CN115448994B - 一种可中和抗凝低分子量肝素及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种可中和抗凝低分子量肝素及其制备方法和应用。本发明以胞外多糖K5CPS为原料，采用化学酶法半合成技术制备所述可中和抗凝低分子量肝素，具体包括化学法与多种酶催化法有序进行的步骤，制备得到的可中和抗凝低分子量肝素为非动物源低分子量肝素，兼具动物源未分级肝素(UFH)和低分子量肝素(LMWH)的优点，抗凝活性高，且可以被鱼精蛋白中和，安全性更高，适合开发成为更优质的肝素类药物，用于临床抗凝和血栓性疾病的治疗，具有重大产业化和临床应用前景。

Description

一种可中和抗凝低分子量肝素及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种可中和抗凝低分子量肝素及其制备方法和应用。
背景技术
肝素是一种天然抗凝剂，在体内外均具有抗凝活性，临床常用于预防及治疗动静脉血栓，已使用九十多年，至今仍发挥着不可替代的作用。肝素属于糖胺聚糖家族，是由糖醛酸残基α-L-艾杜糖醛酸(IdoA)或β-D-葡萄糖醛酸(GlcA)与氨基葡萄糖(GlcN)残基以1，4-糖苷键连接形成的双糖单元交替连接形成的、高度硫酸化的聚阴离子型线性多组分混合物。肝素依赖与抗凝血酶(antithrombin，AT)结合的戊糖序列发挥抗FXa作用，而发挥抗FIIa作用必须有戊糖序列和其非还原端额外的13个单糖单位的共同参与。目前商品化肝素主要包括普通肝素、低分子量肝素，其中普通肝素又称未分级肝素(unfractionatedheparin，UFH)，主要是从动物组织中提取得到，分子量分布范围为5-40kDa，重均分子量(weight-average molecular weight，Mw)为17-20kDa；低分子量肝素(low-molecular-weight heparin,LMWH)主要是由UFH经物理、化学或酶法部分解聚得到的Mw小于8000Da的多组分寡糖混合物。英国药典规定：LMWH的Mw一般不得大于8000Da且其中至少有60％的组分处于这一范围内。LMWH具有高的生物利用度、长的半衰期，可预测的剂量反应，通常没有必要进行监测，因此允许门诊使用和患者自我给药，故近年逐渐替代UFH成为首选临床抗凝药物。但LMWH与UFH相比抗凝活性偏低，而且其抗凝作用仅部分能被硫酸鱼精蛋白快速中和，增加抗凝治疗结束或过量用药时的出血风险。需要指出的是，UFH经不同的方法解聚得到的LMWH(如依诺肝素、达肝素、那屈肝素等)，尽管仍以IdoA2S-GlcNS6S为主要双糖单元，但其微观结构、重均分子量Mw和抗凝活性不可避免的存在明显差异，这些差异会进一步影响药物的药代动力学/药效学，所以不同工艺制备的LMWH应被视为不同的肝素药物。
现有动物源肝素UFH及不同LMWH虽然具有成本相对低廉、来源丰富、生产工艺成熟等优点，但其安全性一直广受关注。因动物组织原料中可能含有病毒以及传播病毒性疾病的传染源，比如牛、羊携带的能引起“疯牛病”、“疯羊病”的朊病毒，导致牛羊来源的肝素减少，使相对较“干净”的猪小肠黏膜被多个国家规定为制备UFH的唯一来源。但肝素需求的增加和猪数量供应的有限性，揭示了动物源肝素供应链的脆弱性。动物源肝素主要使用的原料(肠黏膜)存在被污染并转移到最终药品的风险。如2007年至2008年出现的肝素钠危机，原因是被混入多硫酸软骨素的肝素和低分子量肝素进入市场，仅在美国就造成近百人死亡，考虑到肝素在临床应用中的重要价值，寻求新的不依赖于动物组织提取的肝素制备策略受到广泛关注。
大肠杆菌K5(E.coliK5)等微生物能产生一种特殊的胞外多糖(K5CPS)，是由重复GlcNAc-GlcA双糖单元以1，4-糖苷键连接而成的高分子量糖胺聚糖，是未经修饰的肝素前体(heparosan)多糖，制备工艺简单，来源可控，被认为是制备非动物源抗凝肝素或其衍生物的理想原料。然而，如何高效将肝素前体多糖(Mw达50kDa)修饰转化为抗凝活性、安全性与动物源肝素相当甚至更优的“非动物源肝素”，是糖药物研究者面临的一个巨大挑战。单纯的化学修饰方法反应条件剧烈、选择性差，且无法使糖链的GlcA残基转变为肝素所必需的2-O-硫酸化艾杜糖醛酸(IdoA2S)，不可能将K5CPS转化为抗凝肝素药物。相比之下，以多酶催化为主的化学酶法修饰被认为是较为可行的策略。例如Linhardt课题组采用化学酶法直接修饰肝素前体多糖得到“生物工程肝素”，其双糖单元、重均分子量(18kDa)及抗凝活性与动物源UFH较为相似(Appl Microbiol Biotechnol，2011，91:91-9)。最近，该团队借助碱法高温解聚与化学酶法修饰相结合，将heparosan转化为Mw(4350Da)、抗Xa/IIa活性与依诺肝素相当的LMWH类似物，但解聚条件过于剧烈，规模化制备时难以建立高效稳定的工艺(ACS Chem.Biol.2022,17:637–646)。
尽管目前以肝素前体heparosan为原料已经能够制得非动物源LMWH，但其部分解聚步骤是作用于heparosan或其N-硫酸化产物的随机过程，得率低(<15％)，所得非动物源LMWH的产率和抗凝活性均偏低，因此无论从制备工艺成本，还是从临床抗凝治疗效果与安全性考虑，上述公开的非动物源LMWH都难以成为可替代依诺肝素等的动物源肝素的抗凝药物。现有技术更不可能将肝素前体多糖转化为抗凝活性更强、可被鱼精蛋白高效快速中和的优质非动物源低分子量肝素。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可中和抗凝低分子量肝素及其制备方法和应用，本发明所述可中和抗凝低分子量肝素为非动物源低分子量肝素，抗凝活性高，且可以被鱼精蛋白中和。
本发明提供了一种可中和抗凝低分子量肝素，所述可中和抗凝低分子量肝素的结构包括1个式(Ⅰ)、a个式(Ⅱ)和b个式(Ⅲ)，所述1个式(Ⅰ)、a个式(Ⅱ)和b个式(Ⅲ)任意组合并以α-1,4-糖苷键连接；
其中，式(I)位于非还原末端，a为3～12之间的整数，b为1～5之间的整数，且a+b＝4～15；
R1、R2、R3分别为磺酸基(-SO3H)或氢基(-H)，R2中SO3H与H的数量比≥3：1；
优选的，所述可中和抗凝低分子量肝素的结构中包括1～3个如式(Ⅳ)所示结构：
优选的，所述可中和抗凝低分子量肝素的重均分子量为3000Da～8000Da。
本发明还提供了上述技术方案中所述可中和抗凝低分子量肝素的制备方法，包括如下步骤：
1)采用N-脱乙酰化/N-硫酸化将胞外多糖K5CPS中的N-乙酰葡萄糖胺残基修饰为N-硫酸化葡萄糖胺(GlcNS)，得到中间产物NS-H；
2)以肝素C-5差向异构酶和肝素2-O-硫酸基转移酶对所述中间产物NS-H进行共同催化修饰，使所述中间产物NS-H的糖链中部分葡萄糖醛酸残基转变为2-O-硫酸化艾杜糖醛酸，得到中间产物2S-NSH；
所述中间产物2S-NSH中IdoA2S的摩尔百分含量为20～85％，五糖序列GlcNR-GlcA-GlcNS-IdoA2S-GlcNS的摩尔百分含量为5～25％；
3)对所述中间产物2S-NSH部分解聚，得到以△-4,5位不饱和糖醛酸(ΔU)或2-O-硫酸化ΔU(ΔU2S)为非还原末端的低分子量产物L2S；
采用β-消除法、肝素酶III或肝素酶I对所述中间产物2S-NSH进行所述部分解聚，所得低分子量产物L2S的重均分子量为2000Da～7500Da，IdoA2S含量不少于40％，五糖序列含量不少于7％。
4)以肝素6-O-硫酸基转移酶催化所述以ΔU或ΔU2S为非还原末端的低分子量产物L2S，使GlcNS残基发生6-O-硫酸化修饰，得到L6S；
5)以肝素3-O-硫酸基转移酶1催化所述L6S，使特定葡萄糖胺发生3-O-硫酸化修饰，得到所述可中和抗凝低分子量肝素；所述可中和抗凝低分子量肝素包括β-L3S、EIII-L3S或EI-L3S。
优选的，依据所述中间产物2S-NSH中IdoA2S及五糖序列的含量选择所述部分解聚的方式：
