ITCO960031A1 - Fucani a basso peso molecolare aventi attivita' anticoagulante antitrombinica e antitrombotica - Google Patents
Fucani a basso peso molecolare aventi attivita' anticoagulante antitrombinica e antitrombotica Download PDFInfo
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Description
DESCRIZIONE dell'invenzione
La presente invenzione ha per oggetto dei nuovi tucani ad attività anticoagulante, antitrombinica e antitrombotica, ed il loro metodo di ottenimento dalle alghe brune o Phaeophycee e le relative formulazioni per uso parenterale, orale e topico.
E' noto ormai da diversi anni che i tucani estratti dalle alghe brune possiedono attività anticoagulante ( Springer G.F. et Alii " Isolation of anticoagulant fractions tram crude fucoidin " Proc. Soc. Exp. Biol. Med.
1957 94 404-9 ). Le conoscenze attuali hanno inoltre chiarito alcuni aspetti della correlazione struttura-attività farmacologica di queste sostanze. E' stato accertato che l'attività anticoagulante dipende direttamente dal contenuto di solfati e inversamente da quello degli acidi uranici ( T. Nishino et Alii " Isolation, purifìcation and characterization of fucosecontaining sulfated polysaccharides from thè brown seaweed Ecklonia kurome and their blood-anticoagulant activities, Carbohyd. Res. 186, 119 1989 H. Mori et Alii " Sugar constituents of some sulfated polysaccharides from thè sporaphyfls of wakame ( Undaria pinnatifida ) and their biological activities " Mar. Algae Pharm. Sci. 2. 109 1982 ).
In aggiunta si é trovato che sia il tempo di coagulazione APTT che quello di trombina ( TT ) aumentano nelle frazioni di tucano aventi peso molecolare nel campo da 10000 a 50000 Da ( Nishino et Alii " The relationship between thè molecular weight and thè anticoagulant activity of two types of fucan sulfates from thè brown seaweeds Ecklonia kurome " Agr. Biol. Chem. 55 791 1991 ). Altri autori ( V. Grauffel et Alii " New naturai polysaccharides with potent antithrombotic activity: fucans from brown algae " Biomaterials 10 363 1989 ) hanno osservato che net caso di frazioni dei tucani ottenute da A. nodosum, P. canalicuiata e F. vesiculosus il suddetto intervallo é più ampio e si estende da 18000 a 80000 Da. Queste ultime sostanze evidenziavano anche una attività antitrombinica ( misurata in unità internazionali di trombina/mg della sostanza ) che dipendeva dal peso molecolare allo stesso modo dell'attività anticoagulante.
In definitiva, quindi, gli insegnamenti della tecnica del ramo riguardo le proprietà farmacologiche dei fucani e la correlazione tra la struttura e l'attività indicano che le frazioni più attive si trovano neH’ambito dei pesi molecolari inferiori a 80.000 Da, ove é possibile isolare frazioni con alto titolo di zolfo.
Da quanto sopra risulta evidente il potenziale interesse terapeutico di questi particolari fucani.
Per quanto concerne specificatamente il loro metodo di ottenimento occorre rilevare che in letteratura sono stati descritti diversi procedimenti, sostanzialmente riconducibili a due differenti approcci. Quello che sembra aver avuto finora maggior seguito riguarda procedimenti nei quali sull'estratto grezzo vengono realizzati, in successione, frazionamenti che sfruttano differenti proprietà fisiche di questi polimeri. Le tecniche che vengono solitamente impiegate sono gel filtrazioni, cromatografie a scambio ionico, precipitazioni frazionate mediante quaternari o aggiunta di solventi organici miscibili con acqua come etanolo o acetone. L'altro approccio si fonda invece su procedimenti per ridurre il peso molecolare, nei quali come materiale di partenza sono stati finora utilizzati tucani ad elevato peso molecolare, vale a dire composti con maggior grado di omogeneità rispetto all'estratto grezzo dei precedenti procedimenti di frazionamento.
Per quanto riguarda il primo approccio occorre aggiungere che di sovente la tecnica del ramo mette in evidenza che il numero dei passaggi richiesti per ottenere un tucano a basso peso molecolare aumenta in maniera proporzionale al livello di attività farmacologica richiesto. I due articoli che sono qui sotto riassunti provvedono esempi significativi in merito.
Nel lavoro di S. Mauray et Alii " Venous antithrombotic and anticoagulant activities of a fucoidan fraction" Thromb. and Haemost. 74(5) 1280 1995, si descrìve un tucano isolato da Ascophyllum nodosum caratterizzato come segue : peso molecolare medio 20.000 Da, fucosio 48,6%, acidi uranici 5,8%, zolfo 9%. Il relativo procedimento, in base alle referenze bibliografiche che sono contestualmente menzionate, risulta consistere dei seguenti passaggi : (a) estrazione in mezzo acquoso del materiale vegetale (b) primo frazionamento effettuato con sali di ammonio quaternario e (c) frazionamento su colonna per cromatografia di esclusione.
La sostanza dava luogo a prolungamenti significativi del titolo APTT e TT già a partire dalla dose di 20 mcg/ml. Per ottenere gli stessi tempi APTT e TT deH'eparìna, come viene contestualmente osservato dagli autori, erano comunque richieste quantità del composto pari a 30-40 volte quella del glicosaminoglicano. In aggiunta, dal confronto delle attività ED50 del test antitrombotico in vivo descritto nel medesimo articolo, si evince che l'attività del tucano é uguale a quella evidenziata da una quantità di eparina 17 volte inferiore.
Nel lavoro di T. Nishino et Alii Carbohyd. Res. 186 (1989) 119 ( vedi sopra ) viene descritto un procedimento costituito dalle tasi seguenti: (a) estrazione in acqua bollente della polvere secca e macinata di Ecklonia kurome, (b) precipitazione con cetilpiridinio e ridissoluzione in 4 M NaCI, (c) riprecipitazione con etanolo e ridissoluzione del precipitato in acqua, (d) precipitazione con cloruro di calcio, recupero del sovranatante e liofilizzazione (e) frazionamento su colonna a scambio ionico raccogliendo le frazioni eluite con le soluzioni 0,95 M NaCI e 2 M NaCI, (f) precipitazione frazionata da queste due soluzioni con etanolo contenente acetato di calcio, (g) cromatografia su colonna di gel filtrazione. In tal modo vengono ottenute due frazioni aventi, rispettivamente, peso molecolare 32000 e 21000 Da, zolfo 14,6 e 13,3 % , fucosio 50,1 e 49,5 %, acidi uranici 1 ,5 e 3,9 %, rotazione specifica - 142 e - 129. Le attività farmacologiche APTT e TT di queste sostanze hanno invece evidenziato un andamento di segno opposto. Il titolo APTT espresso in unità/mg prendendo come riferimento un'eparina dosata a 167 I.U./mg é risultato per ognuna delle due frazioni di cui sopra pari a 136 e 142 rispettivamente, e quindi molto vicino a quello della sostanza presa come riferimento. Il titolo di trombina é risultato molto basso, più precisamente di 13 e 11 I.U./mg. In altri termini questi composti sono molto attivi per quanto riguarda l'inibizione del meccanismo globale della coagulazione e poco efficaci neH'inibire la trombina, che é l'enzima coinvolto nell'ultima fase della coagulazione.
Per quanto riguarda invece i metodi di depolimerizzazione nel brevetto europeo n. 403377 si descrivono dei procedimenti per ridurre il peso molecolare nei quali come materiale di partenza devono essere utilizzati tucani ad alto titolo di zolfo. Questi composti vengono preparati estraendo la polvere secca di alghe in ambiente acido ( HCI 0,01 N ) in presenza di cloruro di calcio. Il sovranatante viene poi neutralizzato ed il soluto recuperato precipitando con cetilpiridino cloruro.
I procedimenti di depolimerizzazione in questione vengono realizzati per via chimica, trattando la sostanza ad alto peso molecolare in ambiente acido ( acido solforico 1 N ) alla temperatura di 45°C, oppure mediante enzimi specifici, contenuti nell’estratto grezzo di Haliotis tuberculata o Aplysia californica, a ancora per irraggiamento con una dose complessiva di 11 ,5 Mrads.
