CN104725532B - 一种精确定量控制肝素/类肝素中硫酸软骨素及硫酸皮肤素含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种精确定量控制肝素/类肝素中CS及DS含量的方法。该方法步骤如下:1)向含类肝素/肝素的溶液中加入具有硫酸软骨素酶B活性的蛋白质,待DS含量达到预期值时,终止酶解反应;2)向溶液中继续加入具有硫酸软骨素酶AC活性的蛋白质,待CS含量达到预期值时,终止酶解反应,即得到期望CS及DS含量的肝素样品或类肝素样品。本发明实现了对肝素/类肝素中CS、DS含量的高效、精确控制,从而建立新型肝素类产品的低成本、高产率的生产工艺。且该方法简单易行,具有规模化生产的应用价值,能够用于生产符合欧洲药典标准的达那肝素钠。
Description
技术领域
本发明涉及一种精确定量控制肝素/类肝素中硫酸软骨素及硫酸皮肤素含量的方法。
背景技术
1.1肝素
1.1.1肝素简介:
肝素(Heparin,HP)首先从肝脏发现而得名,肝素广泛分布在哺乳动物的组织中,如肝、肺、肠系膜、心、脾、肾、胸腺、胎盘、肌肉和血液中都有存在(高照明,曹现平,张玉冰,猪小肠粘膜/浆膜/肠衣中的粘多糖组成分析[J],化学与生物工程,2012,29(4):91-94)。各种组织中肝素的含量与肥大细胞的数目有关,肥大细胞内的颗粒含有肝素或肝素前体,当物理或化学剌激使肥大细胞脱粒时,肝素被释放出来,在体内被肝脏产生的肝素酶灭活而从尿排泄出来(Brinkous K.M,Smith H.P,Warner E.D,et al.The Inhibit ion o fBlood Clotting:an Unidentified Sub-stance which Acts in Conjunction w it hHeparin to Prevent t he Conversion of Prothrombin into Thrombin1J2.Am.J.Physiol,1939,125:683~687.)。肝素具有强抗凝作用,是防治深层静脉血栓形成等血栓栓塞性疾病的首选药物。随着研究的深入,人们发现肝素不但有抗凝、抗血栓形成和调整血脂的作用,还有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌等多种生物学功能(Charles H Best.Preparationof Heparin and Its Use in the First Clinical Cases[J].Circulation.1959,19:79~86)。肝素在体内多以与蛋白质结合以糖蛋白复合物的形式存在。这种复合物没有抗凝血活性,但在去除蛋白质后,这种抗凝活性逐渐表现出来(Nader HB,Lopes C,Rocha Hao,Santos EA,Dietrich CP.Heparins and heparinoids occurrence,structure andmechanism of antithrombotic and hemorrhagic activitie[J].Curr.pHarm.Des.2004,10:951~966)。由于疯牛病的病原体阮粒是传染性蛋白质颗粒,为不含有核酸的感染性蛋白因子,其主要成份是一种蛋白酶抗性蛋白,具有对蛋白酶的抵抗力,易溶于去污剂、有致病力和不诱发抗体等特性,给患病动物及人类的诊断和防治带来很大麻烦,给人类和动物的健康和生命带来严重的威胁,因此从反刍动物中提取肝素钠存在较大的安全性风险,现在药用肝素钠主要从猪小肠黏膜提取(Kazuyuki Sugahara,Satoml Nadanaka,KyokoTakeda.Structural analysis of unsaturated hexasaccharides from sharkcartilage chondroitin sulfate D that are substrates for the exolytic actionof chondroitin sulfate ABC lyase.Europe of journal biochemistry,2006,239:871-880)。
肝素钠的结构异常复杂,是由糖醛酸和葡萄糖胺以1→4键连接起来的为主要重复二糖单位组成的多糖链的混合物。其分子量是一个很宽的分布为3000-30000,平均分子量是12000-15000,含10-30个二糖单位不等,约有4种糖醛酸和10种葡萄糖胺交替无序排列组成(Rafael B.Erlich,Claudio C.Werneck,Paulo A.S.Mourao,et al.Majorglycosaminoglycan species in the developing retina:synthesis tissuedistribution and effects upon cell death.Expetimental eye research,2003,77:157-165)。肝素钠结构中的主要单糖是2-O-硫酸-α-L艾杜糖醛酸及6-O-硫酸-N-硫酸-α-D葡萄糖胺,这两种糖单元是肝素钠结构中出现频率最高的两个重复单元,由它们组成的三硫酸二糖的重复单位构成了肝素所谓的“规则区”,是肝素结构的主要部分,也起到了肝素钠抗凝血的主要作用(Komazawa H,Saiki I,Igarashi Y,et al.The conjugation ofRGDS peptide with CM-chitin(4):299-307.)。另外的含有多种单糖残基,如α-L-艾杜糖醛酸,葡萄糖醛酸,6-O-硫酸-N-乙酰-α-D葡萄糖胺,β-D-葡萄糖醛酸及3-6-双-O-硫酸-N-硫酸-α-D葡萄糖胺则以很低的频率出现于“非规则区”(Hirano S,Tanaka Y,Haseqawa M,et al.Effect of sulfated deriva tives of chitosan on some blood coagulantfactors[J].Carbohydr Res,1985,137(3):205-215.)。一定数目的6位无硫酸化的葡萄糖胺及2-O-硫酸-α-D葡萄糖醛酸的存在使得肝素中出现了10种不同的单糖(4种糖醛酸和6种葡萄糖胺),从而使得肝素的整个结构变得异常复杂(高宁国,.肝素结构与功能的研究进展[J],生物工程进展,1999,l9,(5):4-13)。肝素常与其他粘多糖一起被提取出来,可由己糖醛酸(L-艾杜糖醛酸、葡萄糖醛酸)与硫酸氨基葡萄糖分子以一定的比例交替联结形成具有六糖或八糖单位的线型链状大分子,其结构单元如下所示(Albertini R,etal.Chondroitin-4-Sulfate Protects High Density Lipoprotein against CopperDependent Oxidation[J].Archives of Biochemistry and BiopHysis,1999.365(1):143-149):
