JPH11166001A - 過硫酸化コンドロイチン硫酸、その製造方法及びそれを有効成分として含有する抗血液凝固剤 - Google Patents
過硫酸化コンドロイチン硫酸、その製造方法及びそれを有効成分として含有する抗血液凝固剤Info
- Publication number
- JPH11166001A JPH11166001A JP9347071A JP34707197A JPH11166001A JP H11166001 A JPH11166001 A JP H11166001A JP 9347071 A JP9347071 A JP 9347071A JP 34707197 A JP34707197 A JP 34707197A JP H11166001 A JPH11166001 A JP H11166001A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- chondroitin sulfate
- persulfated
- sulfate
- sulfuric acid
- sulfur trioxide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0069—Chondroitin-4-sulfate, i.e. chondroitin sulfate A; Dermatan sulfate, i.e. chondroitin sulfate B or beta-heparin; Chondroitin-6-sulfate, i.e. chondroitin sulfate C; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 高い抗血液凝固活性を有する、ヘパリンとは
異なる新規な化合物を提供すること。 【解決手段】 二糖繰返し単位中にＯ−硫酸基を平均
３．５個以上有する過硫酸化コンドロイチン硫酸又は薬
理学的に許容できるその塩を提供した。
異なる新規な化合物を提供すること。 【解決手段】 二糖繰返し単位中にＯ−硫酸基を平均
３．５個以上有する過硫酸化コンドロイチン硫酸又は薬
理学的に許容できるその塩を提供した。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、過硫酸化コンドロ
イチン硫酸、その製造方法及びそれを有効成分として含
有する抗血液凝固剤に関する。
イチン硫酸、その製造方法及びそれを有効成分として含
有する抗血液凝固剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヘパリンは、臨床の現場で術前、術後の
血栓症予防薬として広く用いられている医薬品である。
しかしながら、出血傾向や血小板減少など重篤な副作用
がヘパリンの長期使用にみられ、現在これに代わる医薬
品の開発が急務である。最近種々の天然多糖およびその
化学的誘導体の抗血液凝固活性が調べられ、医薬品とし
ての可能性が探索されている。
血栓症予防薬として広く用いられている医薬品である。
しかしながら、出血傾向や血小板減少など重篤な副作用
がヘパリンの長期使用にみられ、現在これに代わる医薬
品の開発が急務である。最近種々の天然多糖およびその
化学的誘導体の抗血液凝固活性が調べられ、医薬品とし
ての可能性が探索されている。
【０００３】一方、コンドロイチン硫酸はグリコサミノ
グリカンといわれる複合糖質の一種で、N-アセチルガラ
クトサミンとグルクロン酸が→3GalNAc β1 →4GlcA β
1 →の繰り返し単位を構成する直鎖の酸性多糖である。
平均的に二糖当たり１個の硫酸エステルを有し、普通N-
アセチルガラクトサミンの４位、あるいは６位の水酸基
が硫酸化されている。この多糖は通常プロテオグリカン
としてタンパク質中のセリンあるいはトレオニン残基に
橋渡し構造（GlcA-Gal-Gal-Xyl-Ser/Thr) を介して結合
したプロテオグリカンとして見出される。細胞外マトリ
ックス、あるいは細胞表面に存在し、細胞間情報伝達を
担う分子の一つと想定されている。生体内でコンドロイ
チン硫酸は止血機構の一部を担っているものと考えられ
ているが、ヘパリンなどに比べて抗凝固活性が弱いため
に医薬品として用いられる機会は少ない。
グリカンといわれる複合糖質の一種で、N-アセチルガラ
クトサミンとグルクロン酸が→3GalNAc β1 →4GlcA β
1 →の繰り返し単位を構成する直鎖の酸性多糖である。
平均的に二糖当たり１個の硫酸エステルを有し、普通N-
アセチルガラクトサミンの４位、あるいは６位の水酸基
が硫酸化されている。この多糖は通常プロテオグリカン
としてタンパク質中のセリンあるいはトレオニン残基に
橋渡し構造（GlcA-Gal-Gal-Xyl-Ser/Thr) を介して結合
したプロテオグリカンとして見出される。細胞外マトリ
ックス、あるいは細胞表面に存在し、細胞間情報伝達を
担う分子の一つと想定されている。生体内でコンドロイ
チン硫酸は止血機構の一部を担っているものと考えられ
ているが、ヘパリンなどに比べて抗凝固活性が弱いため
に医薬品として用いられる機会は少ない。
【０００４】二糖単位当たり２ないし３個の硫酸エステ
ルをもつコンドロイチン硫酸が、抗血液凝固活性を示す
ことは既に報告されている（Bourin, M. et al., J. Bi
ol.Chem., 265, 15424-5431 (1990) ）。化学的に硫酸
化されたこれらの過硫酸化コンドロイチン硫酸は、ヘパ
リンに含まれるイズロン酸とは構造的にも、コンホメー
ションも異なるグルクロン酸残基を有していることも事
実である（Qiu, G., et al., Biol. Pharm. Bull., 10
2, 721-726 (1997); Casu, B. Semin. Thromb.Haemos
t., 17S, 9-14 (1991)。
ルをもつコンドロイチン硫酸が、抗血液凝固活性を示す
ことは既に報告されている（Bourin, M. et al., J. Bi
ol.Chem., 265, 15424-5431 (1990) ）。化学的に硫酸
化されたこれらの過硫酸化コンドロイチン硫酸は、ヘパ
リンに含まれるイズロン酸とは構造的にも、コンホメー
ションも異なるグルクロン酸残基を有していることも事
実である（Qiu, G., et al., Biol. Pharm. Bull., 10
2, 721-726 (1997); Casu, B. Semin. Thromb.Haemos
t., 17S, 9-14 (1991)。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
過硫酸化コンドロイチン硫酸でも、抗血液凝固活性がヘ
パリンに比べて不十分である。
過硫酸化コンドロイチン硫酸でも、抗血液凝固活性がヘ
パリンに比べて不十分である。
【０００６】従って、本発明の目的は、高い抗血液凝固
活性を有する、ヘパリンとは異なる新規な化合物及びそ
の製造方法を提供することである。
活性を有する、ヘパリンとは異なる新規な化合物及びそ
の製造方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本願発明者は、鋭意研究
の結果、従来の過硫酸化コンドロイチン硫酸よりも繰返
し単位当りの硫酸基の数が多いコンドロイチン硫酸の製
造方法を新に開発することにより、このような過硫酸化
コンドロイチン硫酸を初めて提供し、かつ、該過硫酸化
コンドロイチン硫酸がヘパリンと比較しても遜色のな
