 ml dieses Plasmas werden mit 9,8 ml von Tris-Puffer gemischt.

f) Herstellung einer Heparin-Lösung als Bezugssubstanz: INTERNATIONAL REFERENCE STANDARD HEPARIN (im nachfolgenden als "Bezugs-Heparin" bezeichnet).

Es wird eine Lösung von 0,1 mg Bezugsheparin pro ml einer 0,15 M Natriumchloridlösung hergestellt. 0,6 ml dieser Lösung werden mit Natriumchlorid (0,15 M) auf 100 ml verdünnt.

Im chromatographischen Verfahren wird eine solche Heparin-Lösung so verdünnt, daß eine Probe erhalten wird, die in 0,05 ml ca. 0,25 ug Heparin enthält.

2. Die Prüfmethode

Die Prüfungen werden wie folgt ausgeführt:

a) 0,4 ml verdünntes Plasma werden in eine Semimikroküvette gebracht. 0,2 ml von Tris-Puffer werden zugegeben. Die Mischung wird 2 min lang bei 37°C inkubiert.

75 μΐ von "Aktivator-Zusammensetzung" werden dann zugefügt.

Die gebildete Mischung wird 60 s lang bei 37°C inkubiert.

0,2 ml des gepufferten Substrates wird zugefügt und mit der vorstehenden Mischung gemischt.

Bei 405 nm wird die Absorption gegen eine Kontrolllösung (1 ml des entsprechenden Puffers) bestimmt.

"ΔΑ min " stellt die Zunahme der optischen Dichte

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pro min dar.

b) In einer zweiten Prüfung werden 0,05 ml einer Lösung des Bezugs-Heparins einer bekannten Stärke in IU (Internationalen Einheiten) zu 0,4 ml eines verdünnten menschlichen Plasmas zugegeben. Die Mischung wird mit Tris-Puffer auf 0,6 ml ergänzt und bei 37⁰C 2 min lang inkubiert.

75 μΐ der "Aktivator-Zusammensetzung" werden zugegeben, mit der vorstehenden Lösung gemischt und die Absorption bei 405 niu bestimmt.

"Δ A¹ min " ist die Zunahme der optischen Dichte pro min.

c) Der Versuch wird mit den zu prüfenden Heparin-Fraktionen hoher Aktivität wiederholt. Die letzteren Fraktionen werden ungefähr auf eine solche Menge eingestellt, daß ein entsprechender "Δ A"min "-Wert erhalten wird, der 50 % über dem "Δ A min "-Wert der gepufferten Kontrollösung liegt.

Der Wert (a), der den Grad der Hemmung des Faktors Xa durch 1 mg Heparin von bekanntem Titer darstellt, wird wie folgt berechnet:

(a) = — —^- χ 1.000

0,25

Der entsprechende Wert (a') der geprüften HeparinFraktion ist:

Δ A - ΔΑ"

(a¹) = χ 1.000

Gewicht der geprüften Heparin-Probe

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wobei sich die Wirksamkeit des geprüften Heparins, in Internationalen Einheiten, ableitet aus der Formel :

Wirksamkeit des geprüften Heparins = Wirksamkeit des

Bezugs-Heparins

C) Prüfung der Heparin-Aktivität an S-2238 Substrat (durch Messung der Hemmung, welche es auf die Aktivität von Thrombin im Hinblick auf S-2238 ausübt)

1. Herstellung der Reagentien

a) Herstellung einer Lösung von S-2238

4,71 mg von S-2238 werden in 10 ml eines 2-fach destillierten Wassers gelöst, um eine Lösung von 0,75 mM/1 zu bilden.

b) Herstellung einer Lösung von Thrombin

5 mg Thrombin werden in 25 ml einer Lösung von Natriumchlorid (0,15 M) gelöst. Wenn benötigt, werden 1,2 ml dieser Lösung mit der gleichen Natriumchlorid-Lösung kurz vor dem Gebrauch auf 10 ml verdünnt.

c) Herstellung des Puffers (pH-Wert 8,4 bei 25°C).

Dieser Puffer ist der gleiche wie oben unter B 1) e) beschrieben.

d) Herstellung von Schafplasma

Schafblut wird in eine Citratlösung eingebracht (900 ml Blut (9 Volumina) werden mit 100 ml einer 0,1 M Natrium-

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citratlösung gemischt).

Das Plasma wird durch 20 min langes Zentrifugieren der vorstehenden Blut-ZusammenSetzung bei 2.000 g und 4⁰C erhalten. Es wird in 25 ml Ampullen eingefroren.

e) Herstellung der Lösung von Bezugs-Heparin

Es wird eine Lösung von 0,1 mg Bezugs-Heparin pro ml einer 0,15 M Natriumchloridlösung hergestellt. 0,5 ml dieser Lösung werden mit 0,15 M Natriumchlorid auf 10 ml ergänzt. Für die Chromatographie wird diese Heparin-Lösung so verdünnt, daß eine Probe von 0,05 ml (die für die Untersuchung eingesetzt wird) erhalten wird, die 0,25 μg Heparin enthält.

2. Prüfmethode

0/3 ml des obigen Puffers und 0,1 ml des Schafplasmas werden in einer Semimikro-Küvette (1 ml) gemischt.

0,1 ml der verdünnten Thrombin-Lösung werden zugefügt. Die Mischung wird bei 37⁰C in einem Wasserbad 2 min lang inkubiert. Dann werden 0,3 ml der Substrat-Lösung zugefügt. Nach der Mischung wird 3 min lang die Absorption bei 405 nm abgelesen und mit der einer Kontrolle, die 1 ml Puffer enthält, verglichen, wobei die Zunahme der optischen Dichte "Δ A min " bestimmt wird.

In einem anderen Versuch werden 0,1 ml Schafplasma und 0,05 ml einer Lösung von Bezugs-Heparin bekannter Wirksamkeit (in Internationalen Einheiten) in eine Semimikro-Küvette gebracht. Mit der Pufferlösung wird das Volumen auf 0,3 ml gebracht.

0,1 ml von Thrombin werden dann dazugefügt. Die Mischung wird 2 min lang bei 37⁰C inkubiert.

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0,3 ml der Substrat-Lösung werden dann zugefügt.

Nach der Mischung wird die Absorption bei 405 nm bestimmt, um die Zunahme der optischen Dichte pro min "Δ A¹ min " zu bestimmen.

Dieselbe Untersuchung wird mit Proben einer zu prüfenden Heparin-Fraktion wiederholt, die in einer Menge verwendet wird, daß ungefähr ein entsprechender "ΔΑ" min " erhalten wird, der 50 % des "Δ A min "-Wertes beträgt.

Die "Antithrombin spezifische Aktivität" (a) des Heparins bekannter Wirksamkeit wird dann wie folgt berechnet:

(a) = ^-^ x 1.000

0,25

Die "Antithrombin spezifische Aktivität" (a¹) jeder Probe der zu prüfenden Heparin-Fraktion wird wie folgt berechnet:

Δ A - Δ Α"

(a¹) = χ 1.000

Gewicht der zu prüfenden Heparin-Probe

Der Titer jeder dieser geprüften Fraktionen in Internationalen Einheiten ist:

Wirksamkeit der geprüften Heparin-Fraktion = Titer des

Heparins mit

bekanntem Titer a'

D. Untersuchungen der antikoagulierenden Wirkung von Heparin (oder Fraktionen) gemäß der thromboelastographischen Methode

Das Prinzip der angewendeten Methode besteht darin, nach

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Recalcifizierung des Inhalts der Testtuben durch Zugabe von Calciumchlorid die mit den Testproben gemessenen Koagulationsperioden mit denen der Kontrollproben zu vergleichen, gemäß der thromboelastographischen Methode (TEG), beschrieben in "Biologie des hemorragies et des thrombo^ses", G. RABY, Ma-sson, Paris 1966, Seiten 186 bis 188.