1.1.2肝素钠的生物学功能
与肝素钠复杂结构相对应的是其复杂的生物学功能,自从1937年肝素在临床上用作抗凝剂以来,肝素一直是主要的抗凝药物,除了抗凝活性及其相关的抗血栓生成活性以外,近年来还发现肝素具有抑制平滑肌细胞增殖,抗炎症,抗肿瘤及抗病毒等生物学功能。
肝素具有抗凝血和抗血栓功能,可以增强抗凝血酶Ⅲ与凝血酶的亲和力,加速凝血酶的失活;抑制血小板的粘附聚集;增强蛋白C的活性,刺激血管内皮细胞释放抗凝物质和纤溶物质。肝素还能抑制血小板形成,增加血管壁的通透性,并可调控血管新生、抑制平滑肌细胞增殖。研究还表明肝素具有调血脂的作用,可以用于降血脂。还可作用于补体系统的多个环节,以抑制系统过度激活,与此功能相关,肝素具有抗炎症,抗肿瘤及抗病毒等生物学功能。
在临床上,肝素也有很多重要的应用。肝素是需要迅速达到抗凝作用的首选药物,可用于外科预防血栓形成以及妊娠者的抗凝治疗,对于急性心肌梗死患者,可用肝素预防病人发生静脉栓栓塞病,并可预防大块的前壁透壁性心肌梗死病人发生动脉栓塞等。肝素的另一重要临床应用是在心脏、手术和肾脏透析时维持血液体外循环畅通。还可用于治疗各种原因引起的弥散性血管内凝血(DIC)、用于治疗肾小球肾炎、肾病综合征、类风湿性关节炎等。
临床上最初应用的肝素称为普通肝素或标准肝素(UnfractionatedHeparin)。标准肝素主要用于治疗各种原因引起的弥漫性血管内凝血,以及血液透析、体外循环、导管术、微血管手术等操作中及某些血液标本或器械的抗凝处理等(Kazuyuki Sugahara,Satoml Nadanaka,Kyoko Takeda.Structural analysis of unsaturatedhexasaccharides from shark cartilage chondroitin sulfate D that aresubstrates for the exolytic action of chondroitin sulfate ABC lyase.Europe ofjournal biochemistry,2006,239:871-880)。临床应用及研究显示,标准肝素除具有抗凝血作用外,还具有其他多种生物活性和临床用途,包括降血脂作用、抗中膜平滑肌细胞(SMC)增生、促进纤维蛋白溶11解等作用,还可以治疗冻疮、静脉曲张、神经性皮炎、浅表性静脉炎等多种常见症状(Halil Bayraktar,Evren Akal,Orkan Sarper,et al.Modelingglycosaminglycans-,chondroitin sulfate A,chondroitin sulfate C and keratinstructure(Theochemistry),2004,683:121-132)。低分子肝素的应用于二十世纪九十年代末,西方医药研究人员通过化学或酶学等方法将普通肝素解聚得到分子量分布为3,500-6,500的肝素衍生物,即低分子肝素(Low Molecular Weight Heparin)。经大量临床研究证实,低分子肝素具有很强的抗血栓作用,具有更为广泛的医学用途,成为治疗急性静脉血栓和急性冠脉综合症(心绞痛、心肌梗塞)等疾病的首选药物。通过不同的解聚方法制成的不同品种的低分子肝素,其药物动力学特性和抗凝谱有不同程度的差别,在临床上不能相互代替。
肝素的临床应用不断进展随着人们对肝素生物化学和药理作用的深入研究,其潜在的作用不断被发掘,如抗炎、抗过敏、降血脂及抗动脉粥样硬化、扩张冠脉、缓解支气管痉挛、抑制单纯疱疹病毒活性、抗肿瘤转移以及诱导干扰素的产生等等(Rafael B.Erlich,Claudio C.Werneck,Paulo A.S.Mourao,et al.Major glycosaminoglycan species inthe developing retina:synthesis tissue distribution and effects upon celldeath.Expetimental eye research,2003,77:157-165),其临床显示出许多新的用途及功效,从而获得了日益广泛的应用。陆续发现肝素在血液系统疾病、心脏病、体外循环手术、血液净化疗法、显微外科、肺内科、肾病、产科、儿科、眼科等12个大的临床学的40余种疾病的治疗中都发挥了较好的医疗作用,而且这样的研究还远没有结束,肝素完全可能衍生成为治疗更多疾病的药物。
1.2硫酸软骨素概述
1.2.1硫酸软骨素来源及分类
硫酸软骨素(chondroition sulfate,CS)是广泛存在于人和动物软骨组织中的一类黏多糖,主要由动物喉骨、鼻中隔、气管等软骨组织分离纯化得到。它是以由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-氨基半乳糖以1,3-糖苷键结合的双糖为单位聚合而成的大分子多糖[14]。硫酸软骨素的结构是由D-葡糖醛酸与N-2酰-D氨基半乳糖酸硫酸酯组成,其成分约含50~70个双糖基本单位,分子量为1~5万。硫酸软骨素为白色粉末,无臭无味,吸水性强,易溶于水,不溶于乙酸、丙酮和乙醚等有机溶剂。其盐类对热较稳定,受热达80℃亦不被破坏,在酸性溶液中易水解成单糖或较小的多糖体(于广利,赵峡,张天民,硫酸软骨素的结构特点及其质量控制[J],食品与药品,2010,12(5):153-157)。
