JPH04503950A

JPH04503950A - 平滑筋細胞増殖のインヒビターとしてのヘパリン断片

Info

Publication number: JPH04503950A
Application number: JP2501865A
Authority: JP
Inventors: ブランドリー，ブライアン　ケイ．; ラム，ラン　エイチ．; レイン，ロジャー　エー．
Original assignee: グリコメド　インコーポレイテッド
Priority date: 1988-12-15
Filing date: 1989-12-14
Publication date: 1992-07-16
Also published as: CA2005739A1; WO1990006755A1; DK115791A; EP0448637A1; AU634199B2; DK115791D0; US5032679A; BR8907831A; EP0448637A4; AU4827490A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ′　のインヒビターとしてのユニＬヱ販五隨良立且本発明は、治療上および診断上有用な組成物としての糖調製物に関する。特に本発明は、過剰な平滑筋細胞の増殖を特徴とする病気および症状を治療するための、四糖単位に相当する分子量を有するヘパリン誘導体に関する。

１１芝五血管壁における平滑筋細胞の増殖は、血管の損傷に応答して、および特定の病気の状態に関連して起こる（Ａｕｓｔｉｎ、Ｇ、Ｅ、ら、　Ｊ　Ａｍ　ｏｆ　Ｉ　Ｃａｒｄｆｏｆ　（１９８５）６：　３６９−３７５）。この細胞の増殖は、不利な影響を与え得る。これは、例えばアテローム硬化、腎性高血圧症、肝性高血圧症、脈管炎、および術後の血管性の管網膜軟化症（ｖａｓｃｕｌａｒ　ｒｅｔｉｎｏｓｉｓ）のような病的な損傷を、細胞自身と共に形成する過剰の蛋白質あるいは他のマトリックス分子が生産されるためである。これらの結果は、血餅を特徴とする損傷に対する急性の応答とは異なっている。

グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）はへキソサミンとアルドウロン酸が交互に連なった共重合体で、硫酸化した形で存在し、プロテオグリカンとして合成される。

これらはムコ多糖と総称される。以下の文章で取り上げられる組成物について、ヘパリンおよびヘパラン硫酸は、ヘキソサミン／アルドウロン酸の繰り返し単位を特徴として分類されるＧＡＧ系列ゐ一員として意味され得る。例えば、コンドロイチン硫酸では、アルドウロン酸は主として、Ｄ−グルクロン酸で、ヘキソサミンは、アセチル化した２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトース（Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｇａ１ＮＡｃ）である。デルマタン硫酸（コンドロイチン硫酸Ｂ）では、アルドウロン酸は主に、Ｌ−イズロン酸で、ヘキソサミンは、Ｇａ　Ｉ　ＮＡｃである。ケラチン硫酸では、アルドウロン酸はＤ−ガラクトースに置き換えられ、へ牛ソサミンは、おもにアセチル化した２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース（Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｇｌ　ｃＮＡｃ）である。本明細書中での重要な組成物であるヘパラン硫酸とヘパリンでは、ヘキソサミンは主に、アセチル化したおよび硫酸化したグル＝ｙす！ン（Ｇ１ｃＮＨ２）であり、アルドウロン酸は、ヘパリンでは主にＬ−イズロン酸であり、ヘパラン硫酸では主にＤ−グルクロン酸である。ヘパラン硫酸は、通常、ヘパリンよりもグルクロン酸を高い割合で含んでいると考えられている。

組織から分離したヘパラン硫酸あるいはヘパリンの調製物の不均一性の問題により、はっきりした区別が困難になっている。以下に説明するように、これらのオリゴ糖類は、生合成の経路に関係しているためである。従来のヘパリン（抗凝固剤として用いられている）は、５−２５ｋｄの分子量を有し、そして従来法により、様々な長の鎖の混合物として抽出される。これらの方法は、ウシおよびブタの肺、腸、あるいは肝臓のような適当な組織の自己分解および抽出、ならびに多糖類以外の構成成分の除去を含む。

抽出物中の鎖の分子量は、組織中で合成されるヘパリンプロテオグリカンの多糖鎖として存在することが知られている６Ｏ−１００ｋｄより有意に少ない。ＧＡＧ部分は、ｘｙｘ−Ｇａ　１−Ｇａ　１−Ｄ−Ｇｌ　ｃＡ−配列の四糖の結合領域とペプチドマトリックスのセリン残基が結合し、次にキシロース残基にＧｌｃＮＡｃとＤ−グルクロン酸とを交互に付加して伸長させることにより合成される。この多糖の側鎖は、以下のことを連続的に行う一連の酵素によって修飾される。すなわち、Ｎ−アセチルグルコサミンの脱アセチル、アセチル基の硫酸基による置き換え、Ｄ−グルクロン酸残基の０５の水酸基のエピマー化（これをＬ−イズロン酸にして、ＧＡＧ鎖をヘパラン型からヘパリン型へ変える）、その結果生じたし一イズロン酸のＯ−２の硫酸化、および次にグルコサミン残基のＯ−６の硫酸化である。更にヘパランあるいはヘパリンのどちらかの段階で、グルコサミン残基のＯ−３が硫酸化される鎖もある。この追加の硫酸化が、抗血栓（抗凝血）活性の活性部位と関連している。他の化学的に可能な硫酸化部位は、Ｌ−イズロン酸あるいはＤ−グルクロン酸の０−３およびＤ−グルクロン酸の０−２であるが、これらはめったに見られない。