い、高い抗血液凝固活性を有していることを見出し、本
発明を完成した。
の結果、従来の過硫酸化コンドロイチン硫酸よりも繰返
し単位当りの硫酸基の数が多いコンドロイチン硫酸の製
造方法を新に開発することにより、このような過硫酸化
コンドロイチン硫酸を初めて提供し、かつ、該過硫酸化
コンドロイチン硫酸がヘパリンと比較しても遜色のな
い、高い抗血液凝固活性を有していることを見出し、本
発明を完成した。
【０００８】すなわち、本発明は、二糖繰返し単位中に
Ｏ−硫酸基を平均３．５個以上有する過硫酸化コンドロ
イチン硫酸又は薬理学的に許容できるその塩を提供す
る。また、本発明は、コンドロイチン硫酸の塩と三酸化
硫黄を非プロトン性溶媒中で、３０℃〜５０℃の温度下
で、コンドロイチン硫酸塩中の遊離水酸基と三酸化硫黄
とのモル比を１：１０ないし１：２０として反応させ
る、過硫酸化コンドロイチン硫酸の製造方法を提供す
る。さらに、本発明は、上記本発明の過硫酸化コンドロ
イチン硫酸を有効成分として含有する抗血液凝固剤を提
供する。
Ｏ−硫酸基を平均３．５個以上有する過硫酸化コンドロ
イチン硫酸又は薬理学的に許容できるその塩を提供す
る。また、本発明は、コンドロイチン硫酸の塩と三酸化
硫黄を非プロトン性溶媒中で、３０℃〜５０℃の温度下
で、コンドロイチン硫酸塩中の遊離水酸基と三酸化硫黄
とのモル比を１：１０ないし１：２０として反応させ
る、過硫酸化コンドロイチン硫酸の製造方法を提供す
る。さらに、本発明は、上記本発明の過硫酸化コンドロ
イチン硫酸を有効成分として含有する抗血液凝固剤を提
供する。
【０００９】
【発明の実施の形態】上述のように、コンドロイチン硫
酸はN-アセチルガラクトサミンとグルクロン酸が→3Gal
NAc β1 →4GlcA β1 →の繰り返し単位を構成する直鎖
の酸性多糖であり、この二糖繰返し単位中に硫酸化可能
な水酸基が４個存在する。生体中に見出されるコンドロ
イチン硫酸では、これら４個の水酸基のうちの平均１個
の水酸基が硫酸エステルとなっている。本発明のコンド
ロイチン硫酸は、二糖繰返し単位中の４個の水酸基のう
ち、平均して３．５個以上、好ましくは３．８個以上、
最も好ましくは４個の水酸基が硫酸エステルとなってい
る。二糖繰返し単位中の硫酸基の数が平均して３．５個
以上、好ましくは３．８個以上、最も好ましくは４個で
あることにより、従来の過硫酸化コンドロイチン硫酸よ
りも顕著に抗血液凝固活性が高くなる。
酸はN-アセチルガラクトサミンとグルクロン酸が→3Gal
NAc β1 →4GlcA β1 →の繰り返し単位を構成する直鎖
の酸性多糖であり、この二糖繰返し単位中に硫酸化可能
な水酸基が４個存在する。生体中に見出されるコンドロ
イチン硫酸では、これら４個の水酸基のうちの平均１個
の水酸基が硫酸エステルとなっている。本発明のコンド
ロイチン硫酸は、二糖繰返し単位中の４個の水酸基のう
ち、平均して３．５個以上、好ましくは３．８個以上、
最も好ましくは４個の水酸基が硫酸エステルとなってい
る。二糖繰返し単位中の硫酸基の数が平均して３．５個
以上、好ましくは３．８個以上、最も好ましくは４個で
あることにより、従来の過硫酸化コンドロイチン硫酸よ
りも顕著に抗血液凝固活性が高くなる。
【００１０】二糖繰返し単位中の４個の水酸基が全て硫
酸エステルとなっている、最も好ましい本発明の過硫酸
化コンドロイチン硫酸は下記式[I] で示される。
酸エステルとなっている、最も好ましい本発明の過硫酸
化コンドロイチン硫酸は下記式[I] で示される。
【００１１】
【化１】
【００１２】二糖繰返し単位の繰返し数（式[I] 中の
ｎ）は、特に限定されないが、１０〜５０程度が好まし
く、さらに好ましくは２０〜３０である。
ｎ）は、特に限定されないが、１０〜５０程度が好まし
く、さらに好ましくは２０〜３０である。
【００１３】本発明の過硫酸化コンドロイチン硫酸は、
薬理学的に許容できる塩の形態にあってもよい。このよ
うな塩として、ナトリウム塩やカリウム塩のようなアル
カリ金属塩、カルシウム塩、アルミニウム塩等を挙げる
ことができるがこれらに限定されるものではない。
薬理学的に許容できる塩の形態にあってもよい。このよ
うな塩として、ナトリウム塩やカリウム塩のようなアル
カリ金属塩、カルシウム塩、アルミニウム塩等を挙げる
ことができるがこれらに限定されるものではない。
【００１４】本発明の過硫酸化コンドロイチン硫酸は、
コンドロイチン硫酸の塩と三酸化硫黄を非プロトン性溶
媒中で、３０℃〜５０℃の温度下で、コンドロイチン硫
酸塩中の遊離水酸基と三酸化硫黄とのモル比を１：１０
ないし１：２０として反応させることにより製造するこ
とができる。
コンドロイチン硫酸の塩と三酸化硫黄を非プロトン性溶
媒中で、３０℃〜５０℃の温度下で、コンドロイチン硫
酸塩中の遊離水酸基と三酸化硫黄とのモル比を１：１０
ないし１：２０として反応させることにより製造するこ
とができる。
【００１５】出発原料となるコンドロイチン硫酸塩とし
ては、有機アミン塩が好ましく、特にトリアルキル（特
に炭素数１〜６の低級アルキル）アミン塩、とりわけ、
トリブチルアミン塩が好ましい。コンドロイチン硫酸の
有機アミン塩は、例えば、ウシの軟骨等から調製された
コンドロイチン硫酸ナトリウム塩（市販品を使用可）
を、陽イオン交換樹脂にかけた後、有機アミンを加え、
凍結乾燥により濃縮することにより容易に調製すること
ができる。ここで用いることができる陽イオン交換樹脂
は何ら限定されるものではなく、例えば市販品であるDo
wex 50W X8（ダウ・ケミカル社製）やSP Sepharose HP
（ファルマシア社製）等を用いることができる。また、
陽イオン交換後のコンドロイチン硫酸に加えられる有機
アミンの量は、コンドロイチン硫酸に含まれる酸性基
（カルボキシル基又は硫酸基）１モルに対して１〜１．
２モル程度が好ましい。
ては、有機アミン塩が好ましく、特にトリアルキル（特
に炭素数１〜６の低級アルキル）アミン塩、とりわけ、
トリブチルアミン塩が好ましい。コンドロイチン硫酸の
有機アミン塩は、例えば、ウシの軟骨等から調製された
コンドロイチン硫酸ナトリウム塩（市販品を使用可）
を、陽イオン交換樹脂にかけた後、有機アミンを加え、
凍結乾燥により濃縮することにより容易に調製すること
ができる。ここで用いることができる陽イオン交換樹脂
は何ら限定されるものではなく、例えば市販品であるDo
wex 50W X8（ダウ・ケミカル社製）やSP Sepharose HP
（ファルマシア社製）等を用いることができる。また、
陽イオン交換後のコンドロイチン硫酸に加えられる有機
アミンの量は、コンドロイチン硫酸に含まれる酸性基
（カルボキシル基又は硫酸基）１モルに対して１〜１．
２モル程度が好ましい。
【００１６】次いで、得られたコンドロイチン硫酸の塩
と三酸化硫黄を非プロトン性溶媒中で、３０℃〜５０℃
の温度下で、コンドロイチン硫酸塩中の遊離水酸基と三
酸化硫黄とのモル比を１：１０ないし１：２０として反
応させる。ここで、好ましい非プロトン性溶媒として
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド
等を挙げることができるがこれらに限定されるものでは
ない。反応温度は、３０〜５０℃であり、好ましくは、
３７〜４３℃であり、最も好ましくは約４０℃である。
コンドロイチン硫酸塩中の遊離水酸基と三酸化硫黄との
モル比は１：１０ないし１：２０であり、好ましくは
１：１３ないし１：１７であり、最も好ましくは約１：
１５である。反応時間は約３０分以上、好ましくは３０