根据硫酸软骨素的结构中硫酸基的位置不同,通常将天然来源的硫酸软骨素分为A,B,C,D,E,F,H,K,L和M等多种异构体。其中B、F、H分子中含L-艾杜糖醛酸,主要存在于皮肤中,所以称为硫酸皮肤素(DS)。此外,采用化学方法对其进行过硫酸化修饰,可得到过硫酸软骨素(over sulfated chondroitin sulfate,OSCS)。
硫酸软骨素的种类多,结构复杂。每种硫酸软骨素并非完全由一种理想的二糖重复单元构成,而是由多种含量不同的二糖结构组成的。
其中,硫酸软骨素B的分子中含有L-艾杜糖醛酸,所以硫酸软骨素B又被称为硫酸皮肤素(DS)。多硫酸软骨素(OSCS)是一个不均一的混合物,通常分子中含有2个或者是2个以上的SO3-的硫酸软骨素均可称为多硫酸软骨素,所以硫酸软骨素D、E、F、H、K、L和M又可统称为多硫酸软骨素。
1.2.2硫酸软骨素的结构特点和生物学功能
硫酸软骨素具有很重要的生物学功能。硫酸软骨素作为结缔组织的重要组成部分,具有多种药理作用与生理功能。林熹等(林熹,易自翔,陈奕权,.硫酸软骨亲对软骨细胞增殖的影响及意义[J],福建医科大学学报,2003,37(2):191)将软骨细胞在不同浓度硫酸软骨素中进行体外培养,发现CS浓度高(30mg/mL)时,能抑制软骨细胞的增殖,而低浓度时则对增殖无明显影响。动物试验的研究结果发现硫酸软骨素可以清除体内血液中的脂质和脂蛋白,清除心脏周围血管的胆固醇,防治动脉粥样硬化,并增加脂质和脂肪酸在细胞内的转换率、增加冠状动脉分支或侧支循环。同时,靳启国等[17]通过实验证明了CS能抑制冷冻-束缚应激、利血平引起的胃黏膜损伤,而对酸性乙醇引起的损伤无明显效果。另外,该实验还证实了CS对胃黏膜损伤期间胃液分泌量、胃液酸度和胃蛋白酶活性均无明显影响,这意味着CS的作用机制不同于H受体拮抗剂和质子泵抑制剂。赵锐等(赵锐,管华诗,张源潮,硫酸软骨紊膜剂制备及对口腔粘膜损伤防治作用研究[J],中国生化药物杂志,1999,20(6):283)研究证明了CS能使大鼠口腔黏膜急性损伤处的水疱、溃疡、坏死面积显著减少,且有肉芽组织形成,并伴有修复现象,说明CS可以加速试验性冠状动脉硬化或栓塞所引起的心脉坏死或变性的愈合、再生和修复。此外,CS还能增加细胞的mRNA和DNA的生物合成,从而促进细胞的代谢。
在临床上,硫酸软骨素也具有很广泛的应用。在我国,硫酸软骨素可用于治疗神经痛、神经性偏头痛、关节炎、肩关节痛和腹腔手术后疼痛等、预防和治疗链霉素引起的听觉障碍及各种噪声引起的听觉困难、耳鸣症等。
在欧、美、日等发达国家,硫酸软骨素作为保健品长期应用于防治冠心病、心绞痛、心肌梗塞、冠状动脉机能不全、心肌缺血等疾病,无明显的毒副作用,能显著降低冠心病患者的发病率和死亡率。长期的临床应用发现,硫酸软骨素可以将在动脉和静脉壁上沉积的脂肪等脂质有效的除去或减少,可以显著降低血浆胆固醇,从而防止动脉粥样硬化的形成。
1.3硫酸皮肤素概述
1.3.1硫酸皮肤素的结构特点与生物学功能
硫酸皮肤素(Dermatan sulfate,DS)最早于1941年由猪皮分离得到。由于此硫酸化黏多糖的基本结构与硫酸软骨素(CS)A、C相似,其糖醛酸为L-艾杜糖醛酸,与硫酸软骨素中的葡糖醛酸不同,故命名为硫酸软骨素B。因最初来源于猪皮,故命名为硫酸皮肤素(DS)。DS广泛存在于哺乳动物的结缔组织、皮、腱、心、大动脉、脐带、颈韧带及巩膜、胃粘膜中,肺、脾、脑、尿中亦含有。DS属于黏多糖类药物,其分子结构主要是(1→4)-O-α-L-艾杜糖醛酸-(1→3)-2-乙酰氨基-2-脱氧-4-O-硫酸-β-O-半乳糖(谢继青,姬胜利,王凤山,.硫酸皮肤素的药理作用研究进展[J],药物生物技术,2001,8(4):234~238)。
DS具有抗凝血和抗血栓的活性,是较为理想的抗凝血和抗血栓药物。它能够激活Hep-Ⅱ因子,显示出一定的抗凝血活性。它参与调节凝血过程,而不与丝氨酸蛋白酶相拮抗。DS还显示出抗Xa因子活性,其抗血栓活性不仅表现在能够阻止静脉血栓的形成,而且在低药物浓度下即可促进血栓的溶解。而且DS与LMWH(低分子肝素)或常规肝素有协同作用,合并应用抗凝作用增强(石滨,郭学平,苏涛,硫酸皮肤素的研究概况[J],中国生化药物杂志,2001,22(2):105-106)。
DS还可以通过与选择素的竞争性结合来抑制白细胞沿血管内皮滚动的产生从而抑制炎症的初始过程,发挥抑制炎症的作用。在癌变组织中,由DS组成的核心蛋白聚糖可抑制并下调癌基因蛋白ErbB2的活性,使其酪氨酸残基磷酸化作用几乎消失。核心蛋白聚糖还可诱导抑癌基因蛋白P21的产生,P21是与细胞周期有关的周期素依赖性蛋白激酶抑制剂,使细胞增殖所需的蛋白质磷酸化受阻,细胞停留在G1期,所有这些均能导致肿瘤细胞的生长迟缓甚至停止,起到抑制肿瘤的作用。鉴于DS可与肽类生长因子结合,因此核心蛋白聚糖中的DS可能作为靶点参与和微生物的结合。通过理解这些与病原体结合的GAGs结构基序,可以为我们研制新型疫苗提供新的思路。而且据报道,培养的表皮微管内皮胞加入DS后,会迅速出现核因子-κB(NF-κB)核转位,细胞间黏附分子16-1(ICAM1)mRNA的表达增加,使ICAM-1细胞表面蛋白质增多,有利于损伤修复。除此之外,DS还能与多种趋化因子和细胞因子结合,参与免疫调节和免疫病理反应,如白介素-8、巨噬细胞炎性肽(MIP)-1α、MIP-β、RANTES(regulate on activation normal T cell expressed and secreted)和干扰素(IFN)-γ等。此外,DS还能与细胞外基质中的纤连蛋白(fibronectin)、凝血酶敏感蛋白(thrombospodin)结合,从而抑制后者介导的细胞黏附作用。DS可与转化生长因子-β(TGF-β)结合并抑制其促细胞生长活性(姬胜利,杜海燕,迟延青,硫酸皮肤素的生物学功能[J],中国生化药物杂志,2005,26(1):46-51)。
在生活中,DS可作为外用药或化妆品原料使用,其主要作用有:参与表皮纤维的形成过程,并能够阻止脂蛋白沉积在血管壁上。DS还具抗水肿和促进皮肤更新的活性,能够促进血肿的再吸收,阻止皮肤的过度角质化和棘皮症。另外,DS也具有滋润皮肤、保持水分的作用(袁实,多硫酸化硫酸软骨素的制备、性质及其口服制剂对兔膝骨关节炎的关节保护作用[M].硕士学位论文,山东大学,2008:9-10)。
1.3肝素精制
1.3.1肝素粗品中结构差异较大的杂质及常用的除杂方法