明らかに化学的に類似性があるため、分離された「ヘパリン」は、そうでなければヘパラン硫酸として分類される物を、かなりの量で含有し得る。

ヘパリン／ヘパラン硫酸値の脱型台およびその産物の大きさ別の分離に関しては、広範囲な技術がある。特に関連しているのは、２，５−アンヒドロマンノースの還元末端が、還元さし、対応する２、５−アンヒドロマンニトールになった後に構造決定された結果を開示しているＧｕｏ、Ｙ、ら、人ｎａｌ　Ｂｌｏｃｈｅｍ（１９８８）１６８：５４−６２の報告である。

次の四糖は、とくにＧｕｏによって挙げられた。これらの代表的な糖を次の略字を用いて表す：　Ｄ−グルクロン酸＝Ｑ１ｃＡ；Ｌ−イズロン酸＝ＩｄｏＡ；Ｄ −グルコサミン冨ＧＩＣＮＨ２：Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン＝Ｇ１ｃＮＡＣＯＤ−グルコサミンＮ−硫酸塩子ＧＩ　ＣＮＳ：　２’、５−アンヒドロマンノース＝Ｍａｎ（２，５）；２．５−アンヒドロマンニトール＝Ｍａ　ｎＨ（２，５）。０結合硫酸残基の位−置は、「Ｓ」および、硫酸化の位置番号で示されており、そこで５Ｏ３Ｒ残基が酸素と結合している。下記の指示において、αおよびβのアノマー結合は、従来ヘパリンにおいて判っているものであり、上記に示されているｐあるいはＬ配置に関連している。硫酸基の位置は、それを付加した糖の略字の下ＧｌｃＡ　−ＧｌｃＮＡｃ　−ＧｌｃＡ　−ＭａｎＨ（２，５）；ＩｄｏＡ　−ＧｌｃＮＡｃ　−ＧｌｃＡ　−ＭａｎＨ（２，５）；工ｄｏＡ　 −ＧｌｃＮＡｃ　−ＧｌｃＡ　−ＭａｎＨ（２，５）；Ｓ工ｄｏＡ　−ＧｌｃＮＡｃ　−ＧｌｃＡ　−ＭａｎＨ（２，５）；ＧｌｃＡ　− ＧｌｃＮＡｃ　−ＧｌｃＡ　−ＭａｎＨ（２，５）；ＩｄｏＡ　−ＧｌｃＮＡｃ　−ＧｌｃＡ　−ＭａｎＨ（２，５）；６Ｓ　３Ｓ工ｄｏＡ　−ＧｌｃＮＡｃ　−ＧｌｃＡ　−ＭａｎＨ（２，５）；６Ｓ　６５ＩｄｏＡ　−ＲＣ−工ｄｏＡ　−ＭａｎＨ（２，５）；２５　６Ｓ　２５工ｄｏＡ　−ＧｌｃＮＡｃ　−ＧｌｃＡ　−ＭａｎＨ（２，５）；６５　３５　、６５ＩｄｏＡ　−ＲＣ−工ｄｏＡ　−ＭａｎＨ（２，５）６Ｓ　２５　６５（ＲＣは、ＭａｎＨ（２，５）に相似性の環化した形（ｒｉｎｇ　ｃｏｎｔｒａｃｔｅｄ　ｆｏｒｍ）を表している；この形は・生じた中間体のへミアセタールが還元されたときに形成されると考えられている。）平滑筋増殖にヘパリンあるいはヘパラン硫酸あるいは、それらの分解産物が関連していることが、ときどき認識されている。ヘパリンおよびヘパラン硫酸は、本明細書で前述したような損傷に関連する血管の増殖を、遅らせ得るかあるいは抑え得る（Ｃｌ　ｏｗｅ　ｓ、Ａ、Ｗ、ら、Ｎａｔｕｒｅ　（１９７７）２６５：　６２５−６２６）。平滑筋増殖におけるヘパラン硫酸およびヘパリンの影響もまたＭａｒｃｕｍ、Ｊ、Ａ。

ら、　Ｂｉｏｌｏ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｏ　ｌ　ｃａｎ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、１９８フ、ｐｐ３０１−３４３に述べられている。血管平滑筋細胞の成長のヘパリンによる阻害もさらに、Ｃａ５ｔｅｌｌｏｔ、ｊ、Ｊ、Ｊｒ、ら、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ（１９８２）２５７：１１２５６−１１２６０に述べられた。胎児の組織の血管平滑筋細胞の成長に対するヘパリンの影響は、Ｂｅｎ１．ｔｚ、Ｗ、、Ｅ、ら、Ｊ　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈ　５ｉｏｌ　（１９８６）１２７：　１−７に述べられた。血管の周囲細胞および平滑筋細胞の両方の増殖のインヒビターとしてのヘパリンの効果は、Ｏｒｌｌｄｇｅ　Ａ、ら、　１ｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　（１９８６）３上：４１−５３に示された。彼らは、コンドロイチン硫酸およびデルマタン硫酸には、この効果がないことも更に示した。ヘパリンおよびヘパラン硫酸の平滑筋細胞の増殖に及ぼす影響の総説は、Ｂｅｎ１ｔｚ　Ｗ、Ｅ、の“Ｔｈｅ　Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ　Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ：Ｎｏｒｍａｌ　ａｎｄ　Ａｂｎｏｒｍａｌ”　（Ｆ　ｉ　ｓ　ｈｍａｎ、Ａ、Ｐ、　編集ペンシルバニア大学出版、１９８８）に述べられている。