分〜２時間、さらに好ましくは４５〜９０分間である。
と三酸化硫黄を非プロトン性溶媒中で、３０℃〜５０℃
の温度下で、コンドロイチン硫酸塩中の遊離水酸基と三
酸化硫黄とのモル比を１：１０ないし１：２０として反
応させる。ここで、好ましい非プロトン性溶媒として
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド
等を挙げることができるがこれらに限定されるものでは
ない。反応温度は、３０〜５０℃であり、好ましくは、
３７〜４３℃であり、最も好ましくは約４０℃である。
コンドロイチン硫酸塩中の遊離水酸基と三酸化硫黄との
モル比は１：１０ないし１：２０であり、好ましくは
１：１３ないし１：１７であり、最も好ましくは約１：
１５である。反応時間は約３０分以上、好ましくは３０
分〜２時間、さらに好ましくは４５〜９０分間である。
【００１７】なお、三酸化硫黄は、これ単独でコンドロ
イチン硫酸塩と反応させてもよいが、予めピリジンのよ
うな環状アミンと三酸化硫黄とを反応させて複合体を形
成し、これをコンドロイチン硫酸塩と反応させてもよ
い。この場合の環状アミンと三酸化硫黄との反応条件
は、例えば次の通りである。すなわち、発煙硫酸を蒸留
し、流出するＳＯ3 ガスを冷却する。アスベスト状を呈
したＳＯ3 に対し、冷却下、環状アミンを滴下し、液状
になった後、常温に戻し、もはや発煙を観察しなくなる
まで滴下を続ける。
イチン硫酸塩と反応させてもよいが、予めピリジンのよ
うな環状アミンと三酸化硫黄とを反応させて複合体を形
成し、これをコンドロイチン硫酸塩と反応させてもよ
い。この場合の環状アミンと三酸化硫黄との反応条件
は、例えば次の通りである。すなわち、発煙硫酸を蒸留
し、流出するＳＯ3 ガスを冷却する。アスベスト状を呈
したＳＯ3 に対し、冷却下、環状アミンを滴下し、液状
になった後、常温に戻し、もはや発煙を観察しなくなる
まで滴下を続ける。
【００１８】上記方法により、本発明の過硫酸化コンド
ロイチン硫酸が生成する。反応は蒸留水を加えることに
より停止させることができる。また、得られた粗生成物
は、酢酸ナトリウムで飽和した冷エタノールで沈殿さ
せ、遠心分離により回収することができる。さらに、回
収された生成物を蒸留水に溶かし、水に対して透析後、
凍結乾燥することにより精製することができる。
ロイチン硫酸が生成する。反応は蒸留水を加えることに
より停止させることができる。また、得られた粗生成物
は、酢酸ナトリウムで飽和した冷エタノールで沈殿さ
せ、遠心分離により回収することができる。さらに、回
収された生成物を蒸留水に溶かし、水に対して透析後、
凍結乾燥することにより精製することができる。
【００１９】本発明の過硫酸化コンドロイチン硫酸は、
抗血液凝固剤としてヘパリンと同様に用いることができ
る。用量は、症状や使用態様に応じて適宜選択される
が、例えば、血液体外循環時における灌流血液の凝固防
止に用いる場合、ヘパリン国際単位として１０００〜３
０００単位を前投与し、開始後１時間あたり５００〜１
５００単位を間欠的に投与することができる。適用の際
の組成としては例えば、生理食塩液又は注射用蒸留水を
加えて１ｍｌ当り１０００単位となるように用時溶解し
て用いることができる。
抗血液凝固剤としてヘパリンと同様に用いることができ
る。用量は、症状や使用態様に応じて適宜選択される
が、例えば、血液体外循環時における灌流血液の凝固防
止に用いる場合、ヘパリン国際単位として１０００〜３
０００単位を前投与し、開始後１時間あたり５００〜１
５００単位を間欠的に投与することができる。適用の際
の組成としては例えば、生理食塩液又は注射用蒸留水を
加えて１ｍｌ当り１０００単位となるように用時溶解し
て用いることができる。
【００２０】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
【００２１】実施例１ 過硫酸化コンドロイチン硫酸の
製造 ウシ気管軟骨由来のコンドロイチン硫酸ナトリウム塩10
0 mgを陽イオン交換樹脂（Dowex 50W X8）にかけた。こ
の際、カラムサイズ１ｃｍ（内径）×１５ｃｍ（長さ）
のカラムを用い、流速１．０ｍｌ／分、水で溶離した。
次いでトリブチルアミン１００μｌを加え、凍結乾燥に
より濃縮してコンドロイチン硫酸トリブチルアミン塩を
得た。得られたコンドロイチン硫酸トリブチルアミン塩
１０ｍｇを０．８ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
（ＤＭＦ）に溶解した。一方、発煙硫酸を蒸留し、流出
するＳＯ3 ガスを冷却し、アスベスト状を呈したＳＯ3
に対し、冷却下、環状アミンを滴下し、液状になった
後、常温に戻し、もはや発煙を観察しなくなるまで滴下
を続けることにより得られたピリジン・三酸化硫黄複合
体を、上記コンドロイチン硫酸トリブチルアミン塩ＤＭ
Ｆ溶液に、三酸化硫黄がコンドロイチン硫酸の遊離水酸
基の１５倍モルとなる量加えた。40℃で1 時間反応させ
た後、蒸留水1.6 mlを加え反応を止めた。また、粗生成
物は酢酸ナトリウムで飽和した冷エタノール (３倍量)
で沈殿させ、遠心分離により回収した。得られた完全Ｏ
−硫酸化コンドロイチン硫酸は再蒸留水に溶かし、透析
で塩を除いた後、凍結乾燥にて回収した。
製造 ウシ気管軟骨由来のコンドロイチン硫酸ナトリウム塩10
0 mgを陽イオン交換樹脂（Dowex 50W X8）にかけた。こ
の際、カラムサイズ１ｃｍ（内径）×１５ｃｍ（長さ）
のカラムを用い、流速１．０ｍｌ／分、水で溶離した。
次いでトリブチルアミン１００μｌを加え、凍結乾燥に
より濃縮してコンドロイチン硫酸トリブチルアミン塩を
得た。得られたコンドロイチン硫酸トリブチルアミン塩
１０ｍｇを０．８ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
（ＤＭＦ）に溶解した。一方、発煙硫酸を蒸留し、流出
するＳＯ3 ガスを冷却し、アスベスト状を呈したＳＯ3
に対し、冷却下、環状アミンを滴下し、液状になった
後、常温に戻し、もはや発煙を観察しなくなるまで滴下
を続けることにより得られたピリジン・三酸化硫黄複合
体を、上記コンドロイチン硫酸トリブチルアミン塩ＤＭ
Ｆ溶液に、三酸化硫黄がコンドロイチン硫酸の遊離水酸
基の１５倍モルとなる量加えた。40℃で1 時間反応させ
た後、蒸留水1.6 mlを加え反応を止めた。また、粗生成
物は酢酸ナトリウムで飽和した冷エタノール (３倍量)
で沈殿させ、遠心分離により回収した。得られた完全Ｏ
−硫酸化コンドロイチン硫酸は再蒸留水に溶かし、透析
で塩を除いた後、凍結乾燥にて回収した。
【００２２】一方、比較のため、コンドロイチン硫酸ト
リブチルアミン塩と三酸化硫黄との反応温度が０℃であ
ることを除いて上記と同じ操作を行い、水酸基の硫酸化
が不完全な部分硫酸化コンドロイチン硫酸を得た。ま
た、以下の実施例においては、原料として用いたコンド
ロイチン硫酸（硫酸化処理なし）についても調べた。
リブチルアミン塩と三酸化硫黄との反応温度が０℃であ
ることを除いて上記と同じ操作を行い、水酸基の硫酸化
が不完全な部分硫酸化コンドロイチン硫酸を得た。ま
た、以下の実施例においては、原料として用いたコンド
ロイチン硫酸（硫酸化処理なし）についても調べた。
【００２３】実施例２ 過硫酸化コンドロイチン硫酸の
性質 (1) 分子量の測定 それぞれのコンドロイチン硫酸の平均分子量はグラジエ
ント（濃度勾配) PAGEにより算出した。測定はEdens 等
