CN105399870B - 一种低抗凝肝素、其低聚糖及其制备方法和在制备抗阿尔兹海默症的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种低抗凝肝素、其低聚糖及其制备方法和在制备抗阿尔兹海默症的药物中的应用。本发明通过将猪小肠粘膜粗品肝素经软骨素酶ABC处理去除硫酸软骨素和透明质酸、盐酸沉淀除去核酸、乙醇沉淀及阴离子交换树脂纯化，最终获得所述高纯度的低抗凝肝素，再进一步用肝素酶或β‑消除法降解得到不同分子量的低聚糖，本发明得到的所述低抗凝肝素分子量在10‑20 kDa之间，低聚糖分子量在1‑7 kDa之间，每个二糖单元平均含有1.5‑2.5个硫酸基。本发明所制备的低抗凝肝素及其低聚糖通过实验证明能显著抑制BACE1的活性，可用于制备抗阿尔兹海默症的药物。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种低抗凝肝素、其低聚糖及其制备方法和在制备抗阿尔兹海默症的药物中的应用。
背景技术
肝素(Heparin,HP)具有多种生物功能，目前主要作为抗凝血剂防止血栓形成，此外还具有调整血脂浓度、增强免疫、抗炎及抗过敏等多种功能。但是由于肝素临床应用时存在出血、血小板减少、高钾血症及骨质疏松等副作用，使其在其它活性方面的临床应用受到限制。因此，低抗凝肝素(Low anticoagulant heparin,LAH)类产品的研究成为热点。低抗凝肝素与肝素相比，具有抗凝活性较低、不与血小板因子4(PF4)抗体(platelet factor 4,PF4)结合，甚至可以在肝素活化PF4的浓度下抑制血小板的活化等优点，并且具有与肝素类似的抗阿尔兹海默症活性。
对天然来源的低抗凝肝素及其低聚糖在抗阿尔兹海默症活性方面的报道很少。中国专利CN 1286266A涉及低抗凝肝素及其衍生物在制备防治肝纤维化药物中的应用，所制备低抗凝肝素由肝素及低分子肝素经亲和层析或离子交换层析获得，分子量约为5000Da，主要针对其防治肝纤维化的应用。中国专利CN 102924627涉及具有抗肿瘤活性的低抗凝肝素的制备方法，所制备低抗凝肝素为以肝素为起始原料，经过完全脱硫酸化及特定位点重新硫酸化修饰制得，并非天然来源低抗凝肝素。WO 20130952276专利涉及的是一种对天然肝素进行高碘酸盐氧化制得的肝素衍生物，主要用于治疗疟疾。以上3个专利均不涉及低抗凝肝素在抗阿尔兹海默症方面的应用。
我国是全球粗品肝素主要生产国和出口国，粗品肝素在精制过程中有大量低抗凝肝素副产品，由于没有找到新用途，大多废弃造成生物资源浪费。
发明内容
本发明的目的是提供一种低抗凝肝素、其低聚糖及其制备方法和在制备抗阿尔兹海默症的药物中的应用。本发明从猪肠粘膜粗品肝素中分离得到一种天然的低抗凝肝素，并用肝素酶及β-消除法制备其低聚糖，所得低抗凝肝素及其低聚糖经试验证明可明显抑制BACE1的活性，具有抗阿尔兹海默症应用前景。
为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：
一种低抗凝肝素，所述低抗凝肝素以猪肠粘膜粗品肝素为原料，通过软骨素酶酶解、盐酸沉淀、乙醇沉淀和纯化而得，其分子量在10-20kDa之间，每个二糖单元含有1.5-2.5个硫酸基团。
进一步的，所述低抗凝肝素含有的8种不饱和二糖即△UA-GlcNAc、△UA-GlcNS、△UA-GlcNAc6S、△UA2S-GlcNAc、△UA-GlcNS6S、△UA2S-GlcNS、△UA2S-GlcNAc6S和△UA2S-GlcNS6S的含量分别在9.5-11.5％、6.4-8.3％、5.7-7.2％、2.2-3.5％、8.8-10.4％、12.0-13.9％、0.5-1.7％和46.3-50.2％之间。