当所述中间产物2S-NSH中IdoA2S的含量为45％～75％，所述五糖序列GlcNR-GlcA-GlcNS-IdoA2S-GlcNS的含量为7～25％时，以β-消除法进行所述部分解聚，选择性部分切割GlcNS-IdoA2S之间的糖苷键，得到以ΔU2S为非还原末端的低分子量产物β-L2S；
当所述中间产物2S-NSH中IdoA2S的含量为20％～50％，所述五糖序列GlcNR-GlcA-GlcNS-IdoA2S-GlcNS的含量为5～20％，时，采用肝素酶III进行所述部分解聚，特异部分切割GlcNS-GlcA之间的连接，得到以ΔU为非还原末端的低分子量产物EIII-L2S；
当所述中间产物2S-NSH中IdoA2S的含量为40％～75％，所述五糖序列GlcNR-GlcA-GlcNS-IdoA2S-GlcNS的含量为7～25％时，采用肝素酶Ⅰ进行所述部分解聚，特异部分切割GlcNS-IdoA2S之间的连接，得到以ΔU2S为非还原末端的低分子量产物EI-L2S。
优选的，所述β-消除法的步骤包括：
将所述中间产物2S-NSH与苄索氯铵于水中混合反应，收集不溶于水的2S-NSH的季铵盐产物；
将干燥的季铵盐产物溶于N,N-二甲基甲酰胺，将得到的溶液与氯化苄混合进行酯化反应，与醋酸钠甲醇溶液混合终止反应，得到苄酯中间产物；
将所述苄酯中间产物与氢氧化钠水溶液混合，加热条件下进行部分解聚反应，得到所述低分子量产物β-L2S；
优选的，所述β-消除法部分解聚在下述任一项或多项反应条件下进行：
1)：所述中间产物2S-NSH浓度为0.05～0.5g/mL，所述苄索氯铵与所述中间产物2S-NSH的质量比≥2；
2)：所述N,N-二甲基甲酰胺与所述干燥的2S-NSH季铵盐的体积质量比≥3～8mL：1g，所述氯化苄与所述溶液的体积比为0.5～1，所述醋酸钠甲醇溶液的浓度为8～10％；
3)：所述酯化反应的温度为25～40℃，时间为12～30h；
4)：所述氢氧化钠水溶液的浓度为0.05～0.15M，所述部分解聚反应的温度为30～65℃，时间为20～90min。
优选的，采用所述肝素酶III或肝素酶I进行所述部分解聚的步骤包括：
将所述中间产物2S-NSH与肝素酶III或肝素酶I在Tris缓冲溶液中混合，进行部分解聚反应，得到所述低分子量产物EIII-L2S或低分子量产物EI-L2S。
优选的，采用所述肝素酶III或肝素酶I进行所述部分解聚时，满足以下一项或多项条件：
a：所述Tris缓冲溶液含50mM Tris-HCl和10mM CaCl2，pH为7.0～7.5；
b：所述肝素酶III或肝素酶I部分解聚反应的温度分别为20～37℃；
c：采用所述肝素酶Ⅲ进行所述部分解聚时，所述中间产物2S-NSH的浓度为0.5～5.0mg/mL，所述肝素酶III在所述Tris缓冲溶液中的浓度为0.06～1.4mg/mL；
d：采用所述肝素酶I进行所述部分解聚时，所述中间产物2S-NSH的浓度为0.5～5.0mg/mL，肝素酶I在所述Tris缓冲溶液中的浓度为0.18～0.24mg/mL。
优选的，步骤2)所述共同催化修饰的步骤包括：
将所述中间产物NS-H溶于MES缓冲溶液，与肝素C-5差向异构酶混合，进行异构化反应后，与肝素2-O-硫酸基转移酶和硫酸基供体PAPS混合，进行硫酸化修饰，得到所述中间产物2S-NSH；
所述缓冲溶液含50mM MES和2mM CaCl2，所述缓冲溶液的pH为7.0～7.5；
优选的，步骤2)所述共同催化修饰在下述A～C任一项或多项反应条件下进行：
A：所述异构化反应的温度为20～37℃，时间为0.5～2.0h；
B：所述肝素C-5差向异构酶与肝素2-O-硫酸基转移酶的质量比和加入量不作限定；
C：所述硫酸基供体PAPS的用量为NS-H所含的GlcA残基的摩尔当量的1.1倍及以上。
优选的，步骤4)所述肝素6-O-硫酸基转移酶催化的步骤包括：
将所述低分子量产物L2S溶于MES缓冲溶液后，与6-O-硫酸基转移酶1、6-O-硫酸基转移酶3和硫酸基供体PAPS混合，对GlcNS进行6-O-硫酸化修饰，得到所述L6S。
步骤4)所述肝素6-O-硫酸基转移酶催化在下述a～c任一项或多项反应条件下进行：
a：所述6-O-硫酸基转移酶1和6-O-硫酸基转移酶3的质量比和加入量不作限定；
b：所述硫酸基供体PAPS的用量为所述低分子量产物L2S所含GlcNS残基摩尔当量的1.1倍及以上；
c：所述缓冲溶液含50mM MES和2mM CaCl2，pH为7.0～7.5；
d：所述6-O-硫酸化修饰的反应温度为20～37℃，反应终点为所述L6S所含双糖单元IdoA2S-GlcNS6S的百分比为45％～90％。
优选的，步骤5)所述肝素3-O-硫酸基转移酶1催化的步骤包括：
将所述L6S在MES缓冲溶液中与3-O-硫酸基转移酶1混合后，与硫酸基供体PAPS混合后选择性地对葡萄糖胺进行3-O-硫酸化修饰，得到所述L3S。
步骤5)所述肝素3-O-硫酸基转移酶1催化的步骤在下述A)～C)任一项或多项的反应条件下进行：
A)所述缓冲溶液含50mM MES和2mM CaCl2，pH为7.0～7.5；
B)所述硫酸基供体PAPS的用量为GlcNS6S残基摩尔当量的1.1倍及以上；
C)所述3-O-硫酸化修饰的温度为20～37℃。
优选的，步骤1)所述化学法N-脱乙酰化/N-硫酸化的步骤包括：
将胞外多糖K5CPS溶解于氢氧化钠溶液中，加热处理，以使胞外多糖K5CPS的N-乙酰葡萄糖胺残基发生N-脱乙酰化，调节pH至7.0～8.0，以三氧化硫-三甲胺复合物为硫酸基供体对葡糖胺残基进行N-硫酸化定点修饰，得到所述中间产物NS-H；
所述胞外多糖K5CPS的重均分子量＞10kDa，来源于天然微生物大肠杆菌K5、多杀性巴氏杆菌、副鸡禽杆菌、或者人工构建的工程菌株；
步骤1)所述化学法N-脱乙酰化/N-硫酸化在下述Ⅰ～Ⅳ任一项或多项反应条件下进行：
Ⅰ：所述氢氧化钠溶液的浓度为2M；
Ⅱ：所述加热处理的温度为55～65℃，时间为5～10h；
Ⅲ：所述三氧化硫-三甲胺复合物与所述胞外多糖K5CPS的质量比≥3：1；
Ⅳ：所述N-硫酸化定点修饰的温度为45～50℃，时间为20～30h。
本发明还提供了上述技术方案所述的可中和抗凝低分子量肝素或所述的制备方法得到的可中和抗凝低分子量肝素在制备防治血栓性疾病的药物中的应用。
有益效果：
本发明提供了一种可中和抗凝低分子量肝素，所述可中和抗凝低分子量肝素包括1个式(Ⅰ)、a个式(Ⅱ)和b个式(Ⅲ)，所述1个式(Ⅰ)、a个式(Ⅱ)和b个式(Ⅲ)任意组合并以α-1,4-糖苷键连接；
其中，式(I)位于非还原末端，a为3～12之间的整数，b为1～5之间的整数，且a+b＝4～15；R1、R2、R3分别为磺酸基(-SO3H)或氢基(-H)，R2中SO3H与H的数量比≥3：1；
本发明所述可中和抗凝低分子量肝素为非动物源低分子量肝素，其重均分子量为5500Da～8000Da，兼具动物源未分级肝素(UFH)和低分子量肝素(LMWH)的优点，抗凝活性高，且可以被鱼精蛋白中和，安全性更高，适合开发成为更优质的肝素类药物，用于临床抗凝和血栓性疾病的治疗，具有重大产业化和临床应用前景。
本发明还提供了所述可中和抗凝低分子量肝素的制备方法，以胞外多糖K5CPS为原料，采用化学酶法半合成技术进行制备，具体包括化学法与多种酶催化法有序进行的步骤：将胞外多糖K5CPS经化学法N-脱乙酰化/N-硫酸化修饰后，经酶法部分C-5差向异构化/2-O-硫酸化修饰，生成含IdoA2S的关键中间产物2S-NSH；然后合理选择β-消除法、肝素酶III或肝素酶I进行部分解聚生成低分子量样品L2S，接着依次进行6-O-硫酸化修饰、3-O-硫酸化修饰，得到具有抗FXa、FIIa活性的非动物源低分子量肝素，可被鱼精蛋白中和。
本发明首次将适度修饰的中间体2S-NSH与特定解聚技术关联，实现基于β-消除法、肝素酶III或肝素酶I的可控性解聚，所得低分子量中间体L2S产率>30％，最终K5CPS转化为LMWH的总产率>15％；同时，β-消除法是首次发现的可用于2S-NSH的部分解聚方法，选择性断裂GlcNS-IdoA2S之间的糖苷键，不破坏GlcNS-GlcA之间的糖苷键；再者，通过调控中间产物2S-NSH与低分子量产物L2S的五糖序列(GlcNR-GlcA-GlcNS-IdoA2S-GlcNS)，可将低分子量产物L2S修饰成高抗凝活性的LMWH，其抗Xa活性可达150IU/mg；进一步的，低分子量产物L2S的重均分子量可在2kDa～7.5kD之间调控、分子量分布窄，最终得到重均分子量3kDa～8kDa的LMWH产物，其中重均分子量为5.5kDa～8kDa的产物的抗凝活性是鱼精蛋白可高效中和的。