组织内的肝素与其他粘多糖在一起,并与蛋白质结合着,所以肝素的制备包括肝素蛋白质复合物的提取,肝素蛋白质复合物的分解和肝素的精制。制备肝素的原料以牛肺、猪肠粘膜为主(Hirsh J.Heparin[J].The New England Journal of Medicine,1991,324(22):1565-1573.),粗品的制备主要采用离子交换树脂法、季铵盐沉淀法,有的结合超滤技术进行除杂和浓缩。
粗品肝素中含有其它粘多糖,也含有大量未除尽的蛋白质和核酸类物质。从而致使粗品肝素的效价过低,根据形成原因及杂质成分的不同,粗品肝素钠所含杂质可大致分为以下三类:(1)酸性杂质类:粗品中含有较多的酸性蛋白类杂质,这类粗品的水溶液中,碱性时杂质不明显,而在酸性时杂质较多。提纯时以除去酸性杂质为主。(2)中碱性杂质类:粗品水溶液在中性时杂质较多,在碱性时有部分杂质,酸性时杂质较少。多因在中性条件下,酒精沉淀未滤清或生产原料腐败所致。提纯时以除去中性杂质为主,适当除去部分碱性杂质。(3)食盐及低活性杂质类:粗品水溶液在酸、中、碱性时都无明显杂质。多数是由于酒精沉淀浓度过高、含盐量大。提纯时主要注意产品溶液浓度及酒精沉淀浓度的控制,着重分离低抗凝血活性杂质。对酸碱性杂质可通过等电点沉淀及热变性作用、盐析作用等办法去除,对抵抗凝活性的水溶杂质,可通过控制产品溶液浓度特别是酒精沉淀浓度去除。对热原杂质可通过超滤、氧化及离子交换加以去除。
1.3.2与肝素结构相似的杂质
与上面提到的核酸、蛋白等杂质相比,在粗品肝素中与肝素分子结构相似的物质更加难以去除。目前国内的肝素钠产品主要是粗品肝素钠,其中含有大量的肝素类似物如硫酸皮肤素、硫酸软骨素以及硫酸乙酰肝素等。这些肝素类似物在结构上与肝素相似度很高,在物理、化学性质上和肝素也比较接近,比如其在分子量分布以及带电性质上非常相似,因此采用常规方法很难将其在粗品肝素钠产品中分离出来,这也就成为制约高品质、高纯度肝素钠产品质量,生产成本以及销售价格的主要瓶颈因素。现有的工艺往往采用醇沉的手段来对其进行分离,然而这个过程步骤多、分离效果差、肝素损失率高,对于整体的肝素效价收率和成本控制来讲非常不利,急需全新的方法来实现对肝素类似物杂质的高效去除。
如何有效去除肝素粗品中的这些杂质,其关键的因素是通过哪些手段能够显著改变这些结结构、性质相似的肝素类似物的理化性质,使得其在分子量、带电类型等方面与肝素分子有显著差异,结合下游的高效分离步骤,将其从肝素中高效去除。与此同时,另一个值得关注的关键因素是在改变这些肝素类似物的理化性质以及去除的过程中,作为主要成分的肝素分子的结构和生物学功能不能够收到影响,需要最大程度的保证肝素分子结构的完整性以及一系列分离纯化工艺之后的较高的效价收率。
目前的研究现状表明高纯度的肝素钠产品具有很高的应用价值,然而由于硫酸软骨素、硫酸皮肤素和硫酸乙酰肝素等肝素类似物也具有其特有的生物学功能,因此在未来的应用中,这些现阶段被看作是杂质的物质很有可能会被应用于新的病理研究以及目前未知的新型适应症中。比如现在达纳肝素(肝素钠中含有一定量的硫酸软骨素与硫酸皮肤素)目前的生物学功能已经被重新认识并重视起来,在治疗乙型肝炎以及抗癌药物的研发中都有重要作用。然而,这类肝素产品的生产规模较小,其主要原因是缺乏有效的手段对其中的硫酸软骨素与硫酸皮肤素含量进行精确的控制,而这些杂质量的差异会显著影响这类肝素产品的使用效果甚至安全性。因此,开发一种能实现对肝素类产品中的硫酸软骨素与硫酸皮肤素含量的高效、精确控制的方法具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种精确定量控制类肝素/肝素样品中硫酸软骨素及硫酸皮肤素含量的方法。
本发明所提供的定量控制类肝素/肝素样品中硫酸软骨素及硫酸皮肤素含量的方法,分为下述A和B两种方法:
1)向含类肝素、硫酸软骨素和硫酸皮肤素的类肝素样品的溶液中或含肝素、硫酸软骨素和硫酸皮肤素的肝素样品的溶液中加入具有硫酸软骨素酶B活性的蛋白质,使其与类肝素或肝素样品中的硫酸皮肤素进行酶解反应,监测酶解过程溶液中硫酸皮肤素的含量变化,待硫酸皮肤素的含量达到预期含量时,终止硫酸软骨素酶B催化的酶解反应;
2)向终止硫酸软骨素酶B催化的酶解反应的溶液中加入具有硫酸软骨素酶AC活性的蛋白质,使其与溶液中的硫酸软骨素进行酶解反应;监测酶解过程溶液中硫酸软骨素的含量变化,待硫酸软骨素的含量达到预期含量时,终止硫酸软骨素酶AC催化的酶解反应,得到期望的硫酸软骨素及硫酸皮肤素含量的类肝素或肝素样品溶液;
方法B包括下述步骤:
a)向含类肝素、硫酸软骨素和硫酸皮肤素的类肝素样品的溶液中或含肝素、硫酸软骨素和硫酸皮肤素的肝素样品的溶液中加入具有硫酸软骨素酶AC活性的蛋白质,使其与类肝素或肝素样品中的硫酸软骨素进行酶解反应;监测酶解过程溶液中硫酸软骨素的含量变化,待硫酸软骨素的含量达到预期含量时,终止硫酸软骨素酶AC催化的酶解反应;
b)向终止硫酸软骨素酶AC催化的酶解反应的溶液中加入具有硫酸软骨素酶B活性的蛋白质,使其与溶液中的硫酸皮肤素进行酶解反应;监测酶解过程溶液中硫酸皮肤素的含量变化,待硫酸皮肤素的含量达到预期含量时,终止硫酸软骨素酶B催化的酶解反应,得到期望的硫酸软骨素及硫酸皮肤素含量的类肝素或肝素样品溶液。
本发明中所述含肝素、硫酸软骨素和硫酸皮肤素的肝素样品是指未经本发明所述的方法进行处理的含有硫酸软骨素、硫酸皮肤素等杂质的肝素样品。当然该肝素样品也可以是经过了常规的纯化步骤除去了其它多种杂质但尚未除去硫酸软骨素、硫酸皮肤素等杂质的肝素样品。
所述类肝素通常是指结构与肝素相似,具有一定抗凝活性的硫酸化多糖。类肝素具体可为硫酸乙酰肝素,达那肝素钠等。
本发明中所述含类肝素、硫酸软骨素和硫酸皮肤素的类肝素样品是指未经本发明所述的方法进行处理的含有硫酸软骨素、硫酸皮肤素等杂质的类肝素样品。当然该类肝素样品也可以是经过了常规的纯化步骤除去了其它多种杂质但尚未除去硫酸软骨素、硫酸皮肤素等杂质的类肝素样品。
所述含类肝素、硫酸软骨素和硫酸皮肤素的类肝素钠样品具体可为未精制的达那肝素,即硫酸软骨素和硫酸皮肤素的含量不符合欧洲药典7.0标准的达那肝素钠样品。
上述方法A的步骤1)中,所述类肝素样品的溶液和肝素样品的溶液的浓度均为10mg/ml~100mg/ml。