の方法（Edens, R.E. et al., J. Pharm. Sci., 81, 82
3-827 (1992)）により、12-22%のグラジエントミニゲル
を用い、アルシアンブルーで染色を行った。各レーンに
は２０μｇのコンドロイチン硫酸をアプライした。それ
ぞれのコンドロイチン硫酸の相対的な分子量はGPC-HPLC
における溶出位置によって確認した。溶離液には50 mM
酢酸ナトリウム(pH 7.4 ，流速1ml/min) を用い、検出
は206 nmにおける吸光度で行った。
性質 (1) 分子量の測定 それぞれのコンドロイチン硫酸の平均分子量はグラジエ
ント（濃度勾配) PAGEにより算出した。測定はEdens 等
の方法（Edens, R.E. et al., J. Pharm. Sci., 81, 82
3-827 (1992)）により、12-22%のグラジエントミニゲル
を用い、アルシアンブルーで染色を行った。各レーンに
は２０μｇのコンドロイチン硫酸をアプライした。それ
ぞれのコンドロイチン硫酸の相対的な分子量はGPC-HPLC
における溶出位置によって確認した。溶離液には50 mM
酢酸ナトリウム(pH 7.4 ，流速1ml/min) を用い、検出
は206 nmにおける吸光度で行った。
【００２４】結果を図１に示す。図１中、レーンａは原
料として用いたコンドロイチン硫酸（硫酸化処理なし）
についての結果を示し、レーンｂは０℃で三酸化硫黄と
反応させた部分硫酸化コンドロイチン硫酸についての結
果を示し、レーンｃは４０℃で三酸化硫黄と反応させた
本発明の過硫酸化コンドロイチン硫酸についての結果を
示す。レーンｄはオリゴサッカライド分子量マーカー
（４μｇ）を示す。コンドロイチン硫酸の硫酸化によっ
て分子量はほとんど変化しないが、若干の分子量増加が
観察された。また、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰ
Ｃ）（Toida, T.,Biochem. J., 322, 499-506 (1997)
）によっても硫酸化による若干の分子量増加が観察さ
れた。これらの結果は、原料のコンドロイチン硫酸に新
たな硫酸基の導入を示唆するばかりでなく、本硫酸化反
応に対して原料のコンドロイチン硫酸中のグリコシド結
合が安定であることも示している。上記の方法により測
定された分子量の範囲は10,000〜20,000であった。
料として用いたコンドロイチン硫酸（硫酸化処理なし）
についての結果を示し、レーンｂは０℃で三酸化硫黄と
反応させた部分硫酸化コンドロイチン硫酸についての結
果を示し、レーンｃは４０℃で三酸化硫黄と反応させた
本発明の過硫酸化コンドロイチン硫酸についての結果を
示す。レーンｄはオリゴサッカライド分子量マーカー
（４μｇ）を示す。コンドロイチン硫酸の硫酸化によっ
て分子量はほとんど変化しないが、若干の分子量増加が
観察された。また、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰ
Ｃ）（Toida, T.,Biochem. J., 322, 499-506 (1997)
）によっても硫酸化による若干の分子量増加が観察さ
れた。これらの結果は、原料のコンドロイチン硫酸に新
たな硫酸基の導入を示唆するばかりでなく、本硫酸化反
応に対して原料のコンドロイチン硫酸中のグリコシド結
合が安定であることも示している。上記の方法により測
定された分子量の範囲は10,000〜20,000であった。
【００２５】(2) 硫酸基含量の分析 硫酸基の定量を行うコンドロイチン硫酸は分画分子量1
2,000の透析チューブで蒸留水に対する徹底的な透析、
凍結乾燥を行った後、五酸化二リン存在下、デシケータ
ーで２日間乾燥させた。硫酸基の定量は酸化した後、東
ソー( 株) 製の CM-8 伝導度検出器を使ってHPLCで測定
した。
2,000の透析チューブで蒸留水に対する徹底的な透析、
凍結乾燥を行った後、五酸化二リン存在下、デシケータ
ーで２日間乾燥させた。硫酸基の定量は酸化した後、東
ソー( 株) 製の CM-8 伝導度検出器を使ってHPLCで測定
した。
【００２６】その結果、二糖繰返し単位中の硫酸基の数
は、原料のコンドロイチン硫酸が１、０℃で硫酸化した
過硫酸化コンドロイチン硫酸が２．５〜３．３、４０℃
で硫酸化した本発明の過硫酸化コンドロイチン硫酸が４
であり、上記した本発明の方法により、コンドロイチン
硫酸中の遊離水酸基が全て硫酸化されたことが確認され
た。
は、原料のコンドロイチン硫酸が１、０℃で硫酸化した
過硫酸化コンドロイチン硫酸が２．５〜３．３、４０℃
で硫酸化した本発明の過硫酸化コンドロイチン硫酸が４
であり、上記した本発明の方法により、コンドロイチン
硫酸中の遊離水酸基が全て硫酸化されたことが確認され
た。
【００２７】(3) ＩＲスペクトル 固体サンプルの赤外線吸収スペクトルを日本分光( 株)
製のFT/IR-230 を用いて測定した。乾燥した臭化カリウ
ム500 μg にグリコサミノグリカン100 μg を混合し、
直径３ｍｍの錠剤を作製し、スペクトロメーターにセッ
トした。
製のFT/IR-230 を用いて測定した。乾燥した臭化カリウ
ム500 μg にグリコサミノグリカン100 μg を混合し、
直径３ｍｍの錠剤を作製し、スペクトロメーターにセッ
トした。
【００２８】得られたＩＲスペクトルを図２に示す。図
２中、Ａは、原料コンドロイチン硫酸のＩＲスペクト
ル、Ｂは実施例１で調製した本発明の完全Ｏ−硫酸化コ
ンドロイチン硫酸のＩＲスペクトルを示す。図２は、全
てのコンドロイチン硫酸に含まれる水酸基がアキシャル
硫酸エステルに変化していることを示している。1240,8
20-850 カイザーの強い吸収はそれぞれS=O, C=O=Sの伸
縮振動に帰属される。同様に2900, 1440, 1380, 1100カ
イザーにおけるC-O-H 変角振動に帰属される信号は完全
O-硫酸化コンドロイチン硫酸のスペクトル中で減少して
いることが明らかである。図２Ｂ中のピーク１は、Ｏ−
Ｈ伸縮振動、ピーク２はＯ−Ｈ変角振動、ピーク３はＳ
＝Ｏ伸縮振動、ピーク４はＣ−Ｏ−Ｓ変角振動及びアキ
シャルＣ−Ｏ−ＳＯ3 の伸縮振動を示す。なお、IRスペ
クトルの帰属についてはCasu, B. et al.,Carbohydr. R
es., 63, 13-27 (1978); Orr, S. F. D., Biochim. Bio
phys. Acta, 14, 173-181 (1954); Bychkov, S. M., Bi
ol. Med.,92, 680-683 (1981);及びSanderson, P. N. e
t al., Biochem. J., 243, 175-181 (1987) を参考にし
た。
２中、Ａは、原料コンドロイチン硫酸のＩＲスペクト
ル、Ｂは実施例１で調製した本発明の完全Ｏ−硫酸化コ
ンドロイチン硫酸のＩＲスペクトルを示す。図２は、全
てのコンドロイチン硫酸に含まれる水酸基がアキシャル
硫酸エステルに変化していることを示している。1240,8
20-850 カイザーの強い吸収はそれぞれS=O, C=O=Sの伸
縮振動に帰属される。同様に2900, 1440, 1380, 1100カ
イザーにおけるC-O-H 変角振動に帰属される信号は完全
O-硫酸化コンドロイチン硫酸のスペクトル中で減少して
いることが明らかである。図２Ｂ中のピーク１は、Ｏ−
Ｈ伸縮振動、ピーク２はＯ−Ｈ変角振動、ピーク３はＳ
＝Ｏ伸縮振動、ピーク４はＣ−Ｏ−Ｓ変角振動及びアキ