Diese Technik nützt den übergang einer Blutzusammensetzung, die koaguliert wird, vom flüssigen in den festen Zustand. Das Prinzip der Methode besteht darin, ein Gefäß, in welches die zu untersuchende Zusammensetzung zuerst eingebracht wurde, einer oszillierenden Winkelbewegung zu unterwerfen und den Koagulationseffekt an einem Zylinder zu beobachten, der am Ende eines Torsionsdrahtes aufgehängt ist und in die Zusammensetzung eintaucht. Wenn die Koagulation beginnt, bewirkt das im Gefäß enthaltene Plasma eine entsprechende Schwingungsbewegung des Zylinders.

Die Koagulation wird zeitlich von dem Moment (t = 0) an verfolgt, an welchem die Aktivierung des für die Koagulation verantwortlichen Paktors durch die Zugabe von Calcium-Ionen unter den oben aufgezeigten Bedingungen erfolgt.

Im folgenden ist "r" die Induktionszeit, die dem effektiven Beginn der Koagulation vorausgeht; "ma" ist die maximale Amplitude der Oszillationen des Zylinders.

"k" ist das Zeitintervall von dem Moment an, an welchem der Zylinder zu oszillieren beginnt bis zu dem Moment, bei dem die Amplitude der Bewegung gleich 20 mm wird, wie dies unter den gleichen Bedingungen mit einem plättchenfreien (plateletfree) Plasma erhalten wird, dessen -fibrinogener Inhalt normal ist (3 bis 4 g pro 1.000).

Die "totale Koagulationszeit" der Zubereitung wird durch die Summe "r" + "k" festgesetzt.

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Die Kinetik der Koagulation wird durch die Parameter "r" und "r" + "k" und die Dynamik der Koagulation durch die maximale , Amplitude "ma" der Schwingungsbewegung des Zylinders ausgedrückt.

E. Thrombingerinnungszeit (TT)

2 μg der zu prüfenden Heparinprobe in 0,1 ml Saline wurden zu 0,9 ml eines frisch bereiteten plättchenarmen Plasmas (aus drei Spendern vereinigt) zugegeben. Eine Teilmenge (0,1 ml) wurde abgetrennt und unter dauerndem Rühren bei 37⁰C in einem elektromagnetischen Wasserbad inkubiert. Die Koagulation wurde durch Zugabe von 0,1 ml einer Thrombin-Saline-Lösung gestartet (ungefähr 1 NIH-Einheit, Standardeinheit des "National Institute of Health").

F. Aktivierte partielle Thromboplasmin-Zeit (Activated Partial Thromboplasmin Time, APTT) oder Kaolin-Cephalin-Zeit (KCT)

2 \ig des zu prüfenden Heparins in 0,1 ml Saline wurden zu 0,9 ml eines frisch zubereiteten plättchenarmen Plasmas gegeben. Eine Teilmenge (0,1 ml) wurde abgetrennt und dazu 0,1 ml einer Suspension von Cephalin (eine 1:10-Verdünnung in Michaelis-Puffer, pH 7,35, des handelsüblichen lyophilisierten Präparates, gelöst in 1 ml destilliertem Wasser) und 0,1 ml Kaolin-Suspension (5 mg/ml) zugegeben. Die Mischung wurde 3 min lang bei 37⁰C inkubiert und 0,1 ml einer bei 37⁰C vorinkubierten Calciumchlorid-Lösung (25 mM) zugegeben.

Die Gerinnungszeiten wurden festgestellt.

Die folgenden Beispiele und Resultate haben, unter Bezugnahme auf die Zeichnungen, selbstverständlich nur den Zweck einer weiteren Veranschaulichung.der Erfindung, ohne sie dadurch einzugrenzen. In den Zeichnungen bedeuten:

Fig. 1 bis 3 sind Beispiele für Elutionsdiagramme von Heparin

03G0U/0747

gemäß den verschiedenen Alternativen des erfindungsgemäßen Verfahrens,

Fig. 4 veranschaulicht die verschiedenen Elektrophoresediagramme, die unter den oben angegebenen Elektrophoresebedingungen mit einem handelsüblichen Heparin und mit einer erfindungsgemäß daraus abgetrennten Heparinfraktion erhalten wurden.

Die Fig. 5-10 veranschaulichen das Verhalten von Standard-Heparin und einer erfindungsgemäßen Fraktion in in vivo-Untersuchungen an Hunden und Affen.

Beispiel 1;

Ein Ausgangs-Heparin aus Schweinedarm (porcine pig intestine) wurde einer Ultragel-Fraktionierung gemäß der oben als "andere Alternative" des erfindungsgemäßen Prozesses definierten Methode unterworfen.

Die Ergebnisse werden in Fig. 1 aufgezeigt, die Kurven enthält, die für die Veränderungen der nachfolgend definierten Parameter, die auf den Ordinatenachsen als eine Funktion der Zahl der hintereinander aufgefangenen 5 ml-Elutionsfraktionen (ausgedrückt als "Röhrchenzahlen", tube numbers) enthalten sind, repräsentativ sind.

Kurve a zeigt die Veränderung des Heparin-Gehaltes in jeder der nacheinander folgenden Röhrchen, wobei der Gehalt (ausgedrückt in mg/ml) durch die polarimetrische Methode, wie sie oben unter "A) Gehalt von Heparin in nacheinander folgenden eluierten Fraktionen" definiert ist, bestimmt wurde.

Kurve b ist repräsentativ für die entsprechende Veränderung der "Anti-FXa-spezifischen-Aktivität", die mit Rücksicht auf das S-2222 Substrat bestimmt wurde.

0300U/0747

30H075

Kurve c ist repräsentativ für die entsprechenden Veränderungen der "Antithrombin spezifischen Aktivität", die mit Rücksicht auf das S-2238 Substrat bestimmt wurde.

Es wird darauf hingewiesen, daß die gleiche graphische Darstellungsweise für die Kurven der Fig. 2 und 3 gilt, die für die Veränderungen der gleichen Parameter repräsentativ sind.

Die Fraktionen LP₁₁, LP₁₂' ^LP2' ^LP31 ^unc^ ^LP32 ^entsprechen den verschiedenen "Röhrchengruppierungen" (grouping of tubes), die nach den erhaltenen Aktivitäten vorgenommen wurden. Die Fraktion LP₂ entspricht einer Gruppe von vorstehend definierten Fraktionen, die eine ausgeprägte maximale "Anti-FXa spezifische Aktivität" und maximale "Antithrombin spezifische Aktivität" zeigen.

Entsprechende antikoagulierende Wirkungen bei verschiedenen Standardtests werden in der nachstehenden Tabelle I aufgezeigt. Wie aus dieser Tabelle ersichtlich, werden besonders gute Ergebnisse mit der LP~-Fraktion erhalten.