本发明还提供了所述的低抗凝肝素的制备方法，它包括以下步骤：
(1)软骨素酶ABC酶解除去硫酸软骨素和透明质酸杂质：将猪肠粘膜粗品肝素溶解于酶解缓冲液中，离心去除不溶性杂质，加入过量的软骨素酶ABC，25～40℃摇床中反应4-6h后，煮沸使酶灭活；
(2)盐酸沉淀除去核酸杂质：将步骤(1)所得酶解液离心，向上清液中加入1-2M盐酸沉淀，离心去除核酸杂质，上清液用NaOH溶液中和至pH 6.5-7.5；
(3)乙醇沉淀：向步骤(2)溶液加入0.5-3倍体积的95％乙醇沉淀，离心后取沉淀,加蒸馏水复溶后对蒸馏水透析，透析内液减压浓缩干燥后得低抗凝肝素粗提物；
(4)粗品纯化：将步骤(3)所得低抗凝肝素粗提物用蒸馏水溶解，以0.5-1.5M氯化钠水溶液为流动相，经过强阴离子交换树脂分离纯化，硫酸苯酚法检测，合并收集含有低抗凝肝素组分，对蒸馏水透析，减压浓缩、冻干，得到高纯度低抗凝肝素。
进一步的，所述步骤(1)中酶解缓冲液包括0.05mol·L-1乙酸铵和2mmol·L-1氯化钙。
本发明还进一步提供了所述的低抗凝肝素降解后制得的低抗凝肝素低聚糖，所述低聚糖由所述低抗凝肝素采用肝素酶降解法或β-消除法制备而得，所述低抗凝肝素低聚糖分子量在1-7kDa之间，每个二糖单元含有1.5-2.5个硫酸基。
进一步的，所述肝素酶降解法的步骤为：将所述低抗凝肝素溶于酶解缓冲液中配成0.5-2.0wt％的溶液，加入2-10U/g的肝素酶于30-38℃反应4-48h，经Sephadex G10柱脱盐，减压浓缩、冻干，得到酶法制备的所述低抗凝肝素低聚糖。
进一步的，所述β-消除法的步骤为：
(1)将所述低抗凝肝素溶于水配成15-25mg/mL的水溶液，加入低抗凝肝素0.5-3倍重量的苄索氯铵，经乙醇沉淀、干燥得到低抗凝肝素-苄索氯铵盐；
(2)将低抗凝肝素苄索氯铵盐溶于二氯甲烷配制浓度为10-15mg/mL的溶液，加入低抗凝肝素-苄索氯铵盐0.5-0.8倍重量的氯化苄，25-40℃反应10-15h，加入2-2.5倍料液体积的乙醇，收集沉淀得到低抗凝肝素苄酯；
(3)将低抗凝肝素苄酯配成15-20mg/mL的水溶液，加入终浓度为0.4-0.8mol·L-1的NaOH溶液，40-80℃搅拌反应0.5-2h，用1mol·L-1的盐酸调pH至7.0，加入乙醇，收集沉淀，加水溶解后经Sephadex G10柱脱盐，冷冻干燥得β-消除法制备的所述低抗凝肝素低聚糖。
本发明还提供了所述的低抗凝肝素在制备抗阿尔兹海默症药物中的应用。
本发明还提供了所述的低抗凝肝素低聚糖在制备抗阿尔兹海默症的药物中的应用。
进一步的，所述低抗凝肝素低聚糖分子量在1kDa以上，且抗阿尔兹海默症活性与其分子量大小呈正相关。
与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：
(1)本发明原料为猪肠粘膜来源粗品肝素，原料来源丰富，安全可靠，成本低廉，适合大规模工业化生产。
(2)本发明采用的制备工艺简单，产率高达粗品肝素的10-15％。
(3)采用本发明方法制备的低抗凝肝素，产品纯度高，分子量为10-20kDa，每个二糖单元含有1.5-2.5个硫酸基团。
(4)采用本发明方法制备的低抗凝肝素及其低聚糖，避免了普通肝素出现的出血、血小板减少和骨质疏松等副作用，具有良好的抗阿尔兹海默症作用。
附图说明
图1为本发明所述低抗凝肝素的十八角激光散射仪图；
图2为本发明所述低抗凝肝素的红外光谱图；
图3为本发明所述低抗凝肝素的1H-NMR图；
图4为本发明所述低抗凝肝素的抗凝血活性图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进一步的详细说明，但本发明要求保护的范围并不局限于是实力表述的范围。
