JPH03243601A - 血液凝固の制御能をもつムコ多糖組成物およびその製造方法 - Google Patents

血液凝固の制御能をもつムコ多糖組成物およびその製造方法

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JPH03243601A
JPH03243601A JP2321340A JP32134090A JPH03243601A JP H03243601 A JPH03243601 A JP H03243601A JP 2321340 A JP2321340 A JP 2321340A JP 32134090 A JP32134090 A JP 32134090A JP H03243601 A JPH03243601 A JP H03243601A
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ジャン・クロード・ロルモ
Jean Goulay
ジャン・グライ
Jean Choay
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、生物学的特性を備えていて、それがために特
に血液凝固に関して調節因子の役割をつとめることがで
きるムコ多糖画分に関する。かかる画分は特に哺乳類の
組織抽出物のごときヘパリン製剤から得ることができる
。
現状においてヘパリンは、最も重要なものではないにし
ても、臨床医が入手できる極めて重要な抗凝血薬の１つ
であることは疑う余地がない。実際ヘパリンは、血液の
凝固亢進を生じ得るような情況で、通常生理学的な止血
過程に係わっている一連の酵素反応のいくつかの段階に
関与し得る。
同時にヘパリンは、特に、種々の形態の凝固亢進を起こ
したり維持したりすることにあづかる多数の凝固因子を
抑制することができる。
以下の説明を明らかにするのに必要な範囲内で、凝血に
関する基礎的な一般概念のいくつかを簡単に述べる。凝
血過程は、実際に、互いに複雑に関係し合ってはいるが
一般に連続して起こると説明されている次の３つの段階
からなっている。
トロンボプラスチン生成段階、すなわちプロトロンビナ
ーゼ（又は活性トロンボプラスチン）生成段階、 トロンビン生成段階、すなわち、カルシウムイオンの存
在下でプロトロンビナーゼの作用によってプロトロンビ
ンがトロンビンに変換される段階、最後は、 フィブリン生成段階、すなわちトロンビンの作用により
血液のフィブリノーゲンがフィブリンに変換される段階 であり、この蛋白質は不溶性になる傾向がある。
プロトロンビナーセの生成は、トロンボプラスチン生成
過程において、本質的に２つの異なる経路によって起る
。すなわち、２つの経路とは、固有の即ち内因的な経路
と、外来の即ち外因的な経路であって、それぞれ血漿由
来および組織由来のプロトロンビナーゼが生成する。こ
の２種のプロトロンビナーゼは共にプロトロンビンを活
性なトロンビンに活性化し得る。
固有の即ち内因的な経路（又は系）には、次々に活性化
され得る多数の因子即ち血漿のプロ酵素（酵素前駆体）
が関与しており（Ｘｌ、　Ｘｌ、　ＩＸ、■およびＸ因
子）、活性化された生成物（ＸＩａ、ＸＩａ。
ＩＸ　ａ　、■ａおよびＸａ因子）は、それぞれ、次の
プロ酵素を活性化し得る酵素として作用する。活性化さ
れたＸ因子（Ｘ　２）は、特にＶ因子および血小板由来
のリン脂質と反応することによって、活性のある内因的
血漿由来プロトロンビナーゼの生成に関与する。
外来の即ち外因的な系は、特に組織の障害に直接依存し
得るものであるが、内因系よりも少数の因子を必要とす
るもので、特に組織トロンボプラスチンの生成が関与し
ている。組織トロンボプラスチンは■因子と組んで、丁
度■ａ因子と同じように、不活性なＸ因子をＸａ因子に
変換する。この場合、プロトロンビンがトロンビンに活
性化される過程は本質的に内因系と同じであるが、ここ
では組織由来のリン脂質が関与しており血漿由来のもの
ではない。
それゆえに、ある意味では、固有の経路と外来の経路は
双方ともＸ因子の活性化のレベルで（Ｘ因子はＳ＋ａｚ
Ｎ因子とも呼ばれる）−緒になるので、それに続く２つ
の凝血段階、即ちトロンビン生成およびフィブリン生成
は、最早固有経路と外来経路との間の差違を生じないと
考えることができる。
凝血過程が起こると、特にこの過程の引金を弓く原因と
なった、例えば血管の損傷部をふさぐために不溶性のフ
ィブリン血塊が生成することになる。
これらの凝血過程の後、通常、特にプラスミンの作用の
もとで、血塊の溶解を生起させるために、線維素溶解（
線溶）と称される過程が起こる。プラスミンなる酵素は
通常不活性な前駆体、即ちプラスミノーゲンの形で循環
血液中に存在するが、フィブリンは不活性なプラスミノ
ーゲンからフィブリン溶解活性のあるプラスミンへの変
換を起こさせ得る因子の１つになっている。
時間的に続いて起る２つの過程として凝血と線維素溶解
の系を呈示したが、実際問題として普通はそうなってな
い。すなわち、実際には、調和のとれた反対に作用する
活性化因子と阻害因子に依存する極めて複雑な過程に従
う均衡のとれた機構が関与しているのである。凝固亢進
という意味でこれらの機構の不均衡が生じると血栓が形
成され得る。また、凝固低下という意味で平衡がやぶれ
ると患者に出血の危険が生じる。
凝血−線溶機構の平衡が乱される毎に、例えば患者に外
科手術を施した際に、この平衡を復元するためにヘパリ
ンの強力な抗凝血特性に頼らざるを得ないことが多いの
は、明らかに凝固亢進の影響を軽減するためである。し
かしながら、この再平衡の試みは極めてデリケートであ
って、その結果、凝固亢進の危険例えば、術後血栓症の
出現を防止する目的であまりに大量の抗凝血剤を投与し
たり、抗凝血剤の選択性が不完全であったりすると、最
終的に重篤な出血の原因となりかねないのである。それ
故に、この処置を受けた患者を常に監視する必要があり
、また、連続的にせよ不連続にせよ、特にＨｏｖ＋　ｌ
　１時間のごとき総括的凝血性についての試験結果（こ
れは一定の時間間隔で行なわなければならない）に照し
て投与量を調整する必要がある。
それゆえに本発明の目的は、上述の困難を少なくとも部
分的に克服することができる医薬の有効成分および医薬
自体を提供することてあり、特に、患者を凝固亢進の危
険にさらす外科手術のごとき処置を受けて凝血の病理に
なやんでいる徹者に、凝血−線溶系を臨床的に監視する
経費をより少なくして再平衡を可能にしかっ／又はより
容易に調節することができる医薬の有効成分（および医
薬自身）を提供することである。
本発明は、さらに詳細には、凝血に関し調節剤としての
効果を発揮し、特に凝血を遅らせ、しかもより少数の凝
血因子に関し、特に活性化されたＸ因子に関してヘパリ
ンの作用よりもさらに選択的な阻害作用を有するムコ多
糖画分に関する。