030044/0747

30K07S

Tabelle I

	Ausgangs produkt	•	42.500 19.400	LP11	62	LP12	LP2	LP31	^32
Gewicht von Heparin (mg)	650		187	111	33	340	126	45
Antithrombin Aktivität (ü/mg) (S-2238)		117	202	201	234	209	156
Anti F Xa-Aktivität (U/mg) (S-2222)	0,62		458	455	335	111
Anti F Xa Aktivität	46"	1,82		1,94	1,60	0,71
Antithratibin Aktivität	30 'ml	40.800	2,28	18.600	13.100	8.500
Mol.-Gewicht (M.W.) (HPLC) Ausgangs-Md.-Gewf Hohes Mfc|.-Gew. Haupfcfraktion	90	25.500	146	167	97
Codex-Einheiten (U/mg) (D	26	166	319	79	32
Titel gemäß Yin & Wessler (ü/mg) (2)	0,29	126	2,18	0,47	0,33
Anti F XaAktivität (Yin & Wessler)	13"	0,76	> 10'	285"	-
USP Titel	33	70"	204	j> 200	27"
Thronibin-Zeit (in see) Codex 0,2 U/ml Plasma	46	43
Thrombelastogramm (r+k) (mm) Blut ohne Heparin : Einheiten Codex : 0,2 U/ Blut

(1) Franz. Codex (VIII. Ausgabe 1965, S. 560) an Schaf-Plasma, koaguliert nach Rekalzifizierung

(2) SIGMA, "Bulletin technique" (Technical Bulletin) Nr. 870, Januar 1975.

030044/0747

ORIGINAL INSPECTED

Beispiel 2:

Eine Ausgangsprobe von handelsüblichem Heparin (Ausgangsmaterial der nachstehenden Tabelle II) wurde wie im vorstehenden Beispiel behandelt. Es wurde eine LP^-Fraktion erhalten, deren Aktivitäten in der mit "Ausgangsprodukt" überschriebenen Spalte der nachfolgenden Tabelle II aufgezeigt sind.

Es wurde dann weiterhin gemäß der oben definierten "dritten Alternative" des erfindungsgemäßen Prozesses behandelt.

Fig. 2 enthält die Kurven, die den Veränderungen der bereits in Beispiel 1 definierten Parameter entsprechen, aber als Funktion des eluierten Volumens und nicht als Funktion der "Röhrchenzahlen" (tube numbers).

A und B der Tabelle II entspricht Volumina, die jeweils zusammengefaßt wurden.

Die Ergebnisse der Aktivitäten dieser zusammengefaßten Fraktionen A und B werden in der nachstehenden Tabelle II aufgezeigt.

Wie aus der Tabelle II und Fig. 2 ersichtlich, sind die aktivsten Fraktionen diejenigen, welche die höchste "Anti-FXa spezifische Aktivität" aufzeigen, wenn sie auch nicht diejenigen "Röhrchen" enthalten, welche die höchste "spezifische Antithrombin-Wirkung" aufzeigen, die in der Fraktion A zusammengenommen werden.

03CGU/0747

30U075

Tabelle II

	Ausgangs prcdukt	A	I	B
Heparin Gewicht (mg)	400	210	70
Antithroiiibin Aktivität (U/mg) (S-2238)	235,2	230,3	284,2
Anti F Xa Aktivität (U/mg) (S-2222)	250,2	181,7	448,4
Anti F Xa Aktivität
Antithrombin Aktivität (chromogenes Substrat)	14.800	13.900	16.700
Mol.-Gew. (HPIjC) Durchschnittliches Anfangs molekulargewicht	48" 115"	nicht dosiert	260"
TCK Physiologisches Wasser (Kon trolle) 2 μg Ausgangsprcdukt	43"		>10 min
Thrombin-Zeit (in see) 2 μg Ausgangsprcdukt	57 mm 28 mm 85 mm	269 mm unter den an gewandten Be dingungen nicht meßbar
Thrombelastogranm (mm) r k r + k amx

Q3ÜGU/0747

ORIGINAL INSPECTED

30U076

Beispiel 3:

Eine handelsübliche Heparinprobe (in der nachstehenden Tabelle III als RB 19072 bezeichnet) wurde einer Fraktionierung gemäß der "dritten Alternative" des erfindungsgemäßen Verfahrens unterworfen.

Fig. 3 ist typisch für die erhaltenen Elutionsdiagramme. Die Zeichen/^" oder \^\auf der Ordinatenachse und den Kurven sollen bloß den großen Zuwachs der Aktivitäten aufzeigen, die für einige der Fraktionen beobachtet wurden, und der auf andere Weise nicht in der Zeichnung aufgenommen werden konnte aufgrund des bereits für die niederen Aktivitäten großen Maßstabes .

Verschiedene Fraktionen wurden zusammengenommen und bilden die vereinigten Fraktionen RB 19067, RB 19068, RB 19069 und RB 19070. Bemerkenswert ist die Tatsache, daß die aktivsten Fraktionen mit dem auf das S-2222 Substrat bezogenen Hemmeffekt (RB 19070) wesentlich verschieden sind von den aktivsten Fraktionen mit dem auf das S-2238 Substrat bezogenen Hemmeffekt.

Vergleichende antikoagulierende Wirkungen in vitro des Ausgangs-Heparins (RB 19072) und der erfindungsgemäßen Fraktion (RB 19070) werden in der nachstehenden Tabelle III aufgezeigt.

In dieser Tabelle bedeuten:

TT die gemessenen Thrombin-Zeiten,

TCK die gemessene "Cephalin-Kaolin-Zeit", die ein Äquivalent zum bekannten "aktivierten partiellen Prothrombin-Test" (Activated Partial Prothrombin Test, APTT) ist.

Tabelle III zeigt den starken Zuwachs der Antikoagulanz-Eigenschaften von RB 19070 gegenüber dent RB 19072.

OSCöU/0747

30U076

Tabelle III

	in mm	r	•in iran	RB 19072	RB 19070	-	173
; Gewicht 1C	r + k)	k		g (anfänglich)	1,674 g (erhalten)		106
JA Antithr. (S-2238;	C TEG (2 μg/Inl) an gesundem	r + k _				250
. u/mg)	menschlichem Blut -		257	382
AntiXa (S-2222; u/mg)	Durchschnittswerte aus	294,5	531,7
Mol.-Gew. (HPIiC)	10 Untersuchungen	14.900	19.600
Codex (IU)	186	200
Elektrophorese-Diagraititi	Diagramm des RB 19072	verschieden von dem des RB 19065
OSo3~/COO~	1,89	2,20
B TT (2 ug/inl) in see.	45	122
TCK (2 ug/ml) in see.	267	^900
TEG (2 ug/ml) r'	60	102
k'	52	87
	112	189
67
48
1T5

Q3GOU/0747

3QU076

Ähnliche Ergebnisse werden in vivo beobachtet. Die nachfolgende Tabelle IV zeigt die Ergebnisse, die mit männlichen Kaninchen gemäß dem unten stehenden Protokoll erhalten wurden.

Männliche Neuseeland-Kaninchen mit einem Durchschnittsgewicht von 3 kg wurden in zwei Gruppen geteilt, wobei jede Gruppe 4 Kaninchen umfaßte.

Der ersten Gruppe wurde das handelsübliche Ausgangs-Heparin (RB 19072) intravenös in einer Menge von 2,5 mg/kg mit einem Volumen von 2 ml injiziert.

Der zweiten Gruppe wurde auf gleiche Weise die Fraktion 19070 verabreicht.

Den Tieren wurde nach Standardverfahren 1 h, 3 h und 6 h nach den Injektionen Blut entnommen. Nach den üblichen Verfahren wurden die Thrombin-Zeit (TT), die Howell-Zeit (TH), die Cephalin-Kaolin-Zeit (TCK) und die thromboelastographischen Werte (TEG) bestimmt.