Dopo questi trattamenti il materiale ottenuto viene sottoposto a gel filtrazione per isolare la frazione compresa tra 10 e 20 Kda circa, ottenendo alla fine composti con un peso molecolare compreso tra 13 e 23 Kda e un contenuto di zolfo tra il 7,8 e 11 %. Dalle rivendicazioni si evince inoltre che i prodotti dell’invenzione devono avere un titolo di zolfo maggiore di una percentuale compresa tra il 2 ed il 20% rispetto al tucano di partenza.
Dai tests farmacologici che sono illustrati nel suindicato attestato europeo si desume che il titolo APTT ( tempo di cefalina - caolino ) rimane al di sotto di 7 U.l./mg ed é quindi molto basso. In aggiunta dal medesimo articolo si evince che per ottenere un tempo di trombina del medesimo ordine di grandezza di quello dell'eparina occorre una dose di tucano almeno 15 volte maggiore rispetto a quella della sostanza presa a confronto.
Ancora sui tema della depolimerizzazione dei tucani occorre osservare che in un'altro lavoro apparso nella letteratura del ramo ( S. Colliec et alii " Anticoagulant properties of a fucoidan fraction " Thromb. Res. 64 143 1991 ) vengono illustrati i risultati dei tests APTT e TT eseguiti su un tucano avente peso molecolare medio di 20000, ottenuto per depolimerizzazione acida e successivo frazionamento come descritto nel brevetto europeo qui sopra menzionato. Gli autori dell'articolo rilevano che per ottenere nei due test i medesimi risultati dell'eparina occorre una quantità di tucano 50 volte maggiore.
Nel lavoro di A. Nardella et Alii " Anticoagulant low molecuiar weight fucans produced by radicai process and ion exchange chromatography of high molecuiar weight fucans extracted from thè brown seaweed Ai^bphyllum nodosum " Carbohyd. Res. 289 ( 1996 ) 201-208, viene descritta la depolimerizzazione radicalica, condotta con sali di rame in presenza di perossido di idrogeno, alla temperatura di 60°C per 5 ore, di due tucani ad elevato peso molecolare indicati come F1 e F2 ed aventi, rispettivamente, i seguenti dati analitici ed attività farmacologica: preparazione F1 : zolfo 8,1%, fucosio 31 ,3%, acidi uronici 5,7%, peso molecolare 556000, attività APTT 9,1 ; preparazione F2 : zolfo 5,7 %, fucosio 35,8%, acidi uronici 11 ,6%, peso molecolare 516000, attività APTT 12,1.11 prodotto che si ottiene dalla preparazione F1 viene indicato nell'articolo con la sigla DF1 e presenta il seguente quadro analitico : zolfo 9,2%, fucosio 36,4%, acidi uronicj 2,6% peso molecolare 8300, attività APTT 8,2. Quello ottenuto da F2 ( DF2 ) ha un titolo di zolfo del 9,3 %, fucosio 32,2%, acidi uranici 6,5%, peso molecolare 7800, titolo APTT 7,3. Dal quadro della tecnica che qui sopra si é cercato di riassumere pare evidente trarre le seguenti conclusioni.
Per ottenere frazioni di fucani a basso peso molecolare con elevata attività nel test APTT, e quindi in grado di inibire globalmente il meccanismo della coagulazione, si devono utilizzare gli insegnamenti di T. Nishino et Aliì ( vedi sopra ) e più in generale ricorrere a procedimenti che consistano in combinazioni di diversi metodi di frazionamento. Tuttavia si tratta di procedimenti che per il numero di passaggi di cui sono costituiti possono rivelarsi poco pratici nella previsione di un loro impiego su scala industriale Se invece si intende ottenere frazioni a basso peso molecolare che possiedano in maggior misura attività inibente la trombina o antitrombinica ( test TT ) allora sembra preferibile optare per i metodi di depolimerizzazione del brevetto europeo n. 403377. Tuttavia, come si é visto, l'attività APTT di queste sostanze é assai ridotta.
Di conseguenza si può concludere che in questo ramo della tecnica rimanga ancora irrisolto il problema di ottenere fucani a basso peso molecolare che nell’ambito della propria attività anticoagulante evidenzino un'attività APTT e antitrombinica più bilanciate tra di loro e al medesimo tempo confrontabili con quelle dell’eparina.
Prima di discutere nel dettaglio l'oggetto delia presente invenzione, si riportano qui di seguito i metodi analitici che sono stati usati per caratterizzare i fucani che verranno più avanti descritti.
La determinazione del fucosio é stata effettuata secondo la metodica descritta da R.J. Winzler, Methods of Biochem. Anal. voi. 2 294 1955, utilizzando come standard L (-) fucosio.
La determinazione degli acidi uranici é stata effettuata secondo il metodo di T. Bitter, H. Muir Anal. Biochem. 4 (1962) 330, utilizzando come standard l'acido D (-) glucuronico.
Il titolo di zolfo viene determinato mediante la tecnica ICP-AES ( (nductively Coupled Plasma-Atomic Emission Spectrometry ) utilizzando come standard interno il nitrato dì cobalto esaidrato Co(N03)2- 6H2O, disciolto nella quantità di 1000 mg/l in 0,5 M HNO3 ( Merck n. catalogo 19785.0500 ), e come standard di riferimento una soluzione acquosa di zolfo ( batch 302267E, C.A. 22831 , Johnson Matthey - ALFA ). La procedura del saggio in sintesi é la seguente. Utilizzando due burette, riempite rispettivamente con la soluzione dello standard di riferimento di zolfo ( soluzione A ) e dello standard interno ( soluzione B ) si preparano in 5 diversi matracci tarati da 100 mi 5 soluzioni a concentrazioni di zolfo di 100, 80, 60, 40 e 20 mg/l, rispettivamente, trasferendo poi nei medesimi 0,8 mi della soluzione B e, rispettivamente, le seguenti aliquote della soluzione A : 10 mi; 8 mi; 6 mi; 4 mi, 2 mi . Si porta poi a volume con acqua distillata.
La soluzione che contiene il campione a titolo incognito di zolfo viene preparata pesando in matraccio da 100 mi circa 60 mg del campione esattamente pesati, che vengono sciolti in 50 mi circa di acqua distillata. Si aggiungono 0,8 mi di soluzione B e si porta poi a volume. _
Il titolo di zolfo nel campione incognito viene determinato riportando sulla retta di taratura ottenuta con le soluzioni standard, che riporta in ascisse la concentrazione di zolfo in mg/l ed in ordinate il rapporto tra l'intensità di emissione dello zolfo misurata a 182,037 nm e l'intensità dell'emissione dello standard interno { Cobalto ) misurata a 222,616 nm, la lettura ottenuta con il campione a titolo incognito.
Il peso molecolare viene determinato mediante cromatografia per gel permeazione ( GPC ) su due colonne accoppiate Supelco Progel TSK-G 4000 SW® e Supelco Progel TSK-G 3000 SW® aventi dimensioni 30 cm X 7,5 mm ( con precolonna Progel TSK-SW® dimensioni 7,5 cm X 7,5 mm ) con rivelatore ad indice di rifrazione. Il tampone è 0,2 M sodio solfato in acqua ( 28,4 g in 1000 mi ). Il flusso é di 0,5 ml/min e il volume iniettato di 50 microlitri. Gli standard di peso molecolare usati in questa determinazione sono stati i seguenti : maltoeptaosio p.m. 1153 g/mole ( Sigma® cod. n. M-7753 ), Destrano T-10 ( Pharmacia Biotech® cod. n.
17-0250-01 ) p.m. 10.000 ( Mw ), Destrano T-40 { Pharmacia Biotech® cod. n. 17-0270-01 ) p.m. 40.000 ( Mw ), Destrano T-70 ( Pharmacia Biotech® cod. n. 17-0280-01 ) p.m. 69100 ( Mw ), Destrano T-500 ( Pharmacia Biotech® cod. n. 17-0320-01 ) p.m. 460.500 ( Mw ).
50 mg di ciascun standard e del campione in esame vengono disciolti, in matraccio da 5 mi, nel tampone di eluizione. La soluzione viene portata a volume e filtrata su membrana Millipore® con porosità di 0,22 pm . La calibrazione viene effettuata partendo dalla soluzione contenente lo standard avente peso molecolare maggiore. L'iniezione viene ripetuta per tre volte rilevando il tempo di ritenzione. Si costruisce in questo modo una curva di calibrazione sulla quale viene poi riportato il tempo di ritenzione medio ottenuto iniettando il campione incognito.