それゆえに、本発明は、ヘパリンから得られるムコ多糖
画分に関し、又は哺乳動物の組織から抽出によって得ら
れるような分子量が特に約２０００から５０．０００に
およぶヘパリン様構成成分を含む画分から得られるムコ
多糖画分に関する。この画分は、アルコール度５５〜６
１’　ＧＬの水性アルコール媒質（水−エタノール）に
可溶であり、それよりもアルコール含量の高い水−エタ
ノール媒質には次第に溶解度が低下し、純粋なアルコー
ルには不溶であり、抗Ｘａ価（イン−ウェスラー価のこ
と。
以下、Ｙｉｏ−Ｗｅｓｔｌｅｒ価とする）と総括的凝血
強度（ＵＳＰ価−後述−のこと。以下、ＵＳＰ価と記載
する）との比が少なくとも２、特に少なくとも３に等し
く、好ましくは６よりも大であることを特徴とする特に
、本発明は、アンチトロンビンＩＩＩに固定され得る分
子量４．０００未満のヘパリン様ムコ多糖類のみからな
るかなり精製されたムコ多糖画分にも係り、このムコ多
糖画分は、アルコール度５５〜６１’　ＧＬの水性アル
コール媒質（水エタノール）に可溶であるが純アルコー
ルに不溶であり、少なくとも４０単位／ｍｇの抗Ｘａ（
インウニスラー）価、および少なくとも約３の抗Ｘａ価
／総括的凝血強度比（ただし総括的凝血強度は０でない
）を有することを特徴とする。
これらのムコ多糖画分をさらに分画すると、Ｙｉｎ−Ｗ
ｃ＋＋ｌｅｒ価の点で特異的な活性が高（、Ｙｉ。
Ｗｅｓｇｌ！ｒ価とＵＳＰ価の比が１０より太きく１６
にもなるムコ多糖画分の製造が可能になる。
このＹｉｏ−１ｒｅｓｓｌｅｒ価（抗Ｘａ価）はＪ、　
Ｌｇｈ、　ＣＩ　ｉｎ。
Ｍｅｄ、　、　１９７３．　Ｖｏｌ、　８１　；　　２
９８〜３００に述べられている本発明者らの技法で測定
される。
ＵＳＰ価はよく知られており、所定の条件下で総括的凝
血強度を示すものであって、米国薬局方ＸＩＸ版２２９
〜２３０ページに記載の方法で測定されることを想起さ
れたい。（「医薬物質と投与形態」と題する第二補遺［
ｌ５Ｐ−ＮＦ、　６２ページ、および第四補遺９０ペー
ジも参照されたい）。
本発明は、Ｘａ因子を極めて選択的に阻害する能力を持
つ特に重要な活性成分を提供するものである。この活性
は、総括的凝血に関する活性と対照をなすものであって
、本発明においては総括的凝血活性は極めて低い水準に
維持することができる。
このムコ多糖画分は、それゆえに、トロンビン形成段階
に近い段階、実際には上記の固有経路と外来経路とが交
差する時期以降で関与するある種の活性化因子を優先的
に阻害して、今日治療に用いられているヘパリンによっ
て生ずるのと同程度の凝固亢進の危険を防止できるにも
かかわらず、上記の選択性によって、従来のヘパリンで
生ずるごとき出血の危険に至ることはないという、特に
有利な抗凝血薬の活性成分を構成するのである。
実際ヘパリンは、単にＸａ因子のみでなく、凝血過程の
他の段階において、Ｘａ因子の前および後に作用する他
の因子、例えばＩＩａ因子をも阻害する。病理学的原因
又はある外部的操作、例えば外科的手術の影響下にあっ
て線溶系が平衡を失う傾向にある際、生体内における凝
血−繊維素溶解系の再平衡（平衡復元）は、いくつかの
凝血因子に対して同時・無差別に作用し得る医薬を用い
る場合よりも、むしろ、特定の因子即ちＸ因子に作用す
る、さらに特定的にはＸａ因子を阻害できるように選択
的に作用する医薬を用いた場合の方かより容易に達成さ
れると考えられる。
本発明は上記のようなムコ多糖画分を得る方法にも関す
るものであって、この方法は次の工程からなる。
アルコール度が約５５６ＧＬと約６１’　ＧＬの間で、
好ましくは５８°ＧＬ程度である水・エタノールのよう
な水性アルコール媒質に、ヘパリンを主体とする物質、
又は分子量が特に　２．０００〜５０．０００の範囲内
にあり、かつ無機塩含有量の低い、好ましくは１重量％
未満のヘパリン様構成成分を主体とする物質を懸濁せし
め、 不溶性画分を分離し、ムコ多糖画分が溶解している溶液
を回収し、次いでこの溶液から、特に上記の水性アルコ
ール媒質によるアルコール沈澱によって、溶解している
ムコ多糖画分を分離する。
本発明のムコ多糖を抽出できる出発材料は、通常の注射
可能な医薬品品質のヘパリンでもよいし、哺乳動物の組
織或いは器官、特に、例えば豚又は牛の腸粘膜又は肺か
らヘパリン活性成分を抽出する操作をした後に得られる
ごとき粗ヘパリンでもよい。また、勿論特異活性の低い
廃棄物が尚ヘパリン様構成成分を含んでいるならば、注
射可能な品質を有し、かつ高めの特異活性を有するヘパ
リンを得るために上記の粗ヘパリンを精製する際通常は
廃棄される画分を出発原料とすることもできる。
次に、このような原材料（本質的に蛋白、核酸および無
機塩をほとんど含まず、好ましくは無機塩の含有量が１
重量％未満）から、５５°〜６１°ＧＬのアルコールに
よる抽出で、Ｙｉｎ−Ｗｅｔｓｌｅｒ価とＵＳＰ価との
比が約２〜約５、特に３〜５である低分子量の構成成分
を含むムコ多糖画分を得ることができる。
アルコール度が６１°ＧＬより高い水−エタノール混合
溶媒を用いると、抽出収率がほぼゼロとなることに注意
されたい。これに反し、アルコール度５５°ＧＬ未満の
水性アルコール媒質を用いると、構成成分の可溶化を来
し、製品にこれが入るとＹｉｎ−Ｗｅｓ＋ｌｅｔ価とＵ
ＳＰ価との比を低下せしめる。
注目すべきは、上述の操作によって得たムコ多糖画分を
、所定の割合の食塩のごとき無機塩の存在下での一定の
濃度の水性アルコール媒質による再度の選択的沈澱又は
ゲル濾過のごとき種々の技術によってさらに分画処理で
きるということである。
追加の分画は、前辺て水に再度溶解した各々のムコ多糖
画分に補足的な操作過程を適用することによって達成で
きる。この過程では、上記の水溶液に１〜２倍容量のエ
タノールとｌＯ〜１００ｇ／ｊ２の食塩とを加え、一方
では活性が変ることなく生成した沈澱を集め、他方では
上溝液に溶けたままでいる含有物を特に更にアルコール
沈澱法で集める。これによって、　Ｙｉｎ−Ｗｅｓｓｌ
ｅｔ価とＵＳＰ価の比が最初の画分の比、特に約３より
も更に高く、６〜８程度になった分画製品を得る。
Ｙｉｎ４ｅ＋＋ｌｃｒ価とＵＳＰ価との比（以下、Ｙｉ
。
・Ｗｓ＋ｘｌｅ＋／ＵＳＰ比と言う）が更に高いムコ多
糖画分は、５５〜６１°ＧＬの水性アルコール媒質によ
る最初の抽出で得た画分を先ずｐｉ（’１．ｓの０．５
１ｉ１ＮａＣｆｌＯ，ＬＭ　ｌ−リスーＨＣｊ２溶液な
どのような水性溶媒に再溶解した後にゲル濾過を行って
も得ることができる。このような溶液を、たとえば市販
名ＵＬＴＲＯＧＥＬ＾ｅＡ　４４なるビーズ状のポリア
クリルアミドとアガロースのゲルを通過させることがで
きる。
このゲルの有効分画ゾーンは有効分子量４．０００と６
０、０００　（線状分子の場合）の間にある。
本発明の高いＹｉａ　−Ｗｅｓｓｌｅｒ／ＵＳＰ比を持
つムコ多糖画分は、直径１１１１）ｍ、高さ１ｍのカラ
ムを用い、分画すべきムコ多糖の濃度とカラムに載せる