Die für jede Gruppe erhaltenen Durchschnittswerte sind in der nachfolgenden Tabelle IV aufgezeigt.

OCijCU/0747

ORIGINAL INSPECTED

-■■je*-

Tabelle IV

30U075

	Anfänglich	1 h	3 h	6 h	0
RB 19072					159
TT (Heparinemia) u/ml)	O	0,77	0,05	0	24
TH (sec.)	129	606	156	184	18
TCK (sec.)	24	93	31	26	10
TEG r (ram)	12	noch nicht koaguliert	32	17	28
k (mn)	5	Il	23	9	513.000
r + k (mm)	18	Il	56	27	58
Plättchen ,(Zahl)'	443.500	467.000	502.750	462.250
Yin & Wessler (sec.)	51	69	52	53
RB 19070
TT (Heparinemia) u/ml)	0	1,05	0,65
TH (sec.)	138	_>2044	373
TCK (sec.)	21	479	92
TEG r (mm)	16	noch nicht koaguliert	(141)
k (um)	8	Il	ND
r + k (um)	24	Il	ND
Plättchen (Zahl)	527.500	520.250	528.000
Yin & Wessler (sec.)	51	98	71

Q30044/0747

ORIGINAL INSPECTED

30ΗΠ76

Die folgenden Beobachtungen können gemacht werden:

Die erfindungsgemäße Fraktion zeigt Antikoagulans-Eigenschaften, die in allen in Betracht gezogenen Tests deutlich höher sind als die des handelsüblichen Ausgangs-Heparins.

Der erhaltene Heparinemia-Wert ist nach der ersten Stunde höher; die Differenz ist sogar nach 3 h höher. In dem von den entsprechenden Kaninchen 3 h nach der Injektion entnommenen Blut war nur mehr sehr wenig des handelsüblichen Heparins enthalten. Unter den gleichen Bedingungen waren aber von den erfindungsgemäßen Fraktionen noch wesentliche Mengen vorhanden (0,65 IU pro ml Plasma).

Die gleichen Beobachtungen werden bei den anderen geprüften Antikoagulations-Faktoren gemacht. Die bei TEG beobachteten nicht signifikanten Unterschiede werden nur der Tatsache zugeschrieben, daß unter den angewandten experimentellen Bedingungen die Beobachtungsζeiten nicht lange genug waren.

Ähnliche Resultate werden bei Hunden erhalten.

Es wurde weiterhin gefunden, daß im Gegensatz zu handelsüblichem Heparin die erfindungsgemäßen Fraktionen keine thrombocytopene Aktivität in denjenigen menschlichen Plasmas zeigen, bei denen eine Empfindlichkeit gegenüber handelsüblichem, in der Therapie verwendeten Heparin gefunden wurde.

Ein weiterer Unterschied zwischen den erfindungsgemäßen Fraktionen und handelsüblichem Heparin wird in den verschiedenen elektrophoretischen Diagrammen gefunden, welche sie unter den bereits definierten Bedingungen zeigen.

Diese verschiedenen Diagramme werden in Fig. 4 veranschaulicht, welche die elektrophoretischen Diagramme von RB 19072 (Kurve d) und von RBC 19070 (Kurve c) zeigt. Der Pfeil f zeigt die

0300AA/0747

ORIGINAL INSPECTED

Wanderungsrichtung an. Zur Sichtbarmachung des elektrophoretischen Musters wurden übliche Farbstoffe und photometrische (densitometrische) Mittel verwendet.

Andere biologische Eigenschaften der erfindungsgemäßen Fraktionen

Die folgenden Untersuchungen wurden mit einer als "Fraktion D" bezeichneten Fraktion ausgeführt, die durch Vereinigung der als RB 19069 und RB 19070 der Fig. 3 bezeichneten Subfraktionen erhalten wurde.

1. Affinität zu Antithrombin III

Affinitätschromatographische Untersuchungen wurden durchgeführt, um das Affinitätsverhalten der "Fraktion D" an einer "Sepharose"-immobilisierten Antithrombin-III-Säule zu untersuchen. Die Antithrombin-III-"Sepharose"-Säule (1,6 χ 12 cm) (mit einem Proteingehalt von ca. 10 mg/ml der endgültigen Gel-Suspension) wurde bei 4⁰C mit Tris-Puffer (0,1 M, pH 7,4, 0,2 molares Natriumchlorid/wie von Höök et al. (FEBS Lett 66,90, 1976) beschrieben, äquilibriert. Eine Probe der "Fraktion D" (2,76 mg in 500 μΐ der gleichen Lösung) wurde auf die Säule aufgebracht und dann hintereinander mit Pufferlösungen , die 0,2 molares Natriumchlorid und 2 molares Natriumchlorid enthalten, eluiert. Die Auffanggefäße (1 ml) wurden durch polarimetrische Messungen bei 365 nra, durch die Carbazol-Reaktion (Bestimmung des Gewichtes) und durch Prüfung ihrer Hemmkapazität gegenüber Thrombin- und FXa-katalysierter Amidolyse der chromogenen Substrate S-2238 oder S-2222 überwacht. Kein Material und keine Aktivität wurden in der Durchbruchsfraktion, die mit 0,2 molarem Natriumchlorid eluiert wurde, gefunden, während die Aktivität gegenüber S-2238 oder S-2222 bei der Elution mit 2 molarem Natriumchlorid im Hinblick auf Gewicht und Aktivität in vollem Ausmaß

030OA4/0747

ORIGINAL INSFECTED

30U?76

zurückerhalten wurde.

Diese Ergebnisse zeigen, daß die Subfraktion D sich bei der Affinitätschromatographie wie ein hochaffines Heparin verhält.

2. Hemmeffekte gegenüber den Faktoren XI und XII

Die Hemmwirkungen der erfindungsgemäßen Fraktion wurden ■ im Vergleich zu denen von Standard-Heparin nach der folgenden Methode bestimmt:

Die Koagulationszeit (gemessen durch APTT) eines normalen menschlichen Piasmgs wurde mit einem Reaktionsgefäß a gemessen. Das Ergebnis wurde mit 100 % angenommen.

In ein Gefäß b wurde ein Substrat, das aus menschlichem Plasma mit einem Mangel an Faktor XI oder XII (was von dem entsprechenden Versuch abhängt) erhalten wurde, gegeben, und dann die Menge Q von normalem menschlichem Plasma, welches eine normale Koagulationszeit verursacht (100 % der zurückzugewinnenden Mischung).

In ein Gefäß c, welches menschliches Plasma mit einem Mangel an Faktor XI oder XII enthält, wurde normales Plasma und eine Menge der erfindungsgemäßen Fraktion (bis zu einer Konzentration von 2 μg/ml Plasma) gegeben und die Koagulationszeit gemessen und in % bezogen auf den oben erwähnten 100 %-Wert des Kontrollgefäßes a ausgedrückt.

Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

APTT (see.) .Faktor XII Faktor XI

Fraktion D > 300 29 % 33 %

Heparin ^400 86 % 47 %

Plasma 29,7 100 % 43 %

03G0U/0747

ORIGINAL INSPECTED

30H073

Die obenstehende Tabelle zeigt, daß die Fraktion D im Hinblick auf den Faktor XII und, obgleich in einem begrenzteren Ausmaß, auf Faktor XI besonders aktiv ist, und größer als Standard-Heparin. So ist sie befähigt, die enzymatischen Reaktionen an den Faktoren XII und XI, welche schließlich die Fibrinbildung, und damit die Koagulation des Plasmas verursachen, selektiv und in einem bestimmten Ausmaß zu hemmen.

