JP4149545B2 - 低分子量のフカン類とその医薬組成物 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗凝固活性、抗トロンビン活性及び抗血栓活性を有する新規のフカン、カッソウ又はフェオフィシー(Pheophycee)からのそれらの製造方法及び非経口、経口ならびに局所投与用の製剤に関する。
【0002】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
カッソウから抽出されたフカンが抗凝固活性を有することは、ここ何年かのあいだに知られている(Springer G.F.ら、‘Isolation of anticoagulant fractions from crude fucoidin’ Proc.Soc.Exp.Biol.Med., 1957, 94, 404-409) 。この技術分野での知識は、これらの物質の構造と薬理学的活性の関係の幾つかの態様を理解するために割かれてきた。抗凝固活性は直接には硫酸塩の含有量に依存し、その他にウロン酸の含有量の減少とともに増加することが、立証されている(T.Nishinoら、‘Isolation, purification and characterization of fucosec-ontaining sulfated polysaccharides from the brown seaweed Ecklonia kuro-me and their blood-anticoagulant activities’Carbohyd.Res., 186, 119(1989); H.Mori ら、‘Sugar constituents of some sulfated polysaccharides f-rom the sporophylls of wakame (Undaria pinnatifida) and their biologicalactivities’Mar.Algae Pharm.Sci., 2, 109 (1982))。
【0003】
さらに、凝固時間ATPP(活性化部分トロンボプラスチン時間)とトロンビン時間TTは、分子量が10000〜50000ダルトンのフカン抽出物でともに増加することが見いだされている(Nishinoら、‘The relationship between the molecular weight and the anticoagulant activity of two types of fuc-an sulfates from the brown seaweeds Ecklonia kurome’Agr.Biol.Chem., 55, 791, 1991)。ほかの研究者(V.Grauffelら、‘New natural polysaccharides with potent antithrom-botic activity: fucans from brown alagae’Biomaterials, 10, 363, 1989)は、エイ・ノドソム(A.nodosum)、ピー・カナリキュレータ(P.canaliculatae)、エフ・ベシクロス(F.vesiculosus) から得られたフカン製品について、上記範囲がより広範囲で、18000〜80000ダルトンに拡大することを指摘している。この後者の化合物では、抗凝固活性と同様に分子量に依存する抗トロンビン活性(トロンビン国際単位/化合物mgで示す)が、さらに立証されている。
【0004】
このために、フカンの薬理学的特性とその構造ならびに薬理学的活性の相関係の両方についてのこの分野での知見は、もっとも活性な製品が、80,000ダルトンより低い分子量を有し、さらに高い硫酸含有量を有するもののなかに見いだされることを示している。このことから、フカンの潜在的な治療上の興味を理解することができる。
【0005】
それらの特定の製造方法に関しては、実質的に2つの異なる手段に対応する方法が、多くの分野の文献に記載されている。もっとも行われているのは、粗抽出物における、フカンのポリマーの異なる物理特性をそれぞれ活用した連続的な分画工程である。通常用いられる分画技術は、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、第四アンモニム界面活性剤又は水混和性有機溶媒(例えばエタノール、アセトン)の添加による分別沈殿である。第二の方法は、高分子量のフカンについて、つまり前述の粗抽出物よりも化学的観点で物質をより均一にする、分子量を低くする方法である。第一の方法に関しては、必要な工程の数が、最終産物に存在すべき薬理学的活性の量との直接的に関連して増加することが、当該分野の文献でしばしば認められることを付加えなければならない。この適切な実施例は、以下に要約する2つの刊行物で提示されている。
【0006】
S.Maurayら(‘Venous antithrombotic and anticoagulant activities of a fucoidan frac-tion’Thromb. and Haemost., 74(5), 1280 (1995))には、化学的ならびに物理化学的観点から特徴づけられるアスコフィラム・ノドソム(Ascophyllum nodosum) から単離したフカンが記載されている:平均分子量20,000ダルトン、フコース48.6%、ウロン酸5.8%、硫黄9%。その製造方法は(a)水性媒体中での植物物質の抽出、(b)第四アンモニウム塩による分画、(c)排除クロマトグラフィーでの分画からなる。このようにして得られる化合物は、20mcg/mlの用量で開始するAPTT及びTT試験でともに時間の有為な延長を誘導した。ヘパリンと同一のAPTT及びTT値を得るために、ヘパリンに用いられる30〜40倍量のフカン量が必要とされた。さらに、記載されている血栓実験モデルで得たED50値の試験によれば、該化合物の活性は、17倍少ない重量のヘパリンによる活性と同じであった。
【0007】
T.Nishino らの刊行物(Carbohyd. Res., 186 (1989), 119 (上記参照)には、(a)Ecklonia kurome の乾燥粉砕粉末の沸騰水中での抽出、(b)セチルピリジニウムクロライドでの沈殿と4M-NaCl中での沈殿物の溶解、(c)エタノールの添加による沈殿と水中での溶解、(d)塩化カルシウムによる沈殿、上澄液の回収及び凍結乾燥、(e)イオン交換分画カラム及び樹脂床にそれぞれ0.95M NaClと2M NaCl溶液を使用することによる画分の回収、(f)酢酸カルシウムを含むエタノールを加えて行う回収溶液での分画沈殿、(g)ゲルろ過カラムクロマトグラフィーからなる製造方法が記載されている。2つのフカン製品は、それぞれ物理化学的および化学的パラメーターで特徴づけた:分子量32,000ならびに21,000ダルトン、硫黄14.6ならびに13.3%、フコース50.1ならびに49.5%、ウロン酸1.5ならびに3.9%、比旋光度−142°ならびに−129°。化合物のAPTTとTT活性は、反対の傾向が立証された。167 I.U. /mgでアッセイしたヘパリン製剤を参照標準として単位/mgで示したAPTT力価は、136と142で標準にかなり近かった。TT力価は非常に低く、それぞれ13ならびに11 I.U./mg量であった。