溶液の容量とをそれぞれ５０ｍｇ／ｍｌ、３７５１とし
、流速２００　ｍｌ／時でゲル濾過を行なった際に、デ
ッドボリューム（空容積）を入れずに（このデッドボリ
ュームとはゲルの入ったカラムに収容される液の容量、
特にゲル粒子の間の空隙に含まれる液容量を言う）　　
２．５１の液が溶出した後に流出して来る分である。最
も活性の高い画分は、この時に（２５１の後に）出て来
る　１．５１中に含まれる。最初に出る　２．５ｊ！に
含まれるものは、大部分ヘパラン硫酸即ちヘパリチン硫
酸から成っており、分子量が大きくて粘度が高く、しか
も抗凝血活性を持っていない。
１個のカラムから、長さが等しく断面積の異なるもう１
つのカラムへ通すには、第１カラムに入れる液の容量に
くらべて、第２カラムへ入れる液（同濃度）の容量は両
力ラムの断面積の比又は直径の二乗の比に等しい比で変
える必要がある。そうすると、第１カラムからの流出液
量との比が両力ラムの断面積の比の二乗にほぼ等しい第
２カラムからの流出液量中に同一の画分が得られる。
この型のゲル濾過は、より好ましいＹｉｎ　−Ｗｅ＋＋
ｌｅｒ／ＵＳＰ比を持つ画分が得られるという利点とは
別に、溶液にした際に粘度の低い製品が得られるという
追加の利点も持っている。
また、この点について注目すべきは、市販へ１＜リン又
は精製ヘパリン、特に注射可能な品質のものであって、
尚特にかなりの割合のヘパラン硫酸又は高分子量の類似
物質を含んでいるものからアルコール度５５〜６１’　
ＧＬ、好ましくは５８°ＧＬのアルコール溶液によって
ムコ多糖画分を抽出する本発明の方法は、それ自体また
、その水溶液の粘度をかなりの割合で低下させることを
可能にする方法も構成していることであって、その水溶
液は、これらのヘパリンから作ることができ、しかもこ
れらムコ多糖画分をほとんど含有しないのである。
この粘度低下は、そのようなヘパリンを以後非経口投与
、特に皮下注射によって抗凝血剤として治療に用いるに
当って或種の長所となる。
Ｙｉｎ−Ｗｅｓ＋ｌｅ＋／ＵＳＰ比が６〜８の程度の画
分から、追加分画、特にゲル濾過又は類似の方法によっ
て、Ｙｉｎ−Ｗｅｓｓｌｅｒ／ＵＳＰ比が１０以上、特
に１３〜１６の程度で、かツＹｉｎ−Ｗｅｓｓｌｃｔ価
が１３０以上、特に　１３５〜１６０単位／ｒｔｒｇで
あることを特徴とするムコ多糖画分を得ることができる
。
上記の分子量についての表示（下記、特に実施例につい
ても）は、ゲルカラムを通すゲル透過実験に於いて、試
料物質の所定量を含む溶液の、同じく所定の溶出条件に
おける保持時間の測定値から導かれたものであると理解
すべきである。即ち、これらの表示分子量の対数と上記
保持時間の測定値とは、ポリスチレン−スルホン酸ナト
リウム標準品、特にＣＨＲＯＭＰＡＣＫ　（Ｏｒ＋ａ７
−ｔｅ＋−Ｕｌｉｔ社、フランス）の商品名で市販され
ているものの分子量４．０［１０，６，５００，１６，
０（１０および３１．０００の対数と、同じゲル透過条
件下で測定した場合の保持時間との関係と同し比例関係
を持っているのである。
上記の処理を受けた画分が、どの程度の精製度に達した
かは別として、生理的に受は入れられるナトリウムのご
とき金属の塩の状態にある限りにおいては、これら処理
済画分を、ヘパリンの塩に応用され得る何れかの方法に
よって別の生理的に受は入れられる金属（たとえばカル
シウムなど）を含む混合塩又は単純塩に変えることがで
きる。
これはフランス特許７３１３５８０　（１９７３年４月
１３日出願、本出願人による）に述べた方法によること
ができ、有利である。この方法では、本質的に、例えば
ヘパリンのナトリウム塩を原材料とし、これを他の生理
的に受は入れられる金属の別の塩、例えば塩化カルシウ
ムと溶液中で接触せしめ、次いで（例えばアルコール沈
澱法又は透析によって）ヘパリンに結合していないその
金属イオンを分離する操作を行い、置換度が充分でない
際には第一回の接触によって得られたヘパリンの混合塩
を、所望の最終置換度に応じた量の他の塩、特に塩化カ
ルシウムと溶液中で再接触せしめる。
本発明の更に好ましいムコ多糖画分は上述のいずれかの
画分から更に得ることができ、そのような画分の特徴は
次のごとくである。
市販名ＵＬＴＲＯＧＥＬ　ＡｃＡ　４４なるビーズ状の
ポリアクリルアミドとアガロースのゲルを充填したカラ
ムにおけるゲルが過操作において、直径１００ｍ＊。
高さ１ｍのカラム内に、ムコ多糖画分の濃度５０ｍｇ／
ｍｌの液を３７．５ｍｌ入れて、流速２０ｈｌ／時でゲ
ルが過を行う際に、デッドボリュームを含めずに２５２
が流出した後に流出する（この画分の大部分は　１．５
Ｉｌの流出液に含まれる）。
１０〜１００ミクロンの粒度を持つシリカを充填したカ
ラムにおけるゲル透過系にあっては、高さ２５０ｏｎ、
直径９−のカラムに、００２ＭのＮａ２ＳＯ４緩衝液に
この画分を　１．３ｍｇ／　ｍｌの濃度で溶かした溶液
５０ｕｉを入れて、３　ＩＡｌ／分の流速で流す時に５
５〜７５分、特に６．６〜７．０分の程度の保持時間を
示す。
本発明による好ましい画分をさらに特定すると、ひとつ
は、アンチトロンビンＩＩＩに対する特別な親和力で特
徴付けられる。この親和力は、アンチトロンビンＩＩＩ
に固定され得る能力のことで、特にこ（７）画分ヲｐＨ
７，５ノ０．２Ｍ　ＮｇＣｆ　、　Ｇ、０５Ｍ　ト！Ｊ
　スーＨＧ！緩衝液中でアガロースのごとき支持体（担
体）に固定されたアンチトロンビンＩＩＩと接触させる
系で示される親和性である。また上記画分はさらに、Ｙ
ｉｎ−Ｗｅ＋ａｌｃ＋／ＵＳＰ比が少なくとも６に等し
く、かツＴｉｎ−Ｗｅ＋＋ｌｅ＋価自身が少なくとも　
３００単位／ｍｇに等しいことによっても特徴付けられ
る。
本発明による好ましい画分および化合物はＹｉｎ−Ｗｓ
ｓ＋ｌｅ＋／ＵＳＰ比が１８より高く、かツＹｉｎ−Ｗ
ｅｓ＋ｌｅ＋価が９００単位／ｍｇより高い。
また、本発明による画分および化合物はＹｉｎＷｅ＋＋
ｌｅｒ／ＵＳＰ比が５０より高いとさらに好ましい。
本発明のさらに好ましい化合物はＹｉｎ−Ｗｅｓｉｌｅ
ｒ／ＵＳＰ比が６５より高（Ｙｉｎ４ｅｓ＋ｌｅｒ価が
１．３００単位／ｒａｇより高いことを特徴とする。
本発明による画分のアンチトロンビンＩＩＩに対する特
殊な親和性は、極めて高く富化された画分をその前段の
画分から製造する際に利用できる肝要な性質であって、
ここに言う製造法では、特に、０．２１　　Ｎ為α、　
　０．０５１１　　トリス−ＨＣｌ　　（ｐＨ７，５）
のような緩衝液中で初めの画分を、支持体（特にアガロ
ース）上に固定化されたアンチトロンビンＩＩＩと接触
せしめることによって、本発明の更に富化された画分又
は製品をアンチトロンビンＩＩＩに選択的に固定させ、
次いで、固定された画分を、イオン強度がより高くて固
定画分を脱着させるのに充分な緩衝液、特に２−Ｎ！α
、　０．０５Ｍ　ｌ−リスＨＣ！緩衝液で溶出せしめる
。
勿論、最後に述べた富化された画分又は化合物を得るこ
