JP2000080102A

JP2000080102A - Ｏ−過硫酸化グリコサミノグリカン及びそれを有効成分として含有する抗血液凝固剤

Info

Publication number: JP2000080102A
Application number: JP26724698A
Authority: JP
Inventors: Toshio Imanari; 登志男今成; Toshihiko Toida; 敏彦戸井田; Robert J Linhardt; ジェイリンハルトロバート
Original assignee: SHIN NIPPON YAKUGYOU KK
Current assignee: SHIN NIPPON YAKUGYOU KK
Priority date: 1998-09-04
Filing date: 1998-09-04
Publication date: 2000-03-21

Abstract

(57)【要約】【課題】高い抗血液凝固活性を有する、ヘパリンとは
異なる新規な化合物及びそれを有効成分として含有する
抗血液凝固剤を提供すること。【解決手段】デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸及びヒア
ルロン酸から成る群より選ばれるグリコサミノグリカン
中の水酸基が硫酸化されたＯ−過硫酸化グリコサミノグ
リカンであって、二糖繰り返し単位中の−ＯＳＯ₃ 基の
数が平均３．８以上である、Ｏ−過硫酸化グリコサミノ
グリカン又は薬理学的に許容できるその塩。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、Ｏ−過硫酸化グリ
コサミノグリカン及びそれを有効成分として含有する抗
血液凝固剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】グリコサミノグリカン(GAG) は二糖の繰
り返しからなる直鎖の酸性多糖であり、基本構造の二糖
はウロン酸あるいはガラクトースとヘキソサミンから構
成される。また、GAG はウロン酸やヘキソサミンといっ
た構成単糖の違いや、硫酸基の結合数や結合位置の違い
からヒアルロン酸(HA)、コンドロイチン硫酸(ChS) 、デ
ルマタン硫酸(DS)、ケラタン硫酸(KS)、ヘパリン(HP)、
及びヘパラン硫酸(HS)の６種類に分類され、HA以外のGA
G は、自然界においてタンパク質と共有結合したプロテ
オグリカン(PG)として様々な組織中に分布していること
が知られている。PGは細胞外マトリックスの主要構成成
分という支持体としての機能だけでなく、細胞接着、移
動、増殖、分化や形態形成に至る様々な細胞の成長過程
に関与していることが期待されており、これらの機能の
大部分は GAGの構造特異性によるものと考えられてい
る。

【０００３】GAG は様々な血漿タンパク質と結合し、多
くの生命現象に関与していることが知られている。特に
研究が進められている HP においてはアンチトロンビン
III(AT III) 、ヘパリンコファクターII (HC II)とい
った血液凝固阻止因子(M.J.Griffith, C.M.Noyes and
F.C. Church, J. Biol. Chem., 260, 2218-2225(1985);
T.H. Tran, B. Zbinden, B. Lammle and F. Duckert,
Semin. Thromb. Haemost.,11, 342-346 (1985)) 、繊維
芽細胞増殖因子 (FGF)などの細胞増殖因子(Y.Matuo, W.
L. Mckeehan, G.C. Yan, S. Nikolaropoulos, P.S. Ada
ms, Y. Fukabori, H. Yamanaka and J. Gaudreau, Adv.
Exp. Med. & Biol., 324, 107-114 (1992)); E.F. Rem
mers, H. Sano and R.L. Wilder, Sem. Arth. Rheum.,
21, 191-199 (1991))、LDL 等のリポタンパク質(H. Eng
elberg, Pharmacol. Rev., 36,91-110 (1984))、セレク
チン(R.M. Nelson, O. Cecconi, W.G. Roberts, A. Aru
ffo, R.J. Linhardt and M.P.Bevilacqua, Blood, 82,
3253-3258 (1993); K.E.Norgard-Sumnichit, N.M. Vark
i and A. Varki, Science, 261, 480-483 (1993))、及
び各種酵素と結合することが報告されている。

【０００４】HPは血液凝固阻止因子に結合することに起
因する抗血液凝固活性が80年前に発見されて以来、60年
に渡って抗血液凝固、抗血栓を目的とした医薬品として
臨床で使用されており、現在でも汎発性血管内血液凝固
症候群 (DIC)、血栓塞栓症の治療及び予防に、また、輸
血、血液検査の際の血液凝固防止にと幅広く用いられて
いる。しかしながら、出血傾向などの深刻な副作用の報
告もあり、現在、より有効かつ安全性の高い抗血液凝固
薬剤の開発が求められている。

【０００５】二糖単位当たり２ないし３個の硫酸エステ
ルをもつコンドロイチン硫酸が、抗血液凝固活性を示す
ことは既に報告されている（Bourin, M. et al., J. Bi
ol.Chem., 265, 15424-5431 (1990) ）。化学的に硫酸
化されたこれらの過硫酸化コンドロイチン硫酸は、ヘパ
リンに含まれるイズロン酸とは構造的にも、コンホメー
ションも異なるグルクロン酸残基を有していることも事
実である（Qiu, G., et al., Biol. Pharm. Bull., 10
2, 721-726 (1997); Casu, B. Semin. Thromb.Haemos
t., 17S, 9-14 (1991)。

【０００６】しかしながら、従来の過硫酸化コンドロイ
チン硫酸でも、抗血液凝固活性がヘパリンに比べて不十
分である。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、高い抗血液凝固活性を有する、ヘパリンとは異なる
新規な化合物及びそれを有効成分として含有する抗血液
凝固剤を提供することである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本願発明者らは、鋭意研
究の結果、特定のＧＡＧの水酸基を実質的に完全に硫酸
化したＯ−過硫酸化ＧＡＧを初めて実際に提供し、その
生成を確認し、かつ、該過硫酸化ＧＡＧがヘパリンと比
較しても遜色のない、高い抗血液凝固活性を有している
ことを見出し、本発明を完成した。

【０００９】すなわち、本発明は、デルマタン硫酸、ヘ
パラン硫酸及びヒアルロン酸から成る群より選ばれるグ
リコサミノグリカン中の水酸基が硫酸化されたＯ−過硫
酸化グリコサミノグリカンであって、二糖繰り返し単位
中の−ＯＳＯ₃ 基の数が平均３．８以上である、Ｏ−過
硫酸化グリコサミノグリカン又は薬理学的に許容できる
その塩を提供する。また、本発明は、上記本発明のＯ−
過硫酸化グリコサミノグリカン又は薬理学的に許容でき
るその塩を有効成分として含有する抗血液凝固剤を提供
する。