【0008】
他の点では、この化合物は、凝固の全メカニズムの阻害に非常に活性であるが、凝固の最終段階に関与する酵素であるトロンビンの阻害にはほとんど作用しない。それは脱高分子方法に関し、ヨーロッパ特許第403,377号は、原料物質として硫黄含有量が高いフカンを用いる、フカンの分子量を低くする方法を開示している。この化合物は、塩化カルシウムの存在下の酸性条件(0.01N-HCl)で海藻の乾燥粉砕粉末を抽出して製造される。次いで、抽出物からの上澄液を中和し、溶質をセチルピリジニウムクロライドの沈殿で回収する。脱高分子化は、化学的方法で、45℃の温度で高分子量の化合物を酸性条件(1N-硫酸)に付すことにより、又はHaliotis tuberculataもしくはAplysia californi-ca由来の粗抽出物に含まれる特異的な酵素により、又は選択的に全体的に11.5メガラド(Mrad)の用量を用いるγ照射により行うことができる。最後に得られる化合物は、13〜23キロダルトンの分子量と7.8〜11%の硫黄含有量を有する画分を単離するために、ゲルろ過工程に付される。その発明の生成物は、原料のフカンより2〜20%の割合で高い硫黄含有量を有しなければならいことが、導き出せる。
【0009】
ヨーロッパ特許に記載の薬理学的試験によれば、APTT力価(又はカオリン−ケファリン時間)は、7 I.U./mg以下であることから非常に低い。記載の表から、ヘパリンとほぼ同一のトロンビン時間を得るためには、参照標準より少なくとも15倍高いフカンの量が必要とされることが考えられる。さらに、この分野で刊行された別の刊行物(S.Colliecら、‘Anticoagulant properties of a fucoidan fraction’Thromb. Res., 64, 143, 1991)のフカンの脱高分子化については、APTTとTT試験(前記ヨーロッパ特許で示唆されるような酸性条件の脱高分子化と連続的な分画工程により得た、平均分子量が20,000のフカンの製品で行った試験)で得た結果が示されている。さらに、試験でヘパリンと同一の活性を得るために、50倍高い重量のフカンが必要とされたことが言及されている。
【0010】
A.Nardellaらの刊行物(‘Anticoagulant low molecular weight fucans pro-duced by radical process and ion exchange chromatography of high molecu-lar weight fucans extracted from the brown seaweed Ascophyllum nodosum’Carbohyd.Res., 289, 1996, 201-208)では、5時間60℃の温度での過酸化水素と銅塩の存在下における、以下の分析データと薬理学的活性を有する2つの高分子量のフカン(F1とF2として示す)のラジカル脱高分子方法が記載されている;製剤F1:硫黄8.1%、フコース31.3%、ウロン酸5.7%、分子量556,000ダルトン、APTT活性9.1 I.U./mg;製剤F2:硫黄5.7%、フコース35.8%、ウロン酸11.6%、分子量516,000ダルトン、APTT活性12.1 I.U./mg。刊行物でDF1として同定された、F1から得られる脱高分子化生成物は、以下のとおり特徴づけられた:硫黄9.2%、フコース36.4%、ウロン酸2.6%、分子量8,300ダルトン、APTT活性8.2 I.U./mg。F2(DF2)から得た脱高分子生成物は、硫黄の含有量が9.3%、フコース32.2%、ウロン酸6.5%、分子量7,800ダルトン、APTT活性7.3 I.U./mgであった。
【0011】
前記先行技術を要約すると、以下の結論を導くことができる。凝固段階の阻害剤として有用であり得る低分子量かつ高APTT活性のフカン製品を得るためには、T.Nishino ら(上記)の教示にしたがうべきであるが、そこで開示される単離方法は多くの分画工程からなるので工業的にほとんど使用できない。他方、より高いトロンビン阻害活性又は抗トロンビン活性(TT)を有する低分子量のフカンの製品が必要であれば、ヨーロッパ特許第403,377号に開示される脱高分子化方法を選択することが好ましい。しかし、立証されているとおり、このようにして得られる物質のAPTT活性はかなり低い。
【0012】
上記結果として、抗凝固剤として用いられ、より良いAPTTと抗トロンビン活性のバランスを示し、かつ同時にヘパリンにより匹敵する低分子量のフカンを利用可能にする問題は、この技術分野において以前未解決のままである。
【0013】
【課題を解決するための手段】
本発明の第一の目的は、次の化学的、物理化学的および薬理学的パラメータ(乾燥重量ベースによる):硫黄12.5〜15%、フコース43〜57%、ウロン酸2〜9%、分子量14,000〜29,000ダルトン、比施光度−130°〜−170°、APTT(活性化部分トロンボプラスチン時間)力価40〜80 I.U./mgおよびTT(トロンビン時間)力価18〜30 I.U./mgで特徴づけられ、APTT活性/凝固の全メカニズムと抗トロンビン活性の両方による有効な抗凝固活性とさらに有効な抗血栓活性を有する、カッソウあるいはフェオフィシー、特にフカス・ベシクロサスより得られる低分子量のフカン硫酸塩を提供することである。
【0014】
【発明の実施の形態】
硫黄含有量が14〜15%、フコース44〜56%、ウロン酸2〜3.5%、比施光度−160°〜−170°、分子量17,000〜25,000ダルトン、APTT力価60〜80 I.U./mgおよびTT力価23〜30 I.U./mgである低分子量のフカン硫酸塩の画分が、好ましい。
【0015】
本発明の化合物は、先行技術の化合物に対して以下の相違点を示すことに留意すべきである:
−トロンビン時間が、 T.Nishinoらの刊行物(Carbohyd.Res., 186, 119, 1989(上記))で開示される低分子量のフカン画分と比較して1.5〜2.5倍高い、
−APTT活性と硫黄含有量が、ヨーロッパ特許第403,377号に開示される物質の相当するそれらよりも高い。
【0016】
さらに、本発明の目的は、該化合物を有効成分として使用する医薬組成物、特に抗凝固剤及び抗血栓剤である。
抗凝固活性は、後述の方法にしたがってAPTTとTT活性で測定した。
また、皮下投与後のヘパリンに対するAPTTの生体利用性を試験し、その生体利用性が、参照標準のヘパリンカルシウムに対して20%(APTT力価186 I.U./mg)であり、本発明(実施例参照)によればそれぞれVO264.AとVO264.Bの製品に対し39%と40%であることが見いだされた。クレームした物質は、ヘパリン(重量ベースで)と比較して、ヘパリンカルシウムの生体利用性の2倍であることが立証された。このために、APTT単位で投与した新規のフカンの生体内の抗凝固活性は、ヘパリンカルシウムの投与後に得られる活性と同じオーダーである。