とのできる原材料は、さきに定義した本発明による第１
の国分には限られない。すなわち、それらは、特に上記
の性質を持ち上記の第一画分自身を得た粗原材料から他
の何らかの適切なやり方で得ることもできるのである。
本発明は、さらに特定的に、前段階の画分の本質的な活
性成分を構成すると思われる実質的に均質で実質的に純
粋な状態にある化合物にも関係する。
これらの化合物は下記に示す条件下で行われた核磁気共
鳴スペクトル（Ｎ　Ｍ　Ｒ）によって特徴付けられる。
そのＮ　Ｍ　Ｒは図１１．　１２．１４および１５に示
した。
重水に溶かした本発明化合物の溶液について３５℃で２
７０　Ｍ＋（！の電磁波によって行なわれたプロトン　
（ＩＨ）にょるＮＭＲスペクトル（図１１および１２）
を見ると、そのスペクトルの特徴として、約４．８ｐｐ
ｍおよび約５．２ｐｐｍの化学シフトの共鳴信号か約５
．４ｐｐａ＋の化学シフトの共鳴信号よりもかなり弱い
ことが観察される（この際ＴＳＰ即ち２、２．３．３−
ｄ４−３−トリメチルンリルプロピオン酸ナトリウムを
測定用基準物質として用いた。）５、４．　５．２およ
び４．ｓｐｐｍの化学シフトで観察される信号は、従来
のヘパリンを同一条件下にＮＭＲで測定した際の信号に
対応するものであって、それぞれ下記に特徴的なもので
ある。
ヘパリンのＮ−硫酸化グルコサミン単位の１位のアノマ
ープロトン（信号Ｇ、）、 ２−Ｑ−硫酸化イズロン酸単位の１位のアノマープロト
ン（信号１１）、および ２−０−硫酸化イズロン酸単位の５位のプロトン（信号
Ｉｓ）。
従来のヘパリンにあっては、（Ｇ　　）、（１，）■ および（■５）の信号はすべて同程度の大きさの強度を
持っている（図１０）。
便宜上、本発明による画分又は化合物に関しても、（プ
ロトンの場合も１３Ｃの場合も）対応する化学シフトに
関連して観察された信号は（Ｇ１）。
（１）および（Ｉ５）とする。
この言い方は異なった条件で異なった基準物質を用いて
得られるＮＭＲスペクトルにも使用する。
本発明の化合物を重水に溶解した溶液について２０ＭＨ
ｓの電磁波で行った炭素１３（１３Ｃ）のＮ　Ｍ　Ｒス
ペクトル（図１４および１５）を見ると、スペクトルの
特徴として次のことが観察される（基準物質としてはテ
トラメチルシランＴＭＳを使用した）。
本発明のムコ多糖画分に含まれるグルコサミン単位の第
一級炭素（６位）にＯＨ基がある場合に特徴的な共鳴信
号が実際上存在しないこと、ＩＨｐｐｍの程度の化学シ
フトに相当する領域内の（１’）および（Ｇ１）信号の
領域内にいくつか追加の信号があること、 ６０　ｐｐｍ領域内でＮ−硫酸の信号（Ｇ２）に近い所
に１個追加の信号があること、 ７５　ｐｐｍ領域内に１個の共鳴信号が存在すること（
従来のヘパリンについて類似の条件下で得たＮＭＲスペ
クトルでは、通常これに対応する信号はほとんど見られ
ない）。上記の化学シフトの表示は、本発明のムコ多糖
画分に含まれるＮ−アセチルグルコサミン残基のＣＨ３
（図のスペクトルの２５　Ｈｍ領域）に対して相対的に
表わした。
本発明による均質な化合物は、実質的に精製された状態
にあって、いずれもＵＳＰ価、　　Ｙｉ。
Ｗｃ＋＋ｌ＋＋価およびアンチトロンビン■への特異的
な親和力に関する上述の特性を有しているものであるか
、これらは、下記の追加的特性も有する均質なオリゴ糖
によって形成されているという特徴もある。
８ないし１２個、特に［０個の単糖単位からなる、この
オリゴ糖のグルコサミン単位の全ての第一級位は硫酸化
されている、 このオリゴ糖は２個の２−〇−硫酸化イズロン酸単位当
りおよび２個のＮ−硫酸化グルコサミン単位当り１個の
Ｎ−アセチルグルコサミン単位を含んでおり、その他の
糖は性質を異にし、かつ別の置換基を含んでいる。
本発明によるオリゴ糖の少なくともいくつかは、特に十
糖順に関しては、その分子量が約２．０００から約３．
０００の範囲、特に約２．５０［１である。
本発明はまた、上述の一般的性質、より特定的には、一
方ではＵＳＰ価と　Ｙｉｎ４ｅｘ＋ｌｅ＋価に関して、
他方ではアンチトロンビン■への親和性に関して上述の
性質を持つ多糖類画分にも関する。これらの画分は高め
の分子量を持つが、またその構造中に上述の構造のオリ
ゴ糖部分を含んでもいる。
本発明の他の特徴は、本発明の実施に関して特に図面を
参照して記載した以下の好ましい実施例についての記述
中で明らかとなるであろう。
実施例　１ 原料は力価１７０　ｉＵ／　ｍｇ　（Ｕ　Ｓ　Ｐ単位）
の注射用ヘパリン　１．００ｇであった。
この　１００ｇのヘパリンに、５８０ＧＬのアルコール
２．５００　［１１を添加し、１５分間非常に激しく撹
拌した後、さらに１５分間激しく撹拌を続け、懸濁液を
７０００＋、　ｐ、　ｔｒ＋で１時間遠心分離にかけ、
上清２．４００ｍ１を回収した。
この上清に、８０ｍ１の飽和食塩溶液を添加〔７、その
後１００°ＧＬのアルコール２．４００ｍ１を添加した
。
沈澱した生成物を回収し、アルコールで洗浄し、乾燥し
た。重量は　２１ｇであった。得られた生成物の特徴は
次の通りであった。
ＵＳＰ価：　４５１１１／ｍｇ 抗Ｘ５（Ｙｉｏ−Ｗｅｓ＋ｌｅ【）価−１６００／ｍｇ
従って抗Ｘａ／ＵＳＰ比は３．５５であった。
実施例　２ 注射用ヘパリンを製造するために行う市販ヘパリンの精
製段階で生ずるごときヘパリンの副画分に由来する物質
を原料として用いた。特に、一部は、塩化ナトリウムｔ
ｏ−２０ｇ／ｊ！含有のヘパリン水溶液に　ＬＯＧ’　
ＧＬのアルコール０．６−０．７倍容量を添加して得ら
れる上清から得たものであった。この沈澱した精製ヘパ
リンをさらに精製するために回収した。ここで使用した
原料はまた、注射用ヘパリンから痕跡量の無機塩を除去
するために行った種々のヘパリシ精製操作の残渣、特に
アルコール沈澱操作によって得られたものも含んでいた
。
この原料１０ｋｇに、５８°ＧＬのアルコールを３０倍
容量（３ＯＮ）添加し、この懸濁液を１５分間激しく分
散及び撹拌した後、強力な撹拌を更に１２時間続けた。
その後、４８時間放置して、溶解しなかった原料を沈澱
せしめた。やや曇った上清液を採り、遠心分離により清
澄化した。
この上澄液（容量２８Ｇりに、飽和塩化ナトリウム溶液
１０ｆ！、次いで１０Ｇ’　ＧＬのアルコールを等容量
（２８０１）添加した。得られたムコ多糖画分を含む沈
澱を１００°ＧＬのアルコールで洗浄後、乾燥した。
得られたムコ多糖画分６６０ｇのＹｉｎ−Ｗｅ■ｌｅｒ
価とＵＳＰ価との比は、既に２より高かった（これをＰ
１９４”Ｈ（Ａ）画分と名付ける）。
上記画分６６０　ｇを水１３．２００ｍ１に溶解して、
上記画分の追加分画を行なった。
即ち、生成した溶液に、塩化ナトリウム　２６４ｇ。
次いで１００’　ＧＬのアルコール１．５倍容量（１９
，８１）を添加した。沈澱物を集めて、アルコールで洗
浄した。その後乾燥して、次のような特徴を有するＰ１
９４Ｈ）Ｉ（１）画分６４０ｇを得た。