Il peso molecolare medio ( M ) ed il tempo di ritenzione ( t ) sono legati dalla relazione log M = At<3 >+ Bt<2 >+ Ct D. Dal confronto fra il cromatogramma del campione di fucansolfato e la curva di calibrazione é possibile determinare, tramite apposito programma di software, il peso molecolare medio Mw del campione in esame.
La misura del potere rotatorio specifico viene effettuata mediante polarimetro Perkin Elmer mod. 241 alla temperatura di 20°C alla linea D del sodio.
Il titolo APTT, espresso in U.l./mg, é stato determinato come descritto in Farmacopea ( rif. heparin sodium, pag. 737 U.S. Pharmacopeia XXIII -1995 ) utilizzando il Kit Hemodiagnostica Stago® art. n. 126551 e plasma di montone ( ditta Glo. Ros, Vercelli ). L'eparina di riferimento é lo standard internazionale ΙΙΓ ( NIBSC - Londra ). Nei due tests qui di seguito descritti sono state utilizzate le preparazioni di fucan solfato V0264.B e V0264.A. Come confronto un lotto di eparina calcica di produzione Crinos ( lotto 9 titolo APTT 186 U.l./mg ).
La biodisponibilità dei campioni suddetti é stata determinata come rapporto tra l'attività anticoagulante dopo somministrazione sottocutanea, calcolata come area sotto la curva dell’attività APTT, e quella dopo somministrazione per via endovenosa riportando nei rispettivi grafici i tempi APTT in ordinate e in ascisse i tempi di prelievo dei campioni di sangue. La determinazione dei tempi APTT é stata eseguita utilizzando le indicazioni provviste nel foglio illustrativo allegato al Kit predetto. Nel caso della somministrazione per via sottocutanea il tucano secondo l'invenzione viene sciolto in soluzione fisiologica alla concentrazione di 20 mg/0,2 mi, l'eparina calcica alla concentrazione di 4 mg/ 0,2 mi. Si utilizzano 4 conigli ( conigli New Zealand White - Allevamento dei Verbano di Conelli, Arona -Italia ) per ciascuna sostanza. La somministrazione sottocutanea viene effettuata in un'unico punto del dorso preventivamente rasato iniettando 0,2 mi /Kg delle soluzioni dette sopra.. Il sangue ( 2 mi ) é prelevato dalla vena marginale dell'orecchio in basale, a 30 minuti e quindi ad intervalli di un'ora fino a 8 ore dal momento dell'iniezione. Come anticoagulante si utilizza una soluzione di sodio citrato 3,8% nella proporzione 1 parte / 9 parti di sangue. Nella fig. 1. La curva indicata con il simbolo ' ' si riferisce alla preparazione V0264.B, con il simbolo ' * ’ la preparazione V0264.A e con il simbolo ' . ’ l’eparina calcica. Ognuno dei punti sperimentali é la media di 4 dati. Si calcola l’area compresa tra ognuna delle due curve e la linea di riferimento, che é la parallela all’asse delle ascisse che taglia le ordinate nel punto corrispondente al tempo APTT basale.
La figura evidenzia inoltre che le aree relative ai due composti dell'invenzione vengono sistematicamente sottostimate in quanto le curve dei tucani a basso peso molecolare, al monento dell'ultimo prelievo, sono ancora molto discoste dalla linea di riferimento.
Nella somministrazione per via endovenosa si preparano soluzioni alla concentrazione di 5 mg/ml delle due suddette preparazioni di fucano secondo l'invenzione e una soluzione di eparina alla concentrazione di 1 mg/ml. Ognuna delle precedenti soluzioni viene iniettata in 4 conigli, attraverso la vena marginale di un precchio ( volume 1 ml/Kg ). I prelievi di sangue ( 2 mi aggiunti di una aliquota della sol. di citrato sodico 3,8% nelle medesime proporzioni dette in precedenza ) vengono effettuati dalla vena marginale dell’altro orecchio, rispettivamente in basale e a 2, 5, 10, 15, 20, 30, 60, 90, 120 minuti ed in seguito ad intervalli regolari di un'ora. Riportando in un grafico i valori di APTT ed il tempo come qui sopra é stato illustrato si ottengono le curve di fig. 2 e si calcolano poi le relative aree. Il significato dei simboli che contraddistinguono ognuna delle tre curve é il medesimo che qui sopra é stato indicato per la fig. 1.
La biodisponibilità viene calcolata dal rapporto tra le aree ottenute per il campione dopo somministrazione sottocutanea, e rispettivamente endovenosa, mediante la seguente formula : Area sotto la curva ( somm. sottocùte ) X 100 / Area sotto la curva somm. endovena ) X 4.
E’ opportuno qui rammentare che le biodisponibilità che vengono in questo modo ottenute, e che sono espresse con i numeri che saranno più avanti riportati, sono sostanzialmente sottostimate per quanto concerne i composti dell'invenzione per i motivi più addietro indicati a proposito del càlcolo delle aree sotto la curva nell'esperimento di somministrazione sottocutanea.
Il titolo di trombina ( TT ) espresso in U.l/mg, viene determinato con il Kit Hemodiagnostica Stago® art. n. 126594. Il test viene effettuato seguendo il medesimo procedimento descritto in farmacopea per il test APTT. Il calcolo della biodisponibilità sulla base del metodo descritto in precedenza per l'attività APTT non si é rivelato possibile per il fatto che le aree non erano esattamente valutabili. Numerosi campioni evidenziavano infatti tempi di coagulazione maggiori di 300 secondi, che nel modello sperimentale in questione era stato arbitrariamente assunto come indice di incoagulabilità totale.
Il test di trombosi da stasi venosa é stato eseguito sostanzialmente secondo quanto descritto nei seguenti articoli: P. Bacher et Alii "The thrombolytic potency of LMW heparin compared to urokinase in a rabbit jugular vein lysis model " Thromb. Res. 66, 151-158 1992; I. Reyers et alii " Stasis-induced venous thrombosis " in Standardization of animai models of thrombosis. 17th Angiological Symposium Kitzbuhel - Proceedings K. Bredding, R. Zimmermann, F.K. Schattiner editors, Stuttgart 1983, pagg.
99 - 104; I. Reyers et Alii " Failure at different doses of aspirin to modify experimental thrombosis in rats " Thromb. Res. 18, 669-674, 1980.
In soluzione fisologica ( volume 10 mi ) vengono sciolte, rispettivamente, -le seguenti sostanze : eparina calcica ( lotto 9 di produzione Crinos ) alla concentrazione di 2 mg/ml e fucan solfato prep. V0264.B alla concentrazione di 10 mg/ml.
Gli animali ( conigli New Zealand White - Allevamento del Verbano di Conelli, Arena - Italia ), nel numero di 3 gruppi ( 4 conigli/gruppo ), preventivamente anestetizzati, venivano sottoposti a tracheotomia e intubati. La vena giugulare destra veniva poi isolata dal tessuto circostante per una lunghezza di 3 cm e a valle del vaso veniva effettuata una stenosi venosa, in modo da ridurre il flusso ematico. 10 minuti dopo si effettuava il trattamento i.v. mediante bolo di 1 ml/Kg, somministrato nella vena dell’orecchio secondo il seguente schema di trattamento:
- gruppo controllo : soluzione fisiologica.
- gruppo trattato con eparina : 2 rr^g/Kg.
- gruppo trattato con V0264.B : 10 mg/Kg.
5 minuti dopo l'iniezione a monte della stenosi veniva applicata una pinza emostatica ricurva sulla vena, in modo da indurre una lesione endoteliale del vaso ( lunghezza 2 cm ). Subito dopo a valle della stenosi veniva applicata una seconda pinza per interrompere completamente il flusso. La pinza emostatica ricurva veniva rimossa dopo 30 minuti. Al sessantesimo minuto dalla induzione della lesione veniva tolta anche la seconda pinza e veniva matenuta la stenosi iniziale. Il trombo veniva prelevato due ore dopo l’inizio dell'esperimento, vale a dire dopo un'ora dal momento in cui sulla vena era stata lasciata soltanto la stenosi iniziale. Il trombo veniva essiccato in stufa a 80°C per 24 ore ed infine pesato. L3⁄4!Xrichiedente ritiene che questo modello sperimentale di trombosi riproduca abbastanza da vicino ciò che accade realmente nella patologia trombotica. Ad esempio la stenosi viene realizzata in maniera da non ostruire completamente il flusso sanguigno, analogamente a quanto accade in vivo quando si creano le condizioni che portano allo sviluppo del trombo. Inoltre nel test in questione, nell'ora successiva alla rimozione della pinza che aveva interrotto totalmente il flusso ematico l'accrescimento del trombo eventualmente formatosi può venir favorito per il fatto che la stenosi iniziale lascia comunque circolare del sangue nel vaso.