【0017】
抗血栓活性は、後述の静脈鬱血の血栓の実験モデルで測定した。アッセイで、10mg/Kg用量のVO246.Bの製品には血栓は生じなかった。同じ実験条件で、血栓の形成を妨げたヘパリンカルシウム(参照標準)の最少用量は1mg/Kgで、わずか10倍低かった。
フカンの特徴づけに用いた分析方法は、以下のとおりであった。
【0018】
フコースの測定は、参照標準にL(−)フコースを用いる R.J.WinzlerのBio-chem.Anal., vol.2, 294, 1955の方法にしたがった。
ウロン酸の測定は、参照標準にD(−)グルクロン酸を用いるT.Bitter、H. MuirのAnal.Biochem., 4, 1962, 330 の方法にしたがった。
硫黄は、参照標準として公知の量の硫黄を含む水溶液(バッチ302267E、C.A.22831、Johnson Matthey-ALFA)を用い、内部標準として0.5M-HNO3に1000mg/l濃度で溶解したコバルト硝酸塩水和物CO(NCO3)2・6H2O(メルクカタログ、197850500号)を用いて、ICP−AES(誘導結合血漿−原子放出スペクトメトリー)の技術にしたがってアッセイした。硫黄の参照標準(溶液A)と内部標準(溶液B)の溶液それぞれで満たした2つのビュレットで、さらに溶液Aのアリコート:10ml、8ml、6ml、4ml、2mlを加えて、5つの異なる100ml量のフラスコに硫黄濃度が100、80、60、40ならびに20mg/lの溶液を調製した。次いで、各メスフラスコに0.8mlの溶液Bを加えた。次に、5つの溶液を蒸留水で増量した。
【0019】
未知の硫黄含有量を含むサンプル溶液は、約60mgの100mlメスフラスコに計って調製した。次いで約50mlの蒸留水を加え、透明な溶液が得られるまで混合した。蒸留水で増量する前に、0.8mlの溶液Bをメスフラスコに注いだ。
サンプルの硫黄含有量の測定は、標準溶液で得た検量線(横座標にmg/lの硫黄の濃度、縦座標に波長182.037nmでアッセイした硫黄放出の強度と222.616nmの波長でアッセイした内部標準(コバルト)の強度の比を示す)用いて行い、未知の力価のサンプルを読んだ。
【0020】
分子量は、屈折率検出器を備え、容積が30cm x 7.5mm(容積が7.5cm x 7.5mm のTSK-SW(登録商標) のプロジェルプレカラムを有する)のSupelco Progel TSK-G 4000SW(登録商標) とSupelco Progel TSK-G 3000SW(登録商標) を一列につないだ2つのカラムで行うゲル透過クロマトグラフィー(GPC)で測定した。緩衝液は、0.2Mの硫酸ナトリウム水溶液(1000ml中28.4g)であった。流速は0.5ml/分で、注入容量は50μl であった。アッセイで用いた分子量標準は、以下のとおりである:マルトヘプトース 分子量1153g/モル(シグマ(登録商標)コード番号M−7753)、デキストランT−10(ファーマシアバイオテック(登録商標)コード番号17−0250−01)、分子量10,000(Mw) 、デキストランT−40(ファーマシアバイオテック コード番号17−0270−01)、分子量40,000(Mw) 、デキストランT−70(ファーマシアバイオテック コード番号17−0280−01)、分子量69,100(Mw) 、デキストランT−500(ファーマシアバイオテック コード番号17−0320−01)、分子量460,500(Mw) 。上記各化合物とサンプルの50mgは、5mlのメスフラスコで計り、溶出溶媒に溶解した。次いで、得た溶液を増量して0.22μm 孔のミリポア(登録商標)メンブレンでろ過した。測定は、もっとも高分子量の溶液から開始した。注入を3回繰り返し、平均的な保持時間をとった。サンプルは、最後及び相当する測定の保持時間に注入した。
【0021】
このようにして検量線を作成し、これからサンプルを注入して得られる平均の保持時間を得た。
平均分子量(M)と保持時間(t)は、logM=At3+Bt2+Ct+Dの方程式による。検量線を用いるフカンの硫酸塩サンプルの保持時間から、ソフトウエアプログラムによってサンプルの平均分子量を測定した。
【0022】
比旋光度は、ナトリウムD線で20℃の温度で、パーキンエルマーモデルの241ポラリメーター(polarimeter)で測定した。
I.U./mgで示すAPTT力価は、 Hemodiagnostica Stago Kit(登録商標)の26551号と羊の血漿(DITTA Glo.Ros., Vercelli) を用いる米国薬局方XXIII-1995(ヘパリンナトリウム、737頁参照)にしたがって測定した。参照ヘパリンは、国際標準のIII(NIBSC-ロンドン) であった。後述の試験では、VO264.BとVO264.Aのフカンの硫酸塩製品を用い、参照化合物として本出願人が製造したヘパリンカルシウム(バッチ番号9、APTT力価186 I.U./mg)を用いた。
【0023】
製品のAPTT活性の生体利用性は、皮下投与後にアッセイした抗凝固活性の値を同一化合物の静脈投与後アッセイした値で割って測定した。両方の場合に、活性値は、血液サンプルを動物から採取した時間(横座標)に対する各投与方法のAPTT時間(縦座標)をプロットして得た曲線の領域として算出した。APTT試験は、上記診断キットの折り込みの説明書にしたがって行った。
【0024】
皮下投与による放出は、20mg/0.2ml濃度に本発明のフカンを生理溶液に溶解して行った。ヘパリンカルシウムには4mg/0.2ml濃度を用いた。試験する各化合物には、4匹のウサギ(ニュージーランドシロウサギ−Allevamento del Verbano di Conelli, Arona - イタリア)を用いた。皮下投与方法は、あらかじめ毛を剃った動物の背の一部に上記溶液0.2ml/Kgを注射して行った。基本条件の耳の末梢静脈から血液(2ml)を採取し(0時間)、次いで30分後、さらに1時間の間隔を空けて採取し、実験の開始から全部で8時間になるまで連続して採取した。血漿抗凝固剤として3.8%のクエン酸ナトリウム溶液を用い、クエン酸1部:血液9部の比率で血液と混合した。図1で、試験した各化合物により得た曲線は、以下の記号で示した:VO264.Bの製品:+、VO264.Aの製品:*、ヘパリンカルシウム:■。各曲線の実験ポイントは、4つのデータの平均である。活性は、各曲線と参照(ドット)ラインのあいだの領域から算出した。図から分かるように、参照ラインは横座標に平行で、APTTの基本値に相当するポイントで縦軸に交差している。図1は、本発明の化合物の生体利用性が系統的に推測され、最後の血液のサンプリング時間に相当するポイントの領域は参照の線に近いことを、立証している。