このようなゲルコサミノグリカンが、どの様な機構によつて機能し、あるいは上皮組織成長因子および繊維芽細胞成長因子のような他の成長因子と、どの程度相互作用するのかについては明かではない。少なくとも５つの糖を有するオリゴ糖の３−０の硫酸が、このプロセスにおいて重要なのではないかといわれている（Ｃａｓｔｅｌｌｏｔら、Ｊ　Ｃｅ１ｌＢ１ｏ１　（１９８６）１０２：１９７９ −１９８４）。

現在、平滑筋細胞に関する抗増殖活性の上昇は、ヘパリンアルいはヘパラン硫酸ＧＡＧｓのより小さいオリゴ糖部分と関連しているということが判ってきた。

曳豆旦訛丞本発明は、平滑筋細胞に関して、より優れた特異的な抗増殖活性を有する低分子量のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を提供する。低分子量のＧＡＧに存在するこの活性により、有効な薬学上の組成物としての契機が提供される。この組成物は、天然物からの該組成物の分離により調製され得、あるいはひとたびＧＡＧの正確な構造が判れば、合成され得る。

従って、ある面で本発明は、抗増殖活性を有するヘパリン／ヘパラン硫酸のＧＡＧサブユニットを調製するプロセスに向けられる。そのプロセスは、ヘパリン／ヘパラン硫酸の脱重合化が実質的に完了した物から構成される混合物の構成成分を、大きさ別に分離し、そして四糖の特徴的な分子量に相当する部分を回収することを包含する。本発明はまた、このようにして得られたＧＡＧ組成物に向けられる。

他の面では、本発明は、本発明のＧＡＧ組成物に対して免疫特異性のあるモノクローナル抗体を含む抗体、およびこれらの抗体との反応により、活性ＧＡＧのレベルを測定する方法に向けられる。他の面では、本発明は、平滑筋細胞の増殖を調節するのに有用な、ＧＡＧ調製物あるいはその抗体の治療用の組成物に向けられる。

更に別の面で、本発明は、透析不可能な無機塩の混入物から、低分子量の有機塩を分離する方法に関する。この方法は、無機塩を除くために有機塩をイオン交換カラムに吸着させ、透析可能な塩で溶出することを包含する。

図面の簡単な説明図１は、ヘパラン硫酸およびヘパリンの生合成の工程、ならびにそれらの相互関係を示す。

図２は、脱重合したヘパリン調製物を、バイオゲルＰ２ゲ“ル濾過カラムで分析を行ったときの典型的な溶出パターンを示す。

図３は、本発明の組成物のインビトロアッセイにおける抗増殖活性を示す。

木え豆旦皇立豊工「ヘパリン／ヘパラン硫酸」とは、ヘパリンを抗血液凝固剤として調製していた従来の方法で組織から得るか、あるいはそうでなければ、組織から得られるものに相当するように合成した調製物を意味する。この調製物は、ヘパラン硫酸に特徴的なり一グルクロン酸（ＧＩＣＡ）残基およびヘパリンに特徴的なイズロン酸（ＩｄｏＡ）を含有し得る。前出の背景技術のところで述べた通り、Ｄ−グルクロン酸からＬ−イズロン酸への変換は、ヘパラン型中間体の５位の炭素のエピマー化の結果である。図１は、工程の流れを示しており、図１を参照すれば、この関係が明らかになる。全ての変換がなされていない範囲では、ヘパラン硫酸の特性は、その調製物の中に残る。ヘパリンの調製物のポリマー鎖の正確な性質は、一般的に決定されていないため、そして、調製物によってそれぞれ異なっているため、用語「ヘパリン／ヘパラン硫酸」は、偶然にできてくる混合物の範囲を満たすものとする。

「ヘパリン／ヘパラン硫酸」調製物は、もし所望であれば、ヒトの組織も含めて、様々な哺乳動物の組織から得られる。

一般的に、ブタあるいはウシ由来の物が用いられ、血管の組織が好ましい。ヘパリン／ヘパラン硫酸の源として好ましい出発材料は、ブタの腸の粘膜であり、この組織から調製され、「ヘパリン」と表示されている調製物が市販されている。

一般的に、ヘパリン／ヘパラン硫酸の出発材料は、選択した組織を、自己分解およびアルカリ抽出させた後に蛋白質を凝固させ、次に酸性化により上清からヘパリン−蛋白質複合体を沈澱させて調製する。この複合体は、エタノールあるいはアセトンあるいはそれらの混合物のような非水系極性溶媒で、再度沈澱して回収する。そして、脂質は、エタノールのような有機溶媒による抽出で除去し、蛋白質はトリプシンのような蛋白質分解酵素による処理で除去する。ヘパリン出発材料の調製の適当な手順は、例えば、Ｃｈａｒｌｅｓ、Ａ、Ｆ。

ら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ　（１９３６）３０：１９２７−１９３３に載っている。そして、この基本的な手順の改良法も既に知られており、例えば、Ｃｏ　ｙ　ｎ　ｅ、Ｅ、の、立瓦！工１ｓｔｒ　ａｎｄ　Ｂｌｏｌｏ　ｏｆ　Ｈｅ　ａｒｌｎ　（Ｅｌｓｅｖｌｅｒ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏ　１１　ａｎｄ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、Ｌｕｎｂｌ　ａｄ。