シャルＣ−Ｏ−ＳＯ3 の伸縮振動を示す。なお、IRスペ
クトルの帰属についてはCasu, B. et al.,Carbohydr. R
es., 63, 13-27 (1978); Orr, S. F. D., Biochim. Bio
phys. Acta, 14, 173-181 (1954); Bychkov, S. M., Bi
ol. Med.,92, 680-683 (1981);及びSanderson, P. N. e
t al., Biochem. J., 243, 175-181 (1987) を参考にし
た。
【００２９】(4) 旋光度 乾燥したサンプルの一部を秤量し、濃度が5 mg/ml にな
るように蒸留水に溶かして旋光度を測定した。測定は日
本分光( 株) 製の DIP-140を用いて、ナトリウムＤ線で
測定した。
るように蒸留水に溶かして旋光度を測定した。測定は日
本分光( 株) 製の DIP-140を用いて、ナトリウムＤ線で
測定した。
【００３０】その結果、旋光度は原料コンドロイチン硫
酸が−３０度であったのに対し、完全Ｏ−硫酸化コンド
ロイチン硫酸では−８度であった。このことは、完全Ｏ
−硫酸化コンドロイチン硫酸の立体構造が、原料のコン
ドロイチン硫酸と比べて変化していることを示してい
る。
酸が−３０度であったのに対し、完全Ｏ−硫酸化コンド
ロイチン硫酸では−８度であった。このことは、完全Ｏ
−硫酸化コンドロイチン硫酸の立体構造が、原料のコン
ドロイチン硫酸と比べて変化していることを示してい
る。
【００３１】(5) 1 Ｈ ＮＭＲスペクトル 過硫酸化コンドロイチン硫酸(2 mg)を重水(99.9%)0.5 m
l に溶かし、凍結乾燥を繰り返し、交換可能なプロトン
を除いた。サンプルは陰圧で五酸化二リン存在下のデシ
ケーターに入れ、室温で一晩放置した。完全に乾燥した
サンプルは重水(99.96%)0.5 mlに溶かし、0.45 mm のシ
リンジフィルターを通してNMR チューブ(外径5.0 mm×
長さ25 cm, pp-528; Wilmad Glass Co., Buena, NJ) に
入れた。一次元及び二次元NMR の測定はチューニング可
能な5 mmのフィールドグラジエントプローブと標準の J
EOL ソフトウェアを装備した日本電子( 株) 製のGSX500
Aスペクトロメーターを用いて、NOE スペクトルは303K
で、その他の測定は333Kで行った。HOD のシグナルは一
次元スペクトルでは３s 、二次元スペクトルでは1.5 s
の間に前飽和させることで削除した。二次元スペクトル
では、観測幅2000 Hz で、サンプリングデータポイント
が1024得られるように512 回の積算を行い、タイムドメ
インデータはゼロフィリング (データマトリックスサイ
ズ、1K x 1K)した後、シフトしたサイン- ベルウィンド
ウ関数を使って、二次元 double quantum filtered (DQ
F)-COSY ，NOESY 及びTOCSY の為に増幅した。二次元TO
CSY 及びNOESY の測定では150 ，250 ，及び500 msをミ
キシングタイムとして行った結果、100 msのMLEV-17 mi
xing sequence を用いることとした。
l に溶かし、凍結乾燥を繰り返し、交換可能なプロトン
を除いた。サンプルは陰圧で五酸化二リン存在下のデシ
ケーターに入れ、室温で一晩放置した。完全に乾燥した
サンプルは重水(99.96%)0.5 mlに溶かし、0.45 mm のシ
リンジフィルターを通してNMR チューブ(外径5.0 mm×
長さ25 cm, pp-528; Wilmad Glass Co., Buena, NJ) に
入れた。一次元及び二次元NMR の測定はチューニング可
能な5 mmのフィールドグラジエントプローブと標準の J
EOL ソフトウェアを装備した日本電子( 株) 製のGSX500
Aスペクトロメーターを用いて、NOE スペクトルは303K
で、その他の測定は333Kで行った。HOD のシグナルは一
次元スペクトルでは３s 、二次元スペクトルでは1.5 s
の間に前飽和させることで削除した。二次元スペクトル
では、観測幅2000 Hz で、サンプリングデータポイント
が1024得られるように512 回の積算を行い、タイムドメ
インデータはゼロフィリング (データマトリックスサイ
ズ、1K x 1K)した後、シフトしたサイン- ベルウィンド
ウ関数を使って、二次元 double quantum filtered (DQ
F)-COSY ，NOESY 及びTOCSY の為に増幅した。二次元TO
CSY 及びNOESY の測定では150 ，250 ，及び500 msをミ
キシングタイムとして行った結果、100 msのMLEV-17 mi
xing sequence を用いることとした。
【００３２】1 Ｈ ＮＭＲスペクトルの結果を図３に示
す。図３中、Ａは原料コンドロイチン硫酸についての結
果、Ｂは０℃で三酸化硫黄と反応させて調製した過硫酸
化コンドロイチン硫酸（二糖繰返し単位中の平均硫酸基
数：３．２）についての結果、Ｃは本発明の完全Ｏ−硫
酸化コンドロイチン硫酸についての結果を示す。原料の
コンドロイチン硫酸のスペクトルが硫酸化度に若干の不
均一性を示している。すなわち、N-アセチルガラクトサ
ミン４位あるいは６位のどちらかが硫酸化されてた部分
構造の、混合物であることが明らかである。0 ℃で調製
した過硫酸化コンドロイチン硫酸は、予期されたとおり
（Maaroufi, R.M. et al., Thromb. Res., 59, 174-758
(1995); Bartolucci, C. et al.,Carbohydr. Res., 27
6, 401-408 (1995))構造不均一性は原料のコンドロイチ
ン硫酸に比べて増していた。この構造不均一性の増加は
N-アセチルガラクトサミン４位、６位の硫酸化だけでは
なく、不完全なグルクロン酸残基の２位、３位の硫酸化
を示唆している。驚くことに、40℃で調製したコンドロ
イチン硫酸の1H NMRスペクトルが、他の化学的に硫酸化
した試料、あるいは原料に比べて非常に単純なものであ
った。これは明らかに硫酸化における不均一性の減少、
すなわち糖鎖水酸基の完全O-硫酸化を意味している。図
４には、完全O-硫酸化コンドロイチン硫酸の二次元1H N
MRスペクトル、DQF-COSYおよびNOESY スペクトルを示
す。図４中の上側のパネル中の各クロスピークはそれぞ
れ次のものを示す。a, GalNpAc H-3/H-4; b, GlcAp H-1
/H-2; c,GlcAp H-2/H-3; d, GlcAp H-3/H-4; e, GalNpA
c H-1/H-2; f, GlcAp H-4/H-5;g, GalNpAc H-5/H-6。ま
た、下側のパネル中の各クロスピークはそれぞれ次のも
のを示す。a, GalNpAc H-1/H-3; b, GalNpAc H-1/GlcAp
H-4; c, GalNAc H-4/H-5; d, GalNpAc H-4/GlcAp H-5;
e, GalNpAc H-4/H-6; f, GlcAp H-3/H-5 。これらのス
ペクトルから、硫酸化による糖リングプロトンの低磁場
シフトが明らかである。スカラー結合および核オーバー
ハウザー効果から、4.87 ppmのピークはN-アセチルガラ
クトサミンのH-1 、4.57 ppmのシグナルがGlcAのH-4 で
あると帰属され、この結果は全ての水酸基が完全に硫酸