3. Versuche mit dem Plättchenfaktor IV (platelet factor IV)

Die Fraktion D wird bei einer Konzentration, bei welcher Standard-Heparin in vitro durch den Plättchenfaktor IV neutralisiert wird, nicht neutralisiert, wie dies durch Vergleichstests in vitro festgestellt wurde, indem man bei 37⁰C 10 min lang Reaktionsgefäße inkubiert, die ein Plasma enthalten, welches reich an Plättchen ist und zu welchen 0,1 ml, die 0,1 μg einer der zu testenden Fraktionen enthalten, zugegeben werden.

In dem Reaktionsgefäß, welches das Standard-Heparin enthält, wurde keine Verlängerung der Koagulationszeit, gemessen durch APTT oder TT, festgestellt. Im Gegensatz dazu wurde in den Reaktionsgefäßen, welche die "Fraktion D" enthalten, eine deutliche Verlängerung der Koagulationszeit beobachtet.

4. In vivo-Experimente

Gesunde männliche Mischlingshunde (mongrel dogs) mit einem Gewicht von 15 bis 20 kg wurden in vier Gruppen zu je vier Tieren eingeteilt. Das Koagulationsprofil jedes Tieres wurde beobachtet und Basislinienwerte für die aktivierte partielle Thromboplastin-Zeit (APTT) und die Throm^eit (TT) wurden erhalten. Stammlösungen von 10 mg/ml Heparin und der "Fraktion D" wurden in einer sterilen Salzlösung

03ÖO44/07A7

ORIGINAL INSPECTED

-*- 30HO

hergestellt. Das Heparin wurde langsam in die Vene injiziert. Zwei Gruppen der Tiere erhielten Natriumheparin in einer Dosis von 1,0 mg/kg und 2,5 mg/kg, während die anderen Gruppen die "Fraktion D" mit einer Dosis von 1,0 mg/kg und 2,5 mg/kg erhielten. Die Figuren 5 und 6 sind typisch für die beobachteten Veränderungen von APTT (in see.) gegenüber der Zeit (in h) in Gegenwart von Heparin (Kurve a) und von "Fraktion D" (Kurve b).

Ähnliche Untersuchungen wurden an Affen durchgeführt, welche entweder die "Fraktion D" oder Standard-Heparin in Dosen von 1 mg/kg (Fig. 7) oder 2,5 mg/kg (Fig. 8) intravenös oder 2,5 mg/kg (Fig. 9) oder 5 mg/kg (Fig. 10) subkutan erhielten.

In allen diesen Figuren sind die Kurven a typisch für die beobachteten Effekte unter der Wirkung von Standard-Heparin; die Kurven b für die beobachteten Effekte unter der Wirkung der "Fraktion D". Die Ergebnisse werden in Form der Veränderungen von APTT (Fig. 7, 8 und 10) oder von TT (Fig. 9) in see. als Funktion der Zeit in h aufgezeigt.

Blutproben wurden in ein 3,8%iges Natriumcitrat-Antikoagulans (9 Teile Blut, 1 Teil Natriumeitrat) nach 1,2, 3, 4 und 6jtündigen Intervallen eingebracht, sofort bei 2.500 g zentrifugiert und sofort auf ihre Koagulationsprofile und Heparinspiegel durch chromogene (Kabi, Stockholm) und fluorogene (Dade, Miami, Florida) Substratmethoden untersucht.

Die Antikoagulans-Wirkung und die Pharmacokinetik einer 1,0 mg/kg-Dosis von Heparin bei Hunden und sein Vergleich mit der Subfraktion D werden in Fig. 5 gezeigt. Eine 6-fache Zunahme in den APTT-Werten wurde bei Hunden be-

030044/0747

ORIGINAL INSPECTED

obachtet, die mit "Fraktion D" behandelt wurden, während nur eine zweifache Zunahme in der Gruppe beobachtet wurde, die mit Natriumheparin behandelt wurden. Beide Gruppen zeigten eine Verringerung der APTT-Werte nach 2 h; jedoch zeigte die "Fraktion D" noch eine starke antikoagulierende Wirkung. Beide Gruppen von Hunden erreichten nach 5 h fast den Vorbehandlungswert.

Die Ergebnisse von ähnlichen Untersuchungen mit 2,5 mg/kg werden in Fig. 6 veranschaulicht. Nach einer 1-stündigen Periode zeigten sowohl Natriumheparin als auch die "Fraktion D" einen APTT-Wert von über 100 see. Nach 2 h zeigte die Gruppe, die mit Natriumheparin behandelt wurde, einen markanten Abfall in den APTT-Werten und kehrte zunehmend zu den Vorbehandlungswerten zurück. Nach 6 h getestete Proben zeigten fast normale APTT-Werte. Im Gegensatz dazu blieben die APTT-Werte bis zu 3 h oberhalb von 100 see. in der Gruppe, die mit 2,5 mg/kg der "Fraktion D" behandelt wurden. Die Hunde zeigten einen Antikoagulans-Zustand (APTT größer als 100 see.) bis zu 5 h, und zeigten außerdem bis zu 10 h einen erhöhten PTT-Wert. Die nach 24 h getestete Gruppe zeigte fast keine Antikoagulans-Aktivität.

Ähnliche Ergebnisse wurden, wie in den Fig. 7 bis 10 gezeigt, mit Affen erhalten, wodurch gezeigt wird, daß Schlußfolgerungen an Hunden gleicherweise auch auf Affen übertragen werden können. Die letzteren stellen besonders zuverlässige Modelle dar, welche Ergebnisse liefern, die vernünftig auf die an Menschen erhaltenen extrapoliert werden können, da die Heparinisierung und Antithrombin III an Menschen und Primaten ähnlich wirken, insbesondere an macaca mulatta.

Ähnliche Resultate können aus der intravenösen Pharmacokinetik der "Fraktion D" und Standard-Heparin bei Dosen

030Ö44/O747

ORIGINAL INSPECTED

30HC76

von 0,25 mg/kg, 0,50 mg/kg, 1,0 mg/kg und 2,0 mg/kg mittels APTT, standardisierter Thrombin-Zeit und den Heparinspiegeln für Zeitperioden bis zu 24 h erhalten werden. Die "Fraktion D" zeigt dabei bei allen verschiedenen Ausführungsformen eine wesentlich stärkere antikoagulierende Wirkung als das Standard-Heparin. Obgleich die Eliminations-Kinetik der 0,25 mg/ kg und 0,50 mg/kg-Dosen für die "Fraktion D" und Standard-Heparin identisch sind, zeigt die "Fraktion D" eine sehr starke anfängliche antikoagulierende Reaktion, während nur eine geringe antikoagulierende Reaktion mit Standard-Heparin beobachtet wurde. Titrationsuntersuchungen zeigten, daß die "Fraktion D" in Konzentrationen von 0,25 bis 0,35 mg/kg die gleiche antikoagulierende Reaktion zeigt wie 1,0 mg/kg von Standard-Heparin. Intravenöse Injektionen in Dosen von 0,5 mg/kg zeigten einen sehr stark verlängerten antikoagulxerenden Effekt. Die "Fraktion D" zeigte die folgende Wirkungsdauer: 0,5 mg/kg: 2 bis 3h; 1,0 mg/kg: 5 bis 6 h und 2,0 mg/kg: 7 bis 9h, während die antikoagulierende Wirkung des Standard-Heparins nur eine relativ kürzere Zeit anhielt.