【0025】
静脈投与後の活性のアッセイに5mg/ml濃度の上記フカン溶液を調製し、ヘパリンには1mg/ml濃度の溶液を調製した。次いで、この各容液をウサギ(4匹)の耳の末梢静脈に注入した(1ml容量/Kg)。血液サンプル(2ml容量、上記と同一比で3.8%クエン酸ナトリウム溶液のアリコートを加えた)を、それぞれ2、5、10、15、20、30、60、90、120分で、次いで一様に1時間の間隔をあけて基本条件の他の耳の末梢静脈から採取した。血液のサンプリング時間に対するAPTT値をグラフにプロットして、図2の曲線を得た。領域は、前に詳述したのと同じ方法で算出した。図2の3つの曲線それぞれに特徴的な記号の意味は、図1の記号と同じである。
【0026】
試験化合物の生体利用性は、皮下投与と静脈投与に関するグラフから、以下の式を適用してそれぞれ得た曲線の領域から得た:
I.U./mgで示すトロンビン時間(TT)は、 Hemodiagnostica Stago Kitアート番号126594で測定した。試験は、APTT試験についての米国薬局方の記載と同じ方法にしたがって行った。
【0027】
静脈鬱血からの血栓の実験モデルは、基本的に以下の刊行物にしたがって行った:P.Bacherら、‘The thrombolytic potency of LMW heparin compared to u-rokinase in a rabbit jugular vein lysine model’Thromb.Res., 66, 151-158, 1992 ; I.Reyerら、‘Stasis-induced venous thrombosis’in Standardisat-ion of animal models of thrombosis. 17版、Angiological Symposium Kitz-buhel -Proceedings K.Breddin, R.Zimmermann, F.K.Schattiner編集、Stuttga-rt 1983, 99-104 頁;I.Reyerら、‘Failure at different doses of aspirin to modify experimental thrombosis in rats’Thromb.Res., 18, 669-674, 1980。生理溶液(10ml容量)に、それぞれ次の化合物を溶解した:2mg/ml濃度のヘパリンカルシウム(ロット9、Crinosで製造) 及び10mg/ml濃度のVO264.Bのフカン硫酸塩の製品。動物(ニュージーランドシロウサギ−Allevanmento del Verbano di Conelli, Arona -イタリア)を3群(4匹/群)に分け、麻酔後に挿管法で気管を切開した。右の頸静脈の周辺組織は、すべて3cm遠位に注意深く単離し、結紮糸で血液の流れを減少させた。10分後に、以下の計画にしたがって1ml/kgの静脈注射用の丸薬を耳の末梢静脈に投与した: 対照の群:生理溶液、
ヘパリン処置群:2mg/Kg、
VO264.B処置群:10mg/Kg。
【0028】
2cmの長さの内皮障害を生じるために、結紮糸の上方に注射してから5分後に、静脈を曲がった止血鉗子で挟んだ。直後に遠位に第二の鉗子を用いて、完全に血液の流れを停止させた。曲がった止血鉗子を30分後に取り除いた。60分後に、第二の鉗子を同様にした。代わりに、結紮糸は静脈にそのままにした。血栓は、第二の鉗子を除いてから1時間に相当する、実験の開始から2時間後に回復した。血栓は、24時間80℃でオーブンで乾燥させ、重量をはかった。この血栓の実験モデルは、実際の血栓の病状に生じるのとかなり近い現象を示す。このモデルでは、静脈の狭窄は、生体内で血栓が生じるのと似た管で完全には血液の流れを妨げない。第二の鉗子を除去して1時間では、最初の狭窄は幾らかの血液を流れさせるために、依然として血栓が生長し得ることに留意すべきである。
【0029】
この発明のさらなる目的は、新規な低分子量ポリマーを得る方法で、次の工程からなる:
a)工程
カッソウあるいはフェオフィシーの粉砕粉末を温水または熱水(例えば92〜100℃)で抽出する。この抽出は、撹拌下16時間程度行うのが好ましい。この工程は、W.A.P.Blackらの刊行物(‘Manufacture of algal chemicals IV. Laboratory scale isola-tion of fucoidin from brown marine algae’J.Sci.Food Agric. 3 (1952)122 〜129)で知られている。
【0030】
b)工程
得られる懸濁液をろ過し、ろ液のpHを強酸性(例えば2〜2.5)に調節させる。この時点で、抽出物中に含有されるアルギン酸塩の一部で構成された沈澱物が生成する。この沈澱物はゼリー様の固体で、ろ過によって上澄液から分離される。ろ過のpHは中性に調節する。
【0031】
c)工程
次いで溶液を、100,000ダルトンのカットオフを有するメンブレンを備えた限外ろ過装置を用いて濃縮(例えばもとの容量の約1/4〜1/5)する。次いで、同じ装置で保留液を水(約3倍量)で透析し、必要により最終容量を減少させるため濃縮する。
【0032】
d)工程
上記の工程の最後で得られる保留液を予め加塩(salting)し、次いで水混和性有機溶媒(例えばエタノール、アセトンなど)を添加(約2倍量)して沈澱させることによって粗抽出物を回収する。
【0033】
e)工程
次いで、粗抽出物を水溶液とし、無機銅塩と過酸化水素水溶液(例えば8%程度)の存在下、高められた温度下(約55℃)で、弱酸性もしくは中性のpHで、分解と同時に脱高分子化を行う。予備実験で、分子量14,000〜29,000ダルトンのフカンを得るのに必要な反応時間を定めた。銅イオンと粗抽出物の比(重量%)は1.3%で、過酸化水素8%w/v容量(ml)と粗抽出物の重量(g)の比は5.5〜36であるのが好ましい。工程のあいだのpHは、約6.0〜7.5が好ましい(米国特許第408030号;N.Volpiの刊行物‘Analytical techniques for studying structures of dermatan sulfate as low malecular weight heparin’Il Farmaco, 47 (No.5),841 〜853(1992) 参照)。
【0034】
f)工程
上記反応の工程が終了してから、溶液をろ過し、塩を加え、2倍量の低級アルカノール(例えばエタノール)を添加して溶質を沈澱させる。次いで、溶質を脱水 、乾燥し、この発明による生成物のナトリウム塩と銅(II)の混合塩を回収する。
【0035】
g)工程
次いで、上記化合物を、Na+樹脂でイオン交換処理して対応するナトリウム塩に転換する。これは、化合物を水に溶解(5〜7%の濃度)させるためであり、得られた溶液はイオン交換樹脂含有カラムに充填するか、溶液にイオン交換樹脂を混合して、カチオン交換が起こるのに必要な時間撹拌される。この工程は、銅イオン選択電極でモニターできる。樹脂と溶液の容量比は1/2〜2/3に変化させることができる。
