DE2944792C3

DE2944792C3 - Mucopolysaccharidfraktion, Verfahren zu ihrer Herstellung und sie enthaltende Arzneimittel

Info

Publication number: DE2944792C3
Application number: DE2944792A
Authority: DE
Inventors: Jean-Claude Lormeau; Jean Goulay; Jean Choay
Original assignee: Choay SA
Current assignee: Choay SA
Priority date: 1978-11-06
Filing date: 1979-11-06
Publication date: 1994-04-14
Anticipated expiration: 1999-11-07
Also published as: DE2944792A1; DE2944792C2; GB2035349A; GB2035349B; JPH03243601A; US4486420A; SE449753B; SE7909087L; IT7927064A0; IT1126319B

Description

Die Erfindung betrifft eine Mucopolysaccharidfraktion, die aus Heparin oder Heparinbestandteilen mit Molekulargewichten von 2000 bis 50 000 enthaltenden Fraktionen erhältlich ist und die biologische Eigenschaften besitzt, aufgrund derer sie als Mittel zur Steuerung der Blutkoagulation verwendet werden kann, ein Verfahren zur Herstellung dieser Mucopolysaccharidfraktion und sie als Wirkstoff enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen. Diese Fraktion kann insbesondere aus Heparinpräparaten, beispielsweise Säugetiergewebeextrakten, gewonnen werden.

Heparin ist bis heute eines der wichtigsten, wenn nicht das wichtigste Antikoagulans, das dem Kliniker zur Verfügung steht. Es ist in der Tat dazu in der Lage, in verschiedenen Niveaus von Kaskaden aufeinanderfolgender enzymatischer Reaktionen einzugreifen, die normalerweise bei der physiologischen Hämostase bei irgendwelchen Situationen ablaufen, die zu einer Hyperkoagulierbarkeit des Bluts führen. Heparin ist insbesondere dazu in der Lage, gleichzeitig eine große Vielzahl der Koagulationsfaktoren zu unterdrücken, die bei der Bildung und der Aufrechterhaltung der verschiedenen Formen der Hyperkoagulation teilnehmen.

Im folgenden sei soweit, wie es die Klarheit der vorliegenden Beschreibung erforderlich macht, auf einige der grundlegenden Phänomene, die die Koagulation oder die Blutgerinnung betreffen, eingegangen, wobei diese Diskussion absichtlich vereinfacht sei. Der Prozeß der Blutgerinnung umfaßt in der Tat drei Phasen, die im allgemeinen als aufeinanderfolgend beschrieben werden, selbst wenn sie innig miteinander verknüpft sind:

Die Thromboplastinbildung, die Phase der Bildung von Prothrombinase (oder des aktiven Thromboplastins), die Thrombinbildung, welche Phase als die Phase der Umwandlung des Prothrombins in Thrombin unter dem Einfluß der Prothrombinase in Gegenwart von ionisiertem Calcium beschrieben werden kann, und schließlich die Fibrinbildung, die Phase, in deren Verlauf das Fibrinogen des Bluts unter dem Einfluß des Thrombins in Fibrin umgewandelt wird, welches Protein zum Unlöslichwerden neigt.

Die Bildung der Prothrombinase verläuft im Zuge der Thromboplastinbildung im wesentlichen über zwei verschiedene Wege: Die intrinsische oder endogene Route und die extrinsische oder exogene Route, die zur Bildung von Prothrombinasen plasmatischen oder geweblichen Ursprungs führen, jedoch beide dazu in der Lage sind, Prothrombin in aktives Thrombin umzuwandeln.

Der endogene Weg (oder das endogene System) umfaßt eine Vielzahl von Faktoren oder Plasmaproenzymen, die nacheinander aktiviert werden (Faktoren XII, XI, IX, VIII und X), wobei jedes aktivierte Produkt (Faktoren XIIa, XIa, IXa, VIIIa und Xa) als Enzym wirken, das das folgende Proenzym zu aktivieren vermag, wobei der aktivierte Faktor X (Xa) dann insbesondere bei einer Reaktion mit dem Faktor V und einem Phospholipid, das von den Blutplättchen herstammt, bei der Bildung von aktiver endogener Plasmaprothrombinase teilnimmt. Das exogene System, das insbesondere direkt durch eine Gewebeverletzung hervorgerufen werden kann, umfaßt eine begrenztere Anzahl von Faktoren und schließt insbesondere die Produktion von Gewebe-Thromboplastin ein, das in Kombination mit dem Faktor VII, ebenso wie der Faktor VIIIa, den inaktiven Faktor X in den Faktor Xa umzuwandeln vermag. Die Folge der Aktivierung des Prothrombins in Thrombin verläuft dann ebenso wie bei dem endogenen System, wobei das Phospholipid in diesem Fall aus dem Gewebe und nicht aus dem Plasma stammt.

Es ist daher möglich, in gewissem Ausmaß davon zu sprechen, daß die beiden Wege, nämlich der endogene Weg und der exogene Weg sich an der Stelle der Aktivierung des Faktors X (der auch als Stuart-Faktor bezeichnet wird) vereinigen, worauf die sich dann anschließenden Phasen der Koagulation, nämlich die Thrombinbildung und die Fibrinbildung, nicht mehr in bezug auf den endogenen Weg oder den exogenen Weg unterscheiden.

Als Ergebnis des Koagulationsprozesses wird ein unlösliches Fibrinklümpchen gebildet, das insbesondere die Verletzung am Ursprung der Auslösung dieses Prozesses ausfüllt, beispielsweise im Bereich eines Blutgefäßes.

Diese Blutgerinnungsprozesse führen normalerweise dann zu einem als Fibrinolyse bezeichneten Prozeß, gemäß dem eine Lyse des Blutklümpchens erfolgt, insbesondere unter dem Einfluß von Plasmin, welches Enzym normalerweise in dem zirkulierenden Blut nur in Form eines inaktiven Vorläufers, nämlich als Plasminogen, enthalten ist, wobei das Fibrin als solches einen der Faktoren darstellt, der dazu in der Lage ist, die Umwandlung des inaktiven Plasminogens in das fibrinolytisch aktive Plasmin auszulösen.

Obwohl in den obigen Ausführungen die Systeme der Koagulation und der Fibrinolyse als zwei Prozesse erläutert wurden, die gleichzeitig ablaufen, ist dies in der Wirklichkeit normalerweise nicht der Fall. In der Tat bestehen bei den ablaufenden extrem komplizierten Prozessen ausgeglichene Mechanismen unter dem Einfluß von harmonisch entgegengesetzt wirkender aktivierender Faktoren und inhibierender Faktoren. Wenn diese Mechanismen im Hinblick auf die Hyperkoagulation ins Ungleichgewicht kommen, sind Thrombosen möglich. Andererseits kann eine Verschiebung des Gleichgewichts im Sinne der Hyperkoagulation zu Blutungsrisiken Anlaß geben.

Im Hinblick auf die Linderung der Effekte der Hyperkoagulierbarkeit oder Hyperkoagulation ist es verständlich, daß derzeit von den starken Antikoagulans-Eigenschaften des Heparins Gebrauch gemacht wird, um den Koagulations/Fibrinolyse-Mechanismus wieder ins Gleichgewicht zu bringen, wenn dieser erheblich gestört wird, beispielsweise im Verlaufe einer chirurgischen Operation des Organismus. Es ist jedoch gut bekannt, daß diese Versuche der Wiedereinstellung des Gleichgewichts äußerst delikat sind und daß demzufolge die Verabreichung einer zu starken Dosis des Antikoagulans oder bei einer unzureichenden Selektivität dieses Arzneimittels, das dazu verabreicht wird, die Risiken der Hyperkoagulation zu verhindern, wie es beispielsweise das Auftreten von postoperativen Thrombosen darstellt, schließlich zur Auslösung von ernsten Blutungen führen kann, was zur Folge hat, daß es erforderlich ist, die behandelten Patienten ständig zu überwachen und die verabreichten Dosierungen kontinuierlich oder diskontinuierlich in Abhängigkeit von Testergebnissen, insbesondere in Abhängigkeit von der gesamten Koagulierbarkeit, wie der Howell-Zeit, die in regelmäßigen Intervallen ermittelt werden müssen, anzupassen.

Aus Thrombosis Research, Vol. 9, Seiten 575 bis 583, 1976, war es bekannt, daß eine antikoagulativ aktive Fraktion des Heparins erhalten werden kann durch Auftrennung an Antithrombin III. Trennt man diese Antithrombin-III-Fraktion, die auch als hochaktive Heparinfraktion bezeichnet wird, bezüglich des Molekulargewichts auf, so erhält man eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von 6000 bis 6500, die in vitro eine relativ hohe Anti-Xa-Aktivität zeigt. Es wurde jedoch gezeigt, daß diese Fraktion bei in vivo Verabreichung eine sehr viel schlechtere thrombolytische Aktivität hat als Heparin selbst oder andere bekannte Derivate.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht somit darin, Arzneimittelwirkstoffe und Arzneimittel zu schaffen, mit denen es gelingt, diese Schwierigkeiten mindestens teilweise zu überwinden, und die dazu in der Lage sind, das Koagulations/Fibrinolyse-System von Patienten, die Koagulationsstörungen aufweisen und einer Behandlung unterworfen worden sind, wie einer chirurgischen Operation, bei der das Risiko der Hyperkoagulierbarkeit besteht, wieder ins Gleichgewicht zu bringen und/oder besser steuern zu können, wobei gleichzeitig die Kosten für die klinische Überwachung der Patienten verringert werden können.

Diese Aufgabe wird nun durch die erfindungsgemäße Mucopolysaccharidfraktion bzw. die sie enthaltenden Arzneimittel gelöst.