ＵＳＰ価・３１１υ／ｍｇ Ｙｉｎ−Ｌｓｔｌｅｒ　ｆｉ　：　１（１（ｌ　Ｕ／ｍ
ｇここで得られた上澄液にも、活性ムコ多糖画分が含ま
れていた（このものの回収は実施例４に記す）。
Ｐ１９４）ＩＦＩ　（。）Ｗｊ分はまた、ＵＳＰテスト
でもＹｉｎＷｓｓｓｌｅ＋テストでも抗凝血作用を示さ
ないヘパリチン−硫酸から主としてなる分子量の大きい
物質も比較的多量に含んでいた。
このＰＩ９４ＨＦＩ（。）画分を５ｈｇ／ＩＩｌの濃度
で、Ｉ］、　５ＭＮ！Ｇ！、　０．１Ｍ　ｔ＋ｉ＋−ロ
Ｃ１緩衝液（ｐｉ（７，５）に再溶解した後、この溶液
１５０ｍ１を、ＵＬＴＲＯＧＥＬ　Ａｃ＾４４を充填し
た直径２１５−１高さ１ｍのカラムに８０［１ｍ／時の
流速で流してゲルが過を行った。デッドボリュームを除
いて最初の流出液１０２中に、高分子量の物質が流出し
た。この高分子量物質の大部分はへパリチン−硫酸であ
った。
その後の流出液６１から、Ｙｉｎ４ｅ＋＋ｌｅ＋価がさ
らに高く、Ｙｉｏ４ｅ＋５ｌｅｒ／ＵＳＰ比が４−８の
程度のムコ多糖画分を得ることができた。
実施例　３ 本実施例は、実施例２のＰ１９４Ｈ）ｌ（ｃ）画分の処
理方法の変法を述べる。
前記画分を５０ｍｇ／ｍｌの割合で０．５Ｍ　ＮａＣｌ
２　、０．１！１１ｊ＋ｉｉ　−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７
，５１に再溶解した後、直径１０ａａ、高さ　１００Ｑ
Ｉのカラムで、ＵＬＴＲＯＧＥＬ　Ａｃ＾４４によるゲ
ルが過を行なった。流出速度は、２００ｍ／時であった
。
この流出液を各５００１１ずつの画分に連続して集め、
各画分のムコ多糖含量を次の如く測定した。画分１ｍｌ
に　１００°ＧＬのアルコール２ｍｌを添加し、２分間
静置後、混合物の濁度を分光光度計を用いて６６Ｇ　ａ
ｍで測定した（光学密度測定）。この濁度は、試験溶液
のムコ多糖含量に正比例していた。
上記流出液のデッドボリュームを除いて４回目の１１の
最後の　１／３容量に含まれるＣ１０画分を集めた。こ
のＣ１０ｍ分の　Ｙｉｖ−’１ｅｘｓ１ｅｒ／ＵＳＰ比
は５ｏ／６であった。
実施例　４ 実施例２の最終上澄液に　１００°ＧＬのアルコール１
９、８１を追加し、生成した懸濁液を２４時間放置した
。
生じた沈澱を集め、　１００’　ＧＬのアルコールで洗
浄後乾燥した。下記の特徴を有するＰ１９４）ＩＨ（Ｐ
）画分６ｇを得た。
ＵＳＰ価・７１υ／ｍｇ ＹｉｏＪｅｉｓｌｅｒ価：　４６　Ｕ／ｍｇ実施例　５ Ｐ１９Ｈｕｔ（Ｐ）画分を５Ｏｎ＋ｇ／ｍｌの濃度で、
ｐｌ（７，５の１５Ｍ　Ｉｒ１ｓ−ＨＣＩ　、　３０ｇ
／Ｉ　Ｎｇ（Ｊｌ緩衝液に再溶解した。
上記溶液を流出速度２００ｍ１／時で、ＵＬＴＲＯＧＥ
Ｌ＾ｃＡ　４４カラム（Ｐｈｘ＋ｍＩｃ１ｘ　ＫＩＧＯ
／１００　：容量７Ｉ！；高さ　１［１０Ｃ３；直径１
［１ａｏ）によるゲル濾過にかけた。
得られた流出図の概略を図１に示すが、この図は、物質
含有量（６６ｈｍで測定した光学的密度ＯＤ）の変化を
リッター（ｊりで表わした流出容量の関数として示して
いる。
カラムのデッドボリュームに相当する容量の液体が流出
した後に画分に、　Ｉ、　ｌ、　ｌ（、Ｇ、　Ｆ、　Ｅ
、　Ｄ、　Ｃ，Ｂ及び人を連続収集したが、各々の容量
は、図１の各々対応する横座標の切片の長さによって示
されている。
上記の各画分の分析特性を次の表Ｉに示す。
表　　　　Ｉ 各画分は、４つのタイプに分類できることが観察される
。
８）画分Ａ、Ｂ及びＣ０これらの流出容量は、上記処理
方法では、本質的に、第４番目に流出した１１１に対応
しく図１参照）、そのＵＳＰ価は１０未満でＹｉｎ４ｅ
ｔ＋ｌｅｒ価は８０未満であった。分子量はせいぜい４
００Ｇの程度であった。
ｂ）画分り、Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨｏこれらのｕｓｐ価は１
０程度以下であり、Ｙｉｎ４ｅｓｓｌｅｒ価は非常に高
く、　１３５〜１６１単位であった。これらの画分は、
また最も好ましいＹｉｎ−Ｌ＋ｔｌｅ＋／ＵＳＰ比を持
ち、即ち１３−１６であり、本質的に第３番目に流出し
た１！中に含まれていた。これらの画分の分子量は、４
０００〜１００００の程度であり、特に４０００〜８［
１００であった。
Ｃ）画分■及びＪｏこれらの画分のＹｉｎ−Ｗｅ＋ｓｌ
＋＋／ＵＳＰ比は、好ましくない値に近く、下記のに画
分が恐らく混入していたのであろう。
ｄ）画分に０この画分には、本質的に、抗凝血作用を持
たないヘパラン硫酸が含まれていた。
表■には、ゲル透過法で測定した保持時間によって評価
した各画分の分子量を示した。この分子量の計算には、
対照物質として分子量既知のポリスチレン−スルホネー
トを用いた。画分Ｆの特徴は、保持時間６６分に対応す
る主ピークと、保持時間６．１分に対応するシタルダー
とを持つことであって、これから、使用した対照系で分
子量が７．２００位に位置する成分の存在することが証
明される。
この測定では、粒度１０〜１００　ミクロンのシリカ、
特に市販名ＬＩＣＩ（ＲＯＰＨＯ５ＰＨＥＲで販売され
ているシリカを充填したカラム（２５０Ｘ９ｍ）を用い
、５ＰＥＣＴＩＩＡＰＩＩＹＳＩＣ５３５０Ｇクロマト
グラフによってゲル透過実験を行なった。ムコ多糖１．
３Ｂ／ｍｌの濃度で、上記画分を０．０２Ｍ　Ｎａ２Ｓ
Ｏ４緩衝液に溶解した溶液を用い（カラムに最初に入れ
た容量、５０４）、流速を３ｄ／分とした。物質の検出
は、紫外線分光計（２０Ｇ　ａｍ）で行った。
表　　　■ 零 （ショルダー） 実施例　６ 原材料 使用した原材料は、動物組織（特に牛の腸粘膜或いは豚
の肺）からの抽出物の如き粗へｔＺリンから、注射用に
供するヘパリンのカルシウム塩を製造する際に生ずる副
産物からなるものであった。
この原材料（２５２ｋ８）は次のような特徴を有してい
た。
ＵＳＰ価　８２１［１７’ｍｇ Ｙｉｎ−Ｗｅ＋＋ｌ＋ｙ価　１００ＬＪ／ｚｇその後、
下記の処理を行った。
５８°ＧＬのアルコールによる抽出 原材料２５２ｋｇを、５８°ＧＬアルコール６０００　
ｆｌに、激しく撹拌しつつ分散させた。
不溶性の相を傾瀉ならびに遠心分離で分離した。
可溶性画分を、ＮａＣｆ１及び１００°ＧＬのアルコー
ルを添加して回収した。
得られた画分は、次の通りであった。
不溶性画分・　２３０ｋｇ０製造段階に再循環。
可溶性画分：　２０．６ｋｇ　（ＴＪ　Ｓ　Ｐ価＝２１
ｔＵ／口ｇＹｉｎ４ｅ＋５ｌｅｒ価＝９０　Ｕ／　ｍ８
）。
可溶性画分からの低分子量画分の抽出 ５８°ＧＬのアルコールに可溶の前記画分を水５１２２
（２０倍容量）に溶解しＮａ（Ｊ　ｌｏ、２４ｋｇを添
加後、１００°ＧＬのアルコール１５倍容量、即ち　７
６８ｆｌを添加した。沈澱した画分を集めてアルコール
で脱水し、乾燥した。
重　　　　　量　　　　　　１９　　ｋｇＵＳＰ価　：
　２２１Ｕ／ωｇ Ｙｉａ−Ｌ＋＋ｌｅｔ　　価　：８９υ／ｍｇこの画分