Diese Untersuchungen zeigen, daß die erfindungsgemäßen Fraktionen starke antikoagulierende Mittel sind (3-bis 5mal stärker als Standard-Heparin) und daß ihre Eliminationskinetik verschieden ist von der des Standard-Heparins .

Beispiel IV (Beschickungsansatz):
1. Materialien:

-10g Ausgangssubstanz (Natriumheparin, isoliert aus

Schweinen )
- DEAE-Sephacel (registriertes Warenzeichen): 1 1, äquilibriert mit einer Tris-HCl-Pufferlösung (50 inM, pH 7,0),

3CCU/0 7 47 ORIGINAL INSPECTED

die 400 mM Natriumchlorid enthält.

- chromogenes Substrat (Kabi): S-2238; S-2222

2. Arbeitsbedingungen

10 g Heparin wurden in 1000 ml Tris-Puffer (50 mM, pH 7,0)gelöst, der 400 mM Natriumchlorid und 0,02 % Natriumazid enthält. Die Lösung wurde mit "DEAE-Sephacel" unter Rühren in Kontakt gebracht. Das Rühren wurde 1 h lang fortgesetzt.

Die folgenden Elutionen wurden hintereinander ausgeführt:

- Mit dem gleichen Puffer enthaltend 400 mM Natriumchlorid: das Gesamtvolumen der Elution war 2,030 ml. Die erhaltene Fraktion wurde als LP.. bezeichnet

- mit dem gleichen Puffer enthaltend 550 mM Natriumchlorid: das Gesamtvolumen der Elution war 3,465 ml. Die Fraktion wurde mit LP- bezeichnet

- mit dem gleichen Puffer enthaltend 600 mM Natriumchlorid: das Gesamtvolumen der Elution war 2,470 ml, die Fraktion wurde mit LP₃ bezeichnet

- mit dem gleichen Puffer enthaltend 1000 mM Natriumchlorid: das Gesamtvolumen der Elution war 1300 ml. Die Fraktion wurde als LP* bezeichnet.

An den erhaltenen Fraktionen wurden die folgenden Versuche ausgeführt:

- Bestimmung der Hemmaktivität gegenüber FXa-katalysierter Amidolyse von Substrat S-2222 wie oben beschrieben. Die Hemmwirkungen wurden an den Fraktionen vor ihrer Konzentrierung bestimmt.

- Blutgerinnungsmessungen:

TT (Thrombin-Zeit) und APTT (Kaolin-Cephalin-Zeit).

03CC44/0747

ORIGINAL INSPECTED

30HCT3

Diese Untersuchungen wurden an den Eluaten ausgeführt, die mit 1,5 Volumenteilen Äthanol (Vol./Vol.) gefällt wurden. Die Fällungen wurden durch Filtration an gesinterten Glasscheiben (Nr. 4) abgetrennt und nacheinander mit Aceton und Äther gewaschen. Die erhaltenen Präparate wurden im Vakuum getrocknet. Sie enthalten noch 5 bis 10 % Natriumchlorid. Ihre Gewichte sind die folgenden:

LP₁ : 1.940 g

LP₂ : 4.46 0 g

LP₃ : 1.600 g {*)

LP₄ : 1 .500 g (*)

(*) Diese zwei Präparate wurden 24 h lang gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert. Sie enthalten kein nachweisbares Salz.

Beispiel V:

A) Materialien

Eine Säule von K100/100 mit DEAE-SEPHACEL (registriertes Warenzeichen) hat die folgende Charakteristik: Die Dimensionen des verwendeten Säulenvolumens: 10 χ 62 cm Gelvolumen 4.870 ml

-1

lineare Fließgeschwxndxgkext 10 cm h

"Leervolumen" ("dead volume", verwendetes

Säulenvolumen minus Gelvolumen) 4100 ml

Pufferlösungen:
*) TRIS-Puffer (50 mMol, Natriumchlorid 400 mM, Natriumazid 0,02 %, pH-Wert 7,0), als "0,4 M-Puffer" bezeichnet;

b) TRIS-Puffer (50 mMol, Natriumchlorid 600 mM, Natriumazid 0,02 %, pH-Wert 7,0), als "0,6 M-Puffer" bezeichnet;

c) TRIS-Puffer (50 mMol, Natriumchlorid 650 mM, Azid 0,02 %, pH-Wert 7,0), als "0,65 M-Puffer" bezeichnet;

d) TRIS-Puffer (50 mMol, Natriumchlorid 1000 mM, Azid 0,02 %, pH-Wert 7,0), als "1 M-Puffer" bezeichnet.

03CCU/0747

ORIGINAL INSPECTED

30U07S

Das handelsübliche Heparin war von therapeutischer Reinheit.

B) Arbeitsbedingungen:

60 g Heparin wurden in 500 ml des 0,4 M-Puffers gelöst und die Lösung in die Säule gebracht. Die folgenden Volumina der entsprechenden Pufferlösungen wurden nacheinander mit Hilfe einer Pumpe durch die Säule durchlaufen gelassen:

2.000 ml von "0,4 M-Puffer"

6.500 ml von "0,6 M-Puffer"

4.500 ml von "0,65 M-Puffer"

6.600 ml von "1 M-Puffer"

Folgende Volumina wurden nacheinander eluiert:

1.: Von 0 bis 4.100 ml "Leervolumen", welches verworfen wurde

2.: Von 4.101 bis 6.600 ml, 0,4-M-Fraktion, als LP₁

bezeichnet

3.: Von 6.601 bis 13.100 ml, 0,6-M-Fraktion, als LP₂

bezeichnet

4.: Von 13.101 bis 17.600 ml 0,65-M-Fraktion, als LP₃

bezeichnet

5.: Von 17.601 bis 18.100 ml 1-M-Fraktion, als LP₄₁

bezeichnet

6.: Von 18.101 bis 18.600 ml 1-M-Fraktion, als LP₄₂

bezeichnet

7.: Von 18.601 bis 19.100 ml 1-M-Fraktion, als LP₄₃

bezeichnet

8.: Von 19.101 bis 19.600 ml 1-M-Fraktion, als LP₄₄

bezeichnet.

Die "1-M-Fraktionen" bilden die aktivsten Fraktionen. Unter gewissen Umständen ist die allerletzte Fraktion "LP₄₄" weniger aktiv und kann verworfen werden.

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ORIGINAL INSPECTED

Die erfindungsgemäßen Fraktionen sind in der Therapie der Koagulationskontrolle von sehr hohem Nutzen, auf alle Fälle dort, wo die Verwendung von Heparin empfohlen wird. Aufgrund ihrer hohen Aktivitäten können die erfindungsgemäßen Fraktionen in kleineren Mengen verwendet werden und die Intervalle zwischen den einzelnen Injektionen vergrößert werden. Sie sind insbesondere nützlich bei Patienten, bei denen eine Aktivierung der Koagulation beobachtet wurde, die oft eine unvermittelte ist und die dazu neigt, in einen Hyperkoagulationszustand überzugehen, der die Gegenwart von Thrombin im Kreislaufsystem mit einbezieht, unabhängig davon, ob eine Thrombose feststellbar ist oder nicht.