Gegenstand der Erfindung ist daher insbesondere eine Mucopolysaccharidfraktion, die eine regulierende Wirkung auf die Blutgerinnung oder Koagulation ausübt, insbesondere indem sie diese verzögert und dennoch inhibierende Wirkungen ins Spiel bringt, die im Hinblick auf eine geringere Anzahl von Koagulationsfaktoren, insbesondere im Hinblick auf den aktivierten Faktor X selektiver sind als die des Heparins.

Die Erfindung betrifft somit eine Mucopolysaccharidfraktion erhältlich aus einem Material auf Basis von Heparin oder Heparinbestandteilen, deren Molekulargewichte im wesentlichen zwischen 2000 und 50 000 liegen, und das einen verminderten Gehalt an Mineralsalzen von vorzugsweise weniger als 1 Gew.-% aufweist, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie aus Heparin-Mucopolysacchariden besteht, die im wesentlichen ein Molekulargewicht von etwa 2000 bis 10 000 haben und die folgenden Eigenschaften aufweisen: daß die Mischung in wäßrig-alkoholischem Medium (Wasser/Ethanol) mit einem Titer von 55 bis 61°GL löslich, aber unlöslich in reinem Alkohol ist, daß der YW-Titer mindestens 40 U/mg beträgt, daß das Verhältnis von YW zu USP dieser Mischung mindestens 2 ist, und ihre pharmakologisch annehmbaren Metallsalze.

Diese Mucopolysaccharidfraktionen ermöglichen weitere Fraktionierungen, wodurch die Herstellung von Mucopolysaccharidfraktionen mit hochspezifischer Wirkung in bezug auf den Yin-Wessler-Titer möglich sind, die ein Verhältnis von Yin-Wessler-Titer zu USP-Titer von mehr als 10 und sogar von mehr als 16 aufweisen.

Den Yin-Wessler-Titer bestimmt man nach der Methode dieser Autoren, die in J. Lab. Clin. Med. 81 (1973) 298 bis 300 beschrieben ist.

Der USP-Titer, der in an sich bekannter Weise die gesamte Koagulationsintensität unter gut bestimmten Bedingungen mißt, ist ebenfalls bekannt. Dieser Titer wird nach der Methode beschrieben, die in The Pharmacopea of the United States XIX, Seiten 229 bis 230 beschrieben ist (siehe auch das Second Supplement USP-NF, Seite 62 bzw. das Fourth Supplement USP-NF, Seite 90, mit dem Titel "Drug Substances and Dosage Forms").

Erfindungsgemäß wird somit ein besonders interessanter Wirkstoff geschaffen, der die Fähigkeit besitzt, den Faktor Xa in sehr selektiver Weise zu inhibieren, welche Fähigkeit im Gegensatz zu der Aktivität des Wirkstoffs auf die Gesamtkoagulation steht, die auf einem sehr niedrigen Niveau gehalten werden kann.

Die erfindungsgemäße Mucopolysaccharidfraktion stellt somit einen besonders vorteilhaften Wirkstoff eines Antikoagulans dar, mit dem durch eine bevorzugte Inhibierung eines aktivierten Faktors, der an einer Stufe in der Nähe der Stufe der Thrombinbildung und in der Praxis an den Schnittpunkt des endogenen Wegs mit dem exogenen Weg oder später eingreift, ein Schutz gegen das Risiko der Hyperkoagulierbarkeit ermöglicht wird, der äquivalent dem Schutz ist, den man mit dem derzeit in der Therapie verwendeten Heparin erzielt, ohne daß jedoch aufgrund der Selektivität der Wirkung des erfindungsgemäßen Wirkstoffs die gleichen Blutungsrisiken auftreten, wie sie bei der herkömmlichen Anwendung von Heparin gegeben sind. Heparin inhibiert nämlich nicht nur den Faktor Xa, sondern auch andere Faktoren, die vor oder nach diesem Faktor an anderen Stufen des Blutgerinnungsprozesses auftreten, beispielsweise den Faktor IIa. Es wird angenommen, daß das in vivo-Wiederinsgleichgewichtbringen des Koagulations/Fibrinolyse-Systems, wenn dieses unter der Einwirkung einer pathologischen Ursache oder eines äußeren Eingriffs, beispielsweise eines operativen Eingriffs, ins Ungleichgewicht gekommen ist, leichter mit einem Arzneimittel erreicht werden kann, das selektiv auf einen spezifischen Faktor, nämlich den Faktor X, einwirkt und insbesondere eine Inhibierung des Faktors Xa verursacht, als mit einem Arzneimittel, das in undifferenzierter Weise mehrere Koagulationsfaktoren zugleich beeinflußt.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung dieser Mucopolysaccharidfraktion, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Substanz auf der Grundlage von Heparin oder Heparinbestandteilen, deren Molekulargewicht insbesondere in einem Bereich von 2000 bis 50 000 liegt, welche Substanz einen niedrigen Gehalt an anorganischen Salzen aufweist, der vorzugsweise weniger als 1 Gew.-% beträgt, in einem wäßrig-alkoholischen Medium des Wasser/Äthanol-Typs mit einem Titer zwischen etwa 55 und 61°GL, vorzugsweise mit einem Titer von etwa 58°GL, suspendiert; die unlösliche Fraktion abtrennt; und die Lösung gewinnt, die die gelöste Mucopolysaccharidfraktion enthält, aus der diese insbesondere durch alkoholische Fällung von dem obenerwähnten wäßrig-alkoholischen Medium abgetrennt werden kann.

Das Ausgangsmaterial, aus dem die erfindungsgemäße Mucopolysaccharidfraktion extrahiert werden kann, kann aus einem Heparin herkömmlicher, injizierbarer pharmazeutischer Qualität oder einem rohen Heparin bestehen, wie man es nach dem Ablauf der Extraktionsmaßnahmen zur Gewinnung dieses Wirkstoffs aus dem Gewebe oder den Organen von Säugern, insbesondere aus der Darmschleimhaut oder den Lungen von beispielsweise Schweinen oder Rindern, erhält. Man kann als Ausgangsmaterial auch Fraktionen der Reinigung solchen rohen Heparins, die zur Gewinnung eines Heparins injizierbarer Qualität und mit höherer spezifischer Aktivität anfallen und normalerweise verworfen werden (Abfall) verwenden, vorausgesetzt, daß diese Abfallmaterialien geringerer spezifischer Aktivität noch Heparinbestandteile (heparinic constituents) enthalten.

Ausgehend von solchen Ausgangsmaterialien, die im wesentlichen frei sind von Proteinen, von Nucleinsäuren und von anorganischen Salzen, wobei der Gehalt der letzteren vorzugsweise weniger als 1 Gew.-% beträgt, ist es möglich, durch Extraktion mit einem Alkohol mit einem Titer von 55 bis 61°GL eine Mucopolysaccharidfraktion zu extrahieren, die Bestandteile niedrigen Molekulargewichts enthält und deren Yin-Wessler-Titer und USP-Titer ein Verhältnis von etwa 2 bis etwa 5 und insbesondere von 3 bis 5 aufweisen.

Es ist festzuhalten, daß, wenn man Wasser/Äthanol-Mischungen mit einem Titer von mehr als 61°GL verwendet, die Extraktionsausbeute praktisch gleich Null wird. Andererseits führt die Verwendung eines wäßrig-alkoholischen Mediums mit einem Titer von weniger als 55°GL zu der Lösung von Bestandteilen, deren Anwesenheit das Verhältnis der Yin-Wessler/USP-Titer vermindert.

Es ist weiterhin festzuhalten, daß es möglich ist, weitere Fraktionierungen der nach der Durchführung des oben beschriebenen Verfahrens anfallenden Mucopolysaccharidfraktion durchzuführen unter Anwendung verschiedenartiger Methoden, wie der Gelfiltration oder einer selektiven Ausfällung in einem wäßrig-alkoholischen Medium vorbestimmten Titers in Gegenwart von vorbestimmten Mengen anorganischer Salze, wie Natriumchlorid.

Man kann eine zusätzliche Fraktionierung auch mit Hilfe einer zusätzlichen Stufe erreichen, die man auf jede Mucopolysaccharidfraktion anwendet, die man zuvor wieder in Wasser gelöst hat, die darin besteht, daß man zu dieser wäßrigen Lösung 1 bis 2 Volumen Äthanol und 10 bis 100 g/l Natriumchlorid zugibt und einerseits den ebenso aktiven gebildeten Niederschlag gewinnt und andererseits die noch in der überstehenden Flüssigkeit gelösten Anteile insbesondere durch eine weitere Alkoholfällung sammelt, so daß man ein Fraktionierungsprodukt erhält, dessen Yin-Wessler- und USP-Titer ein noch höheres Verhältnis im Bereich von 6 bis 8 aufweisen, das höher liegt als das der Ausgangsfraktion, das im Bereich von 3 liegt.

Man kann auch Mucopolysaccharidfraktionen mit einem höheren Verhältnis von Yin-Wessler/USP-Titer durch Gelfiltration aus den Fraktionen der ersten Extraktion mit dem wäßrig-alkoholischen Medium mit einem Titer von 55 bis 61°GL gewinnen, nachdem man diese letzteren Fraktionen in einem wäßrigen Lösungsmittel, wie einer 0,5 m NaCl; 0,1 m Tris-HCl-Lösung bei einem pH-Wert von 7,5 gelöst hat. Man kann diese Lösung dann durch ein Polyacrylamid- und Agarose-Gel in Kugelform, das im Handel unter der Bezeichnung ULTROGEL® AcA 44 erhältlich ist, führen, dessen wirksamer Fraktionierbereich zwischen effektiven Molekulargewichten von 4000 bis 60 000 (für lineare Moleküle) liegt.