化されていることを示している。化学シフト及び結合定
数を表１に示す。カープラスの式によれば、グルクロン
酸の隣接するプロトン間の二面角は180 度ではなく60-7
0 度となり、グルクロン酸のコンホメーションが4 Ｃ1
から1 Ｃ4 に変化していることを示している（図５）。
なお、図５中、Ｘ2 ＝ＳＯ3 -、Ｘ3 ＝Ｈ、又はＸ2 ＝
Ｈ、Ｘ3 ＝ＳＯ3 -を示し、Ｓｕｇは糖（Ｎ−アセチルガ
ラクトサミン）を示す。
す。図３中、Ａは原料コンドロイチン硫酸についての結
果、Ｂは０℃で三酸化硫黄と反応させて調製した過硫酸
化コンドロイチン硫酸（二糖繰返し単位中の平均硫酸基
数：３．２）についての結果、Ｃは本発明の完全Ｏ−硫
酸化コンドロイチン硫酸についての結果を示す。原料の
コンドロイチン硫酸のスペクトルが硫酸化度に若干の不
均一性を示している。すなわち、N-アセチルガラクトサ
ミン４位あるいは６位のどちらかが硫酸化されてた部分
構造の、混合物であることが明らかである。0 ℃で調製
した過硫酸化コンドロイチン硫酸は、予期されたとおり
（Maaroufi, R.M. et al., Thromb. Res., 59, 174-758
(1995); Bartolucci, C. et al.,Carbohydr. Res., 27
6, 401-408 (1995))構造不均一性は原料のコンドロイチ
ン硫酸に比べて増していた。この構造不均一性の増加は
N-アセチルガラクトサミン４位、６位の硫酸化だけでは
なく、不完全なグルクロン酸残基の２位、３位の硫酸化
を示唆している。驚くことに、40℃で調製したコンドロ
イチン硫酸の1H NMRスペクトルが、他の化学的に硫酸化
した試料、あるいは原料に比べて非常に単純なものであ
った。これは明らかに硫酸化における不均一性の減少、
すなわち糖鎖水酸基の完全O-硫酸化を意味している。図
４には、完全O-硫酸化コンドロイチン硫酸の二次元1H N
MRスペクトル、DQF-COSYおよびNOESY スペクトルを示
す。図４中の上側のパネル中の各クロスピークはそれぞ
れ次のものを示す。a, GalNpAc H-3/H-4; b, GlcAp H-1
/H-2; c,GlcAp H-2/H-3; d, GlcAp H-3/H-4; e, GalNpA
c H-1/H-2; f, GlcAp H-4/H-5;g, GalNpAc H-5/H-6。ま
た、下側のパネル中の各クロスピークはそれぞれ次のも
のを示す。a, GalNpAc H-1/H-3; b, GalNpAc H-1/GlcAp
H-4; c, GalNAc H-4/H-5; d, GalNpAc H-4/GlcAp H-5;
e, GalNpAc H-4/H-6; f, GlcAp H-3/H-5 。これらのス
ペクトルから、硫酸化による糖リングプロトンの低磁場
シフトが明らかである。スカラー結合および核オーバー
ハウザー効果から、4.87 ppmのピークはN-アセチルガラ
クトサミンのH-1 、4.57 ppmのシグナルがGlcAのH-4 で
あると帰属され、この結果は全ての水酸基が完全に硫酸
化されていることを示している。化学シフト及び結合定
数を表１に示す。カープラスの式によれば、グルクロン
酸の隣接するプロトン間の二面角は180 度ではなく60-7
0 度となり、グルクロン酸のコンホメーションが4 Ｃ1
から1 Ｃ4 に変化していることを示している（図５）。
なお、図５中、Ｘ2 ＝ＳＯ3 -、Ｘ3 ＝Ｈ、又はＸ2 ＝
Ｈ、Ｘ3 ＝ＳＯ3 -を示し、Ｓｕｇは糖（Ｎ−アセチルガ
ラクトサミン）を示す。
【００３３】
【表１】
【００３４】実施例３ 抗血液凝固効果 正常ヒト血漿 (NHP)は健常なボランティアから採取し
た。抗Xa因子活性は Coatest LMW heparin/heparin kit
(Chromogenix, Molndal, Sweden) を使って測定した。
コンドロイチン硫酸、過硫酸化コンドロイチン硫酸誘導
体及び低分子化ヘパリン標準品は希釈した正常ヒト血漿
に溶かした。2.9 mM Chromogenic Xa substrate S-2732
(Suc-Ile-Glu( γ-Piperidyl)-Gly-Arg-pNA)を含んだ 5
0 mM Tris,7.5μＭ EDTA 緩衝液(pH 8.4) 200μl にサ
ンプルを含んだ血漿 25 μl 及びウシXa因子 (1.25/ml)
200 μl を加えて 37 ℃で 8分間インキュベーションし
た後、20% 酢酸 200μl を加えた。Xa因子活性を405 nm
の吸光度により測定した。
た。抗Xa因子活性は Coatest LMW heparin/heparin kit
(Chromogenix, Molndal, Sweden) を使って測定した。
コンドロイチン硫酸、過硫酸化コンドロイチン硫酸誘導
体及び低分子化ヘパリン標準品は希釈した正常ヒト血漿
に溶かした。2.9 mM Chromogenic Xa substrate S-2732
(Suc-Ile-Glu( γ-Piperidyl)-Gly-Arg-pNA)を含んだ 5
0 mM Tris,7.5μＭ EDTA 緩衝液(pH 8.4) 200μl にサ
ンプルを含んだ血漿 25 μl 及びウシXa因子 (1.25/ml)
200 μl を加えて 37 ℃で 8分間インキュベーションし
た後、20% 酢酸 200μl を加えた。Xa因子活性を405 nm
の吸光度により測定した。
【００３５】抗IIa 因子活性はコンドロイチン硫酸ある
いは過硫酸化誘導体の水溶液 50 μl 、トリス緩衝液
(pH 8.3) 850 μl 、正常ヒト血漿 30 μl 、及びヒト
トロンビン (1.2 NIH units/ml) を混合し、37℃で30秒
間インキュベートした後、1.9mM Chromogenic TH(ethyl
malonyl-Pro-Arg-p -nitroanilide hydrochloride)を加
え、IIa 因子活性を405 nmにおける吸光度により測定し
た。測定はinstrumentation (Lexington, MA) から購入
した ACL 300 plus を用い、対照には U.S. Pharmacope
ial Convention (Rockville, MD)の USP Heparin refer
ence Standard (K-3) を用いた。
いは過硫酸化誘導体の水溶液 50 μl 、トリス緩衝液
(pH 8.3) 850 μl 、正常ヒト血漿 30 μl 、及びヒト
トロンビン (1.2 NIH units/ml) を混合し、37℃で30秒
間インキュベートした後、1.9mM Chromogenic TH(ethyl
malonyl-Pro-Arg-p -nitroanilide hydrochloride)を加
え、IIa 因子活性を405 nmにおける吸光度により測定し
た。測定はinstrumentation (Lexington, MA) から購入
した ACL 300 plus を用い、対照には U.S. Pharmacope
ial Convention (Rockville, MD)の USP Heparin refer
ence Standard (K-3) を用いた。
【００３６】結果を図６に示す。図６中、四角は抗IIa
因子活性を示し、丸は抗Xa因子活性を示す。図６に示す
ように、完全O-硫酸化によってIIa 因子阻害活性は劇的
に上昇した。一方、抗Xa因子活性は硫酸化に伴い若干上
昇はしているものの、IIa 因子対する程のものではなか