【0036】
h)工程
最後に、溶液をろ過し、ろ液のpHを弱酸性(例えば6.0〜6.5)にし、塩を添加し、低級アルカノール(例えばエタノール)を添加(2倍量)し、この発明の化合物を沈澱させる。この沈澱物を回収することにより、この発明のフカンのナトリウム塩を得ることができる。
【0037】
この発明の他の目的は、カッソウまたはフェオフィシーから上記の工程a〜dで得ることができる次のパラメータ(乾燥重量ベースによる):硫黄6〜8%、フコース31〜36%、ウロン酸23〜27%、分子量450,000〜800,000ダルトン、APTT力価40〜60 I.U./mgを示す粗抽出物を提供することからなる。
【0038】
この発明の方法により、植物材料から抽出し、酸沈澱によるアルギン酸塩の除去後の粗抽出物を脱高分子化させることができる。従ってヨーロッパ特許第403,377号に開示の方法によるごとき、より精製した高分子量のフカンを単離する必要がない。
本出願人の実験によれば、粗抽出物VO246.Bから得た分子量652,000ダルトン(APTT力価67.5 I.U./mg)の精製フカンを、酢酸ナトリウム/過酸化水素で24時間、つまり同じ粗抽出物から製品VO264.AとVO264.B(それぞれ実施例7と9参照)を得たのと同じ条件下で、脱高分子化することによって単離した低分子量(8,800ダルトン)のポリマーは、この発明の製品に比較して、薬理活性が減少(APTT力価22.1 I.U./mg)していることが分かった(実施例6)。これは、純粋に高分子量のフカンからは、本発明の生成物を得ることができないことを意味している。
【0039】
当該分野で利用可能な脱高分子化法が、この発明の方法の工程a〜dにより単離される粗抽出物を原料として使用すると異なる化合物を生じることは、価値のあることである。粗抽出物を酸性条件(pH2.2、60℃、16時間(実施例4参照))で脱高分子化すると、フコースの量より高いウロン酸の量を含有する化合物が得られる。粗抽出物にγ線照射をして脱高分子化(実施例5参照)すると、硫黄含有量が非常に低く、大量の分解物を含有する化合物が単離される。この発明の化合物は、中間物の分子量を無機銅塩と過酸化水素の存在下で低下させる(実施例7参照)ことによってのみ得ることができる。
【0040】
この発明によれば、この発明の低分子量のフカン硫酸塩を活性成分として含有することからなる医薬組成物が提供される。このフカン硫酸塩は医薬的に受容な塩の形で使用できる。医薬組成物は、非経口(例えば皮下)、経口または局所投与用の剤型で使用できる。
局所投与用の製剤(実施例16参照)は、非医薬的な使用であってもよく、そのような目的に適切な組成物を有する。
【0041】
非経口投与用の服用製剤は、密閉したアンプルの発熱物質を含まない殺菌溶液であってもよく、又は殺菌した水性溶媒にすぐに溶解した、密閉したボトルに含まれる凍結乾燥物であってもよい。水性溶媒としては、公知の保存剤と混合した従来の緩衝液(クエン酸、リン酸など)からつくった等張溶液を用いることができる。経口製剤は、錠剤、コーティングした錠剤、ゼラチンカプセル及び顆粒剤の型で利用可能である。
【0042】
服用する剤型は、公知の技術にしたがって製造することができる。例えば、特に経口服用する剤型に関しては、通常の技術、例えば粉末又は顆粒の直接圧縮で製造することができ、結合剤、滑剤及び離解剤を含んでいてもよい。
非経口投与用の服用剤型は、1〜90mg/mlの活性成分を含んでいてもよく(凍結乾燥については、殺菌溶媒中の化合物の最終濃度についてである)、経口投与用の服用剤型は、20〜400mg/服用単位の活性成分を含んでいてもよい。
【0043】
局所投与用の組成物は、活性成分を0.1〜20重量%含むゲル、クリーム、軟膏、溶液の型で用いることができる。
以下の実施例に示す分析データは、乾燥重量に基づいて算出している。
【0044】
【実施例】
本発明のより良い理解のために以下に実施例を示すが、これらが本発明を限定するものと解されるべきではない。
実施例1:粗フカン硫酸塩の製品VO246.Aの抽出
1kgのフカス・ベシクロサス乾燥粉末を冷却装置を備えた15Lの反応容器の中で7Lの蒸留水に攪拌下懸濁した。懸濁された後(約15分)、100℃にて16時間油浴中で加熱を行なった。懸濁液はその後40℃で冷却し、1L遠心分離用大試験管を4個使用して3000r.p.m.にて20分間遠心分離を行なった。大試験管の底に残っていたゼリー様固体を、再び60℃の水に15分間攪拌下懸濁した。遠心分離を再び行い、次いでオパールのような光彩を放っている上澄液に200mgのクレアセル(Clarcel) FLO/MA(登録商標、粉末にした焼きパーライト)を加えた。
【0045】
ろ過を行って6.3Lを回収し、約2.1の値にpHを下げるために50mlの37%塩酸を加えた。遠心分離を再び行い、ゼリー様固体(重量44.4g 製品コード番号0195/95005−D 硫黄0.7%、ウロン酸51%)を廃棄し、上澄液に30%水酸化ナトリウム溶液を加えてpHを中性にした。その後、100,000ダルトン分子量のカット−オフメンブレンを備えた限外ろ過装置アミコン(登録商標)CH2−Aにて1.5Lの一定容量に保ちながら濃縮を行なった。濃縮の後、同じメンブレンで溶液を3倍量の蒸留水に透析した。保留液(1.6L)に無水酢酸ナトリウム112g(7%w/v)を加え,ついで均一の溶液が得られるまで攪拌した。2倍量のエタノールを加えると溶質は沈殿した。一晩のデカンテーションののち、その固体を脱水して乾燥させた。79.68g(収率約8%)の以下の乾燥重量ベースの分析結果を有する化合物(製品VO246.A)が最終的に得られた:硫黄6.5 %、フコース31.7%、ウロン酸23.8%、分子量493,000ダルトン、APTT力価53.4 I.U./mg、TT力価18.2 I.U. /mg。
【0046】
実施例2:粗フカン硫酸塩の製品VO246.Bの抽出
300Lの反応容器に175Lの蒸留水を注入した。25kgのフカス・ベシクロサス乾燥粉末を加え、蒸気ジャケットで、92℃の温度で16時間加熱した。その後温度を30℃に下げ、5kgのクレアセルFLO/MAを加えた。ろ過は、ザイツ(Seitz) K800(登録商標)セルロースフィルターを備えたフィルタープレス装置で行なった。ろ液を集め、固形物は60℃で水(20L)に攪拌しながら分散させ、その後それを1時間維持した。ザイツK800フィルターでろ過を再び行ない、ろ液をその後一つに集めて全体で220L得た。溶液を反応容器に移して5.5kgのクレアセルCBR(登録商標)(粉末にした焼き珪藻土)を加え、その後25〜30℃で冷却し、約1.5Lの37%塩酸を添加してpHを2に下げ、沈殿を行なった。
【0047】