Altri modelli sperimentali, a parere della scrivente, offrono condizioni meno critiche e di conseguenza, almeno in linea di principio, più favorevoli al manifestarsi dell'eventuale attività antitrombotica delle sostanze che si intendono esaminare. Ad esempio nel test di S. Wessler et Alii, J. Appi.
Physiol. 1959 14 pagg. 943 - 946, usato per evidenziare l’attività antitrombotica dei composti rivendicati nel brevetto europeo n. 403377, la formazione del trombo viene indotta mediante la somministrazione di una sostanza ad attività procoagulante; il trombo viene lasciato accrescere in un tratto isolato della vena e rimosso dopo 15 minuti appena dall'induzione. E' evidente che in queste condizioni viene ridotta, rispetto a quanto invece avviene nel modello precedente, la possibilità che il trombo si formi e si accresca.
Primo oggetto della presente invenzione sono fucani solfati a basso peso molecolare ottenuti dalle alghe brune o Pheophycee aventi una significativa attività anticoagulante, sia a livello di meccanismo globale della coagulazione ( attività APTT ) che a livello dell'ultima fase della coagulazione { attività antitrombinica ), e antitrombotica caratterizzati dai seguenti parametri analitici chimici, chimico fisici e farmacologici ( dati sul secco ) : Zolfo : 12,5 - 15 %, Fucosio 43 - 57 %, acidi uronici 2 - 9%, peso molecolare 14000 - 29000, rotazione specifica da - 137 a - 170, titolo APTT 40 - 80 U.l./mg , titolo TT 18 - 30 U.l. / mg .Particolarmente preferite secondo l'invenzione sono le frazioni di tucano solfato a basso peso molecolare aventi zolfo compreso tra 14 e 15 %, fucosio 44 - 56%, acidi uronici 2 - 3,5 %, rotazione specifica tra - 160 e - 170, peso molecolare 17000 - 25000, titolo APTT compreso tra 60 e 80 U.l./mg e titolo TT tra 23 e 30 U.l./mg.
Degno di nota é il fatto che queste sostanze hanno un tempo di trombina maggiore da 1 ,5 a 2,5 volte rispettp a quello delle due frazioni di fucan solfato a basso peso molecolare descritte nel lavoro di T. Nishino et Alii in Carbohyd. Res. 186, 119 1989 più addietro menzionato.
La circostanza che il titolo APTT risulti inferiore rispetto ai composti di questa tecnica nota non sembra avere invece molta rilevanza pratica quando le sostanze secondo l'invenzione vengono somministrate, come avviene solitamente per l'eparina, per via sottocutanea. Infatti la biodisponibilità a seguito della somministrazione sottocutanea calcolata secondo la metodica più addietro descritta é risultata del 20% per l'eparina calcica di riferimento ( titolo APTT 186 U.l./mg ) e del 39 e rispettivamente 40% per le preparazioni V0264.A e V0264.B. Quindi i composti dell'invenzione per questa via di somministrazione evidenziano una biodisponibilità che é il doppio di quella dell'eparina calcica, di conseguenza le unità APTT del farmaco che alla fine vengono rese effettivamente disponibili nell'organismo del paziente non sono molto discoste da quelle ottenute dall'eparina calcica.
Degno di nota é il fatto che questo risultato é stato ottenuto confrontando le sostanze su base ponderale, quindi senza tener conto della notevole diversità che esiste tra i corrispondenti valori di attività anticoagulante. Le nuove sostanze oltre alla suddetta attività risultano efficaci anche come agenti antitrombotici, come si dimostra nel test della trombosi da stasi venosa qui sopra descritto. La preparazione V0246.B alla dose di 10 mg/Kg non ha dato luogo alla formazione di trombi. Nelle medesime condizioni sperimentali la concentrazione minima dell’eparina calcica di riferimento a cui non si ha formazione di trombi é stata di 1 mg/Kg. _ Per quanto riguarda le differenze tra i composti descritti nel brevetto europeo n. 403377 e i tucani a basso peso molecolare della presente invenzione viene osservato quanto segue :
- Il contenuto di zolfo dei composti della tecnica nota é più basso ( rif. tabella I a pag. 8 dell'attestato europeo ) ed é compreso tra 7 e 11%. - L'incremento massimo del titolo di zolfo passando dal composto da depolimerizzare al prodotto depolimerizzato secondo il brevetto deve essere uguale al 20%, mentre nel caso delle nuove sostanze detto incremento é assai maggiore ed é compreso tra il 60 e 100% rispetto al titolo di zolfo del composto di partenza.
- L'attività farmacologica almeno per il titolo APTT é molto più bassa. La richiedente ha inoltre messo a punto un procedimento che vantaggiosamente consente di ottenere i nuovi polimeri a basso peso molecolare depolimerizzando direttamente l'estratto grezzo che viene ottenuto dopo l'estrazione del materiale vegetale e il successivo allontanamento degli alginati mediante precipitazione adda. Secondo il procedimento rivendicato non occorre quindi isolare un prodotto intermedio più purificato, vale a dire un tucano ad elevato peso molecolare avente un contenuto più alto sia di zolfo che di fucosio.ed una quantità decisamente inferiore di acidi uranici rispetto al suindicato estratto grezzo, come avviene invece in base al procedimento descritto nel brevetto europeo n. 403377.
Nel merito di quest'ultimo argomento occorre osservare che nel quadro delle ricerche che sono state svolte per mettere a punto la parte del procedimento che riguarda la dpgradazione e riduzione del peso molecolare detrintermedio estratto dalle alghe, é stata affrontata la questione se come sostanza di partenza si doveva impiegare l'estratto grezzo o piuttosto il tucano ad alto peso molecolare più purificato che poteva venire isolato da questo composto. L'esempio 6 illustra che depolimerizzando un tucano purificato avente un peso molecolare di 652000 ( titolo APTT 67,5 ) ottenuto dall'estratto grezzo VO 246. B con il sistema acetato di rame / acqua ossigenata per 24 ore, vale a dire nelle medesime condizioni nelle quali vengono ottenute dal medesimo estratto grezzo le frazioni molto attive VO 264.A e V0264.B ( rif. esempi 7 e 9 rispettivamente ), il polimero che alla fine viene isolato ha un peso molecolare più basso ( 8800 Da ) ed una attività farmacologica molto ^ridotta ( titolo APTT 22,1 U.l./mg ) rispetto alle due preparazioni qui sopra indicate.
Il risultato dell'esempio 6 dimostra quindi che da un tucano ad elevato peso molecolare e molto puro non si possono ottenere i prodotti dell'invenzione.
Inoltre, ancora nel merito della originalità del procedimento secondo la présente invenzione, degno di nota é il fatto che i metodi di depolimerizzazione disponibili nella tecnica nota, come si evince confrontando tra loro i risultati ottenuti negli esempi 4, 5 e 7, non sono tra loro intercambiabili per ottenere le sostanze che vengono rivendicate nella presente domanda, partendo dall'estratto grezzo che viene inizialmente isolato come intermedio. Depolimerizzando come si descrive nell' esempio 4 l'estratto grezzo in ambiente acido ( pH 2,2 a 60°C per 16 ore ) si ottengono composti contenenti una quantità di acidi uranici maggiore rispetto a quella del fucosio. Depolimerizzando l'estratto grezzo con i raggi gamma secondo il procedimento riportato nell'esempio 5 si ottengono composti che hanno un titolo di zolfo assai basso e che presumibilmente contengono in notevole quantità prodotti di degradazione. Da ultimo l'esempio 7 dimostra che i prodotti dell'invenzione possono venire ottenuti riducendo il peso molecolare del prodotto intermedio in presenza di un sale rameico inorganico e di acqua ossigenata.