った。この結果はXa因子に対する阻害活性上昇が単に硫
酸基導入による非特異的な陰電荷上昇に起因するものと
考えられる。
因子活性を示し、丸は抗Xa因子活性を示す。図６に示す
ように、完全O-硫酸化によってIIa 因子阻害活性は劇的
に上昇した。一方、抗Xa因子活性は硫酸化に伴い若干上
昇はしているものの、IIa 因子対する程のものではなか
った。この結果はXa因子に対する阻害活性上昇が単に硫
酸基導入による非特異的な陰電荷上昇に起因するものと
考えられる。
【００３７】
【発明の効果】本発明により、遊離水酸基の硫酸化率が
従来よりも高められた新規な過硫酸化コンドロイチン硫
酸が提供された。本発明の過硫酸化コンドロイチン硫酸
は優れた抗血液凝固活性、特に優れたIIa 因子阻害活性
を有し、副作用の強いヘパリンの代替品として有用であ
る。
従来よりも高められた新規な過硫酸化コンドロイチン硫
酸が提供された。本発明の過硫酸化コンドロイチン硫酸
は優れた抗血液凝固活性、特に優れたIIa 因子阻害活性
を有し、副作用の強いヘパリンの代替品として有用であ
る。
【図１】原料コンドロイチン硫酸(a) 、０℃で三酸化硫
黄と反応させた過硫酸化コンドロイチン硫酸(b) 及び４
０℃で三酸化硫黄と反応させた本発明の過硫酸化コンド
ロイチン硫酸(c) についてのグラジエントＰＡＧＥの結
果を示す図である。
黄と反応させた過硫酸化コンドロイチン硫酸(b) 及び４
０℃で三酸化硫黄と反応させた本発明の過硫酸化コンド
ロイチン硫酸(c) についてのグラジエントＰＡＧＥの結
果を示す図である。
【図２】原料コンドロイチン硫酸（Ａ）及び実施例１で
調製した本発明の完全Ｏ−硫酸化コンドロイチン硫酸
（Ｂ）のＩＲスペクトルを示す。
調製した本発明の完全Ｏ−硫酸化コンドロイチン硫酸
（Ｂ）のＩＲスペクトルを示す。
【図３】原料コンドロイチン硫酸(A) 、０℃で三酸化硫
黄と反応させた過硫酸化コンドロイチン硫酸(B) 及び４
０℃で三酸化硫黄と反応させた本発明の過硫酸化コンド
ロイチン硫酸(C) についての一次元1 Ｈ ＮＭＲの結果
を示す。
黄と反応させた過硫酸化コンドロイチン硫酸(B) 及び４
０℃で三酸化硫黄と反応させた本発明の過硫酸化コンド
ロイチン硫酸(C) についての一次元1 Ｈ ＮＭＲの結果
を示す。
【図４】完全Ｏ−硫酸化コンドロイチン硫酸の二次元DO
F-COSY(A) 及びNOESY(B)スペクトルの結果を示す。
F-COSY(A) 及びNOESY(B)スペクトルの結果を示す。
【図５】従来の過硫酸化コンドロイチン硫酸（Ａ）及び
本発明の完全Ｏ−過硫酸化コンドロイチン硫酸（Ｂ）の
立体構造の平衡状態を示す。
本発明の完全Ｏ−過硫酸化コンドロイチン硫酸（Ｂ）の
立体構造の平衡状態を示す。
【図６】コンドロイチン硫酸の二糖単位中の硫酸基の数
と、抗凝固活性との関係を示す。
と、抗凝固活性との関係を示す。
Claims (8)
- 【請求項１】 二糖繰返し単位中にＯ−硫酸基を平均
３．５個以上有する過硫酸化コンドロイチン硫酸又は薬
理学的に許容できるその塩。 - 【請求項２】 二糖繰返し単位中にＯ−硫酸基を平均
３．８個以上有する請求項１記載の過硫酸化コンドロイ
チン硫酸又は薬理学的に許容できるその塩。 - 【請求項３】 二糖繰返し単位中にＯ−硫酸基を平均４
個有する請求項２記載の過硫酸化コンドロイチン硫酸又
は薬理学的に許容できるその塩。 - 【請求項４】 コンドロイチン硫酸の塩と三酸化硫黄を
非プロトン性溶媒中で、３０℃〜５０℃の温度下で、コ
ンドロイチン硫酸塩中の遊離水酸基と三酸化硫黄とのモ
ル比を１：１０ないし１：２０として反応させる、過硫
酸化コンドロイチン硫酸の製造方法。 - 【請求項５】 前記反応温度が３７〜４３℃であり、前
記モル比が１：１３ないし１：１７である請求項４記載
の方法。 - 【請求項６】 前記反応温度が４０℃であり、前記モル
比が１：１５である請求項５記載の方法。 - 【請求項７】 前記塩は有機アミン塩である請求項４な
いし６のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項８】 請求項１ないし３のいずれか１項に記載
の過硫酸化コンドロイチン硫酸を有効成分として含有す
る抗血液凝固剤。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9347071A JPH11166001A (ja) | 1997-12-02 | 1997-12-02 | 過硫酸化コンドロイチン硫酸、その製造方法及びそれを有効成分として含有する抗血液凝固剤 |
| PCT/JP1998/000023 WO1999028351A1 (fr) | 1997-12-02 | 1998-01-08 | Sulfates de chondroitine persulfatee, procede de production de ces derniers et anticoagulants contenant ces derniers comme ingredient actif |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9347071A JPH11166001A (ja) | 1997-12-02 | 1997-12-02 | 過硫酸化コンドロイチン硫酸、その製造方法及びそれを有効成分として含有する抗血液凝固剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11166001A true JPH11166001A (ja) | 1999-06-22 |
Family
ID=18387726
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9347071A Pending JPH11166001A (ja) | 1997-12-02 | 1997-12-02 | 過硫酸化コンドロイチン硫酸、その製造方法及びそれを有効成分として含有する抗血液凝固剤 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11166001A (ja) |
| WO (1) | WO1999028351A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005344073A (ja) * | 2004-06-07 | 2005-12-15 | Maruho Co Ltd | 多硫酸化コンドロイチン硫酸の製造方法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104198635B (zh) * | 2014-08-13 | 2016-09-07 | 南京健友生化制药股份有限公司 | 一种应用快速分离蛋白纯化仪检测肝素钠中多硫酸软骨素的方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0699485B2 (ja) * | 1984-08-14 | 1994-12-07 | 生化学工業株式会社 | 合成コンドロイチン多硫酸の製造法 |
| JPH08301771A (ja) * | 1995-03-08 | 1996-11-19 | Shiseido Co Ltd | 腎疾患の予防または治療用製剤 |
-
1997
- 1997-12-02 JP JP9347071A patent/JPH11166001A/ja active Pending
-