【００１０】

【発明の実施の形態】上述のように、本発明のＯ−過硫
酸化ＧＡＧは、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫
酸又はヒアルロン酸の水酸基が硫酸化されたものであ
る。デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸又はヒア
ルロン酸の繰り返し単位である二糖中の水酸基が全て硫
酸化された場合、二糖単位中の−ＯＳＯ₃ 基の数は４個
である。本発明のＯ−過硫酸化ＧＡＧでは、二糖構造単
位中の−ＯＳＯ₃ 基の数が平均３．８以上、さらに好ま
しくは平均３．９以上、最も好ましくは平均４．０であ
る。なお、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸及びヒアルロ
ン酸の二糖繰り返し単位の構造は周知であり、図１に示
されている。また、これらのＧＡＧは市販されているの
で、容易に入手可能である。

【００１１】本発明のＯ−過硫酸化ＧＡＧの分子量は特
に限定されないが、通常７千〜１００万、好ましくは７
千〜２０万、さらに好ましくは１万〜１０万程度であ
る。

【００１２】本発明のＯ−過硫酸化ＧＡＧは、薬理学的
に許容できる塩の形態にあってもよい。このような塩と
して、ナトリウム塩やカリウム塩のようなアルカリ金属
塩、カルシウム塩、アルミニウム塩等を挙げることがで
きるがこれらに限定されるものではない。

【００１３】本発明のＯ−過硫酸化ＧＡＧ硫酸は、ＧＡ
Ｇの塩と三酸化硫黄を非プロトン性溶媒中で、３０℃〜
５０℃の温度下で、コンドロイチン硫酸塩中の遊離水酸
基と三酸化硫黄とのモル比を１：8 ないし１：12として
反応させることにより製造することができる。

【００１４】出発原料となるＧＡＧ塩としては、有機ア
ミン塩が好ましく、特にトリアルキル（特に炭素数１〜
６の低級アルキル）アミン塩、とりわけ、トリブチルア
ミン塩が好ましい。ＧＡＧの有機アミン塩は、市販のＧ
ＡＧナトリウム塩を陽イオン交換樹脂にかけた後、有機
アミンを加え、凍結乾燥により濃縮することにより容易
に調製することができる。ここで用いることができる陽
イオン交換樹脂は何ら限定されるものではなく、例えば
市販品であるDowex 50W X8（ダウ・ケミカル社製）やSP
Sepharose HP （ファルマシア社製）等を用いることが
できる。また、陽イオン交換後のＧＡＧに加えられる有
機アミンの量は、ＧＡＧに含まれる酸性基（カルボキシ
ル基又は硫酸基）１モルに対して１〜１．２モル程度が
好ましい。

【００１５】次いで、得られたＧＡＧの塩と三酸化硫黄
を非プロトン性溶媒中で、３０℃〜５０℃の温度下で、
ＧＡＧ塩中の遊離水酸基と三酸化硫黄とのモル比を１：
8 ないし１：12として反応させる。ここで、好ましい非
プロトン性溶媒としてＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、
ジメチルスルホキシド等を挙げることができるがこれら
に限定されるものではない。反応温度は、３０〜５０℃
であり、好ましくは、３７〜４３℃であり、最も好まし
くは約４０℃である。ＧＡＧ塩中の遊離水酸基と三酸化
硫黄とのモル比は１：6 ないし１：15であり、好ましく
は１：8 ないし１：12である。反応時間は約３０分以
上、好ましくは３０分〜８時間程度である。

【００１６】なお、三酸化硫黄は、これ単独でＧＡＧ塩
と反応させてもよいが、予めピリジンのような環状アミ
ンと三酸化硫黄とを反応させて複合体を形成し、これを
ＧＡＧ塩と反応させてもよい。この場合の環状アミンと
三酸化硫黄との反応条件は、例えば次の通りである。す
なわち、発煙硫酸を蒸留し、流出するＳＯ₃ ガスを冷却
する。アスベスト状を呈したＳＯ₃ に対し、冷却下、環
状アミンを滴下し、液状になった後、常温に戻し、もは
や発煙を観察しなくなるまで滴下を続ける。

【００１７】上記方法により、本発明のＯ−過硫酸化Ｇ
ＡＧが生成する。反応は蒸留水を加えることにより停止
させることができる。また、得られた粗生成物は、ｐＨ
を８〜１０、好ましくは約９に調整した後、無水酢酸ナ
トリウムで飽和した冷エタノールで沈殿させ、遠心分離
により回収することができる。さらに、回収された生成
物を蒸留水に溶かし、水に対して透析後、凍結乾燥する
ことにより精製することができる。

【００１８】本発明のＯ−過硫酸化ＧＡＧは、抗血液凝
固剤としてヘパリンと同様に用いることができる。用量
は、症状や使用態様に応じて適宜選択されるが、例え
ば、血液体外循環時における灌流血液の凝固防止に用い
る場合、ヘパリン国際単位として１０００〜３０００単
位を前投与し、開始後１時間あたり５００〜１５００単
位を間欠的に投与することができる。適用の際の組成と
しては例えば、生理食塩液又は注射用蒸留水を加えて１
ｍｌ当り１０００単位となるように用時溶解して用いる
ことができる。