所述类肝素样品的溶液和肝素样品的溶液均由pH7.4Tris缓冲液配制而成,所述pH7.4Tris缓冲液由下述终浓度的物质组成:氯化钙20mM,氯化钠50mM,Tris(三羟甲基氨基甲烷)50mM,稀盐酸调节pH至7.4。
所述酶解反应的反应条件如下:温度为25-35℃;pH值为7-8。
本发明对于上述步骤1)中的酶解反应的时间没有明确限定,只要能够将肝素样品或类肝素样品中的硫酸皮肤素降解至目标含量皆可。因此仅需要根据不同的酶量、不同的操作条件,选择适当的反应时间即可,本领域技术人员可以适当地调节。在具体实施方式中,反应进行的时间可根据加入的酶量和硫酸皮肤素(DS)的含量适当调整。
在上述方法中,本领域技术人员可以根据原料中含有的DS量、期望去除的DS量,以及计划进行的反应时间来适当地确定具有硫酸软骨素酶B活性的蛋白质和肝素钠样品的比例。
其中,所述具有硫酸软骨素酶B活性的蛋白质的1IU定义为:在30℃条件下每分钟能产生1μmol不饱和低聚糖的活力。
上述步骤1)中所述具有硫酸软骨素酶B活性的蛋白质可以是硫酸软骨素酶B;也可以为CN103103173A(申请号为:201110358134.7)中公开的硫酸软骨素酶B融合蛋白MBP-ChSase B,其氨基酸序列如CN103103173A中序列表SEQ ID No:4所示。
该硫酸软骨素酶B可以是购买的酶产品,也可以利用能够生产硫酸软骨素酶B的细菌菌体、该细菌菌体的细胞提取物、亦或是细胞提取物经提纯得到的含酶溶液、以及经纯化得到的酶。上述能够生产硫酸软骨素酶B的细菌例如有肝素黄杆菌(Pedobacter heparinus或Flavobacterium heparinum)、金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)和嗜水气单孢菌(Aeromonas liquefaciens)。
硫酸软骨素酶B可以通过商业途径获得,例如购买自Sigma、IBEX等公司的硫酸软骨素酶B。
上述方法A的步骤1)中,通过HPLC法监测酶解过程溶液中硫酸皮肤素的含量变化。
上述方法A的步骤1)中可以通过添加反应终止剂使硫酸软骨素酶B失活然后出去该酶。所述反应终止剂例如酸、碱等。考虑到上述方法会增加反应体系中的杂质,故优先选择通过加热的方法使酶失活。具体终止硫酸软骨素酶B催化的酶解反应的方法如下:将具有硫酸软骨素酶B活性的蛋白质灭活,并通过离心使灭活后具有硫酸软骨素酶B活性的蛋白质从所述溶液中除去;所述灭活的方法为:90-100℃加热10-15min;
上述方法A的步骤2)中,所述酶解反应的反应条件如下:温度为25-35℃;pH值为6-8。
本发明对于上述步骤2)中的酶解反应的时间没有明确限定,只要能够将肝素钠样品中的硫酸软骨素降解至目标含量皆可。因此仅需要根据不同的酶量、不同的操作条件,选择适当的反应时间即可,本领域技术人员可以适当地调节。在具体实施方式中,反应进行的时间可根据加入的酶量和硫酸软骨素(CS)的含量适当调整。
在上述方法中,本领域技术人员可以根据原料中含有的CS量、期望去除的CS量,以及计划进行的反应时间来适当地确定具有硫酸软骨素酶AC活性的蛋白质和肝素钠样品的比例。
所述具有硫酸软骨素酶AC活性的蛋白质的1IU定义为:在30℃条件下每分钟能产生1μmol不饱和低聚糖的活力。
上述步骤2)中所述具有硫酸软骨素酶AC活性的蛋白质可以是硫酸软骨素酶AC,也可以为CN103103174A(申请号为:201110358185.x)中公开的硫酸软骨素酶AC融合蛋白MBP-ChSase AC,其氨基酸序列如CN103103174A中序列表SEQ ID No:4所示。
该硫酸软骨素酶AC可以是购买的酶产品,也可以利用能够生产硫酸软骨素酶AC的细菌菌体、该细菌菌体的细胞提取物、亦或是细胞提取物经提纯得到的含酶溶液、以及经纯化得到的酶。上述能够生产硫酸软骨素酶AC的细菌例如有肝素黄杆菌(Pedobacterheparinus或Flavobacterium heparinum)、金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)和嗜水气单孢菌(Aeromonas liquefaciens)。
例如,硫酸软骨素酶AC和硫酸软骨素酶B来自肝素黄杆菌。
硫酸软骨素酶AC可以通过商业途径获得,例如购买自Sigma、IBEX等公司的硫酸软骨素酶AC。
步骤2)中,通过HPLC法监测酶解过程溶液中硫酸软骨素的含量变化;
步骤2)中也可以通过添加反应终止剂使硫酸软骨素酶B失活然后出去该酶。所述反应终止剂例如酸、碱等。考虑到上述方法会增加反应体系中的杂质,故优先选择通过加热的方法使酶失活。具体终止硫酸软骨素酶AC催化的酶解反应的方法为:将具有硫酸软骨素酶AC活性的蛋白质灭活,并通过离心使灭活后具有硫酸软骨素酶AC活性的蛋白质从所述溶液中除去;所述灭活的方法为:90-100℃加热10-15min。
为了得到更加纯化的类肝素或肝素样品,所述方法A还包括下述步骤3)和/或4):
步骤3)为:在步骤2)前对终止硫酸软骨素酶B催化的酶解反应的溶液进行如下处理:向终止硫酸软骨素酶B催化的酶解反应的溶液中加入乙醇,离心收集沉淀并除去水分,得到干产物,并将所述干产物配制成溶液;所述干产物配制的溶液的浓度为10mg/ml~100mg/ml,该溶液由pH7.4Tris缓冲液配制而成;所述pH7.4Tris缓冲液由下述终浓度的物质组成:氯化钙20mM,氯化钠50mM,Tris(三羟甲基氨基甲烷)50mM,稀盐酸调节pH至7.4;
步骤4)为:对步骤2)中所述期望的硫酸软骨素及硫酸皮肤素含量的类肝素或肝素样品溶液进行如下处理:向所述期望的硫酸软骨素及硫酸皮肤素含量的类肝素或肝素样品溶液中加入乙醇,离心收集沉淀并除去水分,得到纯化的具有期望的硫酸软骨素及硫酸皮肤素含量的类肝素或肝素样品。
上述方法中除去水分的方法可采用冻干法,也可以采取常温减压干燥的原理去除水分,总之冻干或者烘干及其他脱水的方法有两个要求:1能将样品中的水分去除,2对样品的结构不产生破坏,高温烘干不建议,对结构可能有破坏。