攪拌を再びはじめて15分間継続し、スラリーをザイツK800フィルターでろ過した。次いで、ろ過物の塊を20Lの酸性溶液(pH2)で洗ったところ、あとに集められた液体は全体で220Lであった。溶液は、100,000分子量カット−オフ ミリポアカートリッジを備えた限外ろ過アルファラバル(Alfa Laval)(登録商標)装置へ充填した。まず、溶液を50Lの容量にまで減らすよう濃縮し、次いで3倍量の水に一定の容量で透析を行なった。工程が終わった後、溶液の容量を更に25〜30Lに減らした。溶液を容器から取り出し、塩化ナトリウムで2%w/vの濃度まで加塩し、2倍量のアセトンを加えた。この結果生成した懸濁液をデカンテーションし、沈殿物を回収、脱水し、粉末化して乾燥した。1665gの粗抽出バッチVO246.B(収率6.7%)が得られた。乾燥重量ベースのの分析結果は以下のとおりである:硫黄7.1%、フコース32.0%、ウロン酸25.0%、分子量800,000ダルトン、APTT力価55 I.U./mg。
【0048】
実施例3:粗フカン硫酸塩の製品VO246.Cの抽出
先の実施例の実験方法を25kgの他のバッチのフカス・ベシクロサスを原料として繰り返した。この場合の中間沈殿物のpHは2.5であった。2100g(収率8.4%)の製品VO246.Cが得られ、以下の分析データで特徴づけられた:硫黄7.6%、フコース35.8%、ウロン酸26.1%、分子量470,000ダルトン、APTT力価44 I.U./mg。
【0049】
実施例4:粗フカン硫酸塩の製品VO246.Bの酸性条件下での脱高分子化
5gのVO246.Bを冷却装置に接続した1Lのメスフラスコ中で500mlの蒸留水に溶かした。10mlの1N(規定)塩酸をpHを2.2に下げるため加え、加熱を油浴中で60℃にて16時間行なった。その後溶液を冷却し、水酸化ナトリウム溶液でpHを7に中和した。溶液は、アミコンCH2−A限外ろ過装置で一定の容量で、3連続工程で、各工程につき5倍量の蒸留水に透析を行なった。
【0050】
第一の相(工程A)では、使用した透析メンブレンは3,000ダルトン分子量カット−オフメンブレンであった。第二の相(工程B)では、メンブレンは10,000ダルトン分子量 カット−オフメンブレンで、第三の相(工程C)では、メンブレンは100,000ダルトン分子量カット−オフメンブレンであった。工程A、BおよびCの透過での溶質は、溶液を減圧濃縮した後に沈殿し、塩化ナトリウムで2%w/vの塩濃度まで加塩し、次いで2倍量のアセトンを加えた。このようにして回収した3つの異なる画分の重量を各々測定したところ、57mg(製品0195/95026−A)、6.5mg(製品0195/95026−B、これはその後廃棄)および496mg(製品0195/95026−C)であった。
【0051】
ウロン酸およびフコースの分析は以下のとおりであった:製品0195/95026−A ウロン酸38.0%、フコース8.9%;製品0195/95026−C ウロン酸20.1%、フコース21.2%。
最後の透析工程(工程C)から得られた保留液を塩化ナトリウムで2%w/vの塩濃度まで加塩し、次いで2倍量のアセトンを加え、溶質を沈殿させた。32.5%のウロン酸および16.25%のフコースを含む2.4g(製品0195/95026−D)が得られた。
【0052】
実施例5:粗抽出物VO246.Bのγ線脱高分子化
1.5gの粗抽出物を150mlのメスフラスコ中でpH7の0.1Mのリン酸緩衝液に物質が溶ける容量まで加えて溶かした。その溶液を30mlのバイアル5個に分配し、密封し、γ線処理のためガンマトン(Ganmmaton) 社(Guanzate-Como) へ送った。2個のバイアルは2.5メガラドのγ線照射を行い、他の2個は20メガラドで行なった。2つの処理したサンプルの各々について、1つのバイアルに塩化ナトリウムで2%の塩濃度まで加塩し、次いで2倍量のアセトンを加え溶質を沈殿させた。
【0053】
2.5メガラドで処理した溶液から、51%w/wのリン酸エステル力価の物質を有する460ミリグラムの化合物(製品0195/96041−A)を得た。含有されていた粗抽出物の重量はそれ故225mgで、原料の粗抽出物から計算すると収率75%であった。純粋な化合物に基づく分析データは以下のとおりである:硫黄5.1%、ウロン酸16.1%、フコース19.3%、分子量38,500ダルトン。
【0054】
20メガラドのγ線照射処理を行なった溶液(製品0195/96041−D)から回収した製造物の重量は211mgで、リン酸エステル含有量71%w/wの物質を含んでいた。その結果、含有されていた粗抽出物の真の重量は61.2mg(原料の粗抽出物をもとにすると収率20%)であった。分析結果は以下のとおりである(純粋な化合物を参照):硫黄5.55%、ウロン酸3.38 %、フコース5.79%、分子量5,600ダルトン。
【0055】
実施例6:精製した高分子量のフカン硫酸塩(製品VO248.A)の製造およびその後の過酸化水素存在下における酢酸銅中での24時間の脱高分子化(製品VO269.A)
200gの粗抽出製品VO246.Bを10Lの水に溶かした。200gの塩化ナトリウムを次いで加え、均一な溶液が得られるまで攪拌を行なった。7.5L(0.75容量)のアセトンを加え、一晩放置した。沈殿物を集め、脱水および乾燥後に126.5gを得た。ついで上澄液に12.5Lのアセトン(全体の溶媒の2倍量)を加え、以下の分析値を有する68.3gの精製フカン硫酸塩(製品VO248.A)を回収した:硫黄8.9%、フコース48.5%、ウロン酸9.7%、分子量652,000ダルトン、比施光度−112.8°、APTT力価67.5 I.U./mg。
【0056】
得られた化合物の10gを200mlの蒸留水に溶解した。溶液は、容器に移し、ついで油浴により55℃での加熱を攪拌しながら行なった。酢酸銅一水和物400mgを加え、その後1N水酸化ナトリウムを2、3滴を加えて溶液のpHを7.5に中和した。
ペリスタポンプにより8%w/v過酸化水素溶液を2.3ml/時間の流速で加えた。反応時間は24時間で、pHは6.0〜6.5である(添加した過酸化水素の全体の容量:55ml)。次いで、ザイツK800フィルターでろ過を行い、400mlの透明な溶液を得、28gの無水酢酸ナトリウムを加えてその後、2倍量のエタノールを加えた。ゴム状の沈殿物を70mlの蒸留水に溶解し、それに30mlのアンバーライト(Amberlite)(登録商標)IRC718樹脂(Na+型)を加え、6時間攪拌しながら放置した。最終的に溶液は、無色−わずかにオパールのような光彩を放ってみえ、その溶液に10gのクレアセルCBRを加えたのち、溶液を半融ガラスろ過器でろ過した。氷酢酸を幾滴か加えることにより、pHを6.5にし、溶液を無水酢酸ナトリウムで7%w/vの塩濃度まで加塩し、次いで2倍量のエタノールを加え溶質を沈殿させた。脱水および乾燥後に、12.9%の硫黄、53.2%のフコース、2.5%のウロン酸を含み、分子量8,800ダルトン、比施光度−14.8°、APTT力価22.1 I.U./mgの2.90gの脱高分子化された製造物(製品VO269.A−収率29%)を得た。
【0057】