Die erfindungsgemäßen Mucopolysaccharidfraktionen mit einem höheren Verhältnis von Yin-Wessler-Titer zu USP-Titer sind jene, die nach der Elution eines Volumens von 2,5 l, Totvolumen nicht eingeschlossen (wobei das Totvolumen das Flüssigkeitsvolumen ist, das in der Gelsäule und insbesondere in den Zwischenräumen zwischen den Gelkörnchen vorliegt) eluiert werden, wenn man die Gelfiltration mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 200 ml/h in einer Säule mit einem Durchmesser von 100 mm und einer Länge von 1 m durchführt, wobei die Konzentration des auf die Säule aufgetragenen Mucopolysaccharids 50 mg/ml und das Volumen der auf die Säule aufgetragenen Lösung 37,5 ml betragen. Die aktivsten Fraktionen sind dann in den 1,5 l enthalten, die anschließend eluiert werden. Der Gehalt der ersten 2,5 l des Eluats besteht in großem Ausmaß aus Heparan-sulfaten oder Heparitin-sulfaten, d. h. Produkten mit hohem Molekulargewicht und hoher Viskosität, die keine antikoagulierende Wirkung besitzen.

Wenn man von einer Säule zu einer anderen Säule gleicher Länge, jedoch unterschiedlichen Querschnitts übergeht, ergibt sich eine Änderung des Volumens der Lösung (der gleichen Konzentration), die auf die andere Säule aufgetragen wird in bezug auf das auf die erste Säule aufgebrachte Volumen, wobei dieses Verhältnis gleich ist dem Quadrat der Querschnitte (oder Durchmesser) dieser Säulen, so daß man gleichen Fraktionen in einem Elutionsvolumen aus der anderen Säule erhält, das ebenfalls in einem Volumen zu dem entsprechenden Elutionsvolumen der ersten Säule anfällt, das im wesentlichen gleich ist dem Quadrat des Verhältnisses der genannten Querschnitte.

Gelfiltrationen dieser Art besitzen neben der Tatsache, daß sie Fraktionen liefern, deren Verhältnis von Yin-Wessler-Titer zu USP-Titer günstiger ist, den Vorteil, daß sie Produkte liefern, deren Lösungen eine niedrige Viskosität aufweisen.

In dieser Hinsicht ist darauf hinzuweisen, daß das erfindungsgemäße Verfahren der Extraktion von Mucopolysaccharidfraktionen mit Hilfe eines wäßrig-alkoholischen Mediums mit einem Titer von 55 bis 61°GL, vorzugsweise mit einem Titer von 58°GL, von kommerziell erhältlichem oder gereinigtem Heparin, insbesondere mit einer für Injektionszwecke geeigneten Qualität, das noch merkliche Anteile von Heparan-sulfaten oder ähnlichen Produkten mit hohem Molekulargewicht enthält, es auch ermöglicht, eine erhebliche Verminderung der Viskosität der wäßrigen Lösungen zu erreichen, die man aus diesen Heparinen bilden kann, die dann im wesentlichen frei sind von diesen Mucopolysaccharidfraktionen.

Diese Verminderung der Viskosität bringt erhebliche Vorteile im Hinblick auf die spätere Anwendung dieser Heparine als Antikoagulantien bei der parenteralen und insbesondere bei der subcutanen Injektion mit sich.

Aus Fraktionen mit einem Verhältnis von Yin-Wessler-Titer zu USP-Titer im Bereich von 6 bis 8 ist es möglich, durch Gelfiltration oder dergleichen weitere Mucopolysaccharidfraktionen zu gewinnen, die Verhältnisse von Yin-Wessler-Titer/USP-Titer von mehr als 10 und insbesondere im Bereich von 13 bis 16 und Yin-Wessler-Titer von mehr als 130 und vorzugsweise von 135 bis 160 Einheiten/mg aufweisen.

Es versteht sich, daß die obigen (und auch die insbesondere in den Beispielen folgenden) Angaben zum Molekulargewicht auf Messungen der Retentionszeit von Lösungen mit einem vorbestimmten Gehalt der untersuchten Substanz beruhen und bei Experimenten der Gelpermeation durch eine Gelsäule unter vorbestimmten Elutionsbedingungen ermittelt wurden, wobei die Logarithmen dieser Molekulargewichtsangaben die gleichen proportionalen Beziehungen zu den oben angegebenen Messungen der Retentionszeit besitzen wie die Molekulargewichte von 4000, 6500, 16 000 bzw. 31 000 von Polystyrol-natriumsulfonat-Standards in Bezug zu ihren entsprechenden Retentionszeiten aufweisen, die in identischen Systemen und unter gleichen Gelpermeationsbedingungen ermittelt wurden.

Wenn die behandelten Fraktionen, unabhängig von dem erreichten Reinigungsgrad, in Form von physiologisch annehmbaren Metallsalzen, wie den Natriumsalzen, vorliegen, können sie auch in gemischte oder einfache Salze, die ein anderes physiologisch annehmbares Metall, wie Calcium, aufweisen, überführt werden, indem man Verfahrensweisen anwendet, die auf Heparinsalze anwendbar sind. Mit besonderem Vorteil ist es möglich, auf das Verfahren zurückzugreifen, das in der FR-PS 73 13 580 vom 13. April 1973 der gleichen Anmelderin beschrieben ist. Dieses Verfahren besteht im wesentlichen darin, beispielsweise von einem Natriumsalz des Heparins auszugehen, dieses mit einem andersartigen Salz eines anderen physiologisch annehmbaren Metalls, beispielsweise Calciumchlorid, in Lösung in Kontakt zu bringen, dann die nicht an das Heparin gebundenen Metallionen abzutrennen (beispielsweise durch alkoholische Fällung oder Dialyse) und dann, wenn das erzielte Substitutionsverhältnis nicht ausreicht, das bei der Kontaktbehandlung erhaltene gemischte Heparinsalz in Lösung mit einer weiteren Menge eines anderen Salzes, namentlich Calciumchlorid, in Kontakt bringt, bis das angestrebte Substitutionsverhältnis erreicht ist.

Man kann eine weitere bevorzugte erfindungsgemäße Mucopolysaccharidfraktion aus einer oder den anderen oben beschriebenen Fraktionen erhalten, welche weiteren Fraktionen dadurch gekennzeichnet sind, daß sie bei der Gelfiltration auf einer mit Polyacrylamid- und Agarose-Gel in Kugelform des Typs ULTROGEL® AcA 44 erhältlich ist, beschickten Säule nach der Elution eines Volumens von 2,5 l, Totvolumen nicht eingeschlossen, eluiert werden, wenn man die Gelfiltration bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 200 ml/h in einer Säule mit einem Durchmesser von 100 mm und einer Länge von 1 m durchführt und die Konzentration des auf die Säule aufgetragenen Mucopolysaccharids 50 mg/ml und das auf die Säule aufgetragene Volumen der Lösung 37,5 ml betragen, wobei die wesentlichen Anteile dieser Fraktion insbesondere in den 1,5 l des Eluats enthalten sind, die dann eluiert werden; und daß sie eine Retentionszeit im Bereich von 5,7 bis 7,5 und insbesondere von 6,6 bis 7,0 min in einem Gelpermeationssystem auf einer Säule mit einer Länge von 250 mm und einem Durchmesser von 9 mm, die mit Siliciumdioxid mit einer Korngröße von 10 bis 100 µm beschickt ist, wenn man 50 µl einer Lösung von 1,3 mg/ml dieser Fraktion in eine, 0,02 m Na₂SO₄-Puffer auf diese Säule aufträgt und dann die Elution dieser Fraktion bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 3 ml/min bewirkt, besitzen.

Bevorzugte erfindungsgemäße Fraktionen sind insbesondere dadurch gekennzeichnet, daß sie einerseits eine bestimmte Affinität in bezug auf Antithrombin III besitzen, die sich in ihrer Fähigkeit an das letztere fixiert oder gebunden zu werden manifestiert, insbesondere in einem System, das darin besteht, die Fraktionen mit einem an einem Trägermaterial, wie Agarose, fixierten Antithrombin III in einem 0,2 m NaCl/0,05 m Tris-HCl-Puffer bei einem pH-Wert von 7,5 in Kontakt zu bringen; und andererseits ein Verhältnis von Yin-Wessler-Titer zu USP-Titer (YW/USP-Titer) von mindestens 6 und einen Yin-Wessler-Titer von mindestens 300 Einheiten/mg aufweisen.

Bevorzugte erfindungsgemäße Fraktionen und Verbindungen sind jene, die ein YW/USP-Verhältnis von mehr als 18 bei einer Yin-Wessler-Aktivität von mehr als 900 Einheiten/mg aufweisen.

Besonders bevorzugt sind jene erfindungsgemäßen Fraktionen und Verbindungen, die YW/USP-Verhältnisse von mehr als 50 aufweisen.

Besonders bevorzugte erfindungsgemäße Verbindungen zeichnen sich dadurch aus, daß sie ein YW/USP-Verhältnis von mehr als 65 bei einer Yin-Wessler-Aktivität von mehr als 1300 Einheiten/mg besitzen.

Die besondere Affinität der erfindungsgemäßen Fraktionen für Antithrombin III ist eine wesentliche Eigenschaft, die für die Herstellung solcher stark angereicherter Fraktionen herangezogen werden kann, insbesondere ausgehend von den oben angegebenen Fraktionen, welches Verfahren darin besteht, daß man eine selektive Bindung der erfindungsgemäßen stärker angereicherten Fraktionen oder Produkte an Antithrombin III bewirkt, insbesondere dadurch, daß man die Ausgangsfraktionen mit immobilisiertem Antithrombin III, das vorzugsweise auf dem Trägermaterial, insbesondere Agarose, vorliegt, in einem Puffer, wie man einem 0,2 m NaCl/0,05 m Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 in Kontakt bringt und dann die fixierte Fraktion mit einem Puffer höherer Ionenstärke, der die Desorption zu bewirken vermag, insbesondere mit einem 2 m NaCl/0,05 m Tris-HCl-Puffer eluiert.