本发明所述方法为制备具有肝素典型结构特征、显著抗凝活性和抗凝活性可被中和的低分子量肝素的新方法，原料为K5CPS多糖，原料供应不受限制且无安全风险；采用的化学酶法反应条件温和、高效，所得产物易分离、收率高，能够实现结构均一性好、抗凝活性强、安全性高的低分子量肝素的规模化制备。
术语说明：
UFH：未分级肝素；LMWH：低分子量肝素；AT：抗凝血酶；PAPS：3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸。
胞外多糖K5CPS：又称肝素前体heparosan，是由β-D-葡萄糖醛酸(GlcA)和α-D-N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)二糖重复单元[-GlcA-β(1,4)-GlcNAc-α(1,4)-]n组成的糖胺聚糖；NST：N-硫酸基转移酶；C5-epi：C5-异构化酶；2-OST：2-O-硫酸基转移酶；6-OST1/3：6-O-硫酸基转移酶1和3；
3-OST：3-O-硫酸基转移酶；N-LMWH：可中和低分子量肝素。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为胞外多糖K5CPS双糖分析色谱图；图中，横坐标为保留时间，纵坐标为232nm处的吸光值；
图2为胞外多糖K5CPS的1HNMR谱图；
图3为NS-H双糖分析色谱图；图中，横坐标为保留时间，纵坐标为232nm处的吸光值；
图4为NS-H的1H NMR谱图；
图5为2S-NSH双糖分析的高效液相色谱图；图中，横坐标为保留时间，纵坐标为232nm处的吸光值；
图6为2S-NSH的HSQC谱图；
图7-1～7-3为经由肝素酶降解2S-NSH前后双糖分析色谱图；图7-1为降解前2S-NSH双糖分析色谱图；图7-2为经肝素酶III降解后双糖分析色谱图；图7-3为经肝素酶I降解后双糖分析色谱图；图中，横坐标为保留时间，纵坐标为232nm处的吸光值；
图8为经由β-消除降解2S-NSH前后双糖分析色谱图；图中，A为降解前2S-NSH双糖分析色谱图；B为经β-消除降解后双糖分析色谱图；图中，横坐标为保留时间，纵坐标为232nm处的吸光值；
图9-1～9-3为L6S(EIII-L6S、EI-L6S、β-L6S)双糖分析色谱图；图9-1为EIII-L6S双糖分析色谱图；图9-2为EI-L6S双糖分析色谱图；图9-3为β-L6S双糖分析色谱图；图中，横坐标为保留时间，纵坐标为232nm处的吸光值；
图10-1～10-4为L3S(EIII-L3S、EI-L3S、β-L3S)双糖分析色谱图；图10-1为EIII-L3S双糖分析色谱图；图10-2为EI-L3S双糖分析色谱图；图10-3为β-L3S双糖分析色谱图；图10-4为依诺肝素钠双糖分析色谱图；图中，横坐标为保留时间，纵坐标为232nm处的吸光值；
图11-1、11-2和11-3分别为EIII-L3S、EI-L3S、β-L3S的HSQC谱图；
图12为鱼精蛋白对可中和低分子量肝素β-L3S抗凝活性的体外中和率测定图；
图13为可中和低分子量肝素的血浆抗FXa活性测定结果图；
图14-1、14-2和14-3分别为可中和低分子量肝素高、中、低三个浓度对血栓湿重、动脉血栓大鼠血浆的APTT值和动脉血栓大鼠血浆的PT值的影响；
图15-1、15-2和15-3分别为可中和低分子量肝素高、中两个浓度对血栓湿重、动脉血栓大鼠血浆的APTT值和动脉血栓大鼠血浆的PT值的影响；
图16为鱼精蛋白对可中和低分子量肝素体内抗凝活性中和程度评价结果；
在图14-1、14-2、14-3，图15-1、15-2、15-3和图16中，PBS组表示阴性对照组，依诺肝素钠组表示阳性对照组；
在图6、图11-1、11-2和11-3中横坐标代表氢谱的化学位移值，纵坐标代表碳谱的化学位移值。
具体实施方式
本发明提供了一种可中和抗凝低分子量肝素，所述可中和抗凝低分子量肝素包括1个式(Ⅰ)、a个式(Ⅱ)和b个式(Ⅲ)，所述1个式(Ⅰ)、a个式(Ⅱ)和b个式(Ⅲ)任意组合并以α-1,4-糖苷键连接；
其中，式(I)位于非还原末端，a为3～12之间的整数，b为1～5之间的整数，且a+b＝4～15；
R1、R2、R3分别为磺酸基(-SO3H)或氢基(-H)，R2中SO3H与H的数量比≥3：1；
本发明所述可中和抗凝低分子量肝素的结构中优选包括1～3个如式(Ⅳ)所示结构：
本发明所述a优选为7～12，具体可优选为7、8、9、10、11或12；所述a+b优选为8～15，具体可优选为8、9、10、11、12、13、14或15。本发明所述任意组合优选指在本发明限定的范围内可以将式(Ⅰ)、式(Ⅱ)和式(Ⅲ)以任意数量和顺序进行组合和连接，并形成多个结构化合物。本发明所述可中和抗凝低分子量肝素优选为混合物。
本发明所述可中和抗凝低分子量肝素的重均分子量优选为3000Da～8000Da，更优选为5500Da～8000Da。本发明所述可中和抗凝低分子量肝素的抗FXa活性优选＞50IU/mg，更优选＞90IU/mg；抗FXa和FIIa活性比优选＞2；体外抗凝活性被硫酸鱼精蛋白中和的程度优选＞30％，更优选＞50％。
本发明还提供了上述技术方案所述可中和抗凝低分子量肝素的制备方法，包括如下步骤：
1)采用化学法N-脱乙酰化/N-硫酸化将胞外多糖K5CPS中的N-乙酰葡萄糖胺修饰为N-硫酸化葡萄糖胺(GlcNS)，得到中间产物NS-H；
2)以肝素C-5差向异构酶和肝素2-O-硫酸基转移酶对所述中间产物NS-H进行共同催化修饰，使所述中间产物NS-H的糖链中部分葡萄糖醛酸残基转变为2-O-硫酸化艾杜糖醛酸(IdoA2S)，得到中间产物2S-NSH；
所述中间产物2S-NSH中IdoA2S的摩尔百分含量为20～85％，五糖序列GlcNR-GlcA-GlcNS-IdoA2S-GlcNS的含量为5～25％；
3)对所述中间产物2S-NSH部分解聚，得到以△-4,5位不饱和糖醛酸(ΔU)或2-O-硫酸化ΔU(ΔU2S)为非还原末端的低分子量产物L2S；
采用β-消除法、肝素酶III或肝素酶I对所述中间产物2S-NSH进行所述部分解聚，所得低分子量产物L2S的重均分子量为2000Da～7500Da，IdoA2S含量不少于40％，五糖序列含量不少于7％。4)以肝素6-O-硫酸基转移酶催化所述以ΔU或ΔU2S为非还原末端的低分子量产物L2S，使GlcNS残基发生6-O-硫酸化修饰，得到L6S；
5)以肝素3-O-硫酸基转移酶1催化所述L6S，使特定葡萄糖胺发生3-O-硫酸化修饰，得到所述可中和抗凝低分子量肝素；所述可中和抗凝低分子量肝素包括β-L3S、EIII-L3S或EI-L3S。
本发明采用N-脱乙酰化/N-硫酸化将胞外多糖K5CPS中的N-乙酰葡萄糖胺残基修饰为N-硫酸化葡萄糖胺(GlcNS)，得到中间产物NS-H。本发明所述中间产物NS-H中GlcNS残基的摩尔百分含量优选>90％。
本发明所述胞外多糖K5CPS的重均分子量优选＞10kDa。本发明所述胞外多糖K5CPS优选来源于天然微生物或代谢产生胞外多糖K5CPS的基因工程菌株；所述天然微生物优选包括大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌和副鸡禽杆菌；所述大肠杆菌优选包括大肠杆菌K5。本发明对所述胞外多糖K5CPS的制备方法没有特殊限定，采用本领域中常规方法在上述天然微生物或基因工程菌株得到的重均分子量＞10kDa的胞外多糖K5CPS均属于本发明的保护范围，如在本发明的具体实施过程中，所述胞外多糖K5CPS分离自大肠杆菌K5的发酵上清液。本发明所述胞外多糖K5CPS取自于天然微生物或基因工程菌株，原料易得且无安全风险，可保证可中和抗凝低分子量肝素的品质。