当所述类肝素钠样品为未精制的达那肝素(即硫酸软骨素和硫酸皮肤素的含量不符合欧洲药典7.0标准的达那肝素钠样品),将其精制成符合欧洲药典7.0标准的达那肝素钠样品,所述具有硫酸软骨素酶B活性的蛋白质与达那肝素样品的配比为:每千克达那肝素样品中加入13060-24500IU的具有硫酸软骨素酶B活性的蛋白质,优选配比为每千克达那肝素样品中加入13060-19600IU的具有硫酸软骨素酶B活性的蛋白质;酶解的时间为30-45小时;所述具有硫酸软骨素酶AC活性的蛋白质与达那肝素样品的配比为:每千克达那肝素样品中加入8280-15525IU的具有硫酸软骨素酶AC活性的蛋白质,优选配比为每千克达那肝素样品中加入8280-12420IU的具有硫酸软骨素酶AC活性的蛋白质;酶解的时间为27-40.5小时;
上述方法B与方法A相比,只是加入酶的顺序进行的前后调整,其它处理均未改变。因此,方法B的步骤a)中涉及的物质、具体反应条件及参数设置同方法A的步骤1)。方法B的步骤b)中涉及的物质、具体反应条件及参数设置同方法A的步骤2)。
本发明中所述的硫酸软骨素均指不包含硫酸皮肤素(即硫酸软骨素B)的硫酸软骨。
由上述方法制备得到的肝素样品或类肝素样品也属于本发明的保护范围。
本发明通过硫酸软骨素酶的特异性降解,实现了对肝素或类肝素产品中的硫酸软骨素与硫酸皮肤素含量的高效、精确控制,而对其他组分没有影响,从而建立新型肝素类产品的低成本、高产率的生产工艺。且该生产方法简单易行,成本可控,具有规模化生产的应用价值。
附图说明
图1为测定未精制达那肝素钠样品中CS含量的HPLC图谱。
图2为测定未精制达那肝素钠样品中DS含量的HPLC图谱。
图3为先去除DS后去除CS,最终获得的精制达钠肝素钠中DS含量的HPLC图谱。
图4为先去除DS后去除CS,最终获得的精制达钠肝素钠中CS含量的HPLC图谱。
图5为先去除CS后去除DS,最终获得的精制达钠肝素钠中CS含量的HPLC图谱。
图6为先去除CS后去除DS,最终获得的精制达钠肝素钠中DS含量的HPLC图谱。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明,但本发明并不局限于此。
下述实施例中所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法;所述试剂和生物材料,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
下述实施例中以MBP-ChSase B作为硫酸软骨素酶B的代表、MBP-ChSase AC作为硫酸软骨素酶AC的代表,本领域技术人员应当理解,任何形式的硫酸软骨素酶B、硫酸软骨素酶AC均可以用于实现本发明的目的。
下述实施例中所采用的达那肝素钠样品购于河北常山生化药业股份有限公司,经HPLC方法检测(具体测定方法参见实施例1),测得该产品中硫酸皮肤素(DS)的质量含量为70.62%,硫酸软骨素(CS)的质量含量为12.20%。达那肝素钠主要含有硫酸乙酰肝素(HS),硫酸皮肤素(DS)和硫酸软骨素(CS)。欧洲药典7.0(EP7.0)达那肝素钠质量标准是:DS含量8.0%~16.0%,CS含量不超过8.5%。
下述实施例中所使用的硫酸软骨素酶B融合蛋白为CN103103173A(申请号为:201110358134.7)中公开的硫酸软骨素酶B融合蛋白MBP-ChSase B,其氨基酸序列如CN103103173A中序列表SEQ ID No:4所示。1国际单位IU MBP-ChSase B的酶活定义为:在30℃条件下每分钟能产生1μmol不饱和低聚糖的活力。
下述实施例中所使用的硫酸软骨素酶AC融合蛋白为CN103103174A(申请号为:201110358185.x)中公开的硫酸软骨素酶AC融合蛋白MBP-ChSase AC,其氨基酸序列如CN103103174A中序列表SEQ ID No:4所示。1国际单位IU MBP-ChSase AC的酶活定义为:在30℃条件下每分钟能产生1μmol不饱和低聚糖的活力。
下述实施例中使用的pH7.4Tris缓冲液组成如下:氯化钙20mM,氯化钠50mM,Tris(三羟甲基氨基甲烷)50mM,稀盐酸调节pH至7.4。
实施例1、精制达那肝素钠样品
1.含量分析方法
1.1DS含量分析方法:用pH7.4的Tris缓冲溶液配制待测样品溶液10mg/ml,取1ml的样品溶液,加入1IU的MBP-ChSase B在25℃酶解24h,然后用HPLC分析(具体色谱条件如下),通过外标曲线计算DS含量。DS含量的检测限0.01%。与欧洲药典7.0(EP7.0)中记载的DS含量分析方法相比较,HPLC分析方法灵敏度高,重复性好。
色谱条件:
检测器:紫外检测器;检测波长:232nm;
流动相:A-pH3.5去离子水,B-pH3.52mol/L的氯化钠溶液;
进样量:20μL;
流速:1ml/min;
柱温:35℃;
洗脱方式:线性梯度洗脱,具体洗脱方式见表1。
表1 流动相梯度
时间(分钟) | 流动相A(%,v/v) | 流动相B(%,v/v) |
0 | 100 | 0 |
4 | 100 | 0 |
45 | 50 | 50 |
采用上述方法测定的未精制的达那肝素钠样品中DS含量的HPLC图谱如图2所示。从图中可以看出DS的保留时间为15.838min。
1.2CS含量分析方法:用pH7.4的Tris缓冲溶液配制待测样品溶液10mg/ml,取1ml的样品溶液,加入1IU的MBP-ChSase AC在25℃酶解24h,然后用HPLC分析(具体色谱条件如下),通过外标曲线计算CS含量。CS含量的检测限0.05%。与欧洲药典7.0(EP7.0)中记载的CS含量分析方法相比较,HPLC分析方法灵敏度高,重复性好。
色谱条件:
检测器:紫外检测器;检测波长:232nm;
流动相:A-pH3.5去离子水,B-pH3.52mol/L的氯化钠溶液;
进样量:20μL;
流速:1ml/min;
柱温:35℃;
洗脱方式:线性梯度洗脱,具体洗脱方式见表2。
表2 流动相梯度
时间(分钟) | 流动相A(%,v/v) | 流动相B(%,v/v) |
0 | 100 | 0 |
4 | 100 | 0 |
45 | 50 | 50 |
采用上述方法测定的未精制的达那肝素钠样品中CS含量的HPLC图谱如图1所示。图1中保留时间分别是24.109min和25.113min的两个峰均为CS所对应的峰,计算含量时是以两个峰的峰面积之和参与计算的。
2.精制方法A(先去除DS,然后再去除CS)