Natürlich sind die Ausgangsmaterialien, aus denen die zuletzt erwähnten Fraktionen oder Verbindungen gewonnen werden können, nicht auf die definierten ersten erfindungsgemäßen Fraktionen beschränkt. Insbesondere kann man sie in beliebiger anderer Weise gewinnen, insbesondere aus dem rohen Ausgangsmaterial, dessen Eigenschaften oben angesprochen wurden und aus denen die genannten ersten Fraktionen ihrerseits gewonnen wurden.

Diese Verbindungen sind durch kernmagnetische Resonanzspektren (NMR) gekennzeichnet, die unter Einhaltung der nachstehend angegebenen Bedingungen aufgezeichnet wurden und die in den Fig. 11, 12, 14 und 15 dargestellt sind.

Insbesondere zeigt das Protonen-(¹H)-Kernresonanzspektrum der erfindungsgemäßen Verbindungen, das in Lösungen dieser Verbindungen in deuteriertem Wasser bei 35°C mit einer Strahlung von 270 MHz aufgezeichnet wurde, als charakteristisches Element Resonanzsignale, die bei einer chemischen Verschiebung im Bereich von 4,8 und 5,2 ppm wesentlich schwächer als das Resonanzsignal sind, das man auch bei einer chemischen Verschiebung im Bereich von 5,4 ppm beobachtet (wobei das Referenzsignal für die Verschiebung durch Natrium-3-trimethylsilyl-propionat-2,2,3,3-d₄ (TSP) erzeugt wird).

Die bei chemischen Verschiebungen von 5,4, 5,2 und 4,8 ppm beobachteten Signale entsprechen den Signalen, die im Fall eines herkömmlichen Heparins, dessen Kernresonanzspektrum unter den gleichen Bedingungen aufgezeichnet wurde, charakteristisch sind für:
das anomere Proton in der 1-Stellung der N-sulfatierten Glucoseamin-Einheiten des Heparins (Signal G₁);
das anomere Proton in der 1-Stellung der 2-O-sulfatierten Iduronsäure-Einheiten (Signal I₁); und
das Proton in der 5-Stellung der 2-O-sulfatierten Iduronsäure-Einheiten (Signal I₅).

Bei üblichen Heparinen besitzen sämtliche drei Signale (G₁), (I₁) und (I₅) Intensitäten gleicher Größenordnung.

Der Einfachheit halber wird im folgenden auch bezüglich der erfindungsgemäßen Fraktionen oder Verbindungen auf die Signale (G₁), (I₁) und (I₅) Bezug genommen, um Signale anzusprechen, die in bezug auf die entsprechenden chemischen Verschiebungen beobachtet werden (unabhängig davon, ob es sich um das Protonenresonanzspektrum oder das ¹³C-Resonanzspektrum handelt).

Diese Äquivalenz der Bezeichnung erstreckt sich auch auf die NMR-Spektren, die unter anderen Bedingungen und unter Anwendung andersartiger Referenzsignale erzeugt wurden.

Insbesondere zeigt das Kohlenstoff 13-(¹³C)-Kernresonanzspektrum der erfindungsgemäßen Verbindungen, das in Lösungen dieser Verbindungen in deuteriertem Wasser unter Bestrahlung mit einer Frequenz von 20 MHz aufgezeichnet wurde, als charakteristische Elemente des Spektrums (wobei als Standard Tetramethylsilan (TMS) verwendet wurde) die folgenden Eigenschaften:
die praktische Abwesenheit des Resonanzsignals, das für die Anwesenheit von Hydroxylgruppen am primären Kohlenstoffatom (in der 6-Stellung) der Glucosamin-Einheiten, die in den erfindungsgemäßen Mucopolysaccharidfraktionen enthalten sind, charakteristisch ist,
zusätzliche Signale im Bereich der (I₁)- und (G₁)-Signale in Bereichen, die chemischen Verschiebungen in der Größenordnung von 100 ppm entsprechen, ein zusätzliches (G₂)-Signal in der Nähe des G₂-N-Sulfatsignals in dem Bereich von 60 ppm und die Anwesenheit eines Resonanzsignals im Bereich von 75 ppm (dem normalerweise kein Resonanzsignal der NMR-Spektren entspricht, die man unter ähnlichen Bedingungen mit üblichem Heparin erhält) (wobei die oben angegebenen chemischen Verschiebungen in bezug auf die Methylgruppe der N-Acetylglucosamingruppen abgeschätzt sind, die in der erfindungsgemäßen Mucopolysaccharidfraktion enthalten sind (25-ppm-Bereich in den in den Zeichnungen dargestellten Spektren)).

Die in praktisch gereinigten Zustand vorliegenden homogenen erfindungsgemäßen Verbindungen, die sämtliche oben beschriebenen Eigenschaften im Hinblick auf ihre spezifischen Aktivitäten für Antithrombin III aufweisen, sind weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem homogenen Oligosaccharid bestehen, das die folgenden zusätzlichen Eigenschaften besitzt:

es enthält 8 bis 12, insbesondere 10 Monosaccharid-Einheiten;
sämtliche primären Positionen der Glucosamin-Einheiten dieses Oligosaccharids sind sulfatiert;
dieses Oligosaccharid enthält eine N-Acetylglucosamin-Einheit pro 2 2-O-Sulfatiduronsäure-Einheiten und pro 2 N-Sulfat-glucoseamin-Einheiten, während die anderen Saccharide anderer Art sind und andersartige Substituenten aufweisen.

Die Molekulargewichte mindestens bestimmter erfindungsgemäßer Oligosaccharide liegen im Bereich von etwa 2000 bis etwa 3000 und insbesondere bei etwa 2500, insbesondere was die Dekasaccharide betrifft.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Polysaccharide mit den oben angegebenen allgemeinen Eigenschaften, nämlich insbesondere ihrer USP- und Yin-Wessler-Eigenschaften einerseits und ihrer Affinität für Antithrombin III andererseits, wobei diese Fraktionen ein höheres Molekulargewicht aufweisen und in ihrer Struktur auch eine Oligosaccharideinheit des oben angegebenen Aufbaus besitzen.

Weitere Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der nachstehenden Beschreibung der Erfindung unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen.

In der Zeichnung zeigt

Fig. 1 ein charakteristisches Elutionsdiagramm einer bevorzugten erfindungsgemäßen Mucopolysaccharidfraktion P194HH(P) mit den aufeinanderfolgenden Fraktionen K, J, I, G, F, E, D, C, B und A;

Fig. 2 bis 7 vergleichende biologische Eigenschaften der erfindungsgemäßen Mucopolysaccharidfraktion P188CH und eines herkömmlichen Heparins mit hoher Antikoagulanswirkung (ausgedrückt als USP-Titer);

Fig. 8 ein schematisches Elutionsdiagramm einer erfindungsgemäßen Fraktion, das bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bei der selektiven Abtrennung dieser Fraktion von einer Fraktion, die auch andere Bestandteile enthält, ermittelt wurde;

Fig. 9 ein repräsentatives Elutionsdiagramm, das für eine andere bevorzugte erfindungsgemäße Mucopolysaccharidfraktion charakteristisch ist;

Fig. 10 das Protonen-(¹H)-Kernresonanzspektrum eines herkömmlichen Heparins;

Fig. 11 und 12 das Protonen-(¹H)-Kernresonanzspektrum der erfindungsgemäßen Fraktionen, die mit P194HHPF und P194HHPA bezeichnet wurden;

Fig. 13 das zu Vergleichszwecken aufgezeichnete Kohlenstoff-13-Kernresonanzspektrum eines üblichen Heparins;

Fig. 14 das Kohlenstoff-13-Kernresonanzspektrum der erfindungsgemäßen Fraktion P242HHA;

Fig. 15 eine Vergrößerung eines Teils des in der Fig. 14 dargestellten Kernresonanzspektrums.

Beispiel 1

Man verwendet als Ausgangsmaterial 100 g eines injizierbaren Heparins mit einem Titer von 170 I.E./mg (USP-Einheiten).

Zu diesen 100 g Heparin gibt man 2500 ml Alkohol mit einem Titer von 58°GL. Nach sehr heftigem Rühren während 15 min setzt man das heftige Rühren während 15 Stunden fort. Dann zentrifugiert man die Suspension während 1 Stunde bei 7000 min^-1 und gewinnt 2400 ml der überstehenden Flüssigkeit.

Zu dieser überstehenden Flüssigkeit gibt man 80 ml einer gesättigten Natriumchloridlösung und dann 2400 ml eines Alkohols mit einem Titer von 100°GL.

Man gewinnt das ausgefällte Produkt, wäscht es mit Alkohol und trocknet es. Man erhält das Material in einer Menge von 2,1 g. Seine Eigenschaften sind die folgenden:

USP-Titer = 45 I.E./mg
Anti-Xa-Titer = 160 Einheiten/mg

Das Anti-Xa/USP-Verhältnis beträgt somit 3,55.

Beispiel 2

Man verwendet als Ausgangsmaterial die Subfraktionen, die beim Reinigen von handelsüblichem Heparin zum Zweck der Bildung von injizierbarem Heparin anfallen. Man erhält das Material insbesondere in Form der überstehenden Flüssigkeit, die bei der Zugabe von 0,6 bis 0,7 Volumen eines Alkohols mit einem Titer von 100°GL zu einer wäßrigen Heparinlösung, die 10 bis 20 g Natriumchlorid/l enthält, anfällt, wobei das ausgefällte gereinigte Heparin dann zur weiteren Reinigung gewonnen wird. Das hierin verwendete Ausgangsmaterial enthält weiterhin verschiedene Rückstände der Reinigung von Heparin, die mit dem Zweck durchgeführt wird, injizierbares Heparin von Spuren anorganischer Salze zu befreien, insbesondere jene Materialien, die bei der alkoholischen Fällung anfallen.