本发明优选将胞外多糖K5CPS溶解于氢氧化钠溶液中，加热处理，以使胞外多糖K5CPS的N-乙酰葡萄糖胺残基发生N-脱乙酰化。本发明所述胞外多糖K5CPS与氢氧化钠溶液的质量体积比优选为1g：250mL。本发明所述氢氧化钠溶液浓度优选为2M。本发明所述加热处理的温度优选为55～65℃，更优选为60℃；所述加热处理的时间优选为5～10h，更优选为10h。
发生所述N-脱乙酰化后，本发明优选调节pH至7.0～8.0，以三氧化硫-三甲胺复合物为硫酸基供体对葡糖胺残基进行N-硫酸化定点修饰，得到反应液。本发明所述三氧化硫-三甲胺复合物与所述胞外多糖K5CPS的质量比优选≥3：1，更优选为3：1。本发明所述N-硫酸化定点修饰的温度优选为45～50℃，更优选为47℃；所述N-硫酸化定点修饰的时间优选为20～30h，更优选为24h。
得到所述反应液后，本发明优选还包括调节所述反应液的pH至7.0后，依次进行过滤、超滤和冷冻干燥，得到中间产物记为NS-H。本发明所述过滤用滤膜的孔径优选为0.22μm。本发明优选采用截留分子量为5kDa的膜包对所述过滤后的反应液进行超滤；所述超滤的次数优选为3次，每次超滤至50mL后，补加500mL去离子水，进行下一次超滤。本发明所述过滤和超滤可以达到浓缩和除盐的目的。
得到所述中间产物NS-H后，本发明以肝素C-5差向异构酶和肝素2-O-硫酸基转移酶对所述中间产物NS-H进行共同催化修饰，使所述中间产物NS-H的糖链中部分葡萄糖醛酸残基转变为2-O-硫酸化艾杜糖醛酸，得到中间产物记为2S-NSH；在本发明中，所述共同催化修饰的步骤具体优选如下。
本发明优选将所述中间产物NS-H溶于MES缓冲溶液，与肝素C-5差向异构酶混合，进行异构化反应。本发明所述中间产物NS-H与缓冲溶液的质量体积比优选为1g：500mL。本发明所述缓冲溶液优选含50mM MES和2mM CaCl2，所述缓冲溶液的pH为7.0～7.5。本发明所述肝素C-5差向异构酶与所述中间产物NS-H的质量比为9:1000。本发明所述异构化反应的温度优选为20～37℃，更优选为37℃；所述异构化反应的时间优选为0.5～2.0h，更优选为1h。
预先进行所述异构化反应后，本发明优选向所述异构化反应后的溶液补加上述MES缓冲液使体系扩充后，加入肝素C-5差向异构酶、肝素2-O-硫酸基转移酶和硫酸基供体PAPS(3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸)混合，进行硫酸化修饰。本发明对所述肝素C-5差向异构酶与肝素2-O-硫酸基转移酶的质量比和加入量不作限定，满足所述硫酸化修饰反应即可。本发明所述硫酸基供体PAPS的用量为NS-H所含的GlcA残基的摩尔当量的1.1倍及以上，进一步优选为1.1～1.5倍摩尔当量，更优选为1.5倍当量。本发明所述硫酸化修饰的条件优选为室温反应过夜。
完成所述硫酸化修饰后，本发明优选还包括将硫酸化修饰后溶液依次进行离心、过滤、纯化和透析，收集溶液进行冷冻干燥，得到中间产物记为2S-NSH。本发明优选采用Q-Sepharose层析柱进行所述纯化。本发明优选采用截留分子量为1kDa的透析袋进行所述透析，以达到除盐的作用。本发明对所述离心、过滤和冷冻干燥的具体参数没有特殊限定，采用本领域中常规参数即可。
本发明所述中间产物2S-NSH中IdoA2S的摩尔百分含量优选为20～85％，五糖序列GlcNR-GlcA-GlcNS-IdoA2S-GlcNS的摩尔百分含量优选为5～25％。
得到所述中间产物2S-NSH后，本发明对所述中间产物2S-NSH部分解聚，得到以△-4,5位不饱和糖醛酸(ΔU)或2-O-硫酸化ΔU(ΔU2S)为非还原末端的低分子量产物L2S。本发明所得到的低分子量产物L2S的重均分子量为2000Da～7500Da，IdoA2S含量不少于40％，五糖序列含量不少于7％。
本发明优选依据所述中间产物2S-NSH中IdoA2S的含量选择所述部分解聚的方式：当所述中间产物2S-NSH中IdoA2S的含量为45％～75％，所述五糖序列GlcNR-GlcA-GlcNS-IdoA2S-GlcNS的含量为7～25％时，本发明优选以β-消除法进行所述部分解聚，具体优选包括：将所述中间产物2S-NSH与苄索氯铵于水中混合反应，收集不溶于水的2S-NSH的季铵盐产物；将干燥的季铵盐产物溶于N,N-二甲基甲酰胺，将得到的溶液与氯化苄混合进行酯化反应，与醋酸钠甲醇溶液混合终止反应，得到苄酯中间产物；将所述苄酯中间产物与氢氧化钠水溶液混合，加热条件下进行部分解聚反应，得到所述低分子量产物记为β-L2S。
本发明优选将所述中间产物2S-NSH与苄索氯铵于水中混合反应，收集不溶于水的2S-NSH的季铵盐产物。本发明所述中间产物2S-NSH在水中的的浓度优选为0.05～0.5g/mL，进一步优选为0.1～0.3g/mL，更优选为0.2g/mL。本发明所述苄索氯铵与所述中间产物2S-NSH的质量比优选≥2，进一步优选为2～4，更优选为2.5。
得到所述不溶于水的2S-NSH的季铵盐产物后，本发明优选将干燥的季铵盐产物溶于N,N-二甲基甲酰胺，将得到的溶液与氯化苄混合进行酯化反应，与醋酸钠甲醇溶液混合终止反应，得到苄酯中间产物。本发明所述干燥优选包括真空干燥或冷冻干燥。本发明对所述真空干燥或冷冻干燥的具体参数没有特殊限定，采用本领域中常规真空干燥或冷冻干燥的参数即可。本发明所述N,N-二甲基甲酰胺与所述干燥的2S-NSH季铵盐的体积质量比≥3～8mL：1g。本发明所述所述氯化苄与所述溶液的体积比优选为0.5～1。本发明所述酯化反应的温度优选为25～40℃；所述酯化反应的时间优选为12～30h。本发明所述醋酸钠甲醇溶液的浓度优选为8～10％。
得到所述苄酯中间产物后，本发明将所述苄酯中间产物与氢氧化钠水溶液混合，加热条件下进行部分解聚反应，得到反应液。本发明所述氢氧化钠水溶液的浓度优选为0.05～0.15M，更优选为0.125M。本发明所述部分解聚反应的温度优选为30～65℃，时间优选为20～90min，更优选为60min。
得到所述反应液后，本发明优选将所述反应液与醇混合，将收集的沉淀复溶于水，透析和超滤，收集小于10kDa组分，干燥，得到所述低分子量产物β-L2S。本发明所述醇的体积优选为所述反应液体积的3～5倍，更优选为3倍。本发明所述醇优选包括甲醇或乙醇。本发明所述透析用透析袋的截留分子量优选为1000Da；所述超滤用超滤膜的截留分子量优选为10kDa。本发明采用所述β-消除法选择性部分切割GlcNS-IdoA2S之间的糖苷键，得到以ΔU2S为非还原末端的低分子量产物β-L2S。本发明所述β-消除法之所以能够“选择性部分切割”GlcNS-IdoA2S之间的糖苷键是因为β-消除法不能断裂中间产物2S-NSH的GlcNS-GlcA连接，只断裂GlcNS-IdoA2S，通过控制酯化率和反应条件使部分GlcNS-IdoA2S断裂，得到不同重均分子量的低分子量产物β-L2S。
当所述中间产物2S-NSH中IdoA2S的含量为20％～50％，所述五糖序列GlcNR-GlcA-GlcNS-IdoA2S-GlcNS的含量为5～20％，时，采用肝素酶III进行所述部分解聚，具体包括：将所述中间产物2S-NSH与肝素酶III在Tris缓冲溶液中混合，进行部分解聚反应，得到所述低分子量产物记为EIII-L2S。
本发明优选将所述中间产物2S-NSH与肝素酶III在Tris缓冲溶液中混合，进行部分解聚反应，得到肝素酶III解聚反应液。本发明所述缓冲溶液优选含50mM Tris-HCl和10mM CaCl2，溶剂优选为去离子水，pH优选为7.0～7.5，更优选为7.0。本发明所述中间产物2S-NSH在所述缓冲溶液中的浓度优选为0.5～5.0mg/mL，更优选为2mg/mL。本发明所述肝素酶III在所述缓冲溶液的浓度优选为0.06～1.4mg/mL，更优选为1.4mg/mL。本发明所述部分解聚的温度优选为20～37℃，更优选为37℃；时间优选为30～60min，更优选为30min。