实施例1：低抗凝肝素的制备
本发明低抗凝肝素的制备方法具体包括以下步骤：
1、软骨素酶ABC酶解除去软骨素杂质：将从肝素生产厂购买的猪肠粘膜粗品肝素(10g)溶于3L酶解缓冲液(0.05mol·L-1乙酸铵，2mmol·L-1氯化钙)中，向其中加入50Unit软骨素酶ABC，于35℃摇床反应6h，沸水浴灭活10min。
2、盐酸沉淀除去核酸杂质：将酶解液离心，取上清液。搅拌下逐滴向所述上清液中加入1mol·L-1的盐酸至酶解液的pH为3.0，离心，取上清并用1mol·L-1的NaOH中和至pH7.0左右。
3、乙醇沉淀：将步骤2所得的溶液真空减压浓缩后，加入占浓缩后溶液1.5倍体积的乙醇，离心收集沉淀，沉淀复溶后对蒸馏水透析(截留分子量为7kDa)，至透析外液电导值不再变化，透析液经真空减压浓缩、真空冷冻干燥，得低抗凝肝素粗品。
4、粗品纯化：取低抗凝肝素粗品1g，用5mL水溶解，经QFF强阴离子交换柱(柱体积为300mL)进行分离纯化，用0.7mol·L-1NaCl洗脱3个柱体积，然后用0.9mol·L-1NaCl进行洗脱2个柱体积并收集洗脱液，经浓缩透析脱盐后，冷冻干燥，得到120mg低抗凝肝素。
实施例2：所述低抗凝肝素的结构表征
(1)绝对分子量测定与纯度分析：采用高效凝胶渗透色谱(HPGPC)-十八角激光光散射法(MALLs)联用测定所述低抗凝肝素的绝对分子质量并分析纯度。
色谱条件：色谱柱：Shodex OHPak SB804HQ色谱柱与Shodex OHPak SB802.5HQ色谱柱串联；流动相：0.1mol·L-1Na2SO4水溶液；示差检测器与十八角激光光散射仪串联在线检测测定低抗凝肝素的分子量；样品在HPGPC谱图中程单一对称峰(如图1所示)，样品纯度很高，测得其绝对分子质量为10.24kDa。
(2)二糖组成分析：将低抗凝肝素(LAH)配成20mg·mL-1的水溶液，取20μL加入140μL酶解缓冲液、10μL肝素酶I、II、III。采用SAX-HPLC法进行二糖组成分析。检测波长：232nm。流动相A：2mmol·L-1磷酸盐；流动相B：1.14mol·L-1NaClO4溶液，洗脱条件为0-20min，A由97％降为65％；20-50min，A由65％变为0。结果如表1，LAH的硫酸化程度低于肝素标准品却高于硫酸乙酰肝素，平均每个二糖单元含2.11个硫酸基团。
所述低抗凝肝素的8种不饱和二糖即△UA-GlcNAc(IV-A)、△UA-GlcNS(IV-S)、△UA-GlcNAc6S(II-A)、△UA2S-GlcNAc(III-A)、△UA-GlcNS6S(II-S)、△UA2S-GlcNS(III-S)、△UA2S-GlcNAc6S(I-A)和△UA2S-GlcNS6S(I-S)的含量如表1所示。
表1低抗凝肝素LAH的二糖组成及电荷密度分析表
(3)红外光谱分析：本发明所制备的低抗凝肝素的红外光谱图如图2所示。940cm-1为吡喃糖环的振动吸收峰，1046cm-1处为糖环C-O-H、C-O-C的吸收峰，2929cm-1为糖C-H特征吸收峰，3345cm-1处为-OH伸缩振动，1626cm-1左右为GlcNAc中C＝O吸收峰，1423cm-1处为GlcA的C＝O吸收，1234cm-1左右则为S＝O伸缩振动，此外，885cm-1左右明显的伸缩振动代表GlcA的βC-H，而807cm-1处左右为C2、C6-OSO3 -的O-S伸缩振动。
(4)核磁共振氢谱(1H-NMR)分析：取40mg低抗凝肝素(LAH)进行重水交换后转移到核磁管中，以氘代丙酮为内标，在25℃进行1H-NMR分析。结果如图3，LAH较纯，不含蛋白、核酸及其它非乙酰肝素类的GAGs等杂质。LAH中GlcNS及IdoA含量比HP高，而GlcNS6S及IdoA2S含量比HP低，其硫酸化程度比HP低。