Zu 10 kg dieses Ausgangsmaterials gibt man 30 Volumen (300 l) Alkohol mit einem Titer von 58°GL. Man dispergiert und rührt die Suspension während 15 min heftig, worauf man das heftige Rühren während 12 Stunden fortsetzt. Dann läßt man das Material während 48 Stunden stehen, um die Ausfällung des nichtgelösten Ausgangsmaterials zu bewirken. Die schwach trübe überstehende Flüssigkeit wird abgezogen und durch Zentrifugieren gereinigt.

Zu der überstehenden Flüssigkeit (die ein Volumen von 280 l besitzt) gibt man 10 l einer gesättigten Natriumchloridlösung und dann 1 Volumen (280 l) Alkohol mit einem Titer von 100°GL. Der erhaltene Niederschlag, der die Mucopolysaccharidfraktion enthält, wird mit Alkohol mit einem Titer von 100°GL gewaschen und dann getrocknet.

Man erhält 660 g einer Fraktion mit einem Verhältnis von Yin-Wessler-Titer zu USP-Titer von mehr als 2 (Fraktion P194HH_(A)).

Dann bewirkt man eine zusätzliche Fraktionierung dieser Fraktion, indem man die 660 g der Fraktion in 13 200 ml Wasser löst.

Zu der gebildeten Lösung gibt man 264 g Natriumchlorid und dann 1,5 Volumen (19,8 l) Alkohol mit einem Titer von 100°GL. Man sammelt das ausgefällte Produkt, wäscht es mit Alkohol und trocknet es. Man erhält 640 g der Fraktion P194HH_(C) mit den folgenden Eigenschaften:

USP-Titer = 31 I.E./mg
Yin-Wessler-Titer = 100 Einheiten/mg.

Die überstehende Flüssigkeit enthält auch aktive Mucopolysaccharidfraktionen (deren Gewinnung wird in Beispiel 4 beschrieben).

Die Fraktion P194HH_(C) enthält weiterhin eine relativ große Menge von Substanzen mit hohem Molekulargewicht, insbesondere Heparitin-sulfate, ohne Antikoagulanswirkung sowohl bei dem USP-Test als auch bei dem Yin-Wessler-Test.

Nach dem Auflösen in einem 0,5 m NaCl/0,1 m Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 in einer Konzentration von 50 mg/ml bewirkt man eine Gelfiltration eines Volumens von 150 ml der Lösung auf einem Gel (ULTROGEL® AcA 44) in einer Säule mit einem Durchmesser von 215 mm und einer Länge von 1 m bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 800 ml/h. Die Substanzen mit hohem Molekulargewicht, bei denen es sich überwiegend um Heparitin-sulfate handelt, werden mit den ersten 10 l des Eluats, Totvolumen nicht eingeschlossen, eluiert.

In den nächsten 6 l des Eluats erhält man eine Mucopolysaccharidfraktion mit einem höheren Yin-Wessler-Titer und einem Verhältnis von Yin-Wessler-Titer zu USP-Titer im Bereich von 4 bis 8.

Beispiel 3

Dieses Beispiel verdeutlicht eine Modifizierung der Aufarbeitung der Fraktion P194HH_(C) von Beispiel 2. Nachdem man das Material in einer Konzentration von 50 mg/ml in einem 0,5 m NaCl/0,1 m Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 gelöst hat, unterwirft man das Material einer Gelfiltration auf ULTROGEL® AcA 44 in einer Säule mit einem Durchmesser von 10 cm und einer Länge von 100 cm. Man arbeitet bei einer Elutionsgeschwindigkeit von 200 ml/h.

Man fängt das Eluat in Fraktionen von 50 ml auf, deren Mucopolysaccharidgehalt man wie folgt bestimmt: Zu 100 ml der Fraktion gibt man 2 ml Alkohol mit einem Titer von 100°GL. Nach dem Stehenlassen während 2 min bestimmt man die Trübung der Mischung bei 660 nm mit Hilfe eines Spektrophotometers (Vorrichtung zur Bestimmung der optischen Dichte). Diese Trübung ist direkt proportional dem Mucopolysaccharidgehalt der untersuchten Lösung.

Die in dem letzten Drittel des vierten Liters des Eluats, Totvolumen nicht eingeschlossen, enthaltene Fraktion C10 wird gewonnen. Das Verhältnis des Yin-Wessler-Titers zu dem USP-Titer der Fraktion C10 beträgt 50/6.

Beispiel 4

Man versetzt die in dem Beispiel 2 zuletzt anfallende überstehende Flüssigkeit mit 19,8 l Alkohol mit einem Titer von 100°GL und läßt die Suspension dann während 24 Stunden stehen. Man gewinnt den gebildeten Niederschlag, wäscht ihn mit Alkohol (100°GL) und trocknet ihn. Man erhält 6 g der Fraktion P194HH_(P) mit den folgenden Kenndaten:

USP-Titer = 7 I.E./mg
Yin-Wessler-Titer = 46 Einheiten/mg.

Beispiel 5

Man löst die Fraktion P194HH_(P) erneut in einem 0,5 m Tris-HCl/30 g/l NaCl-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 in einer Konzentration von 50 mg/ml.

Man unterzieht die Lösung der Gelfiltration auf einer mit ULTROGEL® AcA 44 beschichten Säule Volumen: 7 l, Länge: 100 cm, Durchmesser: 10 cm) unter Anwendung einer Elutionsgeschwindigkeit von 200 ml/h.

Das erhaltene Elutionsdiagramm ist schematisch in der Fig. 1 dargestellt und zeigt die Änderung des Materialgehalts (anhand der bei 660 nm gemessenen optischen Dichte) in Abhängigkeit von dem eluierten Volumen (in Litern).

Nach dem Hindurchlaufen eines Flüssigkeitsvolumens, das dem Totvolumen der Säule entspricht, fängt man die aufeinanderfolgenden Fraktionen K, J, I, G, F, E, D, C, B und A auf, deren Volumen über die Länge der Abszissensegmente in der Fig. 1 dargestellt sind.

Jede dieser Fraktionen besitzt die in der nachstehenden Tabelle I angegebenen Analysenwerte:

Tabelle I

Analysenwerte der erhaltenen Fraktionen

Es ist festzuhalten, daß man die Fraktionen in vier Typen einteilen kann:

a) die Fraktionen A, B und C, deren Elutionsvolumen bei der oben beschriebenen Verfahrensweise im wesentlichen dem vierten eluierten Liter entspricht und deren USP-Titer weniger als 10 und deren Yin-Wessler-Titer weniger als 80 beträgt und deren Molekulargewichte höchstens etwa 4000 betragen;
b) die Fraktionen D, E, F, G und H, deren USP-Titer weniger als 10 betragen und deren Yin-Wessler-Titer sehr hoch sind, nämlich 135 bis 161 Einheiten. Diese Fraktionen besitzen auch die günstigsten Verhältnisse von Yin-Wessler-Titer zu USP-Titer von 13 bis 16 und finden sich im wesentlichen in dem dritten Liter des Eluats. Sie besitzen Molekulargewichte von 4000 bis 10 000 und insbesondere von 4000 bis 8000;
c) die Fraktionen I und J, deren Verhältnis von Yin-Wessler-Titer zu USP-Titer ungünstig ist und die wahrscheinlich bereits mit der nachstehenden Fraktion K verunreinigt sind; und
d) die Fraktion K, die im wesentlichen Heparan-sulfate enthält, die keine Antikoagulanswirkung ausüben.

In der nachstehenden Tabelle II sind die Molekulargewichte bestimmter Fraktionen angegeben, die über die durch die Gelpermeation gemessene Retentionszeit im Vergleich zu den oben angesprochenen Polystyrol-sulfonaten bekannten Molekulargewichts abgeschätzt wurden. Die Fraktion F ist durch eine Hauptbande, die eine Retentionszeit von 6,6 min und eine Schulter, die eine Retentionszeit von 6,1 min entspricht, gekennzeichnet, was auf die Anwesenheit eines Bestandteils hinweist, dessen Molekulargewicht in bezug auf das angewandte Vergleichssystem etwa 7200 beträgt.

Die Messungen erfolgten durch Gelpermeation (mit Hilfe eines SPECTRAPHYSICS® 3500 Chromatographen) unter Verwendung von Säulen (250 × 9 mm), die mit Siliciumdioxid mit einer Korngröße von 10 bis 100 µm gefüllt sind von Lösungen dieser Fraktionen in Mengen von 1,3 mg des Mucopolysaccharidmaterials/ml in einem 0,02 m Na₂SO₄-Puffer (wobei das anfänglich auf die Säule aufgetragene Volumen 50 µl beträgt) unter Anwendung einer Elutionsgeschwindigkeit von 3 ml/min. Der Nachweis des Materials erfolgte UV-spektrophotometrisch (200 mµm).

Tabelle II

Beispiel 6 Ausgangsmaterial

Man verwendet als Ausgangsmaterial die Nebenprodukte, die bei der Herstellung von Calciumheparinat aus rohem Heparin anfallen, welches letzteres aus Tiergewebe (insbesondere der Magen-Darm-Schleimhaut von Rindern oder Schweinelungen) extrahiert wurde. Dieses Ausgangsmaterial besitzt die folgenden Eigenschaften:

Gewicht: 252 kg
USP-Titer: 82 I.E./mg
Yin-Wessler-Titer: 100 Einheiten/mg.