Ｒ，Ｌ、ら、編集（１９８１））に開示されている。

好ましくは、出発材料として用いられるヘパリン／ヘパラン硫酸調製物は、まず、エタノールやアセトンのようなヘパリンが溶解しない溶媒での抽出によって精製する。次に精製した出発材料を、脱重合する。

脱重合には、例えば、亜硝酸、ヘパリンアル、あるいは過ヨウ素酸塩、好ましくは、亜硝酸のような様々な試薬を用い得る。本発明の分解産物は、酸性条件下で、亜硝酸分解を完了したときに得られるものに相当する。代表的な手順では、亜硝酸は、冷酸性溶液中の亜硝酸ナトリウム溶液により、濃度０．０１−０．１Ｍで、その場で調製される。そしてその試薬を、濃度１０−１００　ｍ　ｇ　／　ｍ　１、ｐＨ１−２、好ましくは１．５のヘパリンの処理に用いる。反応は室温で行い、反応が完了した時点で、必要に応じて、適当な試薬を加えることによって中和し得る。部分分解を行っただけの時とは明らかに異なった、独特の構成による構成成分の混合物が完全分解によってできる。

したがって、分解混合物の様々な大きさになった断片の組成物は、分解の性質および程度によることは明かである。分解方法によって、結果として生ずる分裂の型が、分裂するところの結合場所で異なり得る。そして例えばＬ−イズロン酸とグルクロン酸との間の結合、あるいは様々な硫酸化レベルの糖の間の結合の分裂の位置も異なる。したがって、主に回収された四糖混合物は、分裂がヘパリナーゼによるときと亜硝酸によるときとでは、異なる組成物になり、そして部分脱重合化と完全脱重合化では異なる組成物になる。

「完全脱重合」とは、脱重合の程度を意味しており、本願の実施例１に記載の手順によって実施される脱重合工程から生じる脱重合の程度のことである。一方、ヘパリン／ヘパラン硫酸の原材料も使用され得、他の脱重合反応物も使用され得る。但し、この脱重合が、この手順を使用して分解が行われる際に得られる成分を生産し、抗増殖活性が高められた組成物が得られる場合に限られる。

従って、他の脱重合方法は、これらの活性成分を生産する限りにおいて、使用され得る。

脱重合により、サイズに基づいて分離され得る断片の混合物が生産される。ゲル浸透、電気泳動、および薄層クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離法を含む、サイズ分離の様々な技術が可能であって、特に、好ましいのは、約１００から１８００ダルトンの範囲の画分を使用した、セフアゾ・ノクスまたはポリアクリルアミドゲルシステムによるゲル濾過クロマトグラフィーである。特に好ましいゲル浸透樹脂は、バイオゲルＰ２であり、この方法を使用して分離を行って、三糖を含有する断片が、高分子量の四糖、三糖、大域および多糖を含む断片から効果的に分離される。

サイズ分離は、反応混合物を脱塩化前または脱塩化後のいずれかにおいて行われ得る。これまで、サイズ画分前に無機イオンの除去を行うことは不可能であった。なぜなら、これまで得られた透析膜は、脱重合反応において得られた低分子量の三糖および四糖を保有するこができなかったためである。

従って、例えば、酢酸のような揮発性溶剤を用いて吸着材料を溶離することによって、サイズ分離手順それ自身において、塩が除去された。

現在では、無機イオンが、サイズ分離前の透析によって除去され得る、あるいは、塩が、サイズ分離における溶離媒体−とじて使用され得ることが分かった。一部には、この可能性は、塩素イオンのサイズ範囲であるイオンから、四糖または三糖を分離させ得る透析膜が、最近得られたことに起因する。

これらの膜は直接使用され得ない。なぜなら、混入イオンは硫酸イオンであり、これらの膜も硫酸塩を保有しているため、すなわち、これらの膜は、硫酸イオンを四糖から分離させることができないためである。従って、硫酸イオンが反応混合物から除去され得、例えば、塩素イオンに置換され得る場合には、透析は、これらの小さい有機イオンを除去するために使用され得る。

このことは、まず、　ＤＥＡＲのようなアニオン交換樹脂に反応混合物を吸着させることによって成し遂げられる。次いで、塩化ナトリウムのような透析膜を通過し得る低分子量の塩類を用いて洗浄および溶離する。溶離された画分は、改良された膜で透析され得る。従って、薬学上受は入れられる組成物は、塩類除去に有効な手段を用いるとさらに容易に調製される。

主として四糖単位を含有する画分は、平滑筋細胞の増殖阻害に高活性を示す。この特性の証明は、Ｃａ５ｔｅｌｌｏｔ、　Ｊ、Ｊ、　Ｊｒ、ら、Ｊ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ　（１９８６）　里：１９７９−１９８４に記載されているような標準的なアッセイを使用して得られ得る。Ｂｅｎ１ｔｚ、　Ｗ、Ｅ。

ら、Ｊ　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈ　５ｉｏｌ　（１９８６）　１２７：１−７　（前記）のような他のアッセイ方法もまた使用され得る。