Entrando in dettaglio nella descrizione del metodo per ottenere le nuove sostanze, esso consiste delle seguenti fasi :
a. Estrazione per 16 ore in acqua bollente o a temperature vicine a quella di ebollizione ( 92 - 100°C ), sotto agitazione, della polvere secca e macinata dell'alga. Il procedimento é in sè noto e descritto nell’articolo di W.A.P. Black et Alii " Manufacture of aigai Chemicals IV.-Laboratory scale isolation of fucoidin from brown marine algae " J. Sci. Food Agric. 3 1952 pages 122 - 129.
b. Filtrazione della sospensione precedente e successiva correzione del pH del filtrato a un valore compreso tra 2 e 2,5. A questo punto si forma un precipitato, costituito da una parte degli alginati che sono presenti nella massa estratta. Il solido gelatinoso viene allontanato dal sovranatante per filtrazione e il filtrato che si recupera viene portato a pH neutro.
c. La soluzione viene successivamente concentrata a circa 1/4 - 1/5 del volume iniziale in apparecchiatura di ultrafiltrazione su membrana avente un cut-off di 100.000 Da. Nella medesima apparecchiatura la soluzione viene poi dializzata contro 3 volumi di acqua e alla fine può venir ulteriormente concentrata, se necessario, per ridurne il volume finale.
d. L’estratto grezzo viene recuperato per precipitazione dopo salatura ed aggiunta di due volumi di etanolo o di acetone alla soluzione ottenuta alla fine del passaggio precedente. La sostanza che viene isolata é definita dai seguenti parametri chimici, chimico-fisici e farmacologici : zolfo 6 - 8%, fucosio 31 -36 %, acidi uranici 23 - 27%, peso molecolare 450000 - 800000, titolo APTT 40 - 60 U.l./mg.
e. L'estratto grezzo viene sciolto in soluzione acquosa e quindi si effettua la degradazione e depolimerizzazione del composto in presenza di un sale rameico inorganico ed acqua ossigenata alla temperatura di 55°C. Mediante prove preliminari di laboratorio si determina il tempo della reazione che occorre per ottenere un tucano con un peso molecolare compreso tra 14000 e 29000. Il rapporto percentuale in peso tra lo ione rameico e la sostanza da depolimerizzare é 1,3 % e il rapporto tra il volume, espresso in mi, di acqua ossigenata a concentrazione 8% e il peso della sostanza espresso in g può variare da 5,5 a 36. il pH durante la depolimerizzazione deve essere mantenuto tra 6,0 e 7,5.
Queste ultime condizioni sperimentali sono sostanzialmente le medesime indicate nel brevetto americano B 408030 e nell’articolo di N. Volpi " Anaiytica! techniques for studying structures of dermatan sulfate and low molecular wpight heparin - Dermatan sulfate " Il Farmaco, 47 ( supplement to η' β ) 841 - 853 1992 ).
f. Ultimata la reazione si filtra, si sala e si precipita aggiungendo due volumi di etanolo. Si disidrata e si essicca, recuperando il corrispondente sale misto di sodio e ione rameico dei prodotti secondo l'invenzione.
g. Questi composti vengono poi convertiti nei corrispondenti sali sodici mediante trattamento con una resina a scambio ionico nella forma Na+. Allo scopo le sostanze vengono sciolte in acqua a una concentrazione compresa tra il 5 e 7% p/v, e la soluzione ottenuta può essere percolata su una colonna contenente la resina, oppure può venire aggiunta dello scambiatore e la sospensione risultante tenuta sotto agitazione per il tempo necessario affinché avvenga lo scambio dei cationi. Quest'ultimo processo può essere facilmente seguito mediante un elettrodo selettivo allo ione rame. Il rapporto in volume tra la resina e la soluzione può variare da 1/2 a 2/3 .
h. Al termine si filtra, si corregge il pH a un valore compreso tra 6,0 e 6,5 si sala la soluzione e si precipita aggiungendo due volumi di etanolo, recuperando il sale sodico dei tucani a basso peso molecolare secondo l'invenzione.
Un ulteriore aspetto della presente invenzione é costituito dalle formulazioni o composizioni contenenti come principio attivo i tucani a basso peso molecolare della presente domanda che possono anche essere sotto forma di sali con altri cationi farmacologicamente accettabili, come ad esempio calcio e magnesio. Dette formulazioni possono essere realizzate sia per la somministrazione parenterale che per quella orale. Le formulazioni per uso topico locale, come si illustra in particolare nell’esempio 16, possono essere destinate anche ad impieghi non farmaceutici e di conseguenza avere composizioni idonee alio scopo. Le composizioni per uso parenterale possono essere soluzioni sterili e apirogene in fiala, oppure liofilizzati da confezionare in flaconcini da sciogliere estemporaneamente nel solvente acquoso sterile. Come solventi acquosi possono venire impiegate soluzioni isotoniche con gli usuali tamponi ( citrati, fosfati e simili ) e conservanti noti. Le formulazioni orali possono essere nella forma di compresse, compresse rivestite, capsule di gelatina, granulati.
Dette forme farmaceutiche possono venir realizzate con procedimenti noti. Ad esempio, per quanto riguarda in particolare le formulazioni orali, esse possono venire preparate con le tecniche usuali, ad es. mediante comprimitura diretta della polvere o del granulato, e possono contenere leganti, lubrificanti e disperdenti noti.
Le formulazioni per somministrazione parenterale possono contenere da 1 a 90 mg/ml di principio attivo ( nel caso di liofilizzati, i numeri precedenti si riferiscono alla concentrazione finale della sostanza nella fiala solvente ), quelle orali da 20 a 400 mg/dose unitaria.
Le composizioni per uso topico locale possono essere nella forma di gel, creme, pomate, soluzioni, contenenti da 0,1 a 20% in peso di principio attivo.
I dati analitici che vengono riferiti negli esempi seguenti sono calcolati sul secco.
Esempio 1
Estrazione del grezzo di fucan solfatp preparazione n. V0246.A.
1 kg di polvere secca di Fucus vesiculosus vengono sospesi sotto agitazione in 7 litri di acqua distillata in pallone di 15 litri con refrigerante. A sospensione avvenuta ( circa 15 minuti ) si scalda in bagno ad olio a 100°C per 16 ore. Si raffredda a 40°C e si centrifuga a 3000 giri per 20 minuti la sospensione, utilizzando 4 provettoni da centrifuga da 1 litro, il residuo gelatinoso che si accumula sul fondo dei recipienti viene sospeso in acqua alla temperatura di 60°C mediante agitazione meccanica, mantenendo l'agitazione per 15 minuti circa. Si centrifuga di nuovo ed al sovranatante opalescente vengono aggiunti 200 mg di Clarcel FLO/MA® ( perlite calcinata e macinata ). Si filtra recuperando 6,3 litri, che vengono aggiunti di 50 mi di HCI 37% per portare il pH attorno al valore di 2,1 e si centrifuga di nuovo. Il solido gelatinoso ( 44,4 g - prep. 0195/95005-D -zolfo 0,7%, acidi uronici 51 % ) viene scartato ed il sovranatante si neutralizza con una soluzione di NaOH 30%. Si concentra mantenendo il volume costante a 1 ,5 litri in apparecchiatura di ultrafiltrazione Amicon® CH2-A su cui é stata installata una membrana con cut-off di 100.000 Dalton. Ultimata la fase di concentrazione, utilizzando la stessa membrana la soluzione viene dializzata contro 3 volumi di acqua distillata. Il retenato ( 1 ,6 litri ) viene aggiunto di 112 g ( 7% p/v ) di acetato di sodio anidro si agita fino ad ottenere una soluzione omogenea e si precipita il soluto con 2 volumi di etanolo. Si lascia decantare per una notte. Il solido viene disidratato ed essiccato. Si recuperano 79,68 g ( resa circa 8% ) di un solido ( preparazione V0246.A ) avente i seguenti dati analitici sul secco : zolfo 6,5%, Fucosio 31 ,7%, acidi uronici 23,8 %, peso molecolare 493000, titolo APTT 53,4, titolo TT 18,2.
Esempio 2
Estrazione del grezzo di fucan solfato preparazione n. V0246.B.