は別に貯蔵しておき、後に精製して注射用カルシウム塩
とした。
上記の沈澱操作後の上澄液１５容量に、アルコール１，
５容量、即ち　７６８２を追加した。沈澱した画分を集
め、アルコールで脱水し、乾燥した。
重　　　　　量　　　　・　７００　　ｇＵＳＰ価　：
　　６１［１／ｍｇ Ｙｉｎ−Ｗｅｉｓｌ＋＋価　４０　Ｕ／ｍｇ本画分７０
０ｇは、低分子量のムコ多糖、殆ど硫酸化していない高
分子量のムコ多糖及び多かれ少なかれ分解を起こしてい
る核酸の混合物であった。
低分子量画分からの核酸除去 次の方法に従って塩化マンガンで沈澱させることにより
核酸の大部分を除去した。
即ち、７００　ｇの画分を７２の水に溶解した後、撹拌
しながら１０％Ｍ　ｎ　Ｃｊ！　２１　ｆｌを添加した
。精製した沈澱（ＲＮＡ及びＤＮＡの不溶性マンガン塩
から成る）の大部分を遠心分離で除去した。ムコ多糖は
透明な上澄液からアルコール沈澱法で回収した。
重　　　　　量　　　　：４８０ｇ ＵＳＰ価　　　８１υ／ｍｇ Ｙｉｎ−Ｗｅ＋＋ｌ＋＋価：　５４　Ｕ／ｍｇ極めて低
分子量の画分のゲル濾過による単離極めて低分子量の画
分を、ＵＬＴＲＯＧＥＬ　ＡｅＡ　４４によるゲル濾過
で分離した。
！径２００皿、高さ１ｍのカラムで、２５ｇの画分が処
理可能であった。
流出図は、図８に示した型のものであった。
次のような特徴を有する３種の画分（番号（１）（３）
）を収集した（最初は全部で２５８）。
（１）重　量：　１６ｇ、　Ｏ５Ｐ価：　１２１Ｕ／ｍ
ｇ。
Ｙｉｎ−Ｗｅ＋ｓｌｅ＋価：　３０　Ｕ／　ｍｇ。
（２）重　量＝７ｇ、Ｕｓｐ価：　６．５１Ｕ／　Ｂ。
Ｙｉｎ−Ｗｅｓｓｌｅｔ　　価　：　　７０　０／ｍｇ
。
（Ｊ　重　量：２ｇ、ＵＳＰ価：２．ｌｌυ／ｍｇ。
Ｙｉｎ−Ｗｅｉｓｌｅ＋価：６０υ／−ｇ０不溶化アン
チトロンビン■を用いたクロマトグラフィー アガロースに担持・固定されたアンチトロンビン■を用
いて前記画分（３）のクロマトグラフィーを行った。
現在使用される　１Ｏｈｌのカラムで、画分（３）７０
０ｍｇが処理可能であった。
吸着は０．２Ｍ　ＮａＣｐ　、　０．０５Ｍ　ｔ＋ｉ＋
−［Ｊｊ緩衝液（ｐＨ７５）によって行い、２Ｍ　Ｎａ
Ｃｆ　、　０．０５Ｍ　＋ｚ＋−ｔｌＱ７緩衝液で溶出
を行った。
固定されなかった部分（６００−６５０ｍ８）のＵＳＰ
価はほぼ１〜２１Ｕ／　ｍｇＳＹｉｎ−Ｗ＋＋５ｌｅｒ
価は１０−２００／ｍｇであり、固定された部分（１０
−３０ｍｇ：）のＵＳＰ価よＩＬ２０１Ｕ／’ｍｇＳＹ
ｉｎ−Ｗｅｉ＋ｌ＋＋価は１０００−１４００Ｕ／’山
ｇであった。
実施例　７ 上記実施例５の画分Ａ、Ｂ及びＣをあわせて単一画分に
プールし、アガロース−アンチトロンビン■カラムを用
い、実施例６に規定した条件下で選択的固定による追加
分画を行なった。
固定された画分を溶出してＰ１９４１１Ｐ＾と称する画
分を得た。この画分のＹｉｎ−Ｗ＋＋５ｌｅｒ価は３１
００７ｍｇ。
ＵＳＰ価は４０　劃／ｍｇであった。
同様の方法で、上記実施例５の画分Ｅ及びＦをプールし
て、アガロース−アンチトロンビン■カラムを用い、再
び上記の固定−溶出法によって最も活性の高い画分の分
離を行った。最終的に、Ｙｉｎ−Ｗｚ＋ｌｅｔ　価９０
０　Ｕ／Ｂ及びＬ’ＳＰ価８２　劃／ｍｇを有するＰ１
９４）ＩＨＰＦ画分を得た。
上記画分Ｐ１９４ＨＨＰＡ及びＰ１９４Ｈ）ＩＰＦにつ
いてプロトン　（ＩＨ）のＮＭＲ分析を行った。従来の
ヘパリン（７０２１ＨＨ）についても同様にＮＭＲ分析
を行った。
即ち、ｈ’Ｅの画分又はヘパリンの各々を１４〜６２ｍ
ｇ／　０．３５ｍ１の濃度で前辺って重水に溶解し、フ
リエ変換系を備え、累積スペクトルを貯蔵できるＢＩＩ
ＵＫＥ［ｌ装置（２７０ＭＨりを用いて分析を行った。
化学シフトは前記のごと＜ＴＳＰを基準物質として測定
した。
図１（ｌは、従来のヘパリンで得たＮＭＲスペクトルの
代表的なものである。図１１及び図１２は、同じくそれ
ぞれ画分ＰＩ９４ｔ（ＨＰＦ及びＩ’１９４Ｈ１（ＰＡ
のＮＭＲスペクトルの代表的なものである。
これらのＮ　Ｍ　Ｒスペクトルを比較すると、本発明に
よる画分の信号（Ｉ　　）及び（■５）が、信号（Ｇ１
）に比して弱いことがはっきりとしている。これらＩ、
Ｉ５．Ｇ１の信号は、ヘパリンの標準スペクトルでは実
質的に同一強度であった。
実施例　８ 実施例６及び実施例７に記載した方法を他の原材料に応
用して同様に次の画分を得た。
Ｐ２１９ＨＨ：　　ＵＳＰ １ｎ Ｐ２２５１（Ｈ：　　ＵＳＰ １ｎ Ｐ２３１Ｈ）Ｉ　　　：　　ＵＳＰ １ｎ Ｐ１９４ＨＨ＾　：　　ＵＳＰ １ｎ Ｐ２４２ＨＨ＾　・　ＵＳＰ １ｎ Ｐ２５５ＨＨＡ　　：　　ＵＳＰ Ｙｉｎ 価＝　１４１Ｕ／ｍｇ。
Ｗｅ＋＋１＋＋価＝　１３５０ 価＝１７１Ｕ／のｇ。
Ｗｅ＋＋ｌ＋＋価＝１３２０ 価−１６，２１Ｕ／ｍｇ。
Ｗｅ＋＋ｌｅ＋価＝１４０Ｇ 価＝８２１Ｕ／ｍｇ。
Ｗｅｉ＋ｌｅｒ価＝９００ 価＝　１６１Ｕ／ｍｇ。
Ｗｅｉｔｌｅｒ価＝　１８００ 価＝３６　ＩＵ／ｍｇ。
Ｗｅ＋＋ｌｔｒ価＝　２１４５ Ｕ／ｙｇ。
０７ｍｇ ０７ｍｇ。
０７ｍｇ。
０７ｍｇ。
Ｕ／ｍｇ／ Ｐ２４２ＨＨＡ画分を炭素１３（１３Ｃ）のＮＭＲ分析
１こかけた（図１４及び図１５）。標準物質（比較用）
として従来のヘパリン７０７１ＨＨも同様にＮＭＲ分析
を行った（図１３）。分析は各画分（ｌｕｍｇ／　ｉｆ
　Ｄ　２０の濃度で重水に溶解した溶液）について、２
０　ＭＨ＋ノｖＡＲＩＡＮ　ＣＦＴ−２０の装置（フー
リエ変換系装備）で行った（化学シフトの測定の基準と
してＴＭＳを用いた）。
観測結果は下記の通りである。
（イ）第１級炭素原子（本発明のムコ多糖画分に含まれ
るグルコサミン単位の６位）のＯＨ基の存在を特徴づけ
る共鳴信号が、実際上存在しないこと。
（ロ）ＩＮ　ｐｐｍ程度の化学シフトに対応する領域号
がいくつかあること（標準ヘパリンのＮＭＲスペクトル
では見られない）。
（ハ）（Ｇ２）信号の近傍の６０　ｐｐｍ領域中に１個
の補足的信号があること。
（ニ）　７５　ｕｍ領域中に１個の共鳴信号が存在する
こと（通常、市販のヘパリンを同一条件下で測定したＮ
ＭＲスペクトルには対応する共鳴信号がない）。
上記に示した化学シフトは、本発明によるムコ多糖に含
まれる　Ｎ−アセチルグルコサミン残基のＣＨ３（図１
４及び図１５のスペクトルの２５　ｐｐｍ領域）に関し
て相対的に評価した。
本発明による画分或いは化合物に特有の信号には図１４
及び図１５で星印（ネ）を付けである。
図１５には積分曲線（ｃｒ）をも示すが、これによって
下記の所見が得られた。
（イ）調へた化合物は均質であり、従って実質的に純粋
な物賀であった。
Ｃ口）上記化合物は、十糖類の特性を有する。
（ハ）上記化合物は２単位の２−〇−硫酸化イズロン酸
及び２単位のＮ−硫酸化グルコサミン当り、１個のＮ−
アセチルグルコサミン単位を含む。
したがって、本発明により、抗Ｘａ活性が高く、かつ、
凝血過程の特徴である一連の継続的酵素反応の中でＸｇ