このようにして得られ得る本発明の化合物は、次式で表される：ここで、ｎは０−２、ＲはＨまたはカチオン、ＸはＨまたは５Ｏ３Ｒ％Ａｃはアシル（２−５Ｃ）、好ましくはアセチル（Ａｃ”）、および。

は、関与するＣ（炭素５）がＲまたはＳ型のいずれかであり得ることを示す。いずれかの末端糖が欠失している、奇数の糖残基を有する糖構造もまた含まれる。

式（２）の化合物において、還元末端における糖は、脱アミン化されて、示されるように、２．５−アンヒドロマンノースを形成する。この化合物をさらに還元すると、ＣＨＯは、−ＣＨ２０Ｈとなるが、この還元は、脱重合反応自身においては起こらない。

非還元末端糖が４．５−不飽和型である形態、すなわち、もまた含まれる。しかし、これは亜硝酸による分解から生じるものではない。亜硝酸による消化は、Ｎ −硫酸化グルコサミンの開裂に特異的である。従うて、三糖よりも長い鎖の完全な消化産物は、非硫酸化グルコサミンを含有しなければならない。

特に好ましい実施態様において、ｎは１である。Ｒによって示されるカチオンは、ナトリウム、カリウム、カルシウムまたはアンモニウムイオンのような無機カチオン、あるいは四級アミンから得られるような有機カチオンであり得、これらの塩類は、簡単な中和によって形成される。

Ｒが上記のようである、本発明の代表的な化合物を以下に示す。これらの代表例において、以下の略語が使用される。Ｄ−グルクロン酸ａＧ１ｃＡ；Ｌ−イズロン酸ｇｌｄｏＡ；Ｄ−グルコサミン弓ＩＣＮＨ２；Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン＝Ｇ１ｃＮＡｃ：　Ｄ−ゲルコサミント硫酸＝Ｇ１ｃＮＳ；　２，５−アンヒトｏｖンノース＝Ｍａｎ（２，５）　：　２．５−アンヒドロマニトール＝ＭａｎＨ（２，５）。Ｓおよび硫酸化されている位置の番号で示される。その番号の位置の所で５ＯｓＲがＯに結合し　−ている。以下の表示の中には、上記式１に示されるようにであり、αおよびβアノマー結合およびＤまたはＬ型もある。

硫酸塩の位置は、硫酸塩が付いている糖の略語の下に示されてＧｌｃＡ　−ＧｌｃＮＡｃ　−ＧｌｃＡ　−ＧｌｃＮＳ；ＧｌｃＡ　−ＧｌｃＮＡｃ　−ＧｌｃＡ　−’ＧｌｃＮＳ；ＧｌｃＡ　−ＧｌｃＮＡｃ　−ＧｌｃＡ　−ＧｌｃＮＳ；ＧｌｃＡ　−ＧｌｃＮＡｃ　−ＧｌｃＡ　−ＧｌｃＮＳ；ＧｌｃＡ　−ＧｌｃＮＡｃ　−ＧｌｃＡ　−ＧｌｃＮＳ；３Ｓ　、　６５　６５ＧｌｃＡ　−ＧｌｃＮＡｃ　−ＩｄｏＡ　−ＧｌｃＮＳ；６Ｓ　６５ＧｌｃＡ　−ＧｌｃＮＡｃ　−１ｄｏＡ　−ＧｌｃＮＳ；ＧｌｃＡ　−ＧｌｃＮＡｃ　−ＩｄｏＡ　−ＧｌｃＮＳ；６５　２５　３５．６５ＧｌｃＡ　−ＧｌｃＮＡｃ　−工ｄｏＡ　−ＧｌｃＮＳ；ＩｄｏＡ　−ＧｌｃＮａｃ　−ＧｌｃＡ　−ＧｌｃＮＳ；ＩｄｏＡ　−ＧｌｃＮａｃ　、−ＧｌｃＡ　 −ＧｌｃＮＳ；ＩｄｏＡ　−ＧｌｃＮＡｃ　−ＧｌｃＡ　−ＧｌｃＮＳ；２Ｓ　６５　６ＳＩｄｏＡ　−ＧｌｃＮａｃ　−ＧｌｃＡ　−ＧｌｃＮＳ；２５　６Ｓ　３Ｓ、６５ＩｄｏＡ　−ＧｌｃＮａｃ　−ＧｌｃＡ　−ＧｌｃＮＳ；２５　３５．６５ＩｄｏＡ　−ＧｌｃＮａｃ　−ＧｌｃＡ　−ＧｌｃＮＳ；２Ｓ　６５ｍｄｏＡ　−ＧｌｃＮａｃ　−ＩｄｏＡ　−ＧｌｃＮＳ；２Ｓ　６Ｓ　２Ｓ　３Ｓ、６ＳＩｄｏＡ　−ＧｌｃＮＡｃ　−ＩｄｏＡ　−ＧｌｃＮＳ；ＩｄｏＡ　−ＧｌｃＮＡｃ−ＩｄｏＡ　−ＧｌｃＮＳ；ＩｄｏＡ　−ＧｌｃＮＡｃ　−ＩｄｏＡ　−ＧｌｃＮＳ；２５　６５　２Ｓ　６Ｓ工ｄｏＡ　−ＧｌｃＮＡｃ　−工ｄＯＡ　−ＧｌｃＮＳ；ＩｄｏＡ　−ＧｌｃＮＡｃ　−ＩｄｏＡ　−ＧｌｃＮＳ；２Ｓ　６５　２５工ｄｏＡ　−ＧｌｃＮａｃ　−ｍｄｏＡ　−ＧｌｃＮＳ；２５　２５　６ＳＩｄｏＡ　−ＧｌｃＮＡｃ　−ＩｄｏＡ　−ＧｌｃＮＳ；６５　３５　、６ＳＩｄｏＡ　−ＧｌｃＮＡｃ　−１ｄｏＡ　−ＧｌｃＮＳ；３５．６５　２５　６５工ｄｏＡ　−ＧｌｃＮＡｃ　−ＩｄｏＡ　−Ｍａｎ（２，５）；２Ｓ　６５　２Ｓ　６５ＩｄｏＡ　−ＧｌｃＮＡｃ　−１ｄｏＡ　−Ｍａｎ（２，５）；工ｄｏＡ　−ＧｌｃＮＡｃ　−ＩｄｏＡ　−Ｍａｎ（２，５）；ＩｄｏＡ　−ＧｌｃＮＡｃ　− ＧｌｃＡ　−Ｍａｎ（２，５）；２Ｓ　６Ｓ　６５工ｄｏＡ　−ＧｌｃＮＡｃ　−ｒｄｏＡ　−Ｍａｎ（２，５）。