実施例7:異なる時に製品VO260.A、VO264.Aおよび0195/96044−Cを生じる、粗抽出物VO246.Bの銅塩による脱高分子化
50gのVO246.Bを1Lの水に溶解した。溶液は55℃で加熱し、2gの酢酸銅一水和物を加え、1N水酸化ナトリウムでpHを7.5に合わせた。この段階で、46ml/時間の流速に設定したペリスタポンプを使用して8%w/v過酸化水素溶液を加え、30%水酸化ナトリウム溶液を加えることによりpHを6〜6.5に保った。6時間後、1/3容量(425ml)の溶液を取り出し、無水酢酸ナトリウムで5%w/vの塩濃度まで加塩し、次いで2倍量のエタノールを加えた。そのようにして得られた沈殿物(9g)を水に溶解し濃度を5%w/v(180ml)とし、残渣を溶解するために使用した水の容量の約半分のベッドを有するアンバーライトIRC718(Na+型)樹脂で充填したカラムで精製した。流速は40ml/時間とした。カラム溶出液は、無水酢酸ナトリウムにて加塩し、その後既に先に述べた工程に従い、エタノールにて沈殿させた。以下の分析結果を有する製品バッチVO260.A7.0g(収率42%)を得た:硫黄9.9%、フコース38.3%、ウロン酸15.1%、分子量88,500ダルトン、比施光度−119.6°、APTT力価58.1 I.U./mg、TT力価14.8 I.U./mg。
【0058】
24時間後、溶液の容量は2Lであった。1Lに、さきに述べた製品VO260.Aを得のと同じ工程を行ない、14.5%の硫黄、56.2%のフコース、2.3%のウロン酸、分子量22,500ダルトン、比施光度−165.0°、APTT力価74.9 I.U./mg、TT力価23 I.U./mgの2.6g(収率15.6%)の製品バッチVO264.Aを得た。
【0059】
残った脱高分子化溶液のさらなるアリコートに、さらに24時間かけて過酸化水素を加えた(全体としての脱高分子化時間は48時間)。最終的に、溶液は上述のように2つのアリコートとして処理し、この場合、濃酢酸を添加して溶液のpHを6.7にあわせ、直ちにエタノールにて沈殿させた。1g(収率6.2%)の沈殿物のバッチ0195/96044−Cが得られた。化合物は、以下の分析パラメーターにより特徴づけた:硫黄15%、分子量9,700ダルトン、APTT力価23.6 I.U./mg、TT力価6.7 I.U./mg。
【0060】
実施例8:粗フカン製品VO246.Cの6時間での脱高分子化および製品VO260.Cの単離
200gのその化合物を4Lの蒸留水に溶解した。先の実施例6に開示の方法と同様に行なわれた予備試験により、反応時間は6時間とした。溶液は55℃で攪拌しながら加熱し、8gの酢酸銅一水和物を加えた。約8mlの30%水酸化ナトリウムを加えることにより、pHは7.5に合わせた。この時、8%w/v過酸化水素溶液を流速約183.3ml/時間(全体で約1.1L)で加えた。反応の間、少量の30%水酸化ナトリウム溶液を適当に加えることにより、pHは6.5〜7.0の値に保った。最終的に溶液を酢酸ナトリウム三水和物で11%w/vの塩濃度まで加塩し、その後2倍量のエタノールを加えた。沈殿物を集め、脱水して乾燥させた。
【0061】
79gの固体をこのようにして回収し、1.2Lの蒸留水に溶解した。溶液の濁りを少なくとも幾分取り除くために、3,000r.p.m.にて遠心分離を行なった。800mlのアンバーライトIRC718(Na+型)を加え、スラリーを攪拌しながら一晩放置した。溶液を回収し、樹脂を2倍量の蒸留水で洗った。あらかじめ15gのクレアセルCBRを積層したブフナーろうとでろ過を行い、容量が約2.8LでpHが8.9の透明な溶液を得た。その後氷酢酸を2、3滴加えることによりpHを6.5に合わせた。その後溶液を無水酢酸ナトリウムで7%w/vの塩濃度まで加塩し、その後2倍量のエタノールを加えることにより沈殿させた。脱水および乾燥後、以下の分析結果を有する60.1g(収率30.1%)の製品VO260.Cを得た:硫黄12.6%、フコース47%、ウロン酸8.1%、分子量29,000ダルトン、比施光度−138.2°、APTT力価49.6 I.U./mg、TT力価21 I.U./mg。
【0062】
実施例9:粗フカン硫酸塩製品VO246.Bの銅塩による24時間での脱高分子化および製品VO264.Bの単離
100gのVO246.Bを2Lの水に溶解させた。先の実施例6に開示の方法と同様に行った予備試験により、反応時間は24時間とした。4gの酢酸銅一水和物を加えた。pHを30%水酸化ナトリウム溶液にて7.5に中和し、次いで55℃で加熱した。ペリスタポンプを使用して、pHを6〜6.5の間に保ちながら8%w/v過酸化水素溶液を加えた(流速45.8ml/時間)。24時間後、過酸化水素の添加容量は1100mlであった。最終的な溶液はオパールのような光彩を放ってみえ、それを遠心分離した。上澄液に無水酢酸ナトリウムを塩濃度が7%w/vになるまで加えた。
【0063】
溶質を2倍量のエタノールで沈殿させ、脱水して乾燥した。23.25gを回収し、それを400mlの水に溶解した。260mlのアンバーライトIRC718(Na+型)樹脂を加えて攪拌を開始し、一晩続けた。ろ過を半融ろうとにて行い、その後フィルターを100mlの蒸留水で洗った。酢酸を加えることにより、ろ液のpHを7に合わせ、無水酢酸ナトリウムを塩濃度が7%w/vになるまで加え、2倍量のエタノールを次いで加えた。脱水および乾燥後、16.4gの固形物(製品VO264.B 収率16.4%)を得た。以下の分析結果がみられた:硫黄14.3%、フコース44.2%、ウロン酸3.4%、分子量17,500ダルトン、比施光度−168.6°、APTT力価69.5 I.U./mg、TT力価28 I.U./mg。
【0064】
実施例10:粗硫酸塩VO246.Cの銅塩による48時間での脱高分子化および製品VO267.Aの単離
200gの粗抽出物を4Lの水に溶解させた。先の実施例6に開示の方法と同様に行なわれた予備試験により、反応時間は48時間とした。55℃で加熱を行い、その後攪拌しながら8gの酢酸銅一水和物を加えた。pHを30%水酸化ナトリウム溶液8mlにて7.5に中和した。この時、8%w/v過酸化水素溶液を、流速23ml/時間で加えた(全体の量は1.1L)。少量の30%水酸化ナトリウム溶液を加えることにより、反応中のpHを6.0〜6.5の間に保った。48時間後、ザイツK800フィルターを使用してろ過した。酢酸ナトリウム三水和物を塩濃度が11%w/vになるまで加え、溶質を2倍量のエタノールで沈殿させた。ガム状の残渣を脱水および乾燥して57.5gを得た。それを再び900mlの蒸留水に溶解し、600mlのアンバーライトIRC718(Na+型)樹脂を加えた。
【0065】