因子に対して著しい選択性を有するムコ多糖画分を製造
することが可能になる。
この顕著な活性と選択性は、以下の薬理テストの結果か
らも例証される。この薬理テストは、ナトリウム塩の形
態であった実施例２のＰ１９４１１ＨＣ画分を上述の方
法によってカルシウム塩の形態に変換して得られたＰ１
８８Ｃ１１画分について行なったものである。
上記の結果は、図２〜７の曲線で示す。これらの図はす
べて、一方では本発明のムコ多糖画分、他方では従来の
ヘパリン（１７０ＵｓＰ単位／　ｍ８）について抗凝血
作用を比較して示すものである。
図２〜５の曲線は、従来のヘパリンの用量増加によって
ヒトの血漿中で誘発されたｉｎ　ｖＮｒｏの凝血時間の
変動と、ＰＩｇ８Ｃ［（画分による同様な変動とを表わ
す（図４と５に対応するテストは、血小板を含まず、し
たがってＸＩ因子の欠乏した血漿について行なった）。
図６及び図７は、家兎を用いてｉｎ　ｖｉマＯで行なっ
た実験結果を比較したものであり、図６ではＰＩＳｇＣ
Ｈ画分を、図７では標準のヘパリンを用いた（結果は、
１群５匹の家兎の平均である）。各動物には体重１ｋｇ
当り５００　Ｙｉｎ４ｅｓｉｌｅ＋単位の試験組成物を
投与した。
まず、図２はトロンビンの、図３はセファリンカオリン
の、図４は濃縮トロンボプラスチンの存在下での凝血の
、そして図５は希釈トロンボプラスチンの存在下での凝
血の、それぞれの時間変化を秒で示す。−これらの変化
は、それぞれ研究対照とした製剤により誘導されたもの
であり、本発明のムコ多糖画分の場合を曲線ａ　　、ａ
　　、ａｌ　　２　３ およびａ４に、及び標準ヘパリンの場合を曲線ｂ　　、
ｂ　　、ｂ　　およびｂ４に、それぞれの投与１　　　
　２　　　３ 量（すべてＵＳＰ単位／ｍｌで表わす）の関数として示
しである。
トロンビン時間及びセファリン−カオリン時間は共に、
むしろ活性化された■因子に対する阻害および総括的凝
血におよぼす製剤の作用を反映する測定値である。この
点で、図２及び図３の曲線は、本発明によるムコ多糖画
分が、プロト０ンビンの不活化の阻害及び総括的凝血レ
ベルの点て標準のヘパリンに比して明らかに弱い効果を
示すことを明瞭に示している。逆に、図４及び図５は、
外因性凝血の特徴である一連の酵素反応（特に、ＩＩａ
因子が相対的に少ない場合）の方により直接的に関連し
ている現象を表わすものであって、これらの図は本発明
のムコ多糖画分が標準のヘパリンに対して顕著に優れて
いることを示している。
すなわち、この条件下でムコ多糖画分は血液サンプルの
凝血をよりゆっくり生起するのである。
図６には、本発明のムコ多糖画分５００　ＹｉｎＷｅｉ
ｓｌｅ＋単位を投与した家兎てみられた活性の変動を、
時間Ｈ（時間）の関数として示しである。
これら画分の活性を評価すべく、Ｙｉｎ　−Ｗ＋＋＋ｌ
ｅｒ価（ＹＷ５曲線）及びセファリン−カオリン価（Ｃ
ＫＴ、曲線）（Ｉ１Ｕ／ｍｌ血漿）の変化を時間Ｈ（時
間）の関数として表した。
標準のヘパリンについても同様の実験を行なった。対応
する活性の変動を、図７のＹＷ６及びＣＫ１６曲線で示
した。
図６から、本発明のムコ多糖５００　Ｙｉａ４ｅｓ＋ｌ
ｅ＋単位を投与すると、ＣＫＴ単位で表した総括的凝血
作用は比較的低レベルに留まったままなのに比べて、顕
著な抗Ｘ！活性を生じたことがわかる。
例えば、２時間後にはＹｉｏ４ｅｓ＋ｌｅ＋活性は０．
８５０／ｍ１であるのに対し、ＣＫＴ活性はわずか０．
１５１Ｕ／ｍｌであることに注意されたい。対照的に標
準のヘパリン５００　Ｙｉｎ−Ｗｅｓｓｌｅｒ単位／ｍ
ｌでは、ＣＫＴ価で表わされるある効果が誘導され、こ
の効果はＹｊＨ４ｅ＋ｓｌｅ＋価で測定可能な抗Ｘａ活
性に比して明らかに大である。特に、２時間後には、抗
Ｘａ活性が、０．５５Ｕ／ｍｌであるのに対し、総括的
抗凝血活性（ＣＫＴ）は０３８劃／ｍｌであることに注
意されたい。このように、ＣＫＴ価とＹｉｎ−Ｗｅｓｓ
ｌｅ＋価の差は、本発明のムコ多糖の場合よりもはるか
に少なかった。即ち、ＣＫＴ価に対するＹｉｎＷｅｓ＋
ｌ＋＋価の比は、標準のヘパリンの場合の２未満から本
発明のムコ多糖画分の場合には５より大きい値になるの
である。
このように、ｌＩＩマ１ｔｒｏ及び１ｎマ１マ０の両方
のテストで、本発明のムコ多糖画分は、標準のヘパリン
に比して、特にＸａ因子の阻害の点で明確に高い選択的
作用を有するのである。
本発明によるムコ多糖画分は無毒である。本発明による
ムコ多糖画分のいずれを１０．０００　Ｕ　（Ｙｉｎ−
Ｗｅ＋５ｌｅｔ価）　／ｋｇで投与しても、家兎にはな
んらの毒性反応も起きなかったし、また、家兎にフラン
ス薬局方による発熱試験を行っても発熱効果は全く認め
られなかった。
従って本発明は、より特定的には、前記のような、特に
その活性が少なくとも４０．好ましくは少なくとも５０
、更に好ましくは少なくとも１００　Ｕ（Ｙｉｎ−Ｗｅ
＋＋Ｉｅｔ価）／ｌｌ１ｇにもなるムコ多糖画分に関す
るもので、活性が３００より高く、特に９００Ｕ（Ｙｉ
ｎ−Ｗｅ＋＋ｌｅｔ価）／ｍｇより高い画分がさらに望
ましい。
本発明はまた、同様の活性を有し、発熱物質を含むこと
なく、かつ医薬的な賦形剤と組み合わさった医薬製剤に
も関する。本発明は、特に、血液凝固調節用として治療
上有用な、上記画分の注射可能な濃縮された滅菌溶液に
関する。この溶液は、皮下注射に用いる場合にはムコ多
糖画分を　１．０００〜１００．０００単位（Ｙｉｎ−
Ｗｅｉ＋ｌｅ＋）／’ｚｌ、特に　５．０００−５００
００単位７′ｍ）、例えば２５．０００単位／口１で含
有し、又は静脈注射又は潅流に用いる場合には例えば５
００〜１０．０００単位／コ［、例えば５．０００単位
／ｍを含有する。
本発明のムコ多糖画分は、ナトリウムおよび／′又はカ
ルシウムの如き、少なくとも一個の生理学的に許容され
つる金属の塩の形態をなしていると有利である。これら
の医薬製剤は、適時使用可能で１回限りの注射剤とする
のが望ましい。
本発明の組成物は、ヒトまたは動物の血液凝固の調節（
予防」二又は治療上）に特に適している。
特に、凝固亢進の危険のある患者の場合に適しており、
更に、例えば、（外科手術、アテローム性経過、腫瘍の
増殖、細菌或いは酵素活性因子による凝血機構の障害等
において）組織トロンボプラスチンの如きトロンボプラ
スチンが放出される結果として前記の外因相の攪乱が生
じて凝固亢進を呈する恐れのある場合に適している。
以下に１例として人に使用可能な薬量について記載する
が、これは本発明を例示するためだけのものであって本
発明の保護範囲を限定する意味は全くない。例えば、患
者の凝固亢進の危険の程度或いは血栓状態に応じて、１
日２−３回に分けて１、０００−２５．０ＯＯＵを皮下
注射するか、或いは、１日容量１．０００〜２５．０Ｏ
ＯＵを一定間隔で非連続に静注するか、或いは、１日量
１．０００−２５．０ＯＯＵを連続的に潅流するか、ま