【００１９】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。

【００２０】なお、下記実施例において用いられている
略号の意味するところは次の通りである。

【００２１】GlcA: グルクロン酸 IdoA: イズロン酸 GalNAc: N- アセチルガラクトサミン GlcNAc: N- アセチルグルコサミン ΔDi-0S: 2-アセタミド-2- デオキシ-3-O-(β-D- グル
コ-4- エンピラノシルウロン酸)- D- ガラクトース ΔDi-4S: 2-アセタミド-2- デオキシ-3-O-(β-D- グル
コ-4- エンピラノシルウロン酸)-4-O-スルホ-D- ガラク
トース ΔDi-6S: 2-アセタミド-2- デオキシ-3-O-(β-D- グル
コ-4- エンピラノシルウロン酸)-6-O-スルホ-D- ガラク
トース ΔDi-diSB: 2- アセタミド-2- デオキシ-3-O-(2-O-スル
ホ- β-D- グルコ-4- エンピラノシル- ウロン酸)-4-O-
スルホ-D- ガラクトース ΔDi-diSD: 2- アセタミド-2- デオキシ-3-O-(2-O-スル
ホ- β-D- グルコ-4- エンピラノシルウロン酸)-6-O-ス
ルホ-D- ガラクトース ΔDi-diSE: 2- アセタミド-2- デオキシ-3-O-(β-D- グ
ルコ-4- エンピラノシルウロン酸)-4,6-ビス-O- スルホ
-D- ガラクトース ΔDi-triS: 2- アセタミド-2- デオキシ-3-O-(2-O-スル
ホ- β-D- グルコ-4- エンピラノシルウロン酸)-4,6-ビ
ス-O- スルホ-D- ガラクトース HPLC: 高速液体クロマトグラフィー PAGE: ポリアクリルアミドゲル電気泳動 AT III: アンチトロンビン III HC II: ヘパリンコファクター II UV: 紫外部吸収スペクトル IR: 赤外線吸収スペクトル NMR: 核磁気共鳴 DQF-COSY: Double quantum filtered correlati
on spectroscopy TQF-COSY: Triple quantum filtered correlati
on spectroscopy TOCSY: Total spin correlation spectroscopy NOESY: Nuclear overhauser effect spectroscopy

【００２２】1 ．GAG の標準品 DS (ブタ皮膚由来) は大鵬ファインケミカル (株) から
提供された。HA (大腸菌由来) は紀文フードケミファ
(株) から購入した。HP (ブタ小腸粘膜由来) 、HS (ブ
タ小腸粘膜由来) は Celusus社 (Ohio) から購入した。
HP (ウシ小腸由来) は SIGMA社から購入した。

【００２３】2 ．GAG 由来の不飽和二糖 GAGs由来の不飽和二糖は生化学工業 (株) より購入し
た。

【００２４】3 ．酵素コンドロイチナーゼ ABC (Proteus vulgaris 由来、EC
4.2.2.4) 、コンドロイチナーゼ AC I (Flavobacteriu
m heparinum 由来、EC 4.2.2.5) 、コンドロイチナーゼ
AC II (Arthrobacter aurescens 由来、EC 4.2.2.5) は
生化学工業 (株) より購入した。ヒアルロニダーゼ (ヒ
ツジ精巣由来、EC 3.2.1.35)は SIGMA社から購入した。
ヘパリンリアーゼ I (Flavobacterium heparinum由来、
EC 4.2.2.7) 、ヘパリンリアーゼ II (Flavobacteriu
m heparinum 由来、EC 4.2.2.7)、ヘパリンリアーゼIII
(Flavobacterium heparinum 由来、EC 4.2.2.8) は SI
GMA社から購入した。トロンビン (ヒト血漿製) は Boeh
ringer Mannheim社から購入した。

【００２５】4 ．その他 HPLC用カラム充填剤として TSKgel SCX を、HPLC用カラ
ムとして TSKgel IC-Anion-PW (4.6 mm i.d.( 内径) x
50 mm)を東ソー (株) から購入した。AsahipakGS-520
(4.6mm i.d. x 500 mm) 、Asahipak GS-320 (7.6 mm i.
d. x 500 mm)は旭化成工業 (株) から購入した。Pegasi
l-ODS (4.6 mm i.d. x 150 mm)は (株)センシュー科学
から購入した。Chromozym THは Boehringer Mannheim社
から購入した。アンチトロンビン III (ヒト血漿製) は
和光純薬工業 (株) から購入した。正常ヒト血漿は健常
なボランティアから採取した。他の試薬は全て市販の特
級品を使用した。水はイオン交換水を蒸留して用いた。

【００２６】装置 1 ．HPLC 溶離液送液ポンプは日本分光工業株式会社 (JASCO)製 I
ntelligent HPLC PumpPU-980 、日立製作所製 L-6000 p
ump、反応試薬送液ポンプは島村製作所製ダブルプラン
ジャーポンプ SPU-2.5NP型、検出器は東ソー製 Conduct
o Monitor CM-8、島津製作所製 Fluorescence Spectrom
onitor RF-530 、日立製作所製 Fluorescence Spectro
monitor F-1050、島津製作所製 UV-VIS Spectrophotome
tric detector SPD-6AV 、反応槽は Seishin Pharm. C
o., Ltd. 製 Dry Reaction Bath DB-2 、島村計器製作
所製 Dry Reaction Bath DB-5 、カラム恒温槽はヤマト
科学(株) 製 Water Bath Incubater BT-22 、記録計は
日立製作所製 Chromoto Integrator D-2500 を使用し
た。

【００２７】2 ．吸光光度計島津製作所製 UV-VIS Spectrophotometer UV-1200 、電
子冷熱式恒温セルホルダーTCC-240A、Kinetics Program
Pack を使用した。

【００２８】3 ．旋光度計日本分光工業株式会社 (JASCO)製 Spectropolarimeter
DIP-140を使用した。

【００２９】4 ．IR装置日立製作所製 FT/IR-230を使用した。

【００３０】5 ．NMR 装置日本電子株式会社 (JEOL) 製 JNM-GSX 400A 、または J
NM-GSX 500A を使用した。

【００３１】6 ．電気泳動ポリアクリルアミドゲルとして ATTO ( 株) 製パジェル
NPG-520L 型 (濃度勾配 5〜20 %) 、または第一化学薬
品 (株) 製マルチゲル 4/20 ( 濃度勾配 4〜20%) を用
いた。

【００３２】実験方法 1 ．Ｏ- 硫酸化グリコサミノグリカンの調製部分的Ｏ- 硫酸化反応いずれのグリコサミノグリカンに対しても図２に示した
方法で行った。硫酸化試薬であるピリジン・三酸化硫黄
は、GAG 鎖の遊離水酸基１モルに対して4 ないし8 モル
加えた。いずれの場合も反応は 0℃で 1時間行った。