Dann führt man die folgenden Verarbeitungsschritte durch:

Extraktion mit Alkohol mit einem Titer von 58°GL

Man dispergiert die 252 kg des Ausgangsmaterials unter heftigem Rühren in 6000 l Alkohol mit einem Titer von 58°GL. Man trennt dann die unlösliche Phase durch Dekantieren und Zentrifugieren ab und gewinnt die lösliche Fraktion durch Zugabe von Natriumchlorid und Alkohol mit einem Titer von 100°GL. Man erhält 230 kg einer unlöslichen Fraktion, die man bei dem nächsten Herstellungsvorgang wiederverwertet, und 20,6 kg einer löslichen Fraktion mit einem USP-Titer von 21 I.E./mg und einem Yin-Wessler-Titer von 90 Einheiten/mg.

Extraktion einer Fraktion mit niedrigem Molekulargewicht aus dieser Fraktion

Man löst die in Alkohol mit einem Titer von 58°GL lösliche Fraktion in 512 l (20 Volumen) Wasser. Dann gibt man 10,24 kg Natriumchlorid und dann 1,5 Volumen (768 l) Alkohol mit einem Titer von 100°GL zu. Man gewinnt die ausgefällte Fraktion, entwässert sie mit Alkohol und trocknet sie. Man erhält 19 kg der Fraktion mit einem USP-Titer von 22 I.E./mg und einem Yin-Wessler-Titer von 89 Einheiten/mg.

Man bewahrt diese Fraktion auf und reinigt und überführt sie anschließend in ein injizierbares Calciumsalz.

Man versetzt die bei der Ausfällung erhaltenen 1,5 Volumen der überstehenden Flüssigkeit mit 1,5 Volumen (768 l) Alkohol. Man gewinnt die ausgefällte Fraktion, entwässert sie mit Alkohol und trocknet sie. Man erhält 700 g eines Produkts mit einem USP-Titer von 6 I.E./mg und einem Yin-Wessler-Titer von 40 Einheiten/mg.

Diese Fraktion mit einem Gewicht von 700 g besteht aus einer Mischung aus Mucopolysacchariden mit einem niedrigen Molekulargewicht, wenig sulfatiertem Mucopolysaccharid mit hohem Molekulargewicht und mehr oder weniger stark abgebauten Nucleinsäuren.

Abtrennung der Nucleinsäuren von der Fraktion mit niedrigem Molekulargewicht

Man entfernt den überwiegenden Anteil der Nucleinsäuren durch Ausfällung mit Manganchlorid wie folgt:

Man löst die 700 g der Fraktion in 7 l Wasser. Dann gibt man unter Rühren 1 l einer 10%igen MnCl₂-Lösung zu. Es bildet sich ein erheblicher Niederschlag (der aus den unlöslichen Mangansalzen der Ribonucleinsäure und der Desoxyribonucleinsäure besteht), den man durch Zentrifugieren abtrennt. Das aus der klaren überstehenden Flüssigkeit gewonnene Mucopolysaccharid wird durch Ausfällen mit Alkohol gewonnen. Man erhält 480 g des Produkts mit einem USP-Titer von 8 I.E./mg und einem Yin-Wessler-Titer von 54 Einheiten/mg.

Isolierung der Fraktionen mit sehr niedrigem Molekulargewicht durch Gelfiltration

Man trennt die Produkte mit sehr niedrigem Molekulargewicht durch Gelfiltration auf ULTROGEL® AcA 44 ab.

Man behandelt 25 g des Materials in einer Säule mit einem Durchmesser von 200 mm und einer Länge von 1 m. Das hierbei erzielte Elutionsdiagramm ist in der Fig. 8 dargestellt.

Man gewinnt drei Fraktionen (Fraktionen (1) bis (3) mit den folgenden Eigenschaften (bezogen auf die als Ausgangsmaterial eingesetzten 25 g):

Fraktion (1): Gewicht = 16 g, USP-Titer = 12 I.E./mg, Yin-Wessler-Titer = 30 Einheiten/mg
Fraktion (2): Gewicht = 7 g, USP-Titer = 6,5 I.E./mg, Yin-Wessler-Titer = 70 Einheiten/mg
Fraktion (3): Gewicht = 2 g, USP-Titer = 2,1 I.E./mg, Yin-Wessler-Titer = 60 Einheiten/mg.

Chromatographie auf immobilisiertem Antithrombin III

Man unterwirft die obige Fraktion (3) einer Chromatographie über an Agarose fixiertem Antithrombin III. Mit Hilfe einer 100-ml-Säule ist es möglich, 700 mg der Fraktion (3) zu behandeln. Man bewirkt die Absorption in einem 0,2 m NaCl/0,05 m Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5.

Man bewirkt die Elution mit Hilfe eines 2 m NaCl/0,05 m Tris-HCl-Puffer.

Der nichtgebundene Anteil (600 bis 650 mg) besitzt einen USP-Titer in der Nähe von 1 bis 2 I.E./mg und einen Yin-Wessler-Titer von 10 bis 20 Einheiten/mg.

Der gebundene Anteil (10 bis 30 mg) besitzt einen USP-Titer von 10 bis 20 I.E./mg und einen Yin-Wessler-Titer von 1000 bis 1400 Einheiten/mg.

Die Angaben bezüglich des Molekulargewichts sind keine absoluten Angaben, sondern bezogen auf die Ausgangsfraktion. "Niedriges Molekulargewicht" bedeutet, daß die erhaltenen Fraktionen nach den zwei aufeinanderfolgenden alkoholischen Extraktionen ein Molekulargewicht im beanspruchten Bereich haben, d. h. niedriger als das Molekulargewicht des natürlichen Heparins. Die Bezeichnung "sehr niedriges Molekulargewicht" bezieht sich auf eine Mischung, die nach Behandlung mit Manganchlorid erhalten wurde, wobei die Nukleinsäuren entfernt worden sind und wobei sich das durchschnittliche Molekulargewicht weiter erniedrigte.

Fig. 8 zeigt drei Fraktionen, die durch Gelfiltration aufgetrennt wurden und aus der Fraktion ohne Nukleinsäuren erhalten wurde.

Beispiel 7

Man vereinigt die Fraktionen A, B und C des Beispiels 5 zu einer einzigen Fraktion, die man dann einer zusätzlichen Fraktionierung durch selektive Bindung an einer Agarose/Antithrombin-III-Säule unter Anwendung der in Beispiel 6 beschriebenen Bedingungen unterwirft.

Man eluiert die gebundene Fraktion und erhält die Fraktion V194HHPA, die einen Yin-Wessler-Titer von 310 Einheiten/mg und einen USP-Titer von 40 I.E./mg aufweist.

In gleicher Weise vereinigt man die Fraktionen E und F des Beispiels 5. Dann führt man die Trennung der aktivsten Fraktionen durch die oben beschriebene Bindungs/Elutions-Technik mit Hilfe der Agarose/Antithrombin-III-Säule durch.

Schließlich erhält man die Fraktion V194HHPF mit einem Yin-Wessler-Titer von 900 Einheiten/mg und einem USP-Titer von 82 I.E./mg.

Die Fraktionen V194HHPA und V194HHPF werden einer Protonen-(¹H)-Kernresonanzanalyse unterworfen. Das gleiche bewirkt man mit herkömmlichem Heparin (7021HH).

Man bewirkt die Kernresonanzanalyse der Produkte, die man zuvor in deuteriertem Wasser in Mengen von 14 bis 62 mg/0,35 ml gelöst hat, bei 270 MHz in einer Vorrichtung, die mit einem FOURIER-Transformationssystem ausgerüstet ist und die Speicherung der Spektren ermöglicht. Man bestimmt die chemische Verschiebung gegenüber dem Referenzsignal von TSP, wie es oben angegeben ist.

In der Fig. 10 ist das Kernresonanzspektrum des herkömmlichen Heparins dargestellt. Die Fig. 11 und 12 sind für die Kernresonanzspektren der Fraktionen V194HHPF und V194HHPA repräsentativ.

Ein Vergleich der Kernresonanzspektren läßt erkennen, daß die Signale (I₁) und (I₅) der erfindungsgemäßen Fraktionen wesentlich weniger intensiv sind als das Signal (G₁), während diese Signale bei dem Heparin-Vergleichsspektrum im wesentlichen die gleiche Intensität besitzen.

Beispiel 8

Durch Anwendung der in den Beispielen 6 und 7 gegebenen Verfahrensweisen auf andere Ausgangsmaterialien erhält man in ähnlicher Weise die folgenden Fraktionen:

Fraktion P219HH: USP-Titer = 14 I.E./mg Yin-Wessler-Titer = 1350 Einheiten/mg
Fraktion P225HH: USP-Titer = 17 I.E./mg Yin-Wessler-Titer = 1320 Einheiten/mg
Fraktion P231HH: USP-Titer = 16,2 I.E./mg Yin-Wessler-Titer = 1400 Einheiten/mg
Fraktion P242HHA: USP-Titer = 16 I.E./mg Yin-Wessler-Titer = 1800 Einheiten/mg
Fraktion P255HHA: USP-Titer = 36 I.E./mg Yin-Wessler-Titer = 2145 Einheiten/mg

Als Ausgangsmaterial für diese Fraktionen wurden 17 kg Heparinmaterial verwendet mit einem USP-Titer von 5 Einheiten/mg und einem Yin-Wessler-Titer von 10 Einheiten/mg. Dieses Material war wie folgt zusammengesetzt: 50% bestanden aus Subfraktionen, die im Verlauf der Aufreinigung von Rohheparin erhalten wurden und 50% stammten aus Subfraktionen, die beim Umwandeln von injizierbarem Natriumheparin in injizierbares Calciumheparin anfielen. Dieses Ausgangsmaterial wurde auf die in den Beispielen 6 und 7 beschriebene Weise behandelt, d. h. es wurde der überwiegende Anteil der Nukleinsäuren durch Ausfällung mit Manganchlorid entfernt, es erfolgte eine alkoholische Fraktionierung gemäß Beispiel 6, es wurde eine Gelfiltration auf ULTROGEL® AcA 44 durchgeführt und es wurden die Fraktionen A, B und C wie in Beispiel 7 beschrieben vereinigt und eine Affinitäts-Chromatographie auf Sepharose-AT® III durchgeführt. Durch chromatographieren der Mischung A-B-C in vier aufeinanderfolgenden Chromatographie-Durchläufen wurden die Fraktionen P219HH, P225HH, P231HH und P242HHA erhalten.