た或いは、１．０００−２５．０ＯＯＵを（１週間に３
回）筋肉的注射する（ＵはＹｉｎ−Ｗ＋＋＋ｌ＋ｒ単位
）。投与量は、前置って行なった血液分析結果、患者の
疾患の程度及び−数的に轡者の健康状態に応じて、患者
毎に増減させるのは勿論である。
本発明は、本発明によるムコ多糖を特に、Ｘａ因子の阻
害レベルで他の物質の抗凝血作用を研究するための比較
用の基準物質として実験室で使用可能な生物学的試薬の
構成に応用することにも関する。
自明なことであり、かつ既に前述かられかるごとく、本
発明はより特別にこれまで見て来たような応用および具
体例には決して制限されるものではない。それとは逆に
あらゆる変形が包含され、特に上記で定義した水性アル
コール系抽出用媒質は、水とエタノール以外の１種のア
ルコール、例えば脂肪族アルコール又は芳香族アルコー
ル、好ましくは炭素原子１〜６個を含む第一級アルコー
ルの如き環式又は非環式飽和脂肪族アルコールとの混合
物で構成されてもよいし、その際、勿論であるが、その
媒質の水／′アルコールの割合は、各々の場合について
簡単な通常の操作によって、５５〜６１゜ＧＬの水−エ
タノール混合物で得られるムコ多糖画分と等価なムコ多
糖画分の抽出が行えるように定めるべきである。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明による好ましいムコ多糖画分の特徴的な
溶出曲線を示す。 図２〜７は、本発明によるムコ多糖画分（ＵＳＰ価で表
わす）と、高い抗凝血能を持つ従来のヘパリン（ＵＳＰ
価で表わす）の生物学的性質を比較したものである。 図８は、他の成分も含んでいる画分から、本発明方法に
よって本発明画分を選択的に分離する操作を実施する際
の本発明画分の概略溶出線図を示す。 図９は、本発明によるもう１つの好ましいムコ多糖画分
の特徴的な溶出曲線の代表的なものである。 図１Ｏは、従来のヘパリンの　ＩＨによるＮＭＲスベク
トルである。 図１１と１２、は本発明による別々の画分の　ＩＨによ
るＮ　Ｍ　Ｒスペクトルである。 図１３は、比較として用いた従来のへ７マリンの炭素１
３によるＮＭＲスペクトルである。 図１４は、本発明による画分の炭素１３によるＮＭＲス
ペクトルである。 図１５は、図１４のＮＭＲスペクトルの部分拡大図であ
る。

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）ヘパリン様オリゴ糖またはその薬理学的に許容さ
    れ得る塩であって、該オリゴ糖が８〜１２個、特に１０
    個の糖基本単位を含み、該オリゴ糖のグルコサミン単位
    の第一級位が全部硫酸化されており、２つの２−０−硫
    酸化イズロン酸単位毎かつ２つのＮ−硫酸化グルコサミ
    ン単位毎に１つのＮ−アセチルグルコサミン単位が存在
    し、それ以外の糖基本単位は異なる種類のものであり異
    なる置換基を含んでいることを特徴とするオリゴ糖。
  2. （２）ｉｎｖｉｔｒｏとｉｎｖｉｖｏで第Ｘａ因子を選
    択的に阻害する作用を示し、かつアンチトロンビンIII
    に固定されることを特徴とする特許請求の範囲第１項に
    記載のオリゴ糖。
  3. （３）重水に溶解したオリゴ糖の溶液中３５℃で２７０
    ＭＨｚの電磁波およびシフト測定用基準物質としての２
    ，２，３，３−ｄ＿４−３−トリメチルシリルプロピオ
    ン酸ナトリウムを用いて測定したプロトン（＾１Ｈ）Ｎ
    ＭＲスペクトルにおいて、化学シフト値約４．８および
    ５．２ｐｐｍに存在する共鳴信号が化学シフト値約５．
    ４ｐｐｍの共鳴信号より実質的に弱いことを特徴とする
    特許請求の範囲第２項に記載のオリゴ糖。
  4. （４）重水に溶解したオリゴ糖の溶液中で２０ＭＨｚの
    電磁波およびシフト測定用基準物質としてのテトラメチ
    ルシランを用いて測定した炭素−１３（＾１＾３Ｃ）Ｎ
    ＭＲスペクトルにおいて、該オリゴ糖中に存在するグル
    コサミン単位の（６位の）第一級炭素上のヒドロキシル
    基の特性共鳴信号が実質的に存在しないことと、約１０
    ０ｐｐｍの化学シフトに対応する領域（Ｉ＿１およびＧ
    ＿１信号の領域）に補足的に共鳴信号が存在し、６０ｐ
    ｐｍの領域のＮ−硫酸化Ｇ信号に近い補足的信号Ｇ＿２
    および７５ｐｐｍの領域の共鳴信号が存在することとを
    特徴とする特許請求の範囲第２項に記載のオリゴ糖。
  5. （５）抗Ｘａ（イン−ウェスラー）価が少なくとも３０
    ０単位／ｍｇであることを特徴とする特許請求の範囲第
    ２項に記載のオリゴ糖。
  6. （６）抗Ｘａ（イン−ウェスラー）価が少なくとも９０
    ０単位／ｍｇであることを特徴とする特許請求の範囲第
    ５項に記載のオリゴ糖。
  7. （７）抗Ｘａ（イン−ウェスラー）価が少なくとも２０
    ００単位／ｍｇであることを特徴とする特許請求の範囲
    第６項に記載のオリゴ糖。
  8. （８）抗Ｘａ（イン−ウェスラー）価／総括的凝血強度
    （ＵＳＰ価）比が５０より大きいことを特徴とする特許
    請求の範囲第５項から第７項のいずれかに記載のオリゴ
    糖。
  9. （９）抗Ｘａ（イン−ウェスラー）価が１３００単位／
    ｍｇより大きく、抗Ｘａ（イン−ウェスラー）価／総括
    的凝血強度（ＵＳＰ価）比が６５より大きいことを特徴
    とする特許請求の範囲第５項から第８項のいずれかに記
    載のオリゴ糖。
  10. （１０）分子量が約２，０００〜３，０００の範囲、特
    に約２，５００であることを特徴とする特許請求の範囲
    第１項から第９項のいずれかに記載のオリゴ糖。
  11. （１１）特許請求の範囲第１項から第１０項のいずれか
    に記載のオリゴ糖の製造方法であって、アルコール度が
    約５５〜６１゜ＧＬの水性アルコール媒質（水−エタノ
    ール）に、分子量が特に２，０００〜５０，０００の範
    囲で無機塩含量が低く、好ましくは１重量％未満のヘパ
    リン又はヘパリン様構成成分をベースとする物質を懸濁
    させ、不溶画分を分離し、ムコ多糖画分が溶解している
    溶液を回収し、該ムコ多糖画分を特にアルコール沈澱に
    よって前記水性アルコール媒質から分離し、場合により
    、回収した画分をさらに、イン−ウェスラー／ＵＳＰ価
    が高まった画分が得られるように調整した条件下でゲル
    濾過にかけることによって得られた画分を固定化アンチ
    トロンビンIIIと接触させ、アンチトロンビンIIIに固定
    化されたオリゴ糖鎖を、脱着させ得る緩衝液で溶出する
    ことによって回収することを特徴とする方法。
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