【００３３】完全Ｏ- 硫酸化反応いずれのグリコサミノグリカンに対しても図２に示した
方法で行った。いずれの場合も反応は 40 ℃で行った。

【００３４】2 ．Ｏ- 硫酸化グリコサミノグリカンの構
造解析 ¹H-NMRスペクトル重水はAldrich 社製( 純度 99.96 %) を使用した。NMR
装置は日本電子株式会社(JEOL)製 JNM-GSX 400A 、また
は JNM-GSX 500A を使用した。試料 2 mg は重水0.5 ml
に溶かし、凍結乾燥を繰り返し、交換可能なプロトンを
除いた後、陰圧で P₂O₅ 存在下のデシケーターで 24 時
間乾燥した。完全に乾燥した試料は重水0.5 ml に溶か
し、Wilmad社製 NMR測定管 pp-528 (5.0 mm o.d.( 外
径) x 25 cm)に入れ、測定に用いた。測定は 400ＭＨz
、または 500ＭＨz の共鳴周波数で行った。一次元ス
ペクトルの測定条件は以下の通りである。観測幅、8 kH
z ；パルス幅、45゜(4.90 msec) ；サンプリングポイン
ト、32 K；パルス間隔、2 sec；積算回数、400 回；温
度、333 K 。また、定量及び化学シフトの基準として 3
- トリメチルシリルプロピオン酸ナトリウム (Aldrich
社製) を用いた。二次元スペクトルでは、観測幅 2000
Hzで、サンプリングポイントが 1024 得られるように 5
12回の積算を行った。タイムドメインデータはゼロフィ
リング (データマトリックスサイズ、1 K x 1 K)した
後、シフトしたサイン- ベルウィンドウ関数を使って、
二次元 DQF-COSY 、TQF-COSY、 TOCSY及び NOESYの為に
フーリエ変換した。

【００３５】不飽和二糖分析試料を図３に示す方法で酵素消化した後、生成する不飽
和二糖をHPLCで分離定量した。ポストカラムHPLCの条件
及びフローダイアグラムを図４に示す。図４に示すフロ
ーダイアグラムの条件は次の通りであった。

【００３６】カラム、Pegasil-ODS(内径4.6 mm x 150 m
m); 溶離液Ａ、８％アセトニトリル中0.8 mM TBA；溶離
液Ｂ、８％アセトニトリル中0.2 M NaCl含有0.8 mM TBA
勾配0-5.5 分、１％Ｂ;5.5-6.5分、1-12% B; 6.5-13.5
分、１２％Ｂ；13.5-16.5 分、12-50%B; 16.5-18.5分、
５０％Ｂ；流速、2.0 ml/ 分、カラム温度、６０℃；試
薬１、1.0 M 水酸化ナトリウム(0.3 ml/分) 、試薬２、
１％２−シアノアセタミド(0.3 ml/分) ；反応温度、１
２０℃、反応コイル、内径0.5 mm x 10 m;冷却コイル、
内径0.25 mm x 2 m,検出、蛍光、Ex.346 nm, Em. 410 n
m 。

【００３７】硫酸化度測定試料を図５に示す方法で酸加水分解した後、生成する硫
酸イオンを図６に示すイオンクロマトグラフィーで定量
した。

【００３８】図６に示すイオンクロマトグラフィーの条
件は次の通りであった。カラム、TSK gel IC-Anion-PW
( 内径4.6 mm x 50 mm);除去カラム、Dowex 50W-X8(H⁺)
( 内径5.0 mm x 200 mm); カラム温度、３０℃；移動
相、1.42 mM 炭酸水素ナトリウムと1.5 mM炭酸ナトリウ
ム溶液、流速1.0 ml/ 分；検出、電気伝導度。

【００３９】アミノ糖の定量に用いたポストカラム HPL
C の条件を以下に示す。

【００４０】カラム、TSKgel SCX (内径4.6 mm x 150 m
m)；溶離液、0.35 Mホウ酸―水酸化ナトリウム緩衝液
(pH 7.6) ；流速、0.6 ml/min；カラム温度、60℃；試
薬1 、1%2- シアノアセトアミド (流速 0.25 ml/min)
；試薬2 、0.3 M 水酸化ナトリウム (流速 0.25ml/mi
n)；反応コイル、( 内径0.5 mm x 10 m)；反応温度、10
0 ℃；冷却コイル、( 内径0.25 mm x 2 m)；検出、UV 2
80 nm 。

【００４１】加水分解した試料溶液中に存在する硫酸イ
オンのモル数をアミノ糖のモル数で除し、硫酸化度とし
た。

【００４２】旋光度日本分光工業株式会社 (JASCO)製の DIP-140を用いて、
ナトリウム D線で測定した。乾燥した試料を秤量し、濃
度が 0.5 mg/ml、1 mg/ml になるように再蒸留水に溶か
して旋光度を測定した。

【００４３】赤外線吸収スペクトル日本分光工業株式会社 (JASCO)製の FT/IR-230を用いて
測定した。測定条件は以下の通りである。積算回数、64
times；分解、4 cm^-1；ゲイン、16；スピード、2.0mm/
sec ；光源、standard；アポダイゼーション、Cosine；
ゼロフィリング、x 2 ；ビームスプリッター、KBr 。

【００４４】3 ．完全 O- 硫酸化 GAGの酵素消化O-SulDS 、O-SulHA のコンドロイチナーゼ消化試料 (5000 ppm) 、コンドロイチナーゼ ABC (0.05 uni
ts/10 ml) 、コンドロイチナーゼ AC I (0.05 units/10
ml)、コンドロイチナーゼ AC II (0.05 units/10 ml)
、0.2 M Tris- 塩酸 buffer (pH 8.0)を 10 mlずつ混
合し、37℃で一晩インキュベートした。

【００４５】酵素消化物は以下のゲル濾過クロマトグラ
フィーで、不飽和二糖の有無を確認した。

【００４６】カラム、Asahipak GS-320 ( 内径7.6 mm x
500 mm)；溶離液、10 mM 重炭酸アンモニウム；流速、
0.5 ml/min ；カラム温度、室温；試薬1 、0.5 % グア
ニジン及び0.5% 2- シアノアセトアミド( 流速、0.25 m
l/min)；試薬2 、0.25 M水酸化ナトリウム( 流速、0.25
ml/min)；反応コイル( 内径0.5 mm x 10 m)；反応温
度、110 ℃；冷却コイル( 内径0.25 mm x 3 m)；検出、
励起波長 346 nm 、蛍光波長 410 nm 。