得到所述肝素酶III解聚反应液后，本发明优选还包括将肝素酶III解聚反应液离心和过滤，将收集的溶液进行超滤或离子交换层析，得到所述低分子量产物EIII-L2S。当进行所述超滤时，本发明优选包括两次超滤，所述第一次超滤用超滤膜的截留分子量优选为10kDa；将收集得到的分子量小于10kDa的组分进行第二次超滤，所述第二次超滤所用超滤膜的截留分子量优选为1kDa，以除去分子量小于1kD的组分，同时达到浓缩除盐的目的。采用肝素酶III特异部分切割GlcNS-GlcA之间的连接，得到以ΔU为非还原末端的低分子量产物产物EIII-L2S。
当所述中间产物2S-NSH中IdoA2S的含量为40％～75％，所述五糖序列GlcNR-GlcA-GlcNS-IdoA2S-GlcNS的含量为7～25％时，采用肝素酶Ⅰ进行所述部分解聚，具体包括：将所述中间产物2S-NSH与肝素酶I在Tris缓冲溶液中混合，进行部分解聚反应，得到所述低分子量产物记为EI-L2S。
本发明优选将所述中间产物2S-NSH与肝素酶I在缓冲溶液中混合，进行部分解聚反应，得到肝素酶I解聚反应液。本发明所述缓冲溶液优选含50mM Tris-HCl和10mM CaCl2，溶剂优选为去离子水，pH优选为7.0～7.5，更优选为7.0。本发明所述中间产物2S-NSH在所述缓冲溶液中的浓度优选为0.5～5.0mg/mL，更优选为2mg/mL。本发明所述肝素酶I在所述缓冲溶液的浓度优选为0.18～0.24mg/mL，更优选为0.24mg/mL。本发明所述部分解聚反应优选为恒温水浴反应，所述恒温水浴反应的温度优选为20～37℃，更优选为37℃；所述恒温水浴反应的时间优选为30～60min，更优选为30min。
得到所述肝素酶I解聚反应液后，本发明优选还包括将肝素酶I解聚反应液离心和过滤，将收集的溶液进行超滤或离子交换层析，得到所述低分子量产物EI-L2S。当进行所述超滤时，本发明优选包括两次超滤，所述第一次超滤用超滤膜的截留分子量优选为10kDa；将收集得到的分子量小于10kDa的组分进行第二次超滤，所述第二次超滤所用超滤膜的截留分子量优选为1kDa，以除去分子量小于1kD的组分，同时达到浓缩除盐的目的。采用肝素酶I特异部分切割GlcNS-IdoA2S之间的连接，得到以ΔU2S为非还原末端的低分子量产物产物EI-L2S。
得到所述以ΔU或ΔU2S为非还原末端的低分子量产物L2S后，本发明以肝素6-O-硫酸基转移酶催化所述以ΔU或ΔU2S为非还原末端的低分子量产物L2S，使GlcNS残基发生6-O-硫酸化修饰，得到L6S。
本发明所述肝素6-O-硫酸基转移酶催化的步骤优选包括：将所述低分子量产物L2S溶于MES缓冲溶液后，与6-O-硫酸基转移酶1、6-O-硫酸基转移酶3和硫酸基供体PAPS混合，对GlcNS进行6-O-硫酸化修饰，得到所述L6S。
本发明所述MES缓冲溶液的组分优选与上述缓冲溶液的组分相同，在此不再赘述。本发明对所述6-O-硫酸基转移酶1和6-O-硫酸基转移酶3的质量比和加入量不作具体限定，满足所述反应要求即可。本发明所述肝素6-O-硫酸基转移酶与所述ΔU为非还原末端的低分子量产物L2S的质量比优选为10～1000：10～1000，更优选为18：250。本发明所述低分子量产物L2S与所述缓冲溶液的质量体积比优选为10～1000mg：10～1000mL，更优选为100mg：100mL。本发明所述硫酸基供体PAPS的用量优选为所述低分子量产物L2S所含GlcNS残基摩尔质量的1.1倍及以上，进一步优选为1.1～1.5倍，更优选为1.5倍。本发明所述6-O-硫酸化修饰的条件优选为20～37℃条件下过夜反应，更优选为37℃。本发明所述6-O-硫酸化修饰的反应终点优选为所述L6S中所含双糖单元IdoA2S-GlcNS6S的摩尔百分比优选为45％～95％。完成所述6-O-硫酸化修饰后，本发明优选还包括对所述6-O-硫酸化修饰后得到的反应液依次进行离心、过滤和纯化，收集样品溶液，透析和冷冻干燥，得到所述L6S。本发明优选采用Q Sephsrose层析柱进行所述纯化。本发明所述透析用透析袋的截留分子量优选为1000Da。本发明对所述离心、过滤和冷冻干燥的具体步骤没有特殊限定，采用本领域中常规步骤即可。本发明优选依据所述低分子量产物L2S的类型的不同，而得到不同类型的L6S；所述L6S优选包括EIII-L6S、EI-L6S或β-L6S；所述L6S的非还原末端含不饱和双键的糖醛酸。
得到所述L6S后，本发明以肝素3-O-硫酸基转移酶1催化所述L6S，使特定葡萄糖胺发生3-O-硫酸化修饰，得到所述可中和抗凝低分子量肝素；所述可中和抗凝低分子量肝素包括β-L3S、EIII-L3S或EI-L3S。本发明所述使“特定”葡萄糖胺发生3-O-硫酸化修饰的原因在于，所述3-O-硫酸基转移酶1专门催化修饰五糖序列GlcA-GlcNS6S-IdoA2S-GlcNS6S中与GlcA相邻的GlcNS6S，只有L6S中含上述序列才能被修饰。
本发明所述肝素3-O-硫酸基转移酶1催化所述L6S的具体步骤优选包括：将所述L6S在MES缓冲溶液中与3-O-硫酸基转移酶1和硫酸基供体PAPS混合，选择性地对葡萄糖胺进行3-O-硫酸化修饰，得到所述L3S。本发明所述MES缓冲溶液的组分优选与上述相同，不再进行赘述。本发明所述硫酸基供体PAPS的用量优选为所述L6S所含葡萄糖胺残基(GlcNS6S)摩尔质量的1.1倍及以上，进一步优化为1.1～1.5倍，更优选为1.5倍。本发明所述肝素3-O-硫酸基转移酶1与所述L6S的质量比优选为1:80；所述L6S与所述MES缓冲溶液的质量体积比优选为100mg：100mL。本发明所述3-O-硫酸化修饰的反应条件优选为20～37℃反应过夜，更优选为室温过夜。完成所述3-O-硫酸化修饰后，本发明优选还包括对所述3-O-硫酸化修饰后得到的反应液依次进行离心、过滤和纯化，收集样品溶液，透析和冷冻干燥，得到所述L3S。本发明优选采用Q Sephsrose层析柱进行所述纯化。本发明所述透析用透析袋的截留分子量优选为1000Da。本发明对所述离心、过滤和冷冻干燥的具体步骤没有特殊限定，采用本领域中常规步骤即可。本发明优选依据所述L6S的类型的不同，而得到不同类型的L3S；所述L3S优选包括EIII-L3S、EI-L3S或β-L3S，即采用本发明所述制备方法得到的可中和抗凝低分子量肝素包括EIII-L3S、EI-L3S或β-L3S三种类型。本发明所述EIII-L3S的非还原末端为ΔU，即式I中R1为氢基；EI-L3S和β-L3S的非还原末端为ΔU2S，即式I的R1为磺酸基。
本发明还提供了上述技术方案所述的可中和抗凝低分子量肝素或所述的制备方法得到的可中和抗凝低分子量肝素在制备防治血栓性疾病的药物中的应用。本发明所述血栓性疾病优选包括静脉血栓、动脉血栓和肺栓塞，更优选为静脉血栓。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
如无特殊限定，在下述实施例中所使用的试剂或试剂盒均为通过常规渠道可购买得到的商用产品；所使用的方法均为本领域中公知的方法。
实施例中所述的室温具有本技术领域公知的含义，一般是指25±2℃。
实施例1：大肠杆菌K5胞外多糖K5CPS的制备
大肠杆菌K5采用发酵罐培养，培养基为葡萄糖培养基，其成分为：20g/L葡萄糖、10～300mg/L维生素B1、13.5g/L KH2PO4、4.0g/L(NH4)2HPO4、1.4g/L MgSO4·7H2O、1.7g/L柠檬酸和10.0mL/L微量元素，pH为7.0。其中，微量元素配制如下：将10.0g FeSO4·7H2O、2.0gCaCl2、2.2g ZnSO4·7H2O、0.5g MnSO4·4H2O、1.0g CuSO4·H2O、0.1g(NH4)6Mo7O24·4H2O和0.02g Na2B4O7·10H2O溶于1L 2M的HCl中。补料培养基为：300～600g/L葡萄糖、20g/LMgSO4·7H2O、0.15～0.25g/L维生素B1。
发酵条件为：接种量为4％(体积百分含量)，30％氨水调节pH 7.0，在37℃以500rpm转速培养36h。