2.1定量去除DS:使用pH7.4Tris缓冲液配制达那肝素钠样品溶液100mg/ml,并调节溶液的pH值至7.4,向溶液中分批添加MBP-ChSase B在30℃进行酶解反应,通过HPLC监测溶液中DS含量变化,确认反应是否到达到控制点(即DS的含量是否到达预期的含量要求),当反应达到控制点时,将溶液放置在100℃水浴10min灭活,灭活后离心使MBP-ChSase B蛋白沉淀,取上清液进行后续处理,然后向上清液中加入6倍体积的无水乙醇,10000r/min离心10min,收集沉淀并冻干。
以精制43.5g达那肝素钠粗品为例,向溶液中分批加入710IU的MBP-ChSase B,酶解30h。
2.2定量去除CS:使用pH7.4Tris缓冲液配制经2.1处理得到的冻干样品溶液100mg/ml,并调节溶液的pH值至7.4,向溶液中分批添加MBP-ChSase AC在30℃进行酶解反应,通过HPLC监测溶液中CS含量变化,确认反应是否到达到控制点(即CS的含量是否到达预期的含量要求),当反应达到控制点时,将溶液放置在100℃水浴10min灭活,灭活后离心使MBP-ChSase AC蛋白沉淀,取上清液进行后续处理,然后向上清液中加入6倍无水乙醇,10000r/min离心10min,收集沉淀并冻干,即得精制后的达那肝素钠。
将2.1收集的冻干样品继续进行酶解,向溶液中分批加入450IU的MBP-ChSase AC,酶解27h,得到精制的达那肝素钠样品14.27g,其中DS含量为1.443g,CS含量为0.559g。
测定该精制后样品中的DS含量,其HPLC图谱如图3所示。测定该精制后样品中的CS含量,其HPLC图谱如图4所示。
3.精制方法B(先去除CS,然后再去除DS)
3.1定量去除CS:使用pH7.4Tris缓冲液配制达那肝素钠样品溶液100mg/ml,并调节溶液的pH值至7.4,向溶液中分批添加MBP-ChSase AC在30℃进行酶解反应,通过HPLC监测溶液中CS含量变化,确认反应是否到达到控制点(即CS的含量是否到达预期的含量要求),当反应达到控制点时,将溶液放置在100℃水浴10min灭活,灭活后离心使MBP-ChSaseAC蛋白沉淀,取上清液进行后续处理,然后向上清液中加入6倍体积的无水乙醇,10000r/min离心10min,收集沉淀并冻干。
以精制43.5g达那肝素钠粗品为例,向溶液中分批加入450IU的MBP-ChSase AC,酶解27h。
3.2定量去除DS:使用pH7.4Tris缓冲液配制经3.1处理得到的冻干样品溶液100mg/ml,并调节溶液的pH值至7.4,向溶液中分批添加MBP-ChSase B在30℃进行酶解反应,通过HPLC监测溶液中DS含量变化,确认反应是否到达到控制点(即CS的含量是否到达预期的含量要求),当反应达到控制点时,将溶液放置在100℃水浴10min灭活,灭活后离心使MBP-ChSase B蛋白沉淀,取上清液进行后续处理,然后向上清液中加入6倍无水乙醇,10000r/min离心10min,收集沉淀并冻干,即得精制后的达那肝素钠。
将3.1收集的冻干样品继续进行酶解,向溶液中分批加入710IU的MBP-ChSase B,酶解30h,得到精制的达那肝素钠样品14.300g,其中DS含量为1.427g,CS含量为0.558g。
测定该精制后样品中的CS含量,其HPLC图谱如图5所示。CS的保留时间为23.645min和24.634min。测定该精制后样品中的DS含量,其HPLC图谱如图6所示。DS的保留时间为24.665min。
4.结果与讨论:
精制方法A酶处理前后DS和CS含量
检测项 | 处理前 | 处理后 |
DS含量 | 70.62% | 10.11% |
CS含量 | 12.20% | 3.92% |
注:DS和CS含量的分析方法使用HPLC检测方法。
精制方法B酶处理前后DS和CS含量
检测项 | 处理前 | 处理后 |
DS含量 | 70.62% | 9.98% |
CS含量 | 12.20% | 3.90% |
注:DS和CS含量的分析方法使用HPLC检测方法。
达那肝素钠样品精制前后,所含硫酸乙酰肝素(HS)的质量几乎没有变化,表明本发明提供的两者精制方法均能选择性的除去DS和CS,而不会降解HS。
由上述结果可知,使用硫酸软骨素酶B和AC能选择性的将不满足欧洲药典7.0标准(EP7.0)的达那肝素钠样品中的DS和CS控制在要求的质量范围(EP7.0达那肝素钠质量标准是:DS含量8.0%~16.0%,CS含量不超过8.5%。),制备出合格的达那肝素钠产品。整个工艺流程简单,可操作性强,易于实现产业化应用。
Claims (7)
1.一种定量控制类肝素或肝素样品中硫酸软骨素及硫酸皮肤素含量的方法,分为下述A和B两种方法:
方法A包括下述步骤:
1)向含类肝素、硫酸软骨素和硫酸皮肤素的类肝素样品的溶液中或含肝素、硫酸软骨素和硫酸皮肤素的肝素样品的溶液中加入具有硫酸软骨素酶B活性的蛋白质,使其与类肝素或肝素样品中的硫酸皮肤素进行酶解反应,监测酶解过程溶液中硫酸皮肤素的含量变化,待硫酸皮肤素的含量达到预期含量时,终止硫酸软骨素酶B催化的酶解反应;
所述方法A的步骤1)中,所述类肝素样品的溶液和肝素样品的溶液均由pH7.4Tris缓冲液配制而成;所述类肝素样品的溶液和肝素样品的溶液的浓度均为10mg/ml-100mg/ml;
所述方法A的步骤1)中,所述酶解反应的反应条件如下:温度为25-35℃,pH值为7-8;
所述方法A的步骤1)中,通过HPLC法监测酶解过程溶液中硫酸皮肤素的含量变化;
所述方法A的步骤1)中终止硫酸软骨素酶B催化的酶解反应的方法为:将具有硫酸软骨素酶B活性的蛋白质灭活,并通过离心使灭活后具有硫酸软骨素酶B活性的蛋白质从所述溶液中除去;所述灭活的方法为:90-100℃加热10-15min;
2)向终止硫酸软骨素酶B催化的酶解反应的溶液中加入具有硫酸软骨素酶AC活性的蛋白质,使其与溶液中的硫酸软骨素进行酶解反应;监测酶解过程溶液中硫酸软骨素的含量变化,待硫酸软骨素的含量达到预期含量时,终止硫酸软骨素酶AC催化的酶解反应,得到期望的硫酸软骨素及硫酸皮肤素含量的类肝素或肝素样品溶液;
所述方法A的步骤2)中,所述酶解反应的反应条件如下:温度为25-35℃,pH值为6-8;
所述方法A的步骤2)中,通过HPLC法监测酶解过程溶液中硫酸软骨素的含量变化;