【００４７】ゲル濾過クロマトグラフィーで不飽和二糖
が検出された場合は、図４に示したHPLCで分離定量し
た。

【００４８】O-SulDS 、O-SulHA のヒアルロニダーゼ消
化試料50 mg を0.3 M NaClを含むリン酸緩衝液(pH 6.0)に
溶かし、ヒアルロニダーゼ (1.5 units/10 ml)20 ml を
加えて、37℃で一晩インキュベートした。

【００４９】酵素消化物はコンドロイチナーゼ消化物と
同条件の HPLC で、飽和二糖の有無を確認した。

【００５０】O-SulHP 、O-SulHS のヘパリンリアーゼ消
化試料(200 ppm) 、10 mM 酢酸カルシウムを含んだ0.1 M
Tris- 酢酸緩衝液(pH7.0)、ヘパリンリアーゼI(2.0 uni
ts/ 10 ml) 、ヘパリンリアーゼII(0.2 units/10 ml)
、ヘパリンリアーゼ III(0.2 units/ 10 ml)を4 mlず
つ混合し、37℃で一晩インキュベートした後、遠心エバ
ポレートし、再蒸留水20 ml に溶かした。

【００５１】酵素消化物はコンドロイチナーゼ消化物と
同条件の HPLC で、不飽和二糖の有無を確認した。

【００５２】4 ．抗血液凝固活性測定血漿を用いた抗IIa 因子活性測定抗IIa 因子( トロンビン) 活性測定は図７に示す方法で
行い、405 nmにおける吸光度の変化を３分間測定した。
標準試料としてHP(172 units/mg)を用いた。測定試料は
その活性の強さに応じて濃度を変え、少なくとも３種類
の濃度で測定した。Tris buffer(pH 8.3) は、Tris 605
mg 、塩化ナトリウム1.33 gを再蒸留水に溶かし、２Ｍ
塩酸でpH 8.3とし、100 mlにメスアップした後、BSA 10
0 mg、及び保存のためのアジ化ナトリウム100 mgを加え
調製した。正常ヒト血漿は、抗凝固剤として3.8 % クエ
ン酸ナトリウムを用い、採血後速やかに1500 gで10分間
遠心し、上清を採取した。

【００５３】AT IIIを用いた抗IIa 因子活性測定抗IIa 因子( トロンビン) 活性測定は図７に示す方法で
行い、405 nmにおける吸光度の変化を 3分間測定した。
標準試料として HP (172 units/mg)を用いた。測定試料
はその活性の強さに応じて濃度を変え、少なくとも３種
類の濃度で測定した。アンチトロンビンIII(ヒト血漿
製、和光純薬工業( 株))は 0.08 units/mlになるように
再蒸留水に溶かして用いた。

【００５４】結果完全O-硫酸化DS，HAの調製と抗血液凝固活性 1. 完全O-硫酸化デルマタン硫酸 (DS) の調製 DSはウロン酸としてイズロン酸 (IdoA) あるいはグルク
ロン酸 (GlcA) 、アミノ糖として N- アセチルガラクト
サミン (GalNAc) から成る二糖の繰り返し構造を有して
いる。また、DSはヘパリンコファクター II (HC II) と
特異的に結合することが報告されており、化学修飾によ
る HC II結合部位の構造解析や構造活性相関に関する研
究が数多く行われている。ここでは天然のDSを完全Ｏ-
硫酸化することによる抗血液凝固活性の変化を調べるこ
とを目的に検討を行った。

【００５５】分子量 30000の市販の DS ( コンドロイチ
ナーゼ消化による二糖組成分析の結果を表１に示す) の
トリ-n- ブチルアミン塩を調製し、ジメチルホルムアミ
ドを溶媒としてピリジン・三酸化硫黄を加え 0℃、1 時
間で部分的 O- 硫酸化反応を、40℃、3 時間で完全 O-
硫酸化反応を行った。更に、エタノール沈殿、透析、凍
結乾燥を経て部分的 O- 硫酸化DS、完全 O- 硫酸化DSを
得た( 図２参照) 。

【００５６】

【表１】

【００５７】部分的 O- 硫酸化DS、完全 O- 硫酸化DSの
構造を調べるために¹H-NMRスペクトルを測定した (図
８、図９) 。なお、図８中、ＡはＤＳについての結果、
Ｂは部分的Ｏ−硫酸化DS(x4 モル) についての結果、Ｃ
は部分的Ｏ−硫酸化DS(x8 モル) についての結果、Ｄは
部分的Ｏ−硫酸化DS(x12モル) についての結果を示す。
また、図９中、ＡはＤＳについての結果、Ｂは部分的Ｏ
−硫酸化ＤＳについての結果、Ｃは完全硫酸化ＤＳにつ
いての結果を示し、「＊」は不純物を示す。一次元¹H-N
MRスペクトルの帰属は二次元¹H-NMRスペクトルの DQF-C
OSY 、TQF-COSY、TOCSY 、NOESY により行った。完全O-
硫酸化DSの¹H-NMRスペクトルは非常に単純なものにな
り、構造が均一化されていることが明らかとなった。ま
た、完全 O-硫酸化DSの硫酸化度は 3.95 を示し、DSの
全ての水酸基が硫酸化されたことが確認された。しかし
ながら、ウロン酸のコンフォメーション変化はDSにおい
ては観察されなかった。

【００５８】官能基の変化を調べるためにIRスペクトル
を測定し、O ―H の伸縮運動、変角運動に由来するピー
クの減少とS ＝O の伸縮振動、C ―O ―S の変角振動、
及びアキシアルC ―O ―SO₃ の伸縮振動に由来するピー
クの増加が観察され、DSの水酸基に硫酸基が導入された
ことが確認された。

【００５９】次に測定温度を変えて完全Ｏ- 硫酸化DSの
1H-NMR スペクトルを測定した。完全Ｏ- 硫酸化DSでは
どのプロトンに由来するシグナルにおいても結合定数の
変化は観察されなかった。30℃、及び 60 ℃における各
プロトンのシグナルの化学シフト及び結合定数を表２に
示す。