1998
- 1998-01-08 WO PCT/JP1998/000023 patent/WO1999028351A1/ja unknown
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005344073A (ja) * | 2004-06-07 | 2005-12-15 | Maruho Co Ltd | 多硫酸化コンドロイチン硫酸の製造方法 |
| JP4636818B2 (ja) * | 2004-06-07 | 2011-02-23 | マルホ株式会社 | 多硫酸化コンドロイチン硫酸の製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1999028351A1 (fr) | 1999-06-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5280016A (en) | Non-anticoagulant heparin derivatives | |
| US5795875A (en) | Therapeutic methods of using O-desulfated heparin derivatives | |
| US5296471A (en) | Method for controlling o-desulfation of heparin and compositions produced thereby | |
| US5696100A (en) | Method for controlling O-desulfation of heparin and compositions produced thereby | |
| US5380716A (en) | Sulfated polysaccharides as inhibitors of smooth muscle cell proliferation | |
| US5013724A (en) | Process for the sulfation of glycosaminoglycans, the sulfated glycosaminoglycans and their biological applications | |
| US4686288A (en) | Process for preparing mucopolysaccharide compositions having high antithrombotic activity, the compositions obtained and their use as medicaments | |
| EP0340628B1 (en) | Sulfoamino derivatives of chondroitin sulfates, of dermaten sulfate and of hyaluronic acid and their pharmacological properties | |
| EP0347588A1 (en) | Heparin derivatives and process for their preparation | |
| WO1996006867A9 (en) | Method for controlling o-desulfation of heparin and compositions produced thereby | |
| HUT64087A (en) | Process for producing n,o-sulfated heparosanes of high molecular weigh and pharmaceutical compositions comprising such compounds | |
| AU2008228162A1 (en) | Low molecular weight heparins including at least one covalent bond with biotin or a biotin derivative, method for making same and use thereof | |
| PT91249B (pt) | Processo para a preparacao de glicosaminoglicanos selectivamente o-acilados | |
| AU1646392A (en) | Novel heparin derivatives and process for the preparation thereof | |
| MXPA06001511A (es) | Derivados de polisacaridos con alta actividad antitrombotica en plasma. | |
| DK174284B1 (da) | Biologisk aktive tetrasaccharider | |
| US20030023079A1 (en) | Polysaccharides derived from K5 polysaccharide having high anticoagulant and antithrombotic activities and process for their preparation | |
| US20100075922A1 (en) | Heparins including at least one covalent bond with biotin or a biotin derivative, method for preparing same and use thereof | |
| EP0582665A1 (en) | Sulfated polysaccharides as inhibitors of smooth muscle cell proliferation | |
| US7005508B2 (en) | Nitroderivatives of polysaccharides | |
| CA2026992C (en) | Sulfated polysaccharide, pharmaceutically acceptable salt thereof, process for preparing same and medicament containing same as effective component | |
| JPH11166001A (ja) | 過硫酸化コンドロイチン硫酸、その製造方法及びそれを有効成分として含有する抗血液凝固剤 | |
| WO1994008595A1 (en) | Use of non-anticoagulant heparin for treating ischemia/reperfusion injury | |
| WO2020114418A1 (zh) | 抗凝血的五糖类化合物、组合物及其制备方法和医药用途 | |
| JP2000080102A (ja) | Ｏ−過硫酸化グリコサミノグリカン及びそれを有効成分として含有する抗血液凝固剤 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20040913 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080304 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20080701 |