Die Fraktion P255HHA wurde, ausgehend von dem oben beschriebenen Ausgangsmaterial und unter Durchführung der ersten drei Bearbeitungsschritte, erhalten. Anschließend an die Gelfiltration auf ULTROGEL® AcA 44 wurden jedoch die Fraktionen C und D vereinigt und über Sepharose-AT® III chromatographiert.

Man unterwirft die Fraktion P242HHA der Kohlenstoff-13-(¹³C)-Kernresonanzanalyse (Fig. 14 und 15). Man unterwirft auch übliches Heparin der Referenz 7071HH dieser Kernresonanzanalyse (Fig. 13). Man ermittelt die Spektren der Fraktionen, die man in Mengen von 100 mg in jeweils 1 ml deuterierten Wasser (D₂O) gelöst hat unter Verwendung eines bei 20 MHz betriebenen Meßgeräts, das mit einem FOURIER-Transformationssystem ausgerüstet ist (wobei man als Referenzsignal für die chemische Verschiebung Tetramethylsilan (TMS) verwendet).

Man beobachtet:

die praktische Abwesenheit eines Resonanzsignals, das für die Anwesenheit von Hydroxylgruppen an dem primären Kohlenstoffatom (in der 6-Stellung der in den erfindungsgemäßen Mucopolysaccharidfraktionen enthaltenen Glucosamin-Einheiten) charakteristisch ist;
zusätzliche Signale (die in dem NMR-Spektrum des als Vergleichsmaterial verwendeten Heparins im Bereich der Signale (I₁) und (G₁) nicht enthalten sind) in Bereichen, die einer chemischen Verschiebung von etwa 100 ppm entsprechen;
ein zusätzliches Signal im Bereich von 60 ppm, das in der Nähe des Signals (G₂) liegt;
die Anwesenheit eines Resonanzsignals im Bereich von 75 ppm (dem normalerweise kein Resonanzsignal des unter gleichen Bedingungen aufgezeichneten NMR-Spektrums des herkömmlichen Heparins entspricht);

(die oben angegebenen chemischen Verschiebungen sind auf die Methylgruppe der N-Acetylglucosamin-gruppen bezogen, die in dem erfindungsgemäßen Mucopolysaccharid enthalten sind (siehe den Bereich von 25 ppm in den Spektren der Fig. 14 und 15)).

Signale, die den erfindungsgemäßen Fraktionen oder Verbindungen eigen sind, sind in den Fig. 14 und 15 mit einem Sternchen gekennzeichnet.

Die Fig. 15 enthält weiterhin eine CI-Integrationskurve, aus der zu erkennen ist, daß

die untersuchte Verbindung homogen und damit praktisch rein ist,
daß sie die Eigenschaften eines Dekasaccharids besitzt und
daß sie eine N-Acetylglucosamin-Einheit pro zwei 2-O-Sulfatiduronsäure-Einheiten und pro zwei N-Sulfat-glucosamin-Einheiten

aufweist.

Die Erfindung ermöglicht somit die Herstellung von Mucopolysaccharidfraktionen mit einer hohen Anti-Xa-Wirkung, die in bezug auf den Faktor Xa eine bemerkenswerte Selektivität im Rahmen der nacheinander ablaufenden enzymatischen Reaktionen, die für den Blutgerinnungsprozeß charakteristisch sind, zeigen.

Diese bemerkenswerte Aktivität und Selektivität wird auch durch die Ergebnisse von pharmakologischen Untersuchungen verdeutlicht, die nachstehend angegeben sind und die mit der Fraktion P188CH durchgeführt wurden, die nach der Umwandlung der Fraktion P194HHC des Beispiels 1, die in Form des Natriumsalzes vorlag, mit Hilfe des oben beschriebenen Verfahrens in das Calciumsalz überführt worden ist.

Diese Ergebnisse werden durch die Kurven der Fig. 2 bis 7 verdeutlicht, die den Vergleich der Antikoagulationswirkung der erfindungsgemäßen Mucopolysaccharidfraktion einerseits mit der eines herkömmlichen Heparins (mit einem USP-Titer von 170 Einheiten/mg) andererseits verdeutlichen.

Die Kurven der Fig. 2 bis 5 zeigen die in vitro beobachtete Veränderung der Koagulationszeit in Humanblutplasma in Abhängigkeit von der Steigerung der Dosis eines herkömmlichen Heparins einerseits und der erfindungsgemäßen Fraktion P188CH andererseits (wobei die den Fig. 4 und 5 entsprechenden Tests mit blutplättchenfreiem Plasma, das demzufolge an dem Faktor XI verarmt ist, durchgeführt wurden).

Die Fig. 6 und 7 verdeutlichen die in vivo am Kaninchen ermittelten Vergleichsergebnisse mit der gleichen Fraktion P188CH (Fig. 6) und dem Vergleichsheparin (Fig. 7) (wobei die angegebenen Ergebnisse an Gruppen von jeweils fünf Kaninchen ermittelt wurden). Jedem Kaninchen wurden 500-Yin-Wessler-Einheiten pro kg der zu untersuchenden Substanz gegeben.

Die Fig. 2 bis 5 zeigen die durch die verabreichten Materialien, insbesondere der Mucopolysaccharidfraktion (Kurven a₁, a₂, a₃ und a₄) und des Vergleichsmaterials Heparin (Kurven b₁, b₂, b₃ und b₄) erreichte zeitliche Änderung (in s)
des Thrombingehalts (Fig. 2).
des Kephalin-Kaolin-Gehalts (Fig. 3) und
der Koagulation in Gegenwart von konzentriertem Thromboplastin (Fig. 4) und von verdünntem Thromboplastin (Fig. 5) in Abhängigkeit von den Dosierungen, die jeweils in USP-Einheiten/mg angegeben sind.

Die Thrombin-Zeit und die Cephalin-Kaolin-Zeit stellen Messungen dar, die die Wirkung der untersuchten Verbindungen auf die Inhibierung des aktivierten Faktors II bzw. die Gesamtkoagulation widerspiegeln. Die Kurven der Fig. 2 und 3 zeigen in dieser Hinsicht deutlich, daß die erfindungsgemäße Mucopolysaccharidfraktion im Vergleich zu der Vergleichssubstanz Heparin eine wesentlich geringere Wirkung auf die Inhibierung der Inaktivierung des Prothrombins und auf das Ausmaß der Gesamtkoagulation ausübt. Im Gegensatz dazu zeigen die Fig. 4 und 5, die repräsentativ für die Phänomene sind, die direkter mit dem Ablauf der enzymatischen Reaktionen verbunden sind, die für die exogene (extrinsic) Koagulation charakteristisch ist (insbesondere in bezug auf die Abwesenheit des Faktors IIa), einen deutlichen Vorteil der erfindungsgemäßen Mucopolysaccharidfraktion gegenüber der Vergleichssubstanz Heparin. Die erfindungsgemäße Mucopolysaccharidfraktion verursacht unter diesen Bedingungen eine langsamere Koagulation der Blutprobe.

In der Fig. 6 sind die Änderungen der bei einem Kaninchen gemessenen Aktivitäten in Abhängigkeit von der Zeit in Stunden dargestellt, dem 500-Yin-Wessler-Einheiten einer erfindungsgemäßen Mucopolysaccharidfraktion verabreicht worden waren. Zur Bewertung dieser Aktivitäten wurde auf die Änderung der Yin-Wessler-Titer (Kurve YW₅) und der Cephalin-Kaolin-Titer (Kurve CKT₅) (I.E./ml Plasma) in Abhängigkeit von der Zeit in Stunden Bezug genommen.

Die gleichen Messungen wurden mit der Vergleichssubstanz Heparin durchgeführt. Die entsprechenden Änderungen der Akivitäten sind in den Kurven YW₆ und CKT₆ der Fig. 7 dargestellt.

Aus der Fig. 6 ist zu erkennen, daß die Verabreichung von 500-Yin-Wessler-Einheiten des erfindungsgemäßen Mucopolysaccharids zu einer beträchtlichen Anti-Xa-Wirkung führt, im Vergleich zu der gesamten Koagulationswirkung, ausgedrückt in CKT-Einheiten, die relativ gering ist. Es ist beispielsweise festzuhalten, daß die Yin-Wessler-Aktivität in der zweiten Stunde 0,85 Einheiten/ml beträgt, während die CKT-Aktivität lediglich 0,15 I.E./ml ausmacht. Im Gegensatz dazu verursacht die Verabreichung von 500-Yin-Wessler-Einheiten pro ml der Vergleichssubstanz Heparin einen über den CKT-Titer ausgedrückten Effekt, der wesentlich größer ist im Vergleich zu der über den Yin-Wessler-Titer meßbaren Anti-Xa-Aktivität. Insbesondere ist festzuhalten, daß in der zweiten Stunde die Anti-Xa-Aktivität 0,55 Einheiten/ml entspricht, während die gesamte Antikoagulanswirkung als CKT-Titer gemessen 0,38 I.E./ml beträgt. Die Differenz zwischen diesen beiden Titern ist damit wesentlich geringer als bei dem erfindungsgemäßen Mucopolysaccharid. Das Verhältnis von Yin-Wessler-Titer zu dem CKT-Titer verändert sich somit von einem Wert von weniger als 2 bei der Vergleichssubstanz Heparin zu einem Wert von mehr als 5 bei der erfindungsgemäßen Mucopolysaccharidfraktion.