In un reattore da 300 litri si versano 175 litri di acqua distillata. Si aggiungono 25 Kg di polvere secca di Fucus vesiculosus e si scalda a camicia di vapore a 92°C per 16 ore. Al termine si abbassa la temperatura a 30°C e si aggiungono 5 Kg di Clarcel FLO/MA®. Si filtra su filtro pressa montato con filtri Seitz K 800 ® . Si raccoglie il filtrato. Il pannello si disperde in acqua ( 20 litri ) e si lascia sotto agitazione per 1 h a 60°C. Si filtra di nuovo su filtri Seitz K 800 ® e si riuniscono i liquidi, ottenendo in totale 220 litri. Si versa la soluzione nel reattore, si aggiungono kg 5,5 di Clarcel CBR® ( polvere di diatomee calcinata e macinata ), si raffredda a 25 - 30°C e si precipita portando a pH 2 con 1 ,5 litri circa di HCI 37%. Si agita per 15 minuti e poi si filtra su filtri Seitz K 800 ® . Si lavano i pannelli con 20 litri di soluzione acida ( pH 2 ) ottenendo 220 litri . La soluzione ottenuta viene caricata in impianto Alfa Lavai ® per ultrafiltrazione equipaggiato con cartuccia Millipore ® avente cut-off = 100.000, dapprima si concentra fino a ridurre il volume a 50 litri e poi si dializza a volume costante contro 3 volumi di acqua. Ultimata quest'ultima fase si riduce ulteriormente il volume della soluzione fino a 25 - 30 litri. Si scarica e il liquido viene salato con NaCI fino a concentrazione 2% p/v del sale e si aggiungono 2 volumi di acetone. Si lascia decantare e si recupera il solido che viene poi disidratato, essiccato e macinato. Si recuperano in questo modo 1665 g di estratto grezzo V0246.B ( resa 6,7 % ) avente i seguenti dati analitici sul secco : zolfo 7,1%,' Fucosio 32,0%, acidi uranici 25,0 %, peso molecolare 800000, Titolo APTT 55.
Esempio 3
Estrazione del grezzo di fucan solfato preparazione n. V0246.C.
Si ripete il procedimento descritto nel precedente esempio partendo da 25 Kg di un nuovo lotto di Fucus vesiculosus. Il pM della precipitazione intermedia in questo caso viene fissato al valore di 2,5. Si ottengono 2100 g ( resa 8,4 % ) di prodotto ( preparazione VO 246. C ) avente i seguenti dati analitici : zolfo 7,6 %, fucosio 35,8%, acidi uronici 26,1 %, peso molecolare 470000, titolo APTT 44.
Esempio 4
Depolimerizzazione in ambiente acido della preparazione di fucan solfato grezzo V0246.B.
5 g di V0.246.B vengono sciolti in 500 mi di acqua distillata in un pallone da I. 1 sul quale é installato un refrigerante. Si aggiungono 10 mi di HCI 1 N per abbassare il pH a 2,2 e si scalda in bagno d'olio a 60° C per 16 ore. Alla fine si raffredda la soluzione, si corregge il pH a 7 con una soluzione di NaOH. Il liquido viene dializzato in apparecchiatura di ultrafiltrazione Amicon® CH2-A a volume costante in tre fasi successive contro 5 volumi di acqua distillata per volta. Nella prima fase ( fase A ) la membrana di dialisi ha un cut-off di 3000 Da, nella seconda ( fase B ) il cut-off é di 10.000 Da e nella terza ( fase C ) di 100000 Da. I soluti contenuti nei dializzati delle fasi A, B e C vengono precipitati dopo concentrazione delle soluzioni per evaporazione sotto pressione ridotta e salatura con NaCI fino a una concentrazione 2% p/v e successiva aggiunta di due volumi di acetone. Vengono così raccolte tre frazioni dal peso, rispettivamente, di 57 mg ( prep. 0195/95026-A ), di 6,5 mg ( prep. 0195/95026-B ) che viene scartata, e di 496 mg ( prep. 0195/95026-C }.
Le analisi per acidi uronici e fucosio hanno dato i seguenti risultati : prep.
0195/95026-A acidi uronici 38,0 %, fucosio 8,9% ; prep. 0195/95026-C acidi uronici 20,1 %, fucosio 21 ,2 %.
Il retenato proveniente dall'ultima dialisi ( fase C ) viene salato con NaCI fino a concentrazione del sale 2% p/v ed il soluto precipitato con 2 volumi di acetone. Si ottengono 2,4 g ( prep. 0195/95026-D ) contenente il 32,5% di acidi uranici e 16,25% di fucosio .
Esempio 5
Depolimerizzazione con raggi gamma del grezzo V0246.B.
1 ,5 g del grezzo vengono sciolti in un matraccio tarato da 150 mi in tampone fosfato 0,1 M pH 7, portando a volume dopo la dissoluzione completa della sostanza. La soluzione viene poi distribuita in n. 5 flaconcini da 30 mi che vengono ermeticamente chiusi ed inviati per il trattamento alla ditta Gammaton ( Guanzate - Como ) . Due flaconcini vengono irradiati con una radiazione da 2,5 Mrad ed altri due con 20 Mrad. Un flaconcino per ognuno dei due trattamenti viene poi aggiunto di NaCI fino a concentrazione 2% ed il soluto precipitato con due volumi di acetone.
Dalla soluzione trattata con 2,5 Mrad si ottengono 460 mg di un prodotto ( prep. 0195/96041-A ) con un titolo di fosfati pari al 51% p/p. La quantità reale di sostanza é di 225 mg, con una resa del 75 % sul grezzo di partenza. I dati analitici calcolati sullq quantità reale di sostanza recuperata sono i seguenti : Zolfo : 5,1 %; acidi uranici 16,1 %, fucosio 19,3%, peso molecolare 38.500 Da.
Il peso del prodotto recuperato dalla soluzione trattata con 20 Mrad ( prep. 0195/96041-D ) é di 211 mg con un contenuto di fosfati pari al 71% p/p. Di conseguenza il recupero effettivo di sostanza é di 61 ,2 mg ( resa del 20% sul grezzo di partenza ). L'analisi ha dato i seguenti risultati ( riferiti alla sostanza pura ) : zolfo 5,55%, acidi uranici 3,38%, fucosio 5,79%, peso molecolare 5600 Da.
Esempio 6
Preparazione del fucan sulfato ad alto peso molecolare purificato ( prep. n. V0248.A ) e successiva depolimerizzazione per 24 ore in acetato di rame in presenza di acqua ossigenata ( prep. VO 269.A ).
200 g di estratto grezzo n. VO 246. B vengono sciolti in 10 litri di acqua distillata. Si aggiungono 200 g di NaCI e si agita fino ad ottenere una soluzione omogenea. Si aggiungono 7,5 litri ( 0,75 voi.) di acetone e si lascia a riposo per una notte. Si raccoglie il precipitato, che dopo disidratazione ed essiccamento pesa 126,5 g. Al sovranatante si aggiungono poi 12,5 litri di acetone ( 2 volumi totali ), recuperando 68,3 g di fucan solfato purificato ( prep. n. V0248.A ) avente il seguente profilo analitico : zolfo 8,9%, fucosio 48,5%, acidi uranici 9,7 %, peso molecolare 652000, rotazione specifica - 112,8, titolo APTT 67,5.
10 g del composto ottenuto vengono sciolti in 200 mi di acqua distillata. Si travasa in pallone e si scalda in bagno ad olio a 55°C sotto agitazione. Si aggiungono 400 mg di acetato rameico monoidrato e si corregge, a dissoluzione avvenuta, il pH a 7,5 niediante poche gocce di NaOH 1 N. Si aggiunge mediante pompa peristaltica la soluzione di acqua ossigenata 8% p/v al flusso di 2,3 ml/h. Si lascia reagire per 24 ore mantenendo il pH tra 6,0 e 6,5 ( volume totale di acqua ossigenata . 55 mi ). Si filtra su filtro Seitz K 800 ® recuperando 400 mi di soluzione limpida, che viene addizionata di 28 g di acetato sodico anidro e poi di due volumi di etanolo. Il precipitato, nella forma di una pasta, viene sciolto direttamente in 70 mi di acqua distillata, a cui vengono aggiunti 30 mi di resina Amberlite® IRC 718 ( forma Na+ ) e si lascia sotto agitazione per 6 ore. La soluzione si presenta alla fine incolore ma leggermente opalescente e viene filtrata su setto poroso aggiungendo g 10 di Clarcel CBR® . Si porta il pH a 6,5 con qualche goccia di acido acetico glaciale, si sala fino a concentrazione 7% p/v con acetato sodico anidro e si precipita il soluto con due volumi di etanolo. Si recuperano, dopo disidratazione ed essiccamento, 2,90 g del prodotto depoli merizzato ( preparazione VO 269. A - resa 29% ) contenente 12,9 % di zolfo, fucosio 53,2 %, acidi uronici 2,5 %, peso molecolare 8800, rotazione specifica - 146,8, titolo APTT 22,1.
Esempio 7
Depolimerizzazione del grezzo V0246.B con sali di rame per tempi diversi e ottenimento delle frazioni VO 260.A, VO 264.A e 0195/96044-C.