Die Erfindung betrifft auch ganz allgemein die verschiedenen brauchbaren Derivate, welche die genannten Fraktionen bilden können, insbesondere ihre Metallsalze, d.h. entweder einfache Salze, wie z.B. Natrium-, Kalium- Calcium-oder Magnesiumsalze der genannten Fraktionen, oder gemischte Salze, die zumindest zwei der vorgenannten metallischen Kationen in einem beliebigen Verhältnis zueinander enthalten.

Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zubereitungen, in welchen die genannten Fraktionen mit einer pharmazeutischen Trägersubstanz vereinigt sind, insbesondere sterile Lösungen für subkutane oder intravenöse Injektionen, die die erfindungsgemäße Fraktion in einer solchen wirksamen Dosis enthalten, daß sie im Menschen Hypo- oder Antikoagulation hervorruft.

Die Erfindung betrifft auch sterile Lösungen zur Inhalation für die Behandlung von Kopfweh. Sie betrifft auch andere pharmazeutische Zubereitungen, wie z.B. Suppositorien oder Liposome.

Es ist klar, daß die effektive Dosis in jedem Fall durch

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den Arzt aufgrund der spezifischen Pathologie oder des allgemeinen Gesundheitszustandes des Patienten bestimmt werden muß. Deshalb sind die folgenden Grenzen der täglichen Dosen nichts anderes als eine vorläufige Richtlinie für den Benutzer der erfindungsgemäßen Fraktionen. So können die täglichen Dosen, die ein- bis dreimal am Tag verabreicht werden, bei intravenöser Anwendung von ein bis sechsmal reichen, oder, bei subkutaner Anwendung, von ein- bis dreimal, oder die Menge kann bei Verabreichung in Form von Liposomen 0,075 bis 0,60 mg/kg betragen.

In einer sterilen Inhalationslösung beträgt die Dosis 2 bis 5 mg - ein- bis zweimal pro Woche.

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ORIGINAL INSPECTED

Claims (1)

1. Patentanwälte Dipl.-Ing. H. Weickmann, Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke

   Dipl.-Ing. F. A."Weιckmann, Dipl.-Ckem. B. Huber Dr. Ing. H. Liska 3014076

   H/SM/HL ⁸⁰⁰° MÜNCHEN 86, DEN ; ·„.

   POSTFACH 860820 MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 39 21/22

   CHOAY S.A.

   48, avenue Theophile-Gautier 75782 Paris-Cedex 16 / Frankreich

   Heue Eepaz-in-Jraktionen mit erhöhter Antikoagulsns-Vfiriung

   Patentansprüche

   Heparin-Fraktion mit antikoagulierenden Eigenschaften, die aus einem Heparinpräparat mit Molekulargewichten von 5.000 bis 50.000 erhalten werden kann ., dadurch gekennzeichnet, daß man eine wässrige gepufferte Lösung dieses Heparinpräparates, deren pH-Wert von 6,5 bis 7,5 reicht, und die ein Salz enthält, welches der gepufferten Lösung · eine Ionenstärke verleiht, die geringer ist als die einer entsprechend^0,6 M gepufferten Natrxumchloridlösung, mit einem Anxonenaustauscherharz in Kontakt bringt, aus diesem Harz die Heparin-Fraktionen, die durch die obengenannte gepufferte Lösung, die frei ist von Heparin und eine Ionenstärke besitzt, die geringer ist als die der genannten 0,6 M gepufferten Natrxumchloridlösung, eluiert, und dann die noch zurückgehaltene Fraktion mit einer entsprechenden gepufferten Lösung eluiert, die eine Ionenstärke besitzt, die höher ist als die der genannten 0,6 M gepufferten Natrxumchloridlösung.

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   ²· ' Heparln-Frafctioa - nach Anspruch 1

   dadurch gekennzeichnet, daß das anionische Harz ein Cellulose- oder Dextran-Gerüst besitzt, welches Aminoalkyl- oder Amino-hydroxy-alkyl-Gruppen trägt.

   3. ; ν HepaTin-IPraurfcion nach Anspruch 1

   dadurch gekennzeichnet, daß das anionische Harz ein Cellulose- oder Dextran-Gerüst besitzt, welches Diaminoäthyl-Gruppen mit der Struktur -C₃H₄NH(C₂H₅! oder Diäthyl-2-hydroxypropylammonium-Gruppen der Struktur:

   -C₃H₄-N (C₂H₅J₂-CH₂-CH(CH₃)OH trägt.

   4. Heparin-Fraktion nach Anspruch 3, die dadurch erhältlich ist, daß man von 10 ml einer Anfangslösung, die 1 g handelsübliches Heparin in einer gepufferten Lösung (Phosphat 0,05 M, pH 6,8, Natriumchlorid 0,4 M) enthält, ausgeht, diese 10 ml Lösung auf eine Säule des genannten Harzes bringt (Höhe 28 cm, Durchmesser 2 cm), die mit der gepufferten Lösung äquilibriert ist, dann die Heparin-Ausgangslösung chromatographisch mittels der gleichen gepufferten Lösung bei einer Elutionsgeschwindigkeit von 36 ml pro h und einer Temperatur von 4⁰C entwickelt, die ersten 500 ml Eluat abtrennt und entfernt, dann während der nächsten 800 ml eluierter Lösung gradientenweise die Natriumchlorid-Konzentration des Elutionsmittels von 0,4 bis auf 1,4 M steigert, und die gewünschten Heparin-Fraktionen, die in den eluierten Fraktionen enthalten sind, die eine Natriumchlorid-Konzentration größer 0,65 M besitzen, —^-r.— =—-—- gewinnt.

   5. Die Heparin-Fraktionen gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie im wesentlichen aus den eluierten Fraktionen bestehen, die eine Natriumchlorid-Konzentration von

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   -3- 30U07B

   0,70 bis 0,90 M besitzen.

   6. Heparin-Fraktion nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man von 30 ml einer Ausgangslösung (Tris 50 mM, Natriumazid 0,02 %, pH-Wert 7,0, Ausgangswert der Natriumchlorid-Konzentration 0,4 M) ausgeht, die 10g handelsübliches Heparin enthält, 30 ml dieser Lösung auf eine Säule des genannten Harzes (Durchmesser 18 cm, Höhe 6,8 cm), welches mit der genannten gepufferten Lösung äquilibriert ist, aufbringt und die Ausgangslösung des Heparins mit Hilfe der gleichen gepufferten Lösung bei einer Elutionsgeschwindigkeit von 75 ml/h und einer Temperatur von 4⁰C chromatographisch entwickelt, die ersten 300 ml eluierte Flüssigkeit abtrennt und entfernt, dann die Natriumchloridkonzentration des Elutionsmittels von 0,4 M auf 1,0M gradientenweise mit einer solchen Geschwindigkeit erhöht, daß die obere Grenze nach 24 h erreicht wird, und die gewünschten Heparin-Fraktionen, die in den eluierten Heparin-Fraktionen enthalten sind, die eine Natriumchlorid-Konzentration von mindestens 0,55 M besitzen, gewinnt.

   7. Heparin-Fraktion nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie im wesentlichen aus den eluierten Fraktionen besteht, die eine Natriumchloridkonzentration von mindestens 0,59 M besitzen.