Die in vitro- und die in vivo-Tests zeigen somit eine deutlich selektivere Wirkung der erfindungsgemäßen Mucopolysaccharidfraktion, insbesondere in bezug auf die Inhibierung des Faktors Xa, im Vergleich zu der Vergleichssubstanz Heparin.

Die erfindungsgemäßen Mucopolysaccharidfraktionen sind frei von toxischen Wirkungen. Die Verabreichung von 10 000 Einheiten/kg (Yin-Wessler-Titer) irgendwelcher erfindungsgemäßer Fraktionen verursacht beim Kaninchen weder irgendwelche toxischen Reaktionen noch irgendeine pyrogene Wirkung bei dem Pyrogenitätstest am Kaninchen nach der Methode der französischen Pharmacopoe.

Gegenstand der Erfindung sind daher insbesondere Mucopolysaccharidfraktionen der beschriebenen Art, die insbesondere eine Aktivität von mindestens 40 und noch bevorzugter mindestens 50 und am bevorzugtesten von mindestens 100 Einheiten/mg (Yin-Wessler-Titer) aufweisen. Fraktionen mit einem Yin-Wessler-Titer von mehr als 300 und insbesondere von mehr als 900 Einheiten/mg sind noch stärker bevorzugt.

Gegenstand der Erfindung sind daher auch pharmazeutische Zubereitungen oder Arzneimittel ähnlicher Aktivität, die frei von pyrogenen Substanzen sind und die erfindungsgemäßen Mucopolysaccharidfraktionen in Kombination mit üblichen pharmazeutischen Bindemitteln, Trägermaterialien und/oder Hilfsstoffen enthalten. Gegenstand der Erfindung sind insbesondere injizierbare, sterile, konzentrierte Lösungen dieser Fraktionen, die in der Therapie zur Steuerung der Blutgerinnung verwendet werden können, welche Lösungen 1000 bis 100 000, vorzugsweise 5000 bis 50 000 und insbesondere 25 000 Einheiten/mg (Yin-Wessler-Titer) der Mucopolysaccharidfraktion enthalten, wenn diese Lösungen durch subcutane Injektion verabreicht werden sollen, und welche Lösungen beispielsweise 500 bis 10 000 und insbesondere 5000 Einheiten/ml der Mucopolysaccharidfraktion enthalten, wenn sie durch intravenöse Injektion oder durch Perfusion gegeben werden sollen.

Die erfindungsgemäße Mucopolysaccharidfraktion liegt mit Vorteil in Form eines Salzes mindestens eines physiologisch annehmbaren Metalls, wie Natrium und/oder Calcium vor. Mit Vorteil liegen diese erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen in Form von einmal verwendbaren Injektionsspritzen vor, die jederzeit angewandt werden können.

Die erfindungsgemäßen Zubereitungen sind insbesondere für die (vorbeugende oder heilende) Beeinflussung der Blutkoagulation oder Blutgerinnung am Menschen oder beim Tier geeignet, insbesondere in jenen Fällen, wenn bei dem Organismus das Risiko der Hyperkoagulierbarkeit besteht, insbesondere in jenen Fällen, bei denen eine Störung der oben angesprochenen exogenen Phase vorliegt, beispielsweise als Folge der Freisetzung von Thromboplastin durch den Organismus, beispielsweise von Gewebethromboplastin (chirurgische Operationen, atheromatöse Prozesse, Tumorentwicklung, Störungen des Koagulationsmechanismus durch bakterielle oder enzymatische Aktivatoren). Lediglich zur weiteren Verdeutlichung der Erfindung und ohne daß dadurch der Schutz in irgendeiner Weise eingeschränkt werden soll, sei im folgenden beispielsweise die Dosierung angegeben, die in der Humantherapie angewandt werden kann: Diese Dosierung umfaßt beispielsweise die Verabreichung von 1000 bis 25 000 Einheiten auf subcutanem Wege zwei- bis dreimal täglich in Abhängigkeit von dem Hyperkoagulationsrisiko oder dem thrombotischen Zustand des Patienten; oder von 1000 bis 25 000 Einheiten/24 Stunden auf intravenösem Wege bei diskontinuierlicher Verabreichung in regelmäßigen Intervallen oder bei kontinuierlicher Verabreichung durch Perfusion; oder von 1000 bis 25 000 Einheiten (dreimal wöchentlich) bei intramuskulärer Verabreichung (wobei die angegebenen Einheiten sich auf den Yin-Wessler-Titer beziehen). Die Dosierungen sollten natürlich bei jedem Patienten in Abhängigkeit von den Ergebnissen der zuvor durchgeführten Blutanalysen, der Art der Störung, an der der Patient leidet, und ganz allgemein seinem Gesundheitszustand eingestellt werden.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Anwendung der erfindungsgemäßen Mucopolysaccharidfraktionen als biologische Reagenzien, die im Laboratorium verwendet werden können, insbesondere als Vergleichsmaßstab für die Untersuchung anderer Substanzen, deren Antikoagulierwirkung untersucht werden soll, insbesondere im Hinblick auf die Inhibierung des Faktors Xa.

Es versteht sich, daß die vorliegende Erfindung nicht auf diese Anwendungszwecke und Ausführungsformen beschränkt ist. Sie umfaßt im Gegenteil auch sämtliche Abänderungen, insbesondere jene im Hinblick auf das oben definierte wäßrig-alkoholische Extraktionsmedium, das auch aus einer Mischung aus Wasser und einem von Äthanol verschiedenen Alkohol, wie beispielsweise einem anderen aliphatischen oder aromatischen Alkohol, vorzugsweise einem cyclischen oder acyclischen gesättigten aliphatischen Alkohol, wie einem primären Alkohol mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, bestehen kann, wobei es sich versteht, daß in jedem Fall die Wasser/Alkohol-Verhältnisse des Mediums durch einfache Routineuntersuchungen bestimmt werden sollten, die zu einer Extraktion der Mucopolysaccharidfraktion führen, die derjenigen äquivalent ist, die man mit einer Wasser/Äthanol-Mischung mit einem Titer von 55 bis 60°GL erhält.

Claims

1. Mucopolysaccharidfraktion erhältlich aus einem Material auf Basis von Heparin oder Heparinbestandteilen, deren Molekulargewichte im wesentlichen zwischen 2000 und 50 000 liegen, und das einen verminderten Gehalt an Mineralsalzen von vorzugsweise weniger als 1 Gew.-% aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Heparin-Mucopolysacchariden besteht, die im wesentlichen ein Molekulargewicht von etwa 2000 bis 10 000 haben und die folgenden Eigenschaften aufweisen: daß die Mischung in wäßrig-alkoholischem Medium (Wasser/Ethanol) mit einem Titer von 55 bis 61° GL löslich, aber unlöslich in reinem Alkohol ist, daß der YW-Titer mindestens 40 U/mg beträgt, daß das Verhältnis von YW zu USP dieser Mischung mindestens 2 ist,
und ihre pharmakologisch annehmbaren Metallsalze.

2. Mucopolysaccharidfraktion nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Heparin-Mucopolysaccharidfraktionen besteht, die ein Molekulargewicht von höchstens etwa 4000 haben und Fraktionen mit einem Molekulargewicht im Bereich von 4000 bis 10 000.

3. Mucopolysaccharidfraktion nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Verhältnis von YW- zu USP-Titer im Bereich von 3 bis 5 aufweist.

4. Mucopolysaccharidfraktion nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der YW-Titer mindestens 100 U/mg beträgt.

5. Mucopolysaccharidfraktion nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der YW-Titer mehr als 130 U/mg beträgt.

6. Mucopolysaccharidfraktion nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Verhältnis von YW zu USP von mehr als 65 und eine YW-Aktivität von mehr als 1300 U/mg aufweist.

7. Mucopolysaccharidfraktion nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie homogene Oligosaccharide mit primären sulfatierten Glucosamingruppen aufweist, wobei eine N-Acetylglucosamingruppe pro zwei 2-O-sulfatsauren Iduronsäuregruppen und pro zwei N-Sulfatglucosamingruppen vorhanden ist, wobei diese Fraktion aus Oligosacchariden mit 8 bis 12 Monosaccharideinheiten besteht.

8. Verfahren zur Herstellung einer Mucopolysaccharidfraktion gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Material auf Basis von Heparin oder Heparinbestandteilen, deren Molekulargewichte im wesentlichen zwischen 2000 und 50 000 liegen und das einen verminderten Gehalt an anorganischen Salzen von vorzugsweise weniger als 1 Gew.-% aufweist, in einem wäßrig-alkoholischen Medium des Wasser/Ethanoltyps mit einem Titer zwischen etwa 55 und etwa 61°GL suspendiert und anschließend in an sich bekannter Weise die unlösliche Fraktion abtrennt und die Lösung, die die gelöste Mucopolysaccharidfraktion enthält, gewinnt, aus der wiederum die Mucopolysaccharidfraktion gewonnen wird, insbesondere durch alkoholische Fällung, und gegebenenfalls diese Mischung mit immobilisiertem AT-III in Kontakt bringt.

9. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine wirksame Menge einer Mucopolysaccharidfraktion nach einem der Ansprüche 1 bis 7.

10. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Form einer sterilen, injizierbaren, konzentrierten Lösung der Mucopolysaccharidfraktion vorliegt, die 1000 bis 100 000 Einheiten YW/ml enthält, wenn diese Lösung zur subcutanen Injektion verwendet wird, oder 500 bis 10 000 Einheiten YW/ml, wenn sie für die intravenöse Injektion oder Perfusion bestimmt ist.