发酵结束后，将发酵液以8800r/min离心20min，收集上清液并用截留分子量为5000Da的超滤膜浓缩至约600mL，加入3倍体积的无水乙醇，4℃过夜进行醇沉。醇沉结束后，以8800r/min离心10min并收集沉淀，于真空干燥箱中干燥，得K5CPS粗品。
将K5CPS粗品溶于去离子水中，12000r/min离心25min后收集上清，以0.22μm水系滤膜过滤后，用截留分子量为30kDa的超滤膜进行超滤以除去低分子的杂质，期间用去离子水洗滤3次后，收集最终的浓缩液，于冷冻干燥机中冻干，即得K5CPS纯品。
所得胞外多糖K5CPS纯品与过量肝素酶I、II、III混合于含50mM Tris-HCl、10mMCaCl2的缓冲液(pH7.0)中，于37℃反应5h以充分切割，反应液除酶过滤后采用高效液相色谱仪进行双糖分析，色谱柱为PAMN多氨柱，以0→100％的1M KH2PO4梯度洗脱，流速0.5mL/min柱，检测波长232nm。结果如图1所示，表明胞外多糖K5CPS的水解产物仅含不饱和双糖ΔU-GlcNAc，证实K5CPS由GlcA-GlcNAc聚合而成。K5CPS的1HNMR检测的谱图如图2所示，进一步确证K5CPS结构的正确。
实施例2：胞外多糖K5CPS的化学法N-脱乙酰化/N-硫酸化修饰
将1g实施例1中制得的K5CPS纯品溶于250mL的2M NaOH溶液中，于47℃搅拌反应10h。反应结束后，反应液冷却至室温，用2M的HCl调pH至7.0，加入3g三氧化硫-三甲胺复合物和3g无水碳酸钠，于60℃搅拌反应12h后，补加3g三氧化硫-三甲胺复合物和3g无水碳酸钠，继续反应12h。反应结束后，待反应液冷却至室温，用2M的HCl调pH至7.0，将反应液用0.22μm水系滤膜过滤，用截留分子量为5kDa的膜包对其进行超滤至50mL，补加去离子水至500mL，继续超滤，如此反复3次，以达到浓缩、除盐的目的。收集浓缩液，于冷冻干燥机冻干，得NS-H纯品。
所得NS-H纯品通过肝素酶I、II、III充分切割后采用高效液相色谱仪进行双糖分析谱图如图3所示，水解产物中不饱和双糖ΔU-GlcNAc、ΔU-GlcNS的摩尔百分比分别为2.34％、97.66％，表明NS-H的GlcN残基的N-硫酸化修饰率为97.66％。NS-H的1HNMR检测的谱图如图4所示，进一步确证NS-H结构的正确。NS-H经多角度激光光散射仪测得其重均分子量(MW)为20.16kDa，多分散指数(PDI)为1.231。
实施例3：NS-H的酶法C5-差向异构化和2-O-硫酸化修饰
将1.0g实施例2中制得的NS-H纯品溶于500mL的缓冲溶液中(50mM MES，2mMCaCl2，pH＝7.5)，加入C5-epi酶9mg，于37℃反应1h后，将反应体系扩至1L，加入9mg C5-epi酶、22mg 2-OST酶和1.5倍当量的PAPS，室温反应过夜。反应结束后用醋酸调pH 4-5终止反应，离心过滤后用Q-Sepharose层析柱纯化，收集样品溶液，用1kDa透析袋透析除盐后，于冷冻干燥机冻干，得2S-NSH纯品。
所得2S-NSH纯品用肝素酶I、II、III充分切割后采用高效液相色谱仪进行双糖分析，方法与实施例1相同。谱图如图5所示，水解产物中不饱和双糖ΔU2S-GlcNS的摩尔百分比为71.93％，表明中间产物3的C-5差向异构化和2-O-硫酸化修饰率即IdoA2S含量为71.93％；2S-NSH的HSQC检测的谱图如图6所示，进一步确证2S-NSH结构的正确。NS-H经多角度激光光散射仪测得其重均分子量(MW)为28.00kDa，多分散指数(PDI)为1.871。
实施例4：2S-NSH的肝素酶III部分解聚
将100mg实施例4中的2S-NSH(IdoA2S含量50％)纯品溶于50mL Tris缓冲溶液(50mM Tris，10mM CaCl2，pH＝7.5)中，再加入1.4mg/mL肝素酶III，于37℃水浴反应30min，反应结束后加入醋酸调pH4-5终止反应。离心过滤后，于截留分子量10kDa的超滤膜进行超滤，收集的分子量小于10kDa组分再用截留分子量为1kDa的超滤膜超滤，除去分子量小于1kDa组分，同时也达到浓缩除盐的目的。收集浓缩液，于冷冻干燥机冻干，即得EIII-L2S，产率50％。EIII-L2S经双糖分析，谱图如图7-2所示，其双糖类型与2S-NSH(图7-1所示)相同，其中双糖单元ΔU2S-GlcNS摩尔百分含量为68％，较原料2S-NSH明显上升。
实施例5：2S-NSH的肝素酶I部分解聚
将100mg实施例4中的2S-NSH(IdoA2S含量71.85％)溶于50mLTris缓冲溶液(50mMTris，10mM CaCl2，pH＝7.5)中，再加入0.24mg/mL肝素酶I，于37℃水浴反应30min，反应结束后加入醋酸调pH4～5终止反应。离心过滤后于截留分子量10kDa的超滤膜进行超滤，收集的分子量小于10kDa组分再用截留分子量为1kDa的超滤膜超滤，除去分子量小于1kDa组分，同时也达到浓缩除盐的目的。收集浓缩液，于冷冻干燥机冻干，即得EI-L2S，产率42％。EI-L2S经双糖分析证实，谱图如图7-3所示，其双糖类型与2S-NSH(图7中A所示)相同，其中双糖单元ΔU2S-GlcNS所占比例为59％，较原料2S-NSH明显下降。
实施例6：2S-NSH的β-消除反应部分解聚：
取1g实施例4中的2S-NSH(IdoA2S含量66％)溶于5mL去离子水，搅拌使其充分溶解，再取苄索氯铵2.5g溶于10mL去离子水中充分溶解后，将其缓慢倒入2S-NSH水溶液中，形成白色不溶性的季铵盐，将其以8800r/min离心10min，弃去上清，再加入去离子水搅拌均匀后，再次离心并弃上清，如此反复三次，使得反应剩余的苄索氯铵完全除去，将沉淀于冷冻干燥机冻干，得2S-NSH的季铵盐产物纯品2.39g。
取500mg季铵盐溶于2.5mL超干DMF中，再向其加入525μL氯化苄，35℃搅拌反应25h。反应结束后，加入等体积的溶有无水乙酸钠的甲醇溶液(10％，v/v)，8800r/min离心10min，弃上清，再加入甲醇溶液，重复上述步骤3次，以除去未反应完的氯化苄。将沉淀于冷冻干燥机冻干，即得236mg苄酯。
将50mg苄酯溶于1.5mL 0.125M NaOH溶液中，于62℃反应1h，反应结束后用1M HCl调pH6.0，加入300mg NaCl固体溶解后，加入三倍体积的甲醇，待有白色固体析出后，离心收集沉淀。将沉淀复溶于水，于1000Da透析袋透析，再经截留分子量为10kDa超滤膜超滤，收集小于10kDa组分，于冷冻干燥机干燥，得纯品，收率43％。β-L2S经双糖分析证实，谱图如图8所示，其双糖类型与比例降解前后无差异；经多角度激光光散射仪测得其Mw＝5561Da，PDI＝1.094。
实施例7：低分子量样品L2S的酶法6-O-硫酸化修饰：
将100mg的实施例4得到的L2S(EIII-L2S)溶于100mL缓冲溶液中(50mM MES，2mMCaCl2，pH＝7.5)，加入6-OST1酶和6-OST3酶各3.6mg、1.5倍当量的PAPS，室温反应过夜。可根据反应进程补加适量酶与硫酸基供体PAPS至反应终点。结束后，将反应液用醋酸调pH4-5终止反应，离心过滤后用Q Sephsrose层析柱纯化，收集样品溶液，用截留分子量为1000Da的透析袋透析，最终样品溶液于冷冻干燥机冻干，得L6S(EIII-L6S)纯品；
实施例5和实施例6中得到的EI-L2S和β-L2S均按照上述方法进行制备，分别得到EI-L6S和β-L6S纯品。
所得L6S(EIII-L6S、EI-L6S、β-L6S)纯品分别用肝素酶I、II、III充分切割后采用高效液相色谱仪进行双糖分析，结果如图9-1～9-3所示，6-O-硫酸化修饰率分别为89％、84％、76％。
实施例8：L6S的酶法3-O-硫酸化修饰