50 g di V0246.B vengono sciolti in 1 litro di acqua. Si scalda alla temperatura di 55°C e si aggiungono 2 g dì acetato rameico monoidrato, portando il pH a 7,5 con una soluzione di NaOH 1 N. A questo punto mediante una pompa peristaltica regolata al flusso di 46 ml/h si aggiunge una soluzione 8% p/v di acqua ossigenata mantenendo il pH tra 6 e 6,5 mediante una soluzione di NaOH 3QP/o. Dopo 6 ore si preleva 1/3 ( 425 mi ) del volume della soluzione, si sala con acetato di sodio anidro fino a concentrazione 5% p/v e si aggiungono 2 volumi di etanolo . Il precipitato ottenuto ( 9 g ) viene sciolto in acqua a concentrazione 5% p/v ( 180 mi ) ed eluito da una colonna di resina Amberlite® IRC 718 ( forma Na+ ) avente un letto pari alla metà, in volume, della quantità di acqua usata per sciogliere il residuo. Il flusso é di 40 ml/h. L'eluato viene salato con acetato sodico anidro e quindi precipitato con etanolo secondo le modalità descritte in precedenza. Si ottengono 7,0 g ( resa 42% ) di un composto batch n. VO 260.A avente le seguenti caratteristiche analitiche : zolfo 9,9 %, fucosio 38,3%, acidi uranici 15,1%, peso molecolare 88500, potere rotatorio - 119,6, titolo APTT 58,1, titolo TT 14,8.
Dopo 24 ore il volume della soluzione é di 2 litri. Si preleva 1 litro, che viene sottoposto ai medesimi passaggi qui sopra descritti che hanno portato all'isolamento della frazione VO 260. A., ottenendo alla fine 2,6 g ( resa 15,6 % ) della preparazione batch n. VO 264.A avente titolo di zolfo 14,5 %, fucosio 56,2 %, addi uranici 2,3 %, peso molecolare 22500, rotazione spedfica - 165, titolo APTT 74,9, titolo TT 23.
Sull'aliquota della soluzione di depolimerizzazione rimasta si prosegue l’aggiunta di acqua ossigenata per altre 24 ore ( tempo di depolimerizzazione totale 48 ore ). Al termine la soluzione viene trattata come le due precedenti aliquote, portando in questo caso la soluzione a pH 6,7 con addo acetico concentrato prima della precipitazione con etanolo. Si ottengono g 1 ( resa 6,2 % ) di un composto, batch n.
0195/96044-C, avente titolo di zolfo 15 %, peso molecolare 9700 Da. titolo APTT 23,6, titolo TT 6,7 .
Esempio 8
Depolimerizzazione per 6 ore della frazione di fucan solfato grezzo VO 246. C e ottenimento della preparazione VO 260. C.
200 g di sostanza vengono sciolti in 4 litri di acqua distillata. In base ad una prova preliminare eseguita secondo i criteri esposti nel precedente esempio 6 si stabilisce che la durata della reazione debba essere di 6 ore. Si scalda a 55°C e si aggiungono, sotto agitazione, 8 g di acetato rameico monoidrato. Si porta a pH 7,5 con circa 8 mi di una soluzione di NaOH 30% . A questo punto si aggiunge una soluzione di acqua ossigenata 8% p/v ad un flusso di circa 183,3 ml/h { in totale 1 ,1 litri ). Il pH durante la reazione viene mantenuto tra 6,5 e 7,0 mediante opportune aggiunte di piccole quantità di una soluzione di NaOH 30%. Alla fine si aggiunge alla soluzione acetato sodico triidrato fino a concentrazione11% p/v e quindi due volumi di etanolo, il precipitato viene raccolto, disidratato ed essiccato. Si recuperano in tal modo 79 g che vengono poi sciolti in 1,2 litri di acqua distillata. Si centrifuga a 3000 giri/minuto per eliminare in parte la torbidità . Si aggiungono 800 mi di resina Amberlite® IRC 718 ( forma Na<+ >) e si lascia sotto agitazione per una notte. Quindi si recupera la soluzione e si lava la resina con due volumi di acqua distillata. Si filtra su buckner con pannello ( 15 g ) di Clarcel CBR® , ottenendo una soluzione limpida, dal volume di litri 2,8 circa ( pH 8,9 ). Si abbassa il pH a 6,5 mediante aggiunta di qualche goccia di acido acetico glaciale, si aggiunge acetato sodico anidro fino a concentrazione 7% p/v e si precipita con due volumi di etanolo. Dopo disidratazione ed essiccamento si ottengono 60,1 g ( resa 30,1 % ) di preparazione VO 260. Q avente il seguente profilo analitico : zolfo 12,6%, fucosio 47 %, acidi uranici 8,1 %, peso molecolare 29000, rotazione specifica - 138,2, titolo APTT 49,6, titolo TT 21.
Esempio 9
Depolimerizzazione della preparazione di fucan solfato grezzo V0246.B con sali di rame per 24 ore e ottenimento della frazione V0264.B.
100 g di V0246.B vengono sciolti in 2 litri di acqua. In base ad una prova preliminare eseguita secondo i criteri esposti nel precedente esempio 6 si stabilisce che la durata della reazione debba essere di 24 ore. Si aggiungono 4 g di acetato rameico monoidrato. Si corregge il pH a 7,5 con NaOH 30% e si scalda a 55°C. Si aggiunge mediante pompa peristaltica una soluzione di acqua ossigenata a concentrazione 8% p/v ( flusso 45,8 ml/h ) mantenendo il pH tra 6 e 6,5. Dopo 24 ore la quantità in volume di soluzione di H2O2 aggiunta é di mi 1100. La soluzione si presenta molto opalescente e viene centrifugata. Il sovranatante viene aggiunto di acetato sodico anidro fino a concentrazione 7% p/v. Si precipita il soluto con 2 volumi di etanolo. Si disidrata e si essicca. Si recuperano 23,25 g che vengono sciolti in 400 m! di acqua. Si aggiungono 260 mi di resina Amberlite® IRC 718 ( forma Na<+ >) e si lascia una notte sotto agitazione. Si filtra su setto poroso lavando alla fine il filtro con 100 mi di acqua distillata. Si porta il filtrato a pH di circa 7 con acido acetico, si sala con sodio acetato anidro fino a concentrazione 7% p/v e si precipita con due volumi di etanolo. Dopo disidratazione ed essiccamento si ottengono 16,4 g di un composto ( preparazione V0264.B - resa 16,4% ) avente le seguenti caratteristiche analitiche : zolfo 14,3 %, fucosio 44,2%, acidi uranici 3,4 %, peso molecolare 17.500 Da, rotazione specifica - 168,6 , titolo APTT 69,5, titolo TT 28.
Esempio 10
Depolimerizzazione con sali di rame per 48 ore del grezzo V0246.C e ottenimento della frazione V0267.A.
200 g di sostanza vengono sciolti in 4 litri di acqua distillata. In base ad una prova preliminare eseguita secondo i criteri esposti nel precedente esempio 6 si stabilisce che la durata della reazione debba essere di 48 ore. Si scalda a 55°C e si aggiungono, sotto agitazione, 8 g di acetato rameico monoidrato. Si porta a pH 7,5 con circa 8 mi di una soluzione di NaOH 30% . A questo punto si aggiunge una soluzione di acqua ossigenata 8% p/v ad un flusso di circa 23 ml/h ( in totale 1 ,1 litri ). Il pH durante la reazione viene mantenuto tra 6,0 e 6,5 mediante aggiunta di piccole quantità di una soluzione di NaOH 30%. Dopo 48 ore si filtra su filtri Seitz K 800 ® . si sala con acetato sodico triidrato fino ad avere una concentrazione del sale 11% p/v e si precipita il soluto aggiungendo due volumi di etanolo. La pasta viene poi disidratata ed essiccata ottenendo 57,5 g. Si ridiscioglie in 900 mi di acqua distillata e si aggiungono 600 mi di resina Amberlite® IRC 718 ( forma Na<+ >). Si lascia sotto agitazione meccanica per una notte. Si filtra su setto poroso e la soluzione risultante viene di nuovo filtrata su setto poroso ricoperto di uno strato di Clarcel CBR® . Si riporta il pH a 6,5 aggiungendo qualche goccia di acido acetico concentrato, si sala con acetato sodico anidro fino a concentrazione del sale 7% p/v e si precipita il soluto con due volumi di etanolo. Il solido ( preparazione V0267.A ) viene raccolto, disidratato ed essiccato ottenendo g. 42,8 ( resa 21 ,4% sul grezzo ). Lanalisi del prodotto ha dato i seguenti risultati : zolfo 14,2 %, fucosio 49,8 %, acidi uranici 5,3 %, peso molecolare 14700, rotazione specifica - 139,6, titolo APTT 45, titolo TT 19.