【００６０】

【表２】

【００６１】酵素への抵抗性を調べるために完全 O- 硫
酸化DSをコンドロイチナーゼ AC I、コンドロイチナー
ゼ AC II、及びコンドロイチナーゼ ABCの混合物で徹底
的に消化した後、HPLCで不飽和二糖の定量を行った。そ
の結果、ΔDi-4S が 0.071 %、ΔDi-6S が 0.011 %、Δ
Di-diSE が 0.008 %検出されたが、回収率は天然のDSを
酵素処理して得られる不飽和二糖の0.09 %であり、コン
ドロイチナーゼに対して抵抗性を示すことが明らかとな
った。また、ヒアルロニダーゼによる徹底消化でも飽和
二糖は全く検出されず、酵素に強い抵抗性を示すことが
明らかとなった。

【００６２】2 ．完全O-硫酸化ヒアルロン酸 (HA) の調
製 HAはウロン酸として GlcA 、アミノ糖として N- アセチ
ルグルコサミン (GlcNAc) を持つ二糖の繰り返し構造を
有している。HAは保水性、粘弾性に富んでいるという物
理的特性を持つほかに、形態形成期にみられる活発な細
胞活動の活性化、血管内皮細胞や白血球の遊走阻害など
の様々な生理的役割を持つと示唆されている。HAは抗血
液凝固活性は示さないが、完全 O- 硫酸化による GlcA
のコンフォメーション変化、及び抗血液凝固活性の発現
を期待して O- 硫酸化反応の検討を行った。

【００６３】分子量100000の市販の HA のトリ-n- ブチ
ルアミン塩を調製し、ジメチルホルムアミドを溶媒とし
てピリジン・三酸化硫黄を加え 0℃、1 時間で部分的 O
- 硫酸化反応を、40℃、3 時間で完全 O- 硫酸化反応を
行った。更に、エタノール沈殿、透析、凍結乾燥を経て
部分的 O- 硫酸化HA、完全 O- 硫酸化HAを得た( 図２参
照) 。

【００６４】部分的 O- 硫酸化HA、完全 O- 硫酸化HAの
構造を知るために¹H-NMRスペクトルを測定した( 図１
０、図１１) 。なお、図１０中、ＡはＨＡについての結
果、Ｂは部分的Ｏ−硫酸化HA(x4 モル) についての結
果、Ｃは部分的Ｏ−硫酸化HA(x8モル) についての結果
を示す。また、図１１中、ＡはHAについての結果、Ｂは
部分的Ｏ−硫酸化HA(x8 モル) についての結果、Ｃは完
全Ｏ−硫酸化ＨＡについての結果を示す。一次元¹H-NMR
スペクトルの帰属は二次元¹H-NMRスペクトルの DQF-COS
Y 、TQF-COSY、TOCSY 、NOESY により行った。完全 O-
硫酸化HAの¹H-NMRスペクトルは非常に単純なものにな
り、構造が均一化されていることが明らかとなった。完
全 O- 硫酸化HAの硫酸化度は 3.97 を示し、HAの全ての
水酸基が硫酸化されたことが確認された。またIRスペク
トルにより、HAの水酸基に硫酸基が導入されたことが確
認された。

【００６５】次に測定温度を変えて完全 O- 硫酸化HAの
¹H-NMRスペクトルを測定した。測定温度を変えることで
GlcA のH-1 及びH-2 の結合定数 3J1、2 の変化が観察
され、GlcAが低温 (30℃) では¹C₄ 、高温 (60℃) では
²S₀ のコンフォメーションをとっていることが確認され
た。30℃、及び 60 ℃における各プロトンのシグナルの
化学シフト及び結合定数を表３に示す。

【００６６】

【表３】

【００６７】酵素への抵抗性を調べるために完全 O- 硫
酸化HAをコンドロイチナーゼ AC I、コンドロイチナー
ゼ AC II、及びコンドロイチナーゼ ABCの混合物で徹底
的に消化した後、HPLCで定量したところ、不飽和二糖が
ごく微量検出され、コンドロイチナーゼに対して抵抗性
を示すことが明らかとなった。また、ヒアルロニダーゼ
による徹底消化においては飽和二糖は全く検出されず、
酵素に強い抵抗性を示すことが明らかとなった。

【００６８】3.完全O-硫酸化ヘパラン硫酸の調製 HSはウロン酸としてイズロン酸 (IdoA) あるいはグルク
ロン酸 (GlcA) 、アミノ糖として N- 硫酸化グルコサミ
ン (GlcNS)あるいは N- アセチルグルコサミン(GlcNAc)
を持つ二糖の繰り返し構造を有している。しかしなが
ら、ウロン酸がそれぞれ約半数ずつ存在し、グルコサミ
ン (GlcN) の N- 硫酸含量が 50 % 前後であることから
HPに比べて構造多様性に富んでいる。HSもHPと同様に繊
維芽細胞増殖因子 (FGF)などの増殖因子に親和性を持つ
ことが知られている。しかしながら、抗血液凝固活性は
HP よりも低く、化学修飾による作用増強の試みが行わ
れている(F.A. Ofosu, G.J. Modi, M.A. Blajchman, M.
R. Buchanan and E.A. Johnson, Biochem. J., 248, 88
9-896 (1987)) 。

【００６９】分子量 14800の市販の HS ( ヘパリンリア
ーゼ消化による二糖組成分析の結果を表４に示す) のト
リ-n- ブチルアミン塩を調製し、ジメチルホルムアミド
を溶媒としてピリジン・三酸化硫黄を加え 0℃、1 時間
で部分的 O- 硫酸化反応を、40℃、6 時間で完全 O- 硫
酸化反応を行った。更に、エタノール沈殿、透析、凍結
乾燥を経て部分的 O-SulHS、完全 O-SulHSを得た( 図２
参照) 。

【００７０】

【表４】

【００７１】部分的 O-SulHS、完全O-SulHS の構造を知
るために¹H-NMRスペクトルを測定した (図１２、図１
３) 。なお、図１２中、ＡはＨＳについての結果、Ｂは
部分的Ｏ−硫酸化HS(x6 モル) についての結果、Ｃは部
分的Ｏ−硫酸化HS(x12モル) についての結果、「＊」は
不純物を示す。また、図１３中、ＡはＨＳについての結
果、Ｂは部分的Ｏ−硫酸化ＨＳ(x12モル) についての結
果、Ｃは完全Ｏ−硫酸化ＨＳについての結果を示し、
「＊」は不純物を示す。一次元¹H-NMRスペクトルの帰属
は二次元¹H-NMRスペクトルの DQF-COSY 、TQF-COSY、TO
CSY 、NOESY により行ったが、構造多様性のためにスペ
クトルが複雑となり、完全な帰属はできなかった。完全
O-SulHS の¹H-NMRスペクトルは各プロトンのシグナルが
低磁場にシフトした他、GlcNAcのアセチル基のメチルプ
ロトン由来のシグナルの収束が観察された。また、完全
O-SulHS の硫酸化度は4.31を示し、HSの全ての水酸基が
硫酸化されたと推測されるが、HPと同様にN-硫酸基が脱
離した可能性もあるが、IRスペクトルによりHSの水酸基
に硫酸基が導入されたことが確認された。