３Ｓ、６５　２Ｓ　６Ｓこれらの代表的な化合物の様々な他のレベルの硫酸化もまた含まれる。さらに、三糖、三糖、三糖および大域の、これらの構造の変形されたものも本発明に含まれる。

仄碧Ａ」ｌ翌主として四糖単位断片を含む分離組成物は、組成物の成分と免疫反応する抗体の生産を刺激するのに使用され得る。ウサギ、ラット、マウスおよびヒツジ等の様々な哺乳類中の四糖組成物を主として使用する標準免疫方法によると、組成物成分と免疫反応する血清が得られる。組成物は、免疫原性を高めるために、適当な血清アルブミンまたはキーホールリンベットヘモシアニンのような適切な、抗原的に中性の牛ヤリャーとうまく結合される。さらに、免疫化された哺乳類の抗体分泌細胞は、モノクローナル抗体のパネルを生産スルように永久増殖化され得る。次いでこのパネルは、組成物と反応するものについてスクリーニングされる。

ヘパリン多糖に対するモノクローナル抗体の調製方法は、本願で参考のために取り入れたＰｅｊｌｅｒ、　Ｇ、ら、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｌｌｌ（１９８ｇ）　２６３：５１９７−５２０１によって説明される。

得られたポリクローナルまたはモノクローナル抗体調製物は、下記のように、生物サンプルにおける活性な抗増殖成分のレベルのアッセイおよび平滑筋細胞の増殖の過度の退化を防止するための受動療法において有用である。

１旦１旦豆皿主として四糖断片を含有する、本発明のオリゴ糖組成物は、過度のおよび破壊的な平滑筋細胞増殖によって特徴づけられる疾病治療のための投与に有用である。

これらの疾病は、しばしば、手術患者の場合のように、被検体が外傷にさらされる際に発生する。創傷または手術によって生じる外傷は、血−管損傷および二次的な平滑筋細胞増殖を引き起こし、この二次的な増殖は、血管性の網膜軟化症を引き起こす。この望ましくない結果は、血管移植片、心臓移植、バルーンまたはレーザー血管形成、動脈外傷、筋肉動脈の手術後の回復、動脈カテーテルの長期に渡る体内膨張、侵入動脈分析手法、腎臓、肺または肝臓移植、冠状動脈バイパス手術、頚動脈バイパス手術、大腿膝のひかがみバイパス手術、および頭蓋内の動脈バイパス手術後に発生し得る。

外傷の結果発生する二次的な平滑筋細胞増殖に加えて、特定の疾病が望ましくない血管増殖と関連している。但し、これらの場合にも、いくつかの未知の向傷が二次的な結果を引き起こしていると思われる。これらの疾病状態は、゛グツドパスチャーシンドローム（Ｇｏｏｄｐａｓｔｕｒｅ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、急性糸球体腎炎、新生児肺動脈性高血圧、喘息、充血性心臓疾患、成゛　人肺動脈性高血圧、および腎臓血管性高血圧を含む。

これらの疾病治療には、適当量の本発明の組成物の投与が有用である。投与は、多糖組成物に適切な、通常の経路によるものであり、通常注射などによる組織投与を含む。特に好ましいのは静脈注射である。長時間に渡って連続的注射が容易に行われ得るためである。通常の投与範囲は、５日から１５日、好ましくは７日から１０日に渡って連続して、０．１から１０　Ｂ／ｋｇ／ｈｒの範囲内である。特に好ましい投与量は、約０．５　ａ＋ｇ／ｋｇ／ｈｒあるいは体重７０　ｋｇの成人では、３５　ｍｇ／ｈｒまたは８４０　ｍｇ／ｄａｙである。

投与の他の形態は、あまり好ましくないが、より好都合である場合もある。静脈注射よりも少ない投与量の皮下注射、または静脈注射よりもわずかに多い投与量の経口投与、あるいは局部的創傷のための膜内外または経皮またはその他の局所投与もまた有効であり得る。血管移植片材料中に含まれる、支持マトリックス（ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ　ｍａｔｒｉｘ）のような連続放出装置による局部投与は、外傷部への接近が可能である場合には、特に有用である。