将100mg实施例8中的L6S(EIII-L6S、EI-L6S、β-L6S中的任意一种)溶于100mL缓冲溶液中(50mM MES，2mM CaCl2，pH＝7.5)，加入3OST1酶1.25mg、1.5倍当量的PAPS，室温反应过夜。结束后，将反应液用醋酸调pH4-5终止反应，离心过滤后用Q Sephsrose层析柱纯化，收集样品溶液，用截留分子量为1000Da的透析袋透析，最终样品溶液于冷冻干燥机冻干，得L3S(EIII-L3S、EI-L3S、β-L3S)纯品。经计算若以K5CPS为起始，总收率分别为26.8％、20.3％、24.9％，即1g的K5CPS可以制得268mg EIII-L3S、203mg EI-L3S、249mgβ-L3S。所得L3S(EIII-L3S、EI-L3S、β-L3S)纯品以及依诺肝素钠分别用肝素酶I、II、III切割后采用高效液相色谱仪进行双糖分析，结果如图10-1～10-4所示，其水解产物的不饱和双糖主要包括ΔU-GlcNS、ΔU-GlcNS6S、ΔU2S-GlcNS、ΔU2S-GlcNS6S，其中EIII-L3S中上述四种不饱和双糖的摩尔百分比分别为7.82％、20.55％、8.12％、63.51％，EI-L3S中上述四种不饱和双糖的摩尔百分比分别为5.4％、29.2％、19.83％、45.57％，β-L3S中上述四种不饱和双糖的摩尔百分比分别为8.39％、8.23％、16.53％、66.96％，依诺肝素钠中上述四种不饱和双糖的摩尔百分比分别为4.6％、11.66％、8.83％、74.91％，由此可知本发明所得产物L3S(EIII-L3S、EI-L3S、β-L3S)的双糖种类与依诺肝素钠相同，且主要双糖均为ΔU2S-GlcNS6S。
将得到的EIII-L3S、EI-L3S、β-L3S纯品以及依诺肝素钠经多角度激光光散射仪测定，各L3S(EIII-L3S、EI-L3S、β-L3S)的重均分子量(Mw)分别为：5.086kDa、3.457kDa、6.204kDa，多分散系数(PDI)分别为：1.066、1.065、1.066，其中Mw<8000Da的比例分别为：98.2％、99.4％、90.6％；同样条件下测得依诺肝素的重均分子量(Mw)、多分散系数(PDI)及Mw<8000Da的比例分别为：4.749kDa、1.056、98.2％，表明本发明分别经由三种降解方式制备得到的L3S(EIII-L3S、EI-L3S、β-L3S)的重均分子量(Mw)与一般药典规定的低分子量肝素(LMWH)相符。
采用2D NMR分析所得L3S(EIII-L3S、EI-L3S、β-L3S)，其HSQC谱图的低场区信号如图11-1～11-3所示，可以清楚观察到GlcNS6x-(IdoA2S)、GlcNS6x3S、IdoA2S-(GlcNS6x3x)、GlcA-(GlcNS6x3S)等动物源肝素表现抗Xa活性必需的典型结构信息，并观察到非还原末端ΔU和还原末端的GlcNS6x的异头信号。
实施例9：可中和低分子量肝素的体外活性测定
通过试剂盒以生色底物法测得本发明三种降解方式制备得到的不同低分子量肝素(EIII-L3S、EI-L3S、β-L3S)的抗FXa活性分别为98.17±6.40IU/mg、109.07±4.50IU/mg、162.62±5.97IU/mg，抗FIIa活性分别为12.23±0.85IU/mg、17.03±0.07IU/mg、37.90±0.97IU/mg。同样条件下测得依诺肝素抗FXa、FIIa因子的活性分别为108.55±4.81IU/mg、20.13±0.01IU/mg。由此可得出本发明得到两种抗FXa、FIIa因子活性与依诺肝素相当的低分子量肝素EIII-L3S、EI-L3S，一种抗凝明显高于依诺肝素钠的低分子量肝素β-L3S。
进一步，通过试剂盒以生色底物法来测定UFH、依诺肝素钠及重均分子量较高的β-L3S的IC50值，分别为350.6ng/mL、168.7ng/mL、176.6ng/mL，并依此为依据来确定鱼精蛋白中和活性中各样品的浓度值。测定结果如图12所示，硫酸鱼精蛋白对β-L3S抗凝活性的体外中和作用达82.68％，略低于对UFH的中和率(92.12％)，但显著高于对依诺肝素钠的中和作用(仅为37.35％)，表明β-L3S是一种理想的“可中和”抗凝低分子量肝素(N-LMWH)。
实施例10：可中和低分子量肝素的体内活性测定
1)以依诺肝素钠、达肝素钠作为阳性对照，评价可中和低分子量肝素(N-LMWH)经皮下注射是否能够达到治疗浓度以及药代动力学特征。具体方法为：取健康Wistar雄性大鼠，称重，将其随机分为依诺肝素钠组(300IU/kg)、达肝素钠组(300IU/kg)、样品组(300IU/kg)三组，每组五只。通过大鼠后背皮下注射给药，给药剂量为500μL/只，分别于给药后0.5h、0.75h、1h、1.25h、1.75h、2h、2.5h、3h、4h、8h、12h、24h、48h静脉窦取血200μL，加入3.8％柠檬酸钠(9:1)抗凝，于4℃、5000r/min离心15min，取上清，-20℃冻存备用。取完所有时间点后，将血样融化，于12000r/min离心3min，取血样上清稀释20倍后用FXa试剂盒检测各个时间点的抗FXa活性。以时间为横坐标，抗FXa活性值为纵坐标，利用GraphPadPrism8.0.2作图。并计算各个时间点抗FXa活性的均值，用DAS2.0软件智能分析。结果如图13和表1～2所示，
表1可中和低分子量肝素的体内活性房室参数测定结果
表2可中和低分子量肝素的体内活性统计矩参数测定结果
由图13和表1～2可以得出表明N-LMWH经皮下注射给药，其药代动力学特征与现有动物源低分子量肝素类似，具有半衰期长、生物利用度高的优点。
2)设置N-LMWH高中低三个浓度与依诺肝素钠比较来进行抗动脉血栓活性评价。具体方法为：取健康Wistar雄性大鼠，称重，将其随机分为PBS组、依诺肝素钠组(2mg/kg)、样品组(1mg/kg)、样品组(2mg/kg)、样品组(3mg/kg)五组，每组8只。通过大鼠后背皮下注射给药，给药剂量为500μL/只。将大鼠仰卧位固定，腹腔注射7.5％的水合氯醛(5mL/kg)麻醉，分离出一段长约1.8cm的左侧颈总动脉，于颈总动脉下方置一塑料薄膜(1.5cm×4cm)以保护周围组织，给药1h后将吸有15μL10％三氯化铁溶液的小滤纸片(0.5cm×1cm)敷于颈总动脉造模，30min后撤去滤纸，剪下长为1cm的血管称重。在剪下血管之前，于静脉窦取血1mL，与3.8％柠檬酸钠以9:1体积抗凝，在4℃，5000r/min离心15min，取上清，-20℃冻存以备测血浆的活化部分凝血活酶时间(APTT)与凝血酶原时间(PT)，均使用相关试剂盒检测。相关结果如图14-1～14-3所示：
由图14-1～14-3可以得出：N-LMWH具有显著的抗动脉血栓活性，其作用呈剂量依赖性，且与依诺肝素钠差别不大；N-LMWH能显著延长动脉血栓大鼠血浆的APTT值，且其作用显著优于依诺肝素钠；N-LMWH能显著延长动脉血栓大鼠血浆的PT值，且其作用与依诺肝素钠差别不大。
3)通过大鼠后背皮下注射给药，设置N-LMWH高中两个浓度与依诺肝素钠比较来进行抗静脉血栓活性评价。具体方法为：取健康Wistar雄性大鼠，称重，将其随机分为PBS组、依诺肝素钠组(2mg/kg)、样品组(1mg/kg)、样品组(2mg/kg)、四组，每组8只。通过大鼠后背皮下注射给药，给药剂量为500μL/只，给药1h后造模。将大鼠仰卧位固定，腹腔注射7.5％的水合氯醛(5mL/kg)麻醉，先用碘伏消毒，再用75％乙醇脱碘，沿腹中线剖开长为2cm纵切口，用棉签将内容物取出置于术野左侧，充分暴露左肾下腔静脉，用4-0手术线将下腔静脉分支结扎，在左肾静脉下方2mm处结扎下腔静脉主干，将内容物回纳腹腔，依次缝合腹壁和皮肤。6h后重新打开腹腔，在主干结扎处向下量取1.5cm结扎，纵向剖开结扎血管，取出血栓，称重。在剪下血管之前，于静脉窦取血1mL，与3.8％柠檬酸钠以9:1体积抗凝，在4℃，5000r/min离心15min，取上清，-20℃冻存以备测血浆的活化部分凝血活酶时间(APTT)与凝血酶原时间(PT)，均使用相关试剂盒检测。相关结果如图15-1～15-2所示：
由图15-1～15-3可以得出：N-LMWH具有显著的抗静脉血栓活性，其作用呈剂量依赖性，且与依诺肝素钠差别不大；N-LMWH能显著延长静脉血栓大鼠血浆的APTT值，且其作用与依诺肝素钠差别不大；N-LMWH能显著延长静脉血栓大鼠血浆的PT值，且其作用与依诺肝素钠差别不大。