【００７２】酵素への抵抗性を調べる為に完全 O-SulHS
をヘパリンリアーゼ I、ヘパリンリアーゼ II 、及びヘ
パリンリアーゼ IIIの混合物で徹底的に消化した後、HP
LCで定量したが、不飽和二糖は全く検出されず酵素に強
い抵抗性を示すことが明らかになった。

【００７３】調製した O- 硫酸化 GAGの硫酸化度と旋光
度を表５に示す。

【００７４】

【表５】

【００７５】II. O-硫酸化 GAGの抗血液凝固活性 DS、HA、HS、HP、及びそれらの誘導体の抗IIa 活性を図
１４に示す。なお、図１４において、SO₃ ^-/ ニ糖は硫酸
基とアミノ糖の定量値から求めた。DS、HAにおいては硫
酸化度の上昇に伴う抗血液凝固活性の上昇が観察され、
完全 O- 硫酸化した DS 、HAでは HP の約 1/3に相当す
る高い活性が得られることが明らかとなった。完全 O-
硫酸化によるHAの抗 IIa活性の急激な上昇は、GlcAのコ
ンフォメーションが⁴C₁ から¹C₄ に変化したことと密接
に相関するものと推察され、糖鎖のコンフォメーション
が抗 IIa活性に大きく寄与している可能性が示唆され
た。

【００７６】HSにおいても O- 硫酸化による抗 IIa活性
の上昇が観察されたが、DS、HAとは異なり部分的 O- 硫
酸化の際に急激な活性の上昇が観察された。これは HS
の一部の構造が部分的 O- 硫酸化によって HP が持つ A
T III 結合部位の五糖構造に類似したためと推察され
る。

【００７７】また、全ての完全 O- 硫酸化 GAGの抗 IIa
活性においてトロンビンに対する直接作用が観察されな
かったことから、AT IIIや HC IIといった血液凝固阻害
因子を介した抗血液凝固作用であることが示唆された。

【００７８】完全 O- 硫酸化 GAGの抗 IIa活性の比較を
図１５に示した。

【００７９】完全 O- 硫酸化 GAGの合成とその抗血液凝
固活性について調べるために種々の反応条件、構造につ
いて検討を行った。その結果、DS、HA、HSにおいても硫
酸化度の上昇に伴う抗血液凝固活性の上昇がみられ、完
全 O- 硫酸化することでHPの約 1/3に相当する高い活性
が得られることが明らかとなった。

【００８０】完全 O- 硫酸化による急激な抗 IIa活性の
上昇は HA においては GlcA のコンフォメーション変化
に起因するものと推測される。しかしながら、DSの構成
糖であり¹C₄ フォームをとっているIdoAでは、完全 O-
硫酸化によるコンフォメーションの変化は観察されなか
った。このことはウロン酸の¹C₄ フォームが 2位、3位
の水酸基に硫酸基が導入されても安定であることを示唆
すると共に、強い抗 IIa活性に影響しているのは¹C₄ が
コンフォメーション変化した²S₀ であることを示唆して
いる。おそらく完全 O-SulDSのIdoAは硫酸基の立体障
害、あるいは電荷の反発により天然のDSのIdoAに比べて
²S₀ フォームをとり易くなっているものと推測される。

【００８１】HSにおいても O- 硫酸化による抗 IIa活性
の上昇が観察されたが、DS、HAとは異なり部分的 O- 硫
酸化の際に急激な活性の上昇が観察された。これは HS
の一部の構造が部分的 O- 硫酸化によって HP が持つ A
T III 結合部位の五糖構造に類似したためと推察され、
特に AT III を介した抗血液凝固活性が上昇していると
推測される。

【００８２】また、HPでは完全 O- 硫酸化による活性の
低下が観察された。これは天然の HP がもつ AT III 結
合部位が壊されたことに起因すると推測されるが、AT I
II結合部位の破壊が O- 硫酸化によるものか、脱 N- 硫
酸化によるものかを調べる為に、完全 O-SulHPを再 N-
硫酸化し抗 IIa活性の変化をみる必要があると思われ
る。

【００８３】III.アンチトロンビン IIIを介した抗血液
凝固活性化学的 O- 硫酸化反応によって様々な硫酸化度を持つ G
AGを調製し、それらの抗 IIa活性を測定した。その結
果、硫酸化度の上昇に伴って抗 IIa活性が上昇し、ま
た、完全 O- 硫酸化によって HP の 1/2〜1/5 に相当す
る強い活性が得られることが明らかとなった。いずれの
完全 O- 硫酸化 GAGにおいてもトロンビンに対する直接
作用は観察されなかったことから、AT III、HC II とい
った血液凝固阻害因子を介した抗IIa 活性であることが
推察された。しかしながら、血漿にはAT III 、HC II
が共に含まれているために、これまでに行った血漿を用
いる抗IIa活性測定法ではどちらを介して発現した作用
であるかは明らかにできない。そこで、 GAGの抗血液凝
固活性が AT III 、HC II のどちらを介しているかを調
べる為に、血漿の代わりにヒト血漿から単離した市販の
AT III を用い、抗 IIa活性測定を行った。