实施例3：低抗凝肝素的抗凝血活性
按照试剂盒所示步骤测定样品对FXa和FIIa活性的抑制作用，样品起始浓度分别为0.001、0.01、0.1、1、10和100μg·mL-1。分别向96孔板各孔中加入20μL抗凝血酶III(ATIII)和20μL样品溶液，37℃孵育1min，再加入40μL FXa或FIIa，37℃孵育1min，加入100μL FXa或FIIa的底物，37℃孵育4min，最后加入100μL终止液，405nm波长检测吸光值，计算抑制率：结果(图4)显示，LAH具有较弱的抗凝血活性，抗凝血活性远低于HP和ES标准品，略高于HS标准品的抗凝血活性。
实施例4：酶法制备低抗凝肝素低聚糖
取所述低抗凝肝素1.8g配成1wt％的水溶液，加入5U的肝素酶I，35℃摇床反应，分别于6、12、18、22、30、35、42和45h取样2mL，100℃加热5min将酶灭活，经G10柱脱盐，冷冻干燥，得到的低抗凝肝素低聚糖的分子量分别为7、5.2、3.6、3.1、2.5、2.0、1.5及1.1kDa，分别命名为OLAH1-OLAH8。
实施例5：β-消除法制备低抗凝肝素低聚糖
1、取所述低抗凝肝素30mg溶于2mLH2O中，缓慢加入150mg·mL-1苄索氯铵150μL，继续搅拌1h后静置离心，沉淀真空干燥得低抗凝肝素-苄索氯铵盐。
2、将低抗凝肝素-苄索氯铵盐溶于二氯甲烷中配成10mg/mL的溶液，加入30mg氯化苄，37℃搅拌14h后加入占溶液2倍体积的乙醇，静置离心，沉淀真空干燥得低抗凝肝素苄酯。
3、将低抗凝肝素苄酯配成15mg·mL-1的水溶液，加入终浓度为0.6mol·L-1的NaOH溶液，60℃搅拌反应1.5h后用1mol·L-1的盐酸调pH至7.0，加入4倍乙醇醇沉，沉淀溶解后经Sephadex G10柱脱盐，冷冻干燥得低抗凝肝素低聚糖OLAH，分子量为5.3kDa。
实施例6：低抗凝肝素及其低聚糖体外抗阿尔兹海默症(抑制BACE-1活性)的活性
利用试剂盒(BACE1FRET Assay Kit)测定低抗凝肝素及其低聚糖对BACE1活性的抑制作用，从而判断其抑制阿尔兹海默症的活性。于384孔板中加入10μL1000-0.0001μg/mL的样品溶液(或缓冲液)，再加入10μL BACE1的底物，轻微摇匀后，加入10μL BACE1，室温孵育1h后，于Ex545/Em585波长下进行荧光扫描，测定荧光值，计算抑制率。
结果如表2所示，LAH活性略低于HP标准品，却高于HS和ES标准品，其低聚糖的活性均低于低抗凝肝素，且与其分子量大小呈正相关，分子量越大，活性越高，其中OLAH1-OLAH4及OLAH活性很好，OLAH5和OLAH6活性较好，OLAH7-OLAH8几乎无活性。结果表明，低抗凝肝素及分子量在2kDa以上的低聚糖有较好的抗阿尔兹海默症活性。
表2低抗凝肝素及其低聚糖与HP、HS、ES标准品的抑制BACE1的活性
综上，本发明以猪肠粘膜来源粗品肝素为原料纯化制备低抗凝肝素，并用肝素酶I或β-消除法降解得到不同分子量的低聚糖，发现本发明中的低抗凝肝素分子量在10-20kDa之间，每个二糖单元含有1.5-2.5个硫酸基，为一种新型天然来源的低抗凝肝素，制备得到的低聚糖分子量在1-7kDa之间。本发明所制备的低抗凝肝素及其低聚糖抗凝血活性很低，体外能显著抑制BACE1的活性，具有很好的抗阿尔兹海默症活性。
以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (8)