上記の投与形態に適切な処方は、当該技術分野に知られており、適切な処方の要約は、■紅旺組吐り肚肛Ｕ組肛Ｒ■」ｃｆｅｎｃｅｓ、　Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｅａｓｔｏｎ、　ＰＡ、最新版において見いだされる。

本発明の組成物はまた、放射標識、蛍光標識、発色団または酵素のような代表的な方法を使用して標識され得、生物サンプルにおける抗増殖成分の量を競合アッセイするのに使用され得る。生物サンプルにおける分析物を競合アッセイするのに適切な方法は、当該技術分野において既知であり、一般に、標識された競合物との混合物中で、代表的には、イムノグロブリンまたはその断片のような分析物と反応する特異的な検出パートナ−を用いてサンプル処理することを含む。本発明によって調製された抗体は、この目的に有用である。分析物および競合物の抗体との結合は、結合複合体を除去し、複合体または上澄み液の標識をアッセイすることによりて測定され得る。分離は、特異的結合パートナ−を予め固体支持体に結合させることによってさらに容易に行うことができる。

このような方法は、当該技術分野において既知であり、このような競合アッセイのために得られる方法は、非常にたくさんあり、また既知であるため、本願ではその詳細を省く。

本発明の抗体は、サンプル中の標識組成物と分析物の抗増殖因子の間の競合を伴う上記のタイプの免疫アッセイ、ならびに因子の直接免疫アッセイにおいて有用である。直接アッセイを伴うその他の方法もまた、様々であってよく知られている。代表的には、抗体に結合する分析物は、標識を有する付加的な反応パートナ −による方法または他の検出方法によって検出される。従って、例えば、通常のサンドイッチアッセイにおいて、本発明の抗体の分析物に対する結０合は、これらの同一抗体の標識調製物との反応、または異なる種の調製物との標識抗体免疫反応によって検出され得る。

本発明の抗体はまた、薬剤組成物を形成することが可能で、この結果が所望される被検体において、平滑筋細胞の増殖を刺激するのに使用され得る。

以下の実施例は、本発明を例示することを目的としており、本発明を限定するものではない。

市販のブタの腸粘膜ヘパリンを、約２７０　Ｂ／ｕ＋１になるようにｌ　Ｍ　ＮａＣ１中で溶解し、３倍容量の９５％エタノールを加えることによって沈澱させた。沈澱したヘパリンを、３，０００　ｇで遠心分離にかけ、さらにもう２回分の沈澱物についても説明されるように、ベレットを回収し、再溶解および再沈澱させた。最終的に得られたヘパリンベレットを凍結乾燥させた。

亜硝酸反応物を調製するために、亜硝酸ナトリウムを、水冷した０、２４Ｍクエン酸中で溶解し、０．０６　Ｍ　Ｎ０ａ−溶液を得た。

５部の亜硝酸試薬を、１部の３００　Ｂ／ｍｌヘパリン溶液に加えた。

調製物を、室温になるまで放置し、Ｉ　Ｍ　Ｈ２ＳＯ４で滴定しｐａ　１゜５ニＬ、３０’Ｃで１時間反応させた。スルファミン酸アンモニウムを０．５Ｍになるように加えて反応を停止した。

得られた脱重合化ヘパリンを、１５％Ｖ／Ｖ酢酸が充填された２゜５　ｘ　９７　ａｍバイオゲルＰ２ゲル濾適用カラムにかけた。１５％Ｖ／Ｖ酢酸による溶離を続け、画分を収集した。各画分におけるウロン酸の濃度は、Ｂｉｔｔｅｒ、　Ｔ、ら、Ａｎａｌ　Ｂｆｏｃｈｅｍ　（１９６２）　４：３３０のカルバゾールアッセイによって決定した。

代表的な溶離特性を図２に示す。３２０　ｍｌ付近の（Ｖ・／ｖｏ＝０．６７）ピークの溶離画分は、主として四糖を含む。

主として四糖を含む混合物を含有する画分を凍結乾燥させて保存する。

Ｋ亘五主 −に・　るテストされる溶液を、１０％の胎児ウシ血清およびペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地である、「完全培地」中で調製した。

ウシ平滑筋細胞（ＳＭＣ）を、Ｂｅｎ１ｔｚ、　Ｗ、Ｅ、ら、Ｊ　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈ　５ｉｏ１　（１９８６）　１２７：１−７によってウシ肺動脈から単離した。継代３−１０のＳＭＣを、上記培地中の９６ウエルミクロタイタープレート中にｌウェル当り３５０から７００細胞を入れて、２から４時間付着させた。完全培地を、０．１％の胎児ウシ血清が供給されたＤＭＥＭで置き換え、細胞をさらに７２時間インキ二ベートして、細胞増殖を停止した。低血清培地を、テストサンプルを含む完全培地に置き換えた。

細胞を、Ｂｒａｎｄｌｅｙ、　Ｂ、ら、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｗ　（１９８７）　２６２：６４３１に記載されるように、一定の間隔でサンプルした複製プレートを使用して最高７日間増殖させた。細胞数は、培地を除去し、リン酸緩衝化生理食塩水で細胞を洗浄し、溶菌緩衝液を加えて、７５から１５０　ｕｌの乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性をアッセイすることによって決定した。