スラリーを攪拌しながら一晩放置した。あらかじめクレアセルCBRを積層した半融ろうとにてろ過を行い、得られた溶液を再び同じろ過器に通してろ過した。濃酢酸を2、3滴加えることにより、ろ液のpHを6.5に合わせ、無水酢酸ナトリウムを塩濃度が7%w/vになるまで加え、溶質を2倍量のエタノールを加えて沈殿させた。固形物(製品VO267.A)を集め、脱水および乾燥して42.8g(粗抽出物をもとにした収率21.4%)を得た。化合物の分析結果は以下のとおりである:硫黄14.2%、フコース49.8%、ウロン酸5.3%、分子量14,700ダルトン、比施光度−139.6°、APTT力価45 I.U./mg、TT力価19 I.U./mg。
【0066】
実施例11:粗フカン硫酸塩VO246.Aの銅塩による18時間での脱高分子化および化合物VO246.A/1の単離
50gのVO246.A化合物を水に溶解した。先の実施例6に開示の方法と同様に行なわれた予備試験により、反応時間は18時間とした。反応中のpHを少量の30%水酸化ナトリウム溶液を加えて7.0〜7.5に保った。その後、同量の酢酸銅および8%w/vの過酸化水素溶液を加えて(全体の添加量は2775ml)、実施例6の工程を行なった。以下の分析結果を有する11.5gの化合物(VO246.A/1)を得た:硫黄14.8%、フコース49.3%、ウロン酸2.1%、分子量25,000ダルトン、比施光度−162°、APTT力価27 I.U./mg。
【0067】
薬理学的使用又はそうでないもの両方の製剤を開示する以下の実施例12〜15では、「低分子量フカン硫酸塩」の表現は、まさに本発明の限定範囲内のフカン硫酸塩の製品を意味する。
【0068】
実施例12:皮下投与用製剤
低分子量フカン硫酸塩 20mg
蒸留(bidistilled) 水 0.2ml
【0069】
実施例13:静脈投与用製剤
低分子量フカン硫酸塩 80mg
蒸留水 4ml
【0070】
実施例14:経口投与(錠剤)用の製造
低分子量フカン硫酸塩 180mg
マンニトール 300mg
サッカロース 240mg
ポリビニルピロリドン 14mg
ステアリン酸マグネシウム 9mg
【0071】
上記に香料と保存剤および蒸留水を加えて100gとした。
【0072】
実施例16:局所投与用の他の製剤
化粧用の水性ローション:
低分子量フカン硫酸塩 0.5〜5g
プロピレングリコール 1.5g
エチルアルコール 15ml
上記に香料と保存剤および蒸留水を加えて100gとした。
洗浄活性がある乳濁液:
低分子量フカン硫酸塩 4g
PEG 15グリセリル リシノール酸エステル 14g
ポリソルベート21 7g
アーモンド油 3g
上記に香料と保存剤および蒸留水を加えて100gとした。
【0073】
【発明の効果】
本発明によれば、トロンビン時間が、従来の低分子量のフカン画分と比較して1.5〜2.5倍高く、APTT活性と硫黄含有量も従来より高い、APTT活性/凝固の全メカニズムと抗トロンビン活性の両方による有効な抗凝固活性、ならびにさらに有効な抗血栓活性を有する低分子量のフカン硫酸塩を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】血液サンプルをウサギの末梢静脈から採取した時間(横座標)に対する製品の皮下投与のAPTT時間(縦座標)をプロットした図である。
【図2】血液サンプルをウサギの末梢静脈から採取した時間(横座標)に対する製品の静脈投与のAPTT時間(縦座標)をプロットした図である。
Claims (10)
- 次の化学的、物理化学的および薬理学的パラメータ(乾燥重量ベースによる):硫黄12.5〜15%、フコース43〜57%、ウロン酸2〜9%、分子量14000〜29000ダルトン、比施光度−130°〜−170°、APTT(活性化部分トロンボプラスチン時間)力価40〜80 I.U./mgおよびTT(トロンビン時間)力価18〜30 I.U./mgで特徴づけられる低分子量を有するフカン硫酸塩。
- 次の化学的、物理化学的および薬理学的パラメータ(乾燥重量ベースによる):硫黄14〜15%、フコース44〜56%、ウロン酸2〜3.5%、比施光度−160°〜−170°、分子量17000〜25000ダルトン、APTT力価60〜80 I.U./mgおよびトロンビン時間力価23〜30 I.U./mgである請求項1によるフカン硫酸塩。
- 原料がカッソウあるいはフェオフィシー(Pheophycee)、特にフカス・ベシクロサス(Fucus vesiculosus)である請求項1〜2の何れか1つによるフカン硫酸塩。
- APTT活性/凝固の全メカニズムと抗トロンビン活性の両方による有効な抗凝固活性とさらに有効な抗血栓活性を有する請求項1〜3の何れか1つによるフカン硫酸塩。
- 請求項1〜4の何れか1つによるフカン硫酸塩を有効成分として含有することからなる医薬組成物。
- 抗凝固剤または抗血栓剤として使用される請求項5による医薬組成物。
- 非経口(特に皮下)、経口または局所投与用の製剤の型である請求項5または6による医薬組成物。
- 次の工程
a)カッソウあるいはフェオフィシーの粉砕粉末を温または熱水で抽出し、
b)ろ過し、そのろ液を強酸性にpH調節し、沈殿物をろ別し、その上澄液を中性に調節し、
c)上澄液を、100,000ダルトンのカットオフを有するメンブレンを備えた限外ろ過装置で濃縮し、次で水で透析しかつ任意に最終液を濃縮し、
d)前工程の終わりに得られる溶液を加塩しかつ水混和性有機溶媒を添加して沈殿した粗抽出物を回収し、
e)粗抽出物を水溶液中、無機の銅塩と過酸化水素水溶液の存在下、高められた温度下でかつ弱酸性もしくは中性のpHで、14,000〜29,000ダルトンの分子量を有する化合物を得るのに必要な時間分解もしくは脱高分子化し、
f)得られる溶液をろ過後に加塩し、低級アルカノールを添加して溶質を沈殿させ、
g)得られる化合物を水に溶解し、イオン交換Na+樹脂で処理し、
h)溶出液をろ過、弱酸性にpHを調節、加塩し、低級アルカノールを添加して化合物を沈殿させることからなる請求項1〜4の何れか1つに記載のフカン硫酸塩を得る方法。 - a)工程の抽出が撹拌下約16時間行われ、
b)工程の強酸性のpH調節が、2〜2.5であり、
c)工程の第1の濃縮が上澄液の約1/4〜1/5にされ、水での透析が約3倍の水で行われ、
d)工程の水混和有機溶媒の添加が約2倍のエタノールまたはアセトンで行われ、
e)工程で、使用される過酸化水素水溶液が8%水溶液で、高められた温度が約55℃で、弱酸性もしくは中性のpHが約6.0〜7.5で、無機銅塩の銅イオンと粗抽出物の重量比が1.3%で、8%過酸化水素水溶液のmlと粗抽出物のgの比が5.5〜36であり、
f)工程で、低級アルカノールが、エタノール、かつ溶質の2倍量用いられ、
h)工程で、弱酸性のpHが6.0〜6.5であり、低級アルカノールがエタノールでかつ溶質の2倍量用いられる請求項8による方法。 - 請求項8または9の工程a)〜d)によって得ることができ、次の化学的、物理化学的および薬理学的パラメータ(乾燥重量による):硫黄6〜8%、フコース31〜36%、ウロン酸23〜27%、分子量450,000〜800,000ダルトン、APTT力価40〜60 I.U./mgを有する粗抽出物。
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