4)通过小鼠后背皮下注射给药，以依诺肝素钠及未分级肝素作为对照来进行体内抗凝活性被鱼精蛋白中和程度评价。具体方法为：取健康C57BL/6J小鼠称重，随机分为PBS组、依诺肝素钠组(3mg/kg)、未分级肝素组(3mg/kg)、样品组(3mg/kg)四组，每组八只。通过小鼠后背皮下注射给药，给药剂量为100μL/只。于给药30min后，每组中一半的小鼠经眼眶后丛静脉注射剂量为100μL的PBS，另一半给予100μL硫酸鱼精蛋白溶液(15mg/kg)，注射结束后计时5min，用3.8％柠檬酸钠润过的注射器于心脏穿刺取血200μL，于4℃，5000r/min离心15min，小心吸取上层血浆，-20℃保存。待实验结束后，将血浆样品用FXa试剂盒测定其抗FXa活性。将得到的数据以PBS组作为FXa活性100％，以FXa活性为纵坐标，利用GraphPadPrism8.0.2作图。相关结果如图16所示，其中在图16中“-”表示未加鱼精蛋白组，“+”表示加入鱼精蛋白组。
由图16可以得出：鱼精蛋白对N-LMWH抗凝活性的中和率达67.61％，显著优于对依诺肝素的中和作用(23.95％)。但是，鱼精蛋白对UFH的中和率仅为44.74％，与文献报道和体外测试结果中有出入，据推测是因为本实验中采用皮下注射给药，UFH皮下注射时生物利用度低，被吸收的仅为低分子量组分，导致其体内抗凝活性被鱼精蛋白中和率偏低。
由以上实施例可以得出：本发明所述可中和抗凝低分子量肝素为非动物源低分子量肝素，抗凝活性高，且可以被鱼精蛋白中和。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (9)

1.一种可中和抗凝低分子量肝素，其特征在于，所述可中和抗凝低分子量肝素的结构包括1个式(Ⅰ)、a个式(Ⅱ)和b个式(Ⅲ)，所述1个式(Ⅰ)、a个式(Ⅱ)和b个式(Ⅲ)任意组合并以α-1,4-糖苷键连接；
其中，式(I)位于非还原末端，a为3～12之间的整数，b为1～5之间的整数，且a+b＝4～15；
R1、R2、R3分别为磺酸基(-SO3H)或氢基(-H)，R2中SO3H与H的数量比≥3：1；
所述可中和抗凝低分子量肝素的结构中包括1～3个如式(Ⅳ)所示结构：
所述可中和抗凝低分子量肝素的重均分子量为3000Da～8000Da；
所述可中和抗凝低分子量肝素的制备方法，包括如下步骤：
1)采用N-脱乙酰化/N-硫酸化将胞外多糖K5CPS中的N-乙酰葡萄糖胺残基修饰为N-硫酸化葡萄糖胺(GlcNS)，得到中间产物NS-H；
2)以肝素C-5差向异构酶和肝素2-O-硫酸基转移酶对所述中间产物NS-H进行共同催化修饰，使所述中间产物NS-H的糖链中部分葡萄糖醛酸残基转变为2-O-硫酸化艾杜糖醛酸，得到中间产物2S-NSH；
所述中间产物2S-NSH中IdoA2S的摩尔百分含量为20～85％；
3)采用β-消除法对所述中间产物2S-NSH进行部分解聚，得到以△-4,5位不饱和糖醛酸(ΔU)或2-O-硫酸化ΔU(ΔU2S)为非还原末端的低分子量产物L2S；
所述低分子量产物L2S的重均分子量为2000Da～7500Da，IdoA2S含量不少于40％；
4)以肝素6-O-硫酸基转移酶催化以ΔU或ΔU2S为非还原末端的低分子量产物L2S，使GlcNS残基发生6-O-硫酸化修饰，得到L6S；
5)以肝素3-O-硫酸基转移酶1催化所述L6S，使特定葡萄糖胺发生3-O-硫酸化修饰，得到所述可中和抗凝低分子量肝素β-L3S。
2.根据权利要求1所述的可中和抗凝低分子量肝素，其特征在于，所述β-消除法的步骤包括：
将所述中间产物2S-NSH与苄索氯铵于水中混合反应，收集不溶于水的2S-NSH的季铵盐产物；
将干燥的季铵盐产物溶于N,N-二甲基甲酰胺，将得到的溶液与氯化苄混合进行酯化反应，与醋酸钠甲醇溶液混合终止反应，得到苄酯中间产物；
将所述苄酯中间产物与氢氧化钠水溶液混合，加热条件下进行部分解聚反应，得到低分子量产物β-L2S。
3.根据权利要求2所述的可中和抗凝低分子量肝素，其特征在于，所述β-消除法的部分解聚在下述反应条件下进行：
1)：所述中间产物2S-NSH浓度为0.05～0.5g/mL，所述苄索氯铵与所述中间产物2S-NSH的质量比≥2；
2)：所述N,N-二甲基甲酰胺与干燥的2S-NSH季铵盐的体积质量比≥3～8mL：1g，所述氯化苄与所述溶液的体积比为0.5～1，所述醋酸钠甲醇溶液的浓度为8～10％；
3)：所述酯化反应的温度为25～40℃，时间为12～30h；
4)：所述氢氧化钠水溶液的浓度为0.05～0.15M，所述部分解聚反应的温度为30～65℃，时间为20～90min。
4.根据权利要求1所述的可中和抗凝低分子量肝素，其特征在于，步骤2)所述共同催化修饰的步骤包括：
将所述中间产物NS-H溶于MES缓冲溶液，与肝素C-5差向异构酶混合，进行异构化反应后，与肝素2-O-硫酸基转移酶和硫酸基供体PAPS混合，进行硫酸化修饰，得到所述中间产物2S-NSH；
所述缓冲溶液含50mM MES和2mM CaCl2，所述缓冲溶液的pH为7.0～7.5。
5.根据权利要求1或4所述的可中和抗凝低分子量肝素，其特征在于，步骤2)所述共同催化修饰在下述反应条件下进行：
A：异构化反应的温度为20～37℃，时间为0.5～2.0h；
B：所述肝素C-5差向异构酶与肝素2-O-硫酸基转移酶的质量比和加入量不作限定；
C：硫酸基供体PAPS的用量为NS-H所含的GlcA残基的摩尔当量的1.1倍及以上。
6.根据权利要求1所述的可中和抗凝低分子量肝素，其特征在于，步骤4)所述肝素6-O-硫酸基转移酶催化的步骤包括：
将所述低分子量产物L2S溶于MES缓冲溶液后，与6-O-硫酸基转移酶1、6-O-硫酸基转移酶3和硫酸基供体PAPS混合，对GlcNS进行6-O-硫酸化修饰，得到所述L6S；
步骤4)所述肝素6-O-硫酸基转移酶催化在下述反应条件下进行：
a：所述6-O-硫酸基转移酶1和6-O-硫酸基转移酶3的质量比和加入量不作限定；
b：所述硫酸基供体PAPS的用量为所述低分子量产物L2S所含GlcNS残基摩尔当量的1.1倍及以上；
c：所述缓冲溶液含50mM MES和2mM CaCl2，pH为7.0～7.5；
d：所述6-O-硫酸化修饰的反应温度为20～37℃，反应终点为所述L6S所含双糖单元IdoA2S-GlcNS6S的百分比为45％～90％。
7.根据权利要求1所述的可中和抗凝低分子量肝素，其特征在于，步骤5)所述肝素3-O-硫酸基转移酶1催化的步骤包括：
将所述L6S在MES缓冲溶液中与3-O-硫酸基转移酶1混合后，与硫酸基供体PAPS混合后选择性地对葡萄糖胺进行3-O-硫酸化修饰，得到所述L3S；
步骤5)所述肝素3-O-硫酸基转移酶1催化的步骤在下述A)～C)反应条件下进行：
A)所述缓冲溶液含50mM MES和2mM CaCl2，pH为7.0～7.5；
B)所述硫酸基供体PAPS的用量为GlcNS6S残基摩尔当量的1.1倍及以上；
C)所述3-O-硫酸化修饰的温度为20～37℃。
8.根据权利要求1所述的可中和抗凝低分子量肝素，其特征在于，步骤1)所述N-脱乙酰化/N-硫酸化的步骤包括：
将胞外多糖K5CPS溶解于氢氧化钠溶液中，加热处理，以使胞外多糖K5CPS的N-乙酰葡萄糖胺残基发生N-脱乙酰化，调节pH至7.0～8.0，以三氧化硫-三甲胺复合物为硫酸基供体对葡糖胺残基进行N-硫酸化定点修饰，得到所述中间产物NS-H；
所述胞外多糖K5CPS的重均分子量＞10kDa，来源于天然微生物大肠杆菌K5、多杀性巴氏杆菌、副鸡禽杆菌、或者人工构建的工程菌株；
步骤1)所述N-脱乙酰化/N-硫酸化在下述反应条件下进行：
Ⅰ：所述氢氧化钠溶液的浓度为2M；
Ⅱ：所述加热处理的温度为55～65℃，时间为5～10h；
Ⅲ：所述三氧化硫-三甲胺复合物与所述胞外多糖K5CPS的质量比≥3：1；
Ⅳ：所述N-硫酸化定点修饰的温度为45～50℃，时间为20～30h。
9.权利要求1～8任一项所述的可中和抗凝低分子量肝素在制备防治血栓性疾病的药物中的应用。
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