このようなアッセイのうちの１つのアッセイの結果を、図′　３に示す。棒線＃ｌおよび＃５は対照物である。棒線＃ｌは、ＧＡＧを含まない。棒線＃５は、１５０　ｕｇ／ｍｌのコンドロイチン硫酸のテスト溶液を示す。棒線＃４は、１５０　ｕｇ／＋１の市販ヘパリンを含む。

棒線＃２および＃３は、本発明の組成物を５０　ｕｇ／＋ｏｌ含む。本発明の組成物が、増殖阻害する能力は、市販のヘパリンよりも優れている。

６０　ｕｇ／ｍｌの温度で、実施例１において調製されたような本発明の組成物は、対照物と比較してＳＭＣの増殖を９０％阻害し、６．６　ｕｇ／ｍｌで、１５０　ｕｇ／ａ＋１ヘパリンを使用して得られる増殖阻害と同等のレベル、すなわちＳＭＣの増殖を５０％阻害する。

本発明の組成物のもう１つの調製物は、１ｏから１００　ｕｇ／ｍｌの濃度でＳＭＣ増殖を５０％阻害した。

ＨＯＮＯＢａ（ＮＯ２）２　ヘパ’）　ン％ゝ１ｉｌｑｚｌｒＨＯＮＯＮａＮＯ２へＩＪシン’ｉ’ａｐｎＦＩＧ、２−２国際調査報告ｌＲｍＲＡ＋＃醪＾ｅ酔ｃ」−會＋６ｆ１ｓａ、ｐ嘴ｉ／Ｕ！ヨ３９１０５’ｉ ’ｉＱむ１噸＃ｆ＾−−嘗−ピーＩＩａ−＾ｎｅ＋普＋、’ｕｎｅｎＮｔ１．ＰＣＴ／に１３８９１０５５５９

Claims

【特許請求の範囲】

１．平滑筋細胞の増殖を防止または抑制するのに有用なグリコサミノグリコシド（ＧＡＧ）を調製する方法であって、哺乳類のヘパリン／へパラン硫酸の亜硝酸による完全脱重合により得られる混合物を、分子サイズに従って断片に分離する工程、および四糖単位である断片が主として含有される、混合物のサイズ画分を回収すること、を包含する方法。
２．請求項１に記載の方法であって、バイオゲルＰ２を含むカラムを用い、そして１５％Ｖ／Ｖの酢酸で溶出することによるゲル濾過により、前記断片が分離される、方法。
３．請求項１に記載の方法により調製されるＧＡＧ組成物。
４．請求項３に記載のオリゴ糖と特異的に免疫反応性を有し、哺乳動物を前記組成物により免疫することを包含するプロセスにより調製される、抗体。
５．亜硝酸分解により完全に脱重合させたヘパリンから単離され得る化合物であって、平滑筋細胞の増殖を防止または抑制し得る、六糖、五糖、四糖、三糖または二糖、またはそれらの塩である、化合物。
６．請求項５に記載の化合物であって、次式（１）を有する化合物、または還元または非還元末端の糖が除去されている式（１）の化合物： ▲数式、化学式、表等があります▼（１）ここでｎは０−２、ＲはＨまたはカオチン、ＸはＨまたはＳＯ３Ｒ、そして、Ａｃはアシル（２−５Ｃ）であり、そして＊はそれがついているＣ（５位の炭素）がＲまたはＳ配置であり得ることを示す。
７．ｎが１である請求項６に記載の化合物。
８．請求項５に記載の化合物であって、次式（２）を有する化合物、または還元または非還元末端の糖が除去されている式（２）の化合物： ▲数式、化学式、表等があります▼（２）ここでｎはＯ−２、ＲはＨまたはカオチン、ＸはＨまたはＳＯ３Ｒ、そして、Ａｃはアシル（２−５Ｃ）であり、そして＊はそれがついているＣ（５位の炭素）がＲまたはＳ配置であり得ることを示す。
９．ｎが１である請求項８に記載の化合物。
１０．平滑筋細胞の望まない増殖により特徴づけられる状態を処置するのに有用な薬剤組成物であって、請求項３または５から９の効果的な量の化合物を、少なくとも１種の薬学的に受容され得る賦形剤と混合して含有する、組成物。
１１．哺乳動物被検体において抗増殖性ＧＡＧが不足していることあるいは過剰であることを診断する方法であって、該被検体由来の生物学的試料の、請求項３または５から９の標識された化合物との免疫反応において、競合するＧＡＧのレベルを評価すること、を包含する方法。
１２．請求項３または５から９に記載の化合物と特異的に免疫反応性を有し、哺乳動物を前記化合物により免疫することを包含するプロセスにより調製される、抗体。
１３．生物学的試料の抗増殖性ファクターのレベルを定量する方法であって、該試料を請求項４または１２の抗体で処理すること、および該試料が結合した抗体の量を検出すること、を包含する方法。
１４．透析膜により保持される無機イオンから有機イオンを分離する方法であって、該無機イオンが吸着しない条件下において、有機イオンをイオン交換樹脂に吸着させる工程；有機溶媒、または透析膜により保持されないイオンを含む塩を用いて、該樹脂から有機イオンを溶出させ、溶出画分を得る工程；および該有機イオンを含む溶出面分を透析にかける工程；を包含する方法。
１５．請求項１４に記載の方法であって、前記有機イオンが硫酸塩であり、そして前記有機イオンが硫酸化された糖である、方法。