   .dadurch gekennzeichnet_t daß man.,

   8. Heparin-Fraktion^ T von einer Ausgangslösung von 650 mg

   Heparin (das vorzugsweise eine Aktivität von ca. 160 + 20 U/ mg und Molekulargewichte von ca. 5.000 bis ca. 50.000 besitzt) in 2 ml einer gepufferten wässrigen Lösung (Natriumchlorid 0,3 M, pH-Wert 6,8) ausgeht, 2 ml der Lösung auf eine Säule von "ültrogel Aca 54"-GeI (2,6 χ 100 cm), die mit dem gleichen Puffer äquilibriert ist, aufbringt und das Ausgangs-Heparin mit der gleichen gepufferten Lösung bei einer Elutionsgeschwindigkeit von 20 ml/h und einer Temperatur von 4⁰C chromatographisch entwickelt, und die

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   -4- 30U076

   eluierte Flüssigkeit in aufeinanderfolgende 5 ml-Fraktionen trennt und die gewünschten Heparin-Fraktionen, die in der 53. bis 86. auf diese Weise aufgefangenen 5 ml-Fraktionen enthalten sind, gewinnt.

   9. Heparin-Fraktion, erhältlich durch eine Kombination der Verfahren von Anspruch 1 und 8.

   10. Heparin-Fraktion nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie im Hinblick auf die Verringerung der Hydrolysegeschwindigkeit eines Substrates aus Benzoylisoleucin-glutaminsäure-glycin-arginin-p-nitroanilid-Hydrochlorid (S-2222-Substrat) in vitro durch den Faktor Xa, erhalten durch Aktivierung des Faktors X in Gegenwart von Antithrombin III und der genannten Heparin-Fraktion, eine Aktivität von mindestens 300 u/mg zeigt.

   11. Heparin-Fraktion nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie im Hinblick auf die oben definierte Verringerung der Hydrolysegeschwindigkeit des S-2222-Substrats eine Aktivität von mindestens 450 u/mg zeigt.

   12. Heparin-Fraktion nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie im Hinblick auf die oben genannte Verringerung der Hydrolysegeschwindigkeit des S-2222-Substrats eine Aktivität von mindestens 500 u/mg zeigt.

   13. Heparin-Fraktion nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie im Hinblick auf die Verringerung der Hydrolysegeschwindigkeit eines Substrates aus H-D-Phenylalanin-L-pipecolyl-L-arginin-p-nitroanilid-Dihydrochlorid durch Thrombin in Gegenwart von Antithrombin III und der genannten Heparin-Fraktion in vitro eine Aktivität von weniger als 400 u/mg zeigt.

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   30U076

   14. Heparin-Fraktion nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie

   - im wesentlichen vollkommen durch Ant!thrombin III fixiert wird,

   - zumindest teilweise die Blutfaktoren XI und XII hemmt,

   - durch den Plättchenfaktor IV nicht in einem großen Ausmaß gehemmt wird,

   - keine thrombocytopene Wirkung zeigt.

   15. Heparin-Fraktion mit starken antikoagulierenden Eigenschaften, gekennzeichnet durch die folgenden Charakteristika: Sie wird an einem Harz mit einem Cellulose- oder Dextran-Gerüst, welches Diaminoäthylgruppen der Struktur (C₂Hc)₂ oder Diäthyl-2-hydroxy-propylammonium-

   Gruppen der Struktur:

   C₂H₅ OH

   -C₀H₄ -N⁺- CH₀ - CH

   ²⁴I ²I

   C₂H₅ CH₃ trägt,

   wenn sie in der Form einer gepufferten Lösung mit einem pH-Wert von 6,5 bis 7,5 und einer Natriumchlorid-Konzentration, die geringer als 0,6 M ist, vorliegt , zurückgehalten;

   - sie zeigt im Hinblick auf die Verringerung der Hydrolyserate eines Substrats aus Benzyl-isoleucin-glutaminsäure-glycin-arginin-p-nitroanilid-Hydrochlorid (S-2222-Substrat) in vitro durch den Faktor Xa, erhalten durch Aktivierung des Faktors X in Gegenwart von Antithrombin III und der genannten Heparin-Fraktion, eine Aktivität von mindestens 300 u/mg

   - sie besitzt Molekulareinheiten mit Molekulargewichten von 17.000 bis 25.000, die mittels Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie durch Messung der Retentionszeiten im Vergleich zu unter gleichen Bedingungen eluierten Polystyrol-Natriumsulf ona ten mit standardisierten Molekular-

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   30H076

   gewichten von 1.600, 4.000, 6.500, 16.000, 31.000, 65.000 und 88.000 bestimmt wurden,

   - sie wird im wesentlichen vollständig durch Antithrombin III fixiert

   - sie hemmt zumindestens teilweise die Blutfaktoren XI und XII,

   - sie wird durch den Plättchenfaktor IV nicht in großem Ausmaß gehemmt,

   sie zeigt keine thrombocytopene Wirkung.

   16. Heparin-Fraktion nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß sie Glucosamin-Gruppen nur teilweise in Form von N-Glucosaminsulfaten enthält, und der verbleibende Teil der Glucosamin-Gruppen, wie durch NMR-Untersuchungen festgestellt, in Form von N-Acetylglucosamin-Gruppen vorliegt.

   17. Verfahren zur Herstellung einer Heparin-Fraktion nach einem, der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung eines Heparin-Präparates mit Molekulargewichten von 5.000 bis 50.000 in Form einer gepufferten wässrigen Lösung mit einem pH-Wert von 6,5 bis 7,5, die ein Salz enthält, welches der gepufferten Lösung eine Ionenstärke verleiht, die geringer ist als die einer entsprechenden 0,6 M gepufferten Natriumchloridlösung, in Kontakt mit einem anionischen Harz bringt, aus diesem Harz diejenigen Heparin-Fraktionen, die durch die obengenannte gepufferte, aber kein Heparin enthaltende Lösung mit einer Ionenstärke, die geringer ist als die der genannten 0,6 M gepufferten Natriumchloridlösung, eluierbar sind, eluiert, und dann die noch zurückgehaltene Fraktion mit einer entsprechenden gepufferten Lösung, die eine Ionenstärke besitzt, die höher ist als die der genannten 0,6 M gepufferten Natriumchloridlösung, eluiert.

   18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das anionische Harz ein Cellulose- oder Dextran-Gerüst enthält, welches Diaminoäthylgruppen der Struktur

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   C₂Hr-) - oder Diäthyl-2-hydroxy-propylammonium-Gruppen der Struktur:

   C₉Hc OH

   I I

   -C₂H₄ - N⁺ - CH₂ - CH C₂H₅ CH₃

   trägt.

   19. Pharmazeutische Zubereitung mit antikoagulierenden Eigenschaften, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine wirksame Dosis einer Fraktion nach einem der Ansprüche 1 bis 16 und eine oder mehrere pharmazeutische Trägersubstanzen enthält.

   20. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine injizierbare sterile Lösung ist.

   21. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Form eines Liposome vorliegt.

   22. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Zäpfchen vorliegt.

   23. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine sterile Inhal ationslösung ist.

   24. Verfahren zur Kontrolle der Koagulation bei Patienten, dadurch gekennzeichnet, daß man eine pharmazeutische Zubereitung nach einem der Ansprüche 19 bis 22 ein- bis sechsmal täglich intravenös oder ein- bis dreimal täglich subkutan oder in Form eines Liposome in einer Menge von 0,075 bis 0,60 mg/kg verabreicht.

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   25. Verfahren zur Behandlung von Kopf vieh, dadurch gekennzeichnet, daß man eine pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 23 mit einer wirksamen Dosis ^on 2 bis 5 mg ein- bis zweimal pro V/oche verabreicht.

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   BAD ORIGiNAL