所述方法A的步骤2)中终止硫酸软骨素酶AC催化的酶解反应的方法为:将具有硫酸软骨素酶AC活性的蛋白质灭活,并通过离心使灭活后具有硫酸软骨素酶AC活性的蛋白质从所述溶液中除去;所述灭活的方法为:90-100℃加热10-15min;
方法B包括下述步骤:
a)向含类肝素、硫酸软骨素和硫酸皮肤素的类肝素样品的溶液中或含肝素、硫酸软骨素和硫酸皮肤素的肝素样品的溶液中加入具有硫酸软骨素酶AC活性的蛋白质,使其与类肝素或肝素样品中的硫酸软骨素进行酶解反应;监测酶解过程溶液中硫酸软骨素的含量变化,待硫酸软骨素的含量达到预期含量时,终止硫酸软骨素酶AC催化的酶解反应;
所述方法B的步骤a)中,所述类肝素样品的溶液和肝素样品的溶液均由pH7.4Tris缓冲液配制而成;所述类肝素样品的溶液和肝素样品的溶液的浓度均为10mg/ml-100mg/ml;
所述方法B的步骤a)中,所述酶解反应的反应条件如下:温度为25-35℃,pH值为6-8;
所述方法B的步骤a)中,通过HPLC法监测酶解过程溶液中硫酸软骨素的含量变化;
所述方法B的步骤a)中终止硫酸软骨素酶AC催化的酶解反应的方法为:将具有硫酸软骨素酶AC活性的蛋白质灭活,并通过离心使灭活后具有硫酸软骨素酶AC活性的蛋白质从所述溶液中除去;所述灭活的方法为:90-100℃加热10-15min;
b)向终止硫酸软骨素酶AC催化的酶解反应的溶液中加入具有硫酸软骨素酶B活性的蛋白质,使其与溶液中的硫酸皮肤素进行酶解反应;监测酶解过程溶液中硫酸皮肤素的含量变化,待硫酸皮肤素的含量达到预期含量时,终止硫酸软骨素酶B催化的酶解反应,得到期望的硫酸软骨素及硫酸皮肤素含量的类肝素或肝素样品溶液;
所述方法B的步骤b)中,所述酶解反应的反应条件如下:温度为25-35℃,pH值为7-8;
所述方法B的步骤b)中,通过HPLC法监测酶解过程溶液中硫酸皮肤素的含量变化;
所述方法B的步骤b)中终止硫酸软骨素酶B催化的酶解反应的方法为:将具有硫酸软骨素酶B活性的蛋白质灭活,并通过离心使灭活后具有硫酸软骨素酶B活性的蛋白质从所述溶液中除去;所述灭活的方法为:90-100℃加热10-15min。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:
所述方法A的步骤1)和所述方法B的步骤b)中,所述具有硫酸软骨素酶B活性的蛋白质为硫酸软骨素酶B或硫酸软骨素酶B融合蛋白;其中硫酸软骨素酶B融合蛋白中融合有硫酸软骨素酶B和麦芽糖结合蛋白;
所述方法A的步骤2)和所述方法B的步骤a)中,所述具有硫酸软骨素酶AC活性的蛋白质为硫酸软骨素酶AC或硫酸软骨素酶AC融合蛋白;其中,所述硫酸软骨素酶AC融合蛋白中融合有硫酸软骨素酶AC和麦芽糖结合蛋白。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:所述硫酸软骨素酶B融合蛋白的氨基酸序列是CN103103173A中SEQ ID NO:4所示的氨基酸;
所述硫酸软骨素酶AC融合蛋白的氨基酸序列是CN103103174A中SEQ ID No:4所示的氨基酸。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述方法A还包括下述步骤3)和/或4):
步骤3)为:在步骤2)前对终止硫酸软骨素酶B催化的酶解反应的溶液进行如下处理:向终止硫酸软骨素酶B催化的酶解反应的溶液中加入乙醇,离心收集沉淀并除去水分,得到干产物,并将所述干产物配制成溶液;所述干产物配制的溶液的浓度为10mg/ml~100mg/ml,该溶液由pH7.4Tris缓冲液配制而成;
步骤4)为:对步骤2)中所述期望的硫酸软骨素及硫酸皮肤素含量的类肝素或肝素样品溶液进行如下处理:向所述期望的硫酸软骨素及硫酸皮肤素含量的类肝素或肝素样品溶液中加入乙醇,离心收集沉淀并除去水分,得到纯化的具有期望的硫酸软骨素及硫酸皮肤素含量的类肝素或肝素样品。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述方法B还包括下述步骤c)和/或d):
步骤c)为:在步骤b)前对终止硫酸软骨素酶AC催化的酶解反应的溶液进行如下处理:向终止硫酸软骨素酶AC催化的酶解反应的溶液中加入乙醇,离心收集沉淀并除去水分,得到干产物,并将所述干产物配制成溶液;所述干产物配制的溶液的浓度为10mg/ml~100mg/ml,该溶液由pH7.4Tris缓冲液配制而成;
步骤d)为:对步骤b)中所述期望的硫酸软骨素及硫酸皮肤素含量的类肝素或肝素样品溶液进行如下处理:向所述期望的硫酸软骨素及硫酸皮肤素含量的类肝素或肝素样品溶液中加入乙醇,离心收集沉淀并除去水分,得到纯化的具有期望的硫酸软骨素及硫酸皮肤素含量的类肝素或肝素样品。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法,其特征在于:所述含类肝素、硫酸软骨素和硫酸皮肤素的类肝素样品为未精制的达纳肝素钠,即硫酸软骨素和硫酸皮肤素的含量不符合欧洲药典7.0标准的达那肝素钠样品。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于:
所述方法A的步骤1)中,所述具有硫酸软骨素酶B活性的蛋白质与类肝素样品或肝素样品的配比为:每千克类肝素样品或肝素样品中加入13060-24500IU的具有硫酸软骨素酶B活性的蛋白质;酶解的时间为30-45小时;
所述方法A的步骤2)中,所述具有硫酸软骨素酶AC活性的蛋白质与类肝素样品或肝素样品的配比为:每千克类肝素样品或肝素样品中加入8280-15525IU的具有硫酸软骨素酶AC活性的蛋白质;酶解的时间为27-40.5小时;
所述方法B的步骤a)中,所述具有硫酸软骨素酶AC活性的蛋白质与类肝素样品或肝素样品的配比为:每千克类肝素样品或肝素样品中加入8280-15525IU的具有硫酸软骨素酶AC活性的蛋白质;酶解的时间为27-40.5小时;
所述方法B的步骤b)中,所述具有硫酸软骨素酶B活性的蛋白质与类肝素样品或肝素样品的配比为:每千克类肝素样品或肝素样品中加入13060-24500IU的具有硫酸软骨素酶B活性的蛋白质;酶解的时间为30-45小时。
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