Esempio 11
Depolimerizzazione del fucan solfato grezzo V0246.A per 18 ore e ottenimento del composto V0246A/1.
50 g del composto V0246.A vengono sciolti in acqua. In base ad una prova preliminare eseguita secondo i criteri esposti nel precedente esempio 6 si stabilisce che la durata della reazione debba essere di 18 ore. Il pH durante la reazione viene mantenuto tra 7,0 e 7,5 mediante aggiunta di opiccole quantità di una soluzione di NaOH 30%.. Si procede come descritto nell'esempio 6, aggiungendo le stesse quantità di acetato di rame e di soluzione di acqua ossigenata 8 % p/v ( quantità totale aggiunta 2775 mi ). Si recuperano 11 ,5 g di prodotto ( V0246A/1 ) avente il seguente profilo analitico : zolfo 14,8 %, fucosio 49,3%, acidi uranici 2,1 %, peso molecolare 25000, rotazione specifica - 162, titolo APTT 78, titolo TT 27.
Negli esempi 12 - 15 qui sotto riportati e che esemplificano formulazioni farmaceutiche e non, l'espressione " fucan solfato a basso p.m. " sta a indicare una preparazione di fucan solfato che rientra nei limiti previsti nella presente invenzione.
Esempio 12
formulazione per uso sottocutaneo
Fucan solfato a basso p.m. mg 20
acqua bidistillata 0,2 mi
Esempio 13
Formulazione per somministrazione endovenosa
Fucan solfato a basso p.m. mg 80
acqua bidistillata 4 mi
Esempio 14
Preparazione per uso orale ( compressa )
Fucan solfato a basso p.m. mg 180
mannitolo mg 300
saccarosio mg 240
polivinilpirrolidone mg 14
magnesio stearato mg 9
Esempio 15
Composizioni per uso topico locale
Gel Crema
Fucan solfato a basso p.m. g 12 Fucan solfato a basso p.m. g 18 isopropanolo g 25 poliossietilenglicole stearato g 11 1 ,2 propilenglicole g 0,7 alcool cetilstearilico g 14 trietanolamina g 1 ,2 propilenglicole g 9 carbopol g 1 ,1 conservanti, profumo profumo acqua bidist. q.b. a e acqua q.b. a g 100
g 100
Lozione acquosa
Fucan solfato a basso p.m. g 7
glicerina g 7
alcool etilico mi 10
conservanti, profumo
e acqua q.b. a g 100
Esempio 16
Altre composizioni ad uso topico
Lozione acquosa per uso Emulsione ad attività cosmetico detergente
Fucan solfato a basso Fucan solfato a basso p.m. g 4 p.m. g 0,5 - 5 PEG 15 gliceril ricinoleato g 14 glicole propilenico g 1 ,5 polisorbato 21 g 7 alcool etilico mi 15 olio di mandorle g 3 conservanti, profumo profumo acqua bidist. q.b. a e acqua q.b. a g 100 g 100
Claims (10)
- RIVENDICAZIONI 1. Fucani solfati a basso peso molecolare ottenuti dalle alghe brune o Pheophycee, aventi una significativa attività anticoagulante sia a livello di meccanismo globale della coagulazione ( attività APTT ) che a livello dell'ultima fase della coagulazione ( attività antitrombinica ), ed aventi inoltre attività antitrombotica, caratterizzati dai seguenti parametri chimici, chimico fisici e farmacologici ( dati sul secco ) : zolfo : 12,5 - 15 %, fucosio 43 - 57 %, acidi uronici 2 - 9%, peso molecolare 14000 - 29000, rotazione specifica da - 137 a - 170, titolo APTT 40 - 80 U.l./mg, titolo TT 18 - 30 U.I. / mg.
- 2. Fucani solfati secondo la rivendicazione 1 caratterizzati dai seguenti parametri chimici, chimico fisici e farmacologici ( dati su 1 secco ) : zolfo 14 - 15 %, fucosio 44 - 56%, acidi uronici 2 - 3,5 %, rotazione specifica da - 160 a - 170, peso molecolare 17000 - 25000, titolo APTT 60 - 80 U.l./mg , titolo TT 23 - 30 U.l./mg. .
- 3. Fucani solfati secondo la rivendicazione 1 caratterizzati dal fatto di venire ottenuti da Fucus vesiculosus.
- 4. Fucani secondo la rivendicazione 1 per uso come medicamento.
- 5. Uso dei fucani secondo la rivendicazione 1 per la preparazione di farmaci attivi sulla coagulazione e per la terapia della trombosi.
- 6. Uso secondo la precedente rivendicazione ove i farmaci hanno unq. composizione idonea per la somministrazione sottocutanea.
- 7. Procedimento per ottenere i fucani della rivendicazione 1 comprendente le seguenti fasi : a. Estrazione della polvere secca e macinata dell'alga in acqua bollente, o a temperature vicine a quella di ebollizione ( 92 - 100°C ) sotto agitazione per 16 ore. b. Filtrazione, correzione del pH del filtrato a un valore compreso tra 2 e 2,5, allontanamento del precipitato dal sovranatante per filtrazione e correzione del pH del sovranatante alla neutralità. c. Concentrazione della soluzione a circa 1/4 - 1/5 del volume iniziale in apparecchiatura di ultrafiltrazione su membrana avente un cut-off di 100.000 Da, successiva dialisi contro 3 volumi di acqua ed eventuale concentrazione finale. d. Recupero dell'estratto grezzo per precipitazione dopo salatura e aggiunta di due volumi di etanolo o acetone alla soluzione ottenuta alla fine del passaggio precedente. e. Degradazione e depolimerizzazione dell'estratto grezzo in soluzione acquosa in presenza di un sale rameico inorganico e di acqua ossigenata 8 % alla temperatura di 55°C e a un pH tra 6,0 e 7,5, per il tempo occorrente per ottenere un composto con un peso molecolare compreso tra 14000 e 29000, essendo il rapporto ponderale percentuale tra lo ione rameico e l'estratto grezzo di 1,3% e il· rapporto tra mi di acqua ossigenata 8% impiegati e i grammi di estratto grezzo compreso tra 5,5 e 36. f. Filtrazione, salatura della soluzione, precipitazione del soluto mediante aggiunta di due volumi di etanolo. g. Dissoluzione del composto ottenuto in acqua e trattamento con una resina a scambio ionico nella forma Na . h. Filtrazione, abbassamento del pH tra 6,0 e 6,5, salatura della soluzione e precipitazione dei composti secondo l'invenzione mediante aggiunta di due volumi di etanolo.
- 8. Estratto grezzo ottenuto da alghe brune o Pheophycee, ottenibile come intermedio del procedimento secondo la rivendicazione 7, caratterizzato dai seguenti parametri analitici chimici, chimico fisici e farmacologici : zolfo 6 -8%, fucosio 31 -36 %, acidi uronici 23 - 27%, peso molecolare 450000 - 800000, titolo APTT 40 - 60 U.l./mg
- 9. Procedimento per ottenere l'estratto grezzo della rivendicazione 8 costituito dalle seguenti fasi : a. Estrazione della polvere secca e macinata dell'alga in acqua bollente, o a temperature vicine a quella di ebollizione ( 92 - 100°C ) sotto agitazione per 16 ore. b. Filtrazione, correzione del pH del filtrato a un valore compreso tra 2 e 2; 5, allontanamento de! precipitato dal sovranatante per filtrazione e correzione del pH del sovranatante alla neutralità. c. Concentrazione della soluzione a circa 1/4 - 1/5 del volume iniziale in apparecchiatura di ultrafiltrazione su membrana avente un cut-off di 100.000 Da, successiva dialisi contro 3 volumi di acqua ed eventuale concentrazione finale. d. Recupero dell'estratto grezzo per precipitazione dopo salatura e aggiunta di due volumi di etanolo o acetone alla soluzione ottenuta alla fine del passaggio precedente.
- 10. Formulazioni per la somministrazione parenterale, orale e topica locale contenti i fucani della rivendicazione 1.
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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