【００８４】DS、HA、HSの抗IIa 活性測定の結果をそれ
ぞれ図１６、１７、１８に示す。なお、これらの図中、
SO₃ ^-／二糖は、アミノ糖に対する硫酸イオンの比率で表
されている。なお、硫酸イオン及びアミノ糖は、イオン
クロマトグラフィー及び２−シアノアセタミドを用いた
ポスト−カラムHPCLにより決定した。DS、HAにおいて
は、硫酸化度の上昇に伴って血漿を介した抗IIa 活性の
上昇が観察されたが、ATIIIを介した活性は全く観察さ
れなかった。天然の HP では血漿、AT IIIのどちらを用
いた場合にも抗 IIa活性が強く観察されたが、完全 O-S
ulHPでは共にその活性が著しく低下した。特に、AT III
を介した抗 IIa活性は全く観察されなくなった。一方、
HSでは硫酸化度の上昇に伴って抗 IIa活性の上昇が観察
され、特にHS の場合は部分的 O- 硫酸化による急激な
抗 IIa活性の上昇が観察された。また、この部分的 O-
硫酸化した HS の抗 IIa活性の上昇は、AT IIIを介した
活性発現であることが実験から明らかとなった。このこ
とは、その糖鎖配列中に天然の HP に見出された AT II
I 結合部位に相当する配列が生成されたことを示唆して
いる。

【００８５】GAG 及びそれらの誘導体の抗 IIa活性発現
の媒介物質を調べるために AT IIIを用いた抗 IIa活性
測定を行った。DS、HAにおいては、硫酸化度の上昇に伴
って血漿を介した抗 IIa活性の上昇が観察されたが、AT
IIIを介した活性は全く観察されなかった。このことか
ら ChS、DS、HA及びそれらの誘導体の抗 IIa活性がHCII
を介したものであることが示唆された。この結果はDSの
抗血液凝固活性が HCIIを介しているという報告と一致
した。

【００８６】HSでは硫酸化度の上昇に伴う抗 IIa活性の
上昇が観察され、特に部分的O-硫酸化による著しい活性
の上昇が観察された。また、部分的O-硫酸化による抗 I
Ia活性の急激な上昇に伴い、AT IIIを介した活性の発現
が観察されたことから、HSの構造の一部に AT III 結合
部位が生成したものと推測される。また、完全O-SulHS
においてはHPの場合と同様にAT IIIを介した抗IIa 活性
は観察されなかった。

【００８７】

【発明の効果】本発明により、遊離水酸基の硫酸化率が
従来よりも高められた新規なＯ−過硫酸化ＧＡＧが提供
された。本発明のＯ−過硫酸化ＧＡＧは優れた抗血液凝
固活性、特に優れたIIa 因子阻害活性を有し、副作用の
強いヘパリンの代替品として有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のＯ−過硫酸化ＧＡＧのＯ−過硫酸化前
ＧＡＧのニ糖繰り返し単位の化学構造を示す図である。

【図２】本発明のＯ−過硫酸化ＧＡＧの製造方法の工程
を示す図である。

【図３】不飽和二糖分析のための酵素消化方法の工程を
示す図である。

【図４】不飽和二糖分析のためのポスト−カラムHPCLシ
ステムのフローダイアグラムを示す図である。

【図５】硫酸化度測定のための酸加水分解の工程を示す
図である。

【図６】硫酸化度測定のための酸加水分解の後のイオン
クロマトグラフィー装置を模式的に示す図である。

【図７】抗IIa 因子( トロンビン) 活性測定の工程を示
す図である。

【図８】デルマタン硫酸及び部分的Ｏ−硫酸化デルマタ
ン硫酸の¹H-NMRスペクトルを示す図である。

【図９】デルマタン酸及びＯ−硫酸化デルマタン硫酸の
¹H-NMRスペクトルを示す図である。

【図１０】ヒアルロン酸及び部分的Ｏ−硫酸化ヒアルロ
ン酸の¹H-NMRスペクトルを示す図である。

【図１１】ヒアルロン酸及びＯ−硫酸化ヒアルロン酸の
¹H-NMRスペクトルを示す図である。

【図１２】ヘパラン硫酸及び部分的Ｏ−硫酸化ヘパラン
硫酸の¹H-NMRスペクトルを示す図である。

【図１３】ヘパラン硫酸及びＯ−硫酸化ヘパラン硫酸の
¹H-NMRスペクトルを示す図である。

【図１４】ＧＡＧ及びＯ−硫酸化ＧＡＧの抗IIa 活性を
示す図である。

【図１５】完全Ｏ−硫酸化ＧＡＧの抗IIa 活性を示す図
である。

【図１６】デルマタン硫酸及びＯ−硫酸化デルマタン硫
酸の抗IIa 活性を示す図である。

【図１７】ヒアルロン酸及びＯ−硫酸化ヒアルロン酸の
抗IIa 活性を示す図である。

【図１８】ヘパラン硫酸及びＯ−硫酸化ヘパラン硫酸の
抗IIa 活性を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ロバートジェイリンハルトアメリカ合衆国アイオワ州アイオワシティーアイオワ大学薬学部内Ｆターム(参考） 4C086 AA01 AA02 AA03 EA26 EA27 MA01 MA04 NA05 NA14 ZA54 4C090 AA01 AA02 AA09 BA66 BA67 BA68 BA97 BB63 BB95 BD36 CA38 DA09 DA23

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸及びヒア
ルロン酸から成る群より選ばれるグリコサミノグリカン
中の水酸基が硫酸化されたＯ−過硫酸化グリコサミノグ
リカンであって、二糖繰り返し単位中の−ＯＳＯ₃ 基の
数が平均３．８以上である、Ｏ−過硫酸化グリコサミノ
グリカン又は薬理学的に許容できるその塩。
【請求項２】Ｏ−過硫酸化デルマタン硫酸又は薬理学
的に許容できるその塩である請求項１記載のＯ−過硫酸
化グリコサミノグリカン又は薬理学的に許容できるその
塩。
【請求項３】Ｏ−過硫酸化ヘパラン硫酸又は薬理学的
に許容できるその塩である請求項１記載のＯ−過硫酸化
グリコサミノグリカン又は薬理学的に許容できるその
塩。
【請求項４】Ｏ−過硫酸化ヒアルロン酸又は薬理学的
に許容できるその塩である請求項１記載のＯ−過硫酸化
グリコサミノグリカン又は薬理学的に許容できるその
塩。
【請求項５】二糖繰り返し単位中の−ＯＳＯ₃ 基の数
が平均３．９以上である、請求項１ないし４のいずれか
１項に記載のＯ−過硫酸化グリコサミノグリカン又は薬
理学的に許容できるその塩。
【請求項６】請求項１ないし５のいずれか１項に記載
のＯ−過硫酸化グリコサミノグリカン又は薬理学的に許
容できるその塩を有効成分として含有する抗血液凝固
剤。