1.一种低抗凝肝素，其特征在于：所述低抗凝肝素以猪肠粘膜粗品肝素为原料，通过软骨素酶酶解、盐酸沉淀、乙醇沉淀和纯化而得，其分子量在10-20 kDa之间，每个二糖单元含有1.5-2.5个硫酸基团；所述低抗凝肝素含有的8种不饱和二糖即△UA-GlcNAc、△UA-GlcNS、△UA-GlcNAc6S、△UA2S-GlcNAc、△UA-GlcNS6S、△UA2S-GlcNS、△UA2S-GlcNAc6S和△UA2S-GlcNS6S的含量分别在9.5-11.5 %、6.4-8.3 %、5.7-7.2 %、2.2-3.5 %、8.8-10.4%、12.0-13.9 %、0.5-1.7 %和46.3-50.2 %之间。
2.根据权利要求1所述的低抗凝肝素的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：
(1) 软骨素酶ABC酶解除去硫酸软骨素和透明质酸杂质：将猪肠粘膜粗品肝素溶解于酶解缓冲液中，离心去除不溶性杂质，加入过量的软骨素酶ABC，25~40 ℃摇床中反应4-6 h后，煮沸使酶灭活；所述酶解缓冲液包括0.05 mol•L-1乙酸铵和2 mmol•L-1氯化钙；
(2) 盐酸沉淀除去核酸杂质：将步骤(1)所得酶解液离心，向上清液中加入1-2M盐酸沉淀，离心去除核酸杂质，上清液用NaOH溶液中和至pH 6.5-7.5；
(3) 乙醇沉淀：向步骤(2)溶液加入0.5-3倍体积的95 %乙醇沉淀，离心后取沉淀, 加蒸馏水复溶后对蒸馏水透析，透析内液减压浓缩干燥后得低抗凝肝素粗提物；
(4) 粗品纯化：将步骤(3)所得低抗凝肝素粗提物用蒸馏水溶解，以0.5-1.5 M氯化钠水溶液为流动相，经过强阴离子交换树脂分离纯化，硫酸苯酚法检测，合并收集含有低抗凝肝素组分，对蒸馏水透析，减压浓缩、冻干，得到高纯度低抗凝肝素。
3.权利要求1所述的低抗凝肝素降解后制得的低抗凝肝素低聚糖，其特征在于所述低聚糖由所述低抗凝肝素采用肝素酶降解法或β-消除法制备而得，所述低抗凝肝素低聚糖分子量在1-7 kDa之间，每个二糖单元含有1.5-2.5个硫酸基。
4.根据权利要求3所述的低抗凝肝素低聚糖，其特征在于：所述肝素酶降解法的步骤为：将所述低抗凝肝素溶于酶解缓冲液中配成0.5-2.0 wt %的溶液，加入2-10 U/g的肝素酶于30-38 ℃反应4-48 h，经Sephadex G10柱脱盐，减压浓缩、冻干，得到酶法制备的所述低抗凝肝素低聚糖。
5.根据权利要求3所述的低抗凝肝素低聚糖，其特征在于：所述β-消除法的步骤为：
（1）将所述低抗凝肝素溶于水配成15 -25 mg/mL的水溶液，加入低抗凝肝素0.5-3倍重量的苄索氯铵，经乙醇沉淀、干燥得到低抗凝肝素-苄索氯铵盐；
（2）将低抗凝肝素苄索氯铵盐溶于二氯甲烷配制浓度为10-15 mg/mL的溶液，加入低抗凝肝素-苄索氯铵盐0.5-0.8倍重量的氯化苄，25-40 ℃反应10-15 h，加入2-2.5倍料液体积的乙醇，收集沉淀得到低抗凝肝素苄酯；
（3）将低抗凝肝素苄酯配成15-20 mg/mL的水溶液，加入终浓度为0.4-0.8 mol•L-1的NaOH溶液，40-80 ℃搅拌反应0.5-2 h，用1 mol•L-1的盐酸调pH至7.0，加入乙醇，收集沉淀，加水溶解后经Sephadex G10柱脱盐，冷冻干燥得β-消除法制备的所述低抗凝肝素低聚糖。
6.权利要求1所述的低抗凝肝素在制备抗阿尔兹海默症药物中的应用。
7.权利要求3-5任一项所述的低抗凝肝素低聚糖在制备抗阿尔兹海默症的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的低抗凝肝素低聚糖在制备抗阿尔兹海默症的药物中的应用，其特征在于：所述低抗凝肝素低聚糖分子量在1 kDa以上，且抗阿尔兹海默症活性与其分子量大小呈正相关。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |