CN113666980A - 一种高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖及其制备方法与应用 - Google Patents
一种高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖及其制备方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113666980A CN113666980A CN202110794195.1A CN202110794195A CN113666980A CN 113666980 A CN113666980 A CN 113666980A CN 202110794195 A CN202110794195 A CN 202110794195A CN 113666980 A CN113666980 A CN 113666980A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- heptasaccharide
- heparin
- reaction
- disaccharide
- residue
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 title claims abstract description 98
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 title claims abstract description 96
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 94
- PZUPAGRIHCRVKN-UHFFFAOYSA-N 5-[5-[3,4-dihydroxy-6-[(3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl)oxymethyl]-5-[3,4,5-trihydroxy-6-[(3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl)oxymethyl]oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,4-dihydroxy-6-[(3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl)oxymethyl]oxan-2-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-2,3,4-triol Chemical compound OCC1OC(O)C(O)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(COC4C(C(O)C(O)CO4)O)O3)O)C(COC3C(C(O)C(O)CO3)O)O2)O)C(COC2C(C(O)C(O)CO2)O)O1 PZUPAGRIHCRVKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 90
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 229940123583 Factor Xa inhibitor Drugs 0.000 title claims description 10
- -1 PNZ groups Chemical group 0.000 claims abstract description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 43
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 32
- 108010001092 disaccharide receptor Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims abstract description 23
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims abstract description 22
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 claims abstract description 22
- XEKSTYNIJLDDAZ-JASSWCPGSA-F fondaparinux sodium Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].O[C@@H]1[C@@H](NS([O-])(=O)=O)[C@@H](OC)O[C@H](COS([O-])(=O)=O)[C@H]1O[C@H]1[C@H](OS([O-])(=O)=O)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](OS([O-])(=O)=O)[C@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@@H]4[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS([O-])(=O)=O)O4)NS([O-])(=O)=O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@@H](COS([O-])(=O)=O)O2)NS([O-])(=O)=O)[C@H](C(O)=O)O1 XEKSTYNIJLDDAZ-JASSWCPGSA-F 0.000 claims abstract description 21
- 229960003661 fondaparinux sodium Drugs 0.000 claims abstract description 21
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 claims abstract description 12
- 108010083213 heparitinsulfate lyase Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 68
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 37
- WMFOQBRAJBCJND-UHFFFAOYSA-M Lithium hydroxide Chemical compound [Li+].[OH-] WMFOQBRAJBCJND-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 31
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 claims description 29
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 26
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate group Chemical group S(=O)(=O)([O-])[O-] QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 22
- 239000000386 donor Substances 0.000 claims description 19
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims description 18
- 150000004043 trisaccharides Chemical class 0.000 claims description 17
- HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N Uridindiphosphoglukose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 claims description 16
- HDYANYHVCAPMJV-UHFFFAOYSA-N Uridine diphospho-D-glucuronic acid Natural products O1C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)C(O)C(O)C1COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC1OC(C(O)=O)C(O)C(O)C1O HDYANYHVCAPMJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 16
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 claims description 15
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 claims description 13
- 239000000348 glycosyl donor Substances 0.000 claims description 13
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 13
- 125000004044 trifluoroacetyl group Chemical group FC(C(=O)*)(F)F 0.000 claims description 13
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 12
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 claims description 11
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 claims description 10
- MHSGOABISYIYKP-UHFFFAOYSA-N (4-nitrophenyl)methyl carbonochloridate Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(COC(Cl)=O)C=C1 MHSGOABISYIYKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 claims description 9
- GACDQMDRPRGCTN-KQYNXXCUSA-N 3'-phospho-5'-adenylyl sulfate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OS(O)(=O)=O)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H]1O GACDQMDRPRGCTN-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 9
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 claims description 9
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 claims description 9
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 claims description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N D-glucopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N 0.000 claims description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 7
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 7
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 claims description 7
- OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N N-acetyl-D-glucosamine Chemical group CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N 0.000 claims description 6
- 102100023315 N-acetyllactosaminide beta-1,6-N-acetylglucosaminyl-transferase Human genes 0.000 claims description 6
- 108010056664 N-acetyllactosaminide beta-1,6-N-acetylglucosaminyltransferase Proteins 0.000 claims description 6
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 claims description 6
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 claims description 6
- 108010031142 heparosan synthase Proteins 0.000 claims description 6
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims description 6
- QSUILVWOWLUOEU-GOVZDWNOSA-N 4-nitrophenyl beta-D-glucuronide Chemical compound O1[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 QSUILVWOWLUOEU-GOVZDWNOSA-N 0.000 claims description 5
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 5
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 claims description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 5
- 125000000472 sulfonyl group Chemical group *S(*)(=O)=O 0.000 claims description 5
- 101100506199 Cricetulus griseus HS6ST1 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 241000606856 Pasteurella multocida Species 0.000 claims description 4
- LFTYTUAZOPRMMI-CFRASDGPSA-N UDP-N-acetyl-alpha-D-glucosamine Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C)[C@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 LFTYTUAZOPRMMI-CFRASDGPSA-N 0.000 claims description 4
- LFTYTUAZOPRMMI-UHFFFAOYSA-N UNPD164450 Natural products O1C(CO)C(O)C(O)C(NC(=O)C)C1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 LFTYTUAZOPRMMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 4
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 4
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 claims description 4
- DXASQZJWWGZNSF-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylmethanamine;sulfur trioxide Chemical compound CN(C)C.O=S(=O)=O DXASQZJWWGZNSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229940051027 pasteurella multocida Drugs 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 238000010992 reflux Methods 0.000 claims description 4
- 150000004044 tetrasaccharides Chemical group 0.000 claims description 4
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- WETWJCDKMRHUPV-UHFFFAOYSA-N acetyl chloride Chemical compound CC(Cl)=O WETWJCDKMRHUPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000012346 acetyl chloride Substances 0.000 claims description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 3
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 claims description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 2
- 229940127090 anticoagulant agent Drugs 0.000 claims description 2
- 229960004676 antithrombotic agent Drugs 0.000 claims description 2
- AEMOLEFTQBMNLQ-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactopyranuronic acid Natural products OC1OC(C(O)=O)C(O)C(O)C1O AEMOLEFTQBMNLQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000002301 glucosamine derivatives Chemical class 0.000 claims description 2
- UKVIEHSSVKSQBA-UHFFFAOYSA-N methane;palladium Chemical compound C.[Pd] UKVIEHSSVKSQBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 2
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 claims description 2
- HDYANYHVCAPMJV-USQUEEHTSA-N udp-glucuronic acid Chemical compound O([P@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OC[C@H]1[C@@H]([C@H]([C@@H](O1)N1C(NC(=O)C=C1)=O)O)O)[C@H]1O[C@@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O HDYANYHVCAPMJV-USQUEEHTSA-N 0.000 claims 6
- AEMOLEFTQBMNLQ-HNFCZKTMSA-N L-idopyranuronic acid Chemical class OC1O[C@@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-HNFCZKTMSA-N 0.000 claims 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 20
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 11
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 10
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 abstract description 9
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 abstract description 8
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 abstract description 8
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 abstract description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 6
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 abstract description 4
- 238000006345 epimerization reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 239000004019 antithrombin Substances 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- HDYANYHVCAPMJV-LXQIFKJMSA-N UDP-alpha-D-glucuronic acid Chemical compound C([C@@H]1[C@H]([C@H]([C@@H](O1)N1C(NC(=O)C=C1)=O)O)O)OP(O)(=O)OP(O)(=O)O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HDYANYHVCAPMJV-LXQIFKJMSA-N 0.000 description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 11
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 9
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 6
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 5
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003055 low molecular weight heparin Substances 0.000 description 4
- 229940127215 low-molecular weight heparin Drugs 0.000 description 4
- 125000000636 p-nitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1*)[N+]([O-])=O 0.000 description 4
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000005570 heteronuclear single quantum coherence Methods 0.000 description 3
- 238000000990 heteronuclear single quantum coherence spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- RVDBHQMAUIHAHC-OFKSJOQMSA-N (2s,3s,4s,5r,6r)-3,4,5,6-tetrahydroxy-6-(4-nitrophenyl)oxane-2-carboxylic acid Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(O)=O)O[C@]1(O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 RVDBHQMAUIHAHC-OFKSJOQMSA-N 0.000 description 2
- OKKJLVBELUTLKV-MZCSYVLQSA-N Deuterated methanol Chemical compound [2H]OC([2H])([2H])[2H] OKKJLVBELUTLKV-MZCSYVLQSA-N 0.000 description 2
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001858 anti-Xa Effects 0.000 description 2
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 2
- 229960001318 fondaparinux Drugs 0.000 description 2
- KANJSNBRCNMZMV-ABRZTLGGSA-N fondaparinux Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NS(O)(=O)=O)[C@@H](OC)O[C@H](COS(O)(=O)=O)[C@H]1O[C@H]1[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@@H]4[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O4)NS(O)(=O)=O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O2)NS(O)(=O)=O)[C@H](C(O)=O)O1 KANJSNBRCNMZMV-ABRZTLGGSA-N 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 2
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- MZPNWHGZPIHRNC-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-3-(4-nitrophenyl)propanenitrile Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(CC(Cl)C#N)C=C1 MZPNWHGZPIHRNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 108010079356 FIIa Proteins 0.000 description 1
- FZHXIRIBWMQPQF-UHFFFAOYSA-N Glc-NH2 Natural products O=CC(N)C(O)C(O)C(O)CO FZHXIRIBWMQPQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 102100023937 Heparan sulfate glucosamine 3-O-sulfotransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010022901 Heparin Lyase Proteins 0.000 description 1
- 101001048058 Homo sapiens Heparan sulfate glucosamine 3-O-sulfotransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000007810 chemical reaction solvent Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 108010006406 heparinase II Proteins 0.000 description 1
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-LECHCGJUSA-N iduronic acid Chemical class O=C[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-LECHCGJUSA-N 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- ZHCAAFJSYLFLPX-UHFFFAOYSA-N nitrocyclohexatriene Chemical group [O-][N+](=O)C1=CC=C=C[CH]1 ZHCAAFJSYLFLPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000006501 nitrophenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000010118 platelet activation Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖及其制备方法与应用，本发明首先采用肝素酶III辅助的化学酶法高效合成具特征UV吸收且方便脱除的PNZ为氨基保护基的二糖受体，然后将其进行酶法延长糖链及合理组合的化学酶法N‑硫酸化、酶法C‑5差向异构化/2‑O‑硫酸化、酶法6‑O‑硫酸化与3‑O‑硫酸化修饰，最后以温和的化学法脱除PNZ基团，得到含AT结合序列的真正“天然”肝素七糖，本发明所述肝素七糖具有与磺达肝癸钠相当的、强效特异抗FXa活性，且合成步数明显少、总产率显著高，适合用于制备具显著成本优势的新型抗凝血药物，具有重大产业化和临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖及其制备方法与应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
肝素是高度硫酸化、结构复杂且不均一的糖胺聚糖，作为抗凝和抗血栓药物广泛应用于临床上已经超过80年。当前市售肝素产品主要指提取自猪小肠黏膜等动物组织的未分级肝素(unfractionated heparin，UFH)及其部分解聚得到的新一代低分子量肝素(low-molecular-weight heparin，LMWH)。相比这下，低分子量肝素LMWH具有皮下注射生物利用度高、半衰期长，副作用减小及使用安全等优点，近年逐渐成为临床首选抗凝药物。然而动物源LMWH是高度不均一的混合物，有明显的临床局限性，且存在污染风险、有限的原料供应问题。因此寻求新的非动物源肝素受到广泛关注。
磺达肝癸钠(fondaparinux)是目前唯一上市的全化学合成的肝素寡糖类抗凝药物，为还原末端以O-甲基保护的抗凝血酶(antithrombin，AT)结合五糖序列的类似物。与上述动物源肝素相比，磺达肝癸钠是化学合成制得的单一化合物，为高选择性Xa因子抑制剂，不会引起Ila因子灭活和血小板活化，因此出血风险等副作用明显降低，而且皮下注射半衰期长(～17hr)、生物利用度高。尽管磺达肝癸钠临床效果出色，但其化学合成难度极大，如：据美国专利US4818816报道，合成需要65步，总产率0.1％～0.3％，导致生产成本居高不下，不利于药物的推广。
最近，美国北卡大学教堂山分校Jian Liu教授模拟肝素的体内生物合成途径，建立了一种多酶催化为主、温和化学合成为辅的化学酶法合成技术，能够以极少的反应步数、超高的产率制得含AT结合序列的不同肝素寡糖分子，各化合物均具有AT依赖的强效抗Xa因子活性(Science,2011，334(6055):498–501；Nat Chem Biol,2014,10:248-50)。由于肝素本身无特征吸收，为便于酶促合成反应过程中的检测和纯化，合成选择以在310nm具紫外吸收的、非天然的对硝基苯基β-D-葡糖醛酸(GlcA-PNP)为起始原料进行，故所得化合物实际上为还原末端具有疏水的对硝基苯基的肝素寡糖衍生物。为消除对硝基苯配基对活性难以预测的影响及潜在的致癌风险(http://www.epa.gov/ttnatw01/hlthef/nitrophe.html)，有学者曾尝试采取化学法将硝基苯基从合成的肝素分子末端脱除，并保持糖链完整性和抗Xa活性，但未能取得成功(PNAS,2019,116:9208-9213)。
迄今为止，现有经典的化学酶法策略尚无法制备不含对硝基苯基非天然基团“未被修饰”的肝素寡糖，严重制约着将化学酶法合成的肝素寡糖开发成为与磺达肝癸钠类似的、安全的抗凝血药物。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖及其制备方法与应用。
本发明的第一个目的是提供一种用来制备肝素七糖的二糖受体或二糖受体的甲苷衍生物。
第二个目的是提供上述二糖受体或二糖受体的甲苷衍生物的制备方法。
第三个目的是提供一种高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖。
本发明的肝素七糖除具有天然肝素的磺酰基、乙酰基取代基外，同时不含对硝基苯基等任何非天然修饰基团，可作为AT依赖的Xa因子间接抑制剂。
第四个目的是提供上述高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖的制备方法。
本发明的制备方法简单，制备步骤远远少于磺达肝癸钠，且总产率≥10％。
第五个目的是提供一种高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖的应用。
本发明的肝素七糖用于抗凝血和血栓，具有强效抗FXa活性，可作为磺达肝癸钠的替代药物，与磺达肝癸钠相比成本更低、抗凝血疗效相当。
术语说明：
ABD：抗凝血酶(AT)结合域；
GlcA-PNP：对硝基苯基-β-D-葡糖醛酸；
PNZ：对硝基苄氧羰基；
UDP-GlcNTFA：尿苷二磷酸-N-三氟乙酰葡糖胺
UDP-GlcNAc：尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺
UDP-GlcA：尿苷二磷酸-葡糖醛酸
PAPS：3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸。
KfiA：大肠杆菌K5 N-乙酰氨基葡糖基转移酶
PmHS2：多杀巴斯德菌Heparosan合酶2
NST：N-硫酸基转移酶
C5-epi：C5-异构化酶
2OST：2-O-硫酸基转移酶
6OST：6-O-硫酸基转移酶
3OST：3-O-硫酸基转移酶
本发明的技术方案如下：
一种用来制备肝素七糖的二糖受体，结构式如式I所示：
一种用来制备肝素七糖的二糖受体的甲苷衍生物，结构式如式Ⅱ或式Ⅲ所示：
上述用来制备肝素七糖的二糖受体的制备方法，采用肝素酶III辅助化学酶法，包括步骤如下：
(1)以对硝基苯基-β-D-葡糖醛酸苷(GlcA-PNP)为起始原料、尿苷二磷酸-N-三氟乙酰葡糖胺(UDP-GlcNTFA)为糖基供体，在N-乙酰氨基葡糖基转移酶(KfiA)酶促催化下进行糖链延长，得到二糖骨架，然后以得到的二糖骨架为受体、UDP-葡糖醛酸(UDP-GlcA)为糖基供体，在Heparosan合酶2(PmHS2)酶促催化下进一步延长糖链，得到三糖骨架；
(2)将三糖骨架溶于氢氧化锂水溶液，于冰上静置至完全脱除GlcNTFA残基的三氟乙酰基，所得产物于弱碱性、室温下与对硝基氯甲酸苄酯(PNZ-Cl)混合反应，使N-未取代的葡糖胺(GlcNH3 +)残基的氨基保护，得到含N-对硝基苄氧羰基(PNZ)葡糖胺(GlcNPNZ)的三糖中间体；
(3)步骤(2)含GlcNPNZ的三糖于缓冲液中与肝素酶Ⅲ共同孵育，使GlcNPNZ与GlcA之间的糖苷键断裂，得到二糖受体。
上述用来制备肝素七糖的二糖受体的甲苷衍生物的制备方法，
将制备得到的二糖受体与乙酰氯、甲醇混合并加热回流，经NaOH处理后，纯化得到二糖受体的α-或β-型甲苷衍生物。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述酶KfiA、PmHS2以大肠杆菌重组表达，N-乙酰氨基葡糖基转移酶(KfiA)来源于大肠杆菌(E.coli)K5，Heparosan合酶2(PmHS2)来源于多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)。
根据本发明优选的，步骤(1)中，酶促催化在缓冲液中进行，所用缓冲液为50mmol/L含5-8mmol/L MnCl2的Tris-HCl，pH＝7.0～7.5，反应温度为20℃～37℃，反应液均以C18柱层析纯化。
根据本发明优选的，步骤(1)中，起始原料用量为400-600mg的对硝基苯基-β-D-葡糖醛酸苷(GlcA-PNP)，糖基供体用量为1.2倍当量的尿苷二磷酸-N-三氟乙酰葡糖胺(UDP-GlcNTFA)，1.2倍当量的UDP-葡糖醛酸(UDP-GlcA)。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述LiOH溶液的浓度<0.5mol/L，优选的，LiOH溶液的浓度为0.05mol/L～0.2mol/L。
根据本发明优选的，步骤(2)中，对硝基氯甲酸苄酯(PNZ-Cl)的加入量为三糖的1.5倍量以上。
根据本发明优选的，步骤(2)中，弱碱性pH为9-10。
根据本发明优选的，步骤(3)中，肝素酶Ⅲ切割反应缓冲液为含8-12mM CaCl2的Tris-HCl缓冲液，pH＝7.0～7.5，浓度为50mmol/L，反应温度20℃～37℃。
根据本发明优选的，步骤(1)～(3)的反应液以C18柱层析纯化。
本发明建立的肝素III拓展的化学酶法，首次实现了以4步反应、>80％的高产率制备带PNZ保护基的二糖受体；以5步、>40％的产率制备二糖受体的α-或β-甲苷衍生物。所合成的受体以PNZ为保护基，具特征紫外吸收，方便检测。
一种高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖，含AT结合序列，具有如下如式Ⅴ结构式：
其中，R1为氢(-H)、甲基(-CH3)或其他烷基；R2为氢、乙酰基(-COCH3)或磺酰基(-SO3H)；R3为磺酰基或乙酰基。
上述高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖的制备方法，以上述二糖受体或二糖受体的甲苷衍生物为起始受体，采用化学酶法制备，包括步骤如下：
1)以二糖受体或二糖受体的甲苷衍生物为起始受体，以尿苷二磷酸-N-三氟乙酰葡糖胺(UDP-GlcNTFA)为糖基供体，在N-乙酰氨基葡糖基转移酶(KfiA)酶促催化下进行糖链延长，然后以得到的三糖中间体为受体、UDP-葡糖醛酸(UDP-GlcA)为糖基供体，在Heparosan合酶2(PmHS2)酶促催化下进一步延长糖链，得到四糖骨架，重复上述交替糖链延长反应，得到六糖骨架；
2)步骤1)的六糖骨架溶于氢氧化锂水溶液，于冰上静置至完全脱除GlcNTFA残基的三氟乙酰基，调pH至中性，然后经N-硫酸基转移酶(NST)催化，以3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸(PAPS)为硫酸基供体，使糖链中的GlcNH3 +残基发生N-硫酸化(GlcNS)，得到N-硫酸化六糖；
3)在肝素C-5差向异构化酶(C5-epi)和2-O-硫酸基转移酶(2OST)共同催化下，以PAPS为硫酸基供体，使步骤2)的N-硫酸化六糖两个GlcNS残基之间的GlcA残基直接转变为2-O-硫酸化艾杜糖醛酸(IdoA2S)，得含单一IdoA2S残基的六糖；
4)在KfiA催化下，以UDP-GlcNTFA或UDP-GlcNAc为糖基供体，使步骤3)的含单一IdoA2S残基的六糖进行糖链延长，然后按步骤2)的脱除三氟乙酰基、NST催化方法使糖链中的GlcNH3 +残基发生N-硫酸化(GlcNS)，得七糖中间体；
5)步骤4)得到的七糖中间体，经肝素6-O-硫酸基转移酶(6OST1/3)催化，以PAPS为硫酸基供体，使中间体中的GlcNS或GlcNAc残基全部发生6-O-硫酸化修饰(GlcNS6S或GlcNAc6S)，得到6-O-硫酸化的七糖中间体；
6)步骤5)得到的6-O-硫酸化的七糖中间体，在肝素3-O-硫酸基转移酶(3OST)催化下，以PAPS为硫酸基供体，6-O-硫酸化七糖的特定葡糖胺发生3-O-硫酸化修饰(GlcNS6S3S)，得到含AT结合五糖序列的肝素七糖中间体；
7)采用钯碳还原脱除肝素七糖中间体中的PNZ基团，得到不含任何非天然修饰基团的“天然”肝素七糖；
8)步骤7)得到的肝素七糖在弱碱性条件下与三氧化硫-三甲胺混合物反应，使其还原末端单个GlcNH3 +残基转变为GlcNS，或与乙酸酐混合，使还原末端单个GlcNH3 +残基转化为GlcNAc残基；得到高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖。
本发明提供的式I、II和III中所示的葡糖胺的氨基保护基对硝基苄氧羰基(PNZ)为优选的氨基保护基，在270nm处具最大紫外吸收且可以在温和的特定条件下脱除，其可以用同样具紫外吸吸收的其他基团替代，如在220nm处具最大紫外吸收的苄氧羰基(Cbz)等。
本发明首次证实，肝素酶III除能切割-GlcNAc-GlcA-或-GlcNS-GlcA-之间的糖苷键，还能切割N-PNZ(或N-Cbz)葡糖胺(GlcNPNZ或GlcNCbz)与GlcA残基之间的糖苷键。
本发明提供的高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖的制备方法，利用肝素酶III切割N-PNZ(或N-Cbz)葡糖胺(GlcNPNZ或GlcNCbz)与GlcA残基之间的糖苷键制得以PNZ或Cbz为氨基保护基的二糖受体，然后采用化学酶法得到了高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖，制备工艺简单，总产率高。
高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖的制备方法中，优选方案如下：
步骤1)中，KfiA、PmHS2酶促催化在缓冲液中进行，所用缓冲液为50mmol/L含5-8mmol/L MnCl2的Tris-HCl，pH＝7.0～7.5，反应温度为20℃～37℃，反应液以C18柱层析纯化。
步骤1)中，起始受体用量为400-600mg，糖基供体用量为1.2倍当量的尿苷二磷酸-N-三氟乙酰葡糖胺(UDP-GlcNTFA)，1.2倍当量的UDP-葡糖醛酸(UDP-GlcA)。
步骤2)中，所述LiOH溶液的浓度<0.5mol/L，优选的，LiOH溶液的浓度为0.05mol/L～0.2mol/L。
步骤2)中，NST催化的修饰反应所用缓冲液为50mmol/L、pH＝7.0～7.4的2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)，硫酸基供体PAPS加入量为被修饰GlcNH3 +残基摩尔质量的1.1倍以上；反应液以强阴离子交换柱层析纯化。
步骤3)中C5-epi和2OST共同催化修饰的具体方法为：将底物与C5-epi先于缓冲溶液中进行异构化反应0.5h以上，再加入2OST酶和硫酸基供体PAPS以进行硫酸化修饰，反应液经强阴离子柱层析纯化；所述缓冲溶液为含2mM CaCl2的50mmol/L MES，pH7.0～7.4。
进一步优选的，异构化反应的条件为20℃～37℃下反应0.5h～1.5h。
进一步优选的，硫酸基供体PAPS的加入量为N-硫酸化六糖的摩尔质量的1.1倍以上。
进一步优选的，C5-epi单独异构化和与2OST硫酸化共同修饰的温度为20℃～37℃。
步骤4)KfiA酶促催化反应与步骤1)条件相同；脱除三氟乙酰基、NST酶催化反应条件与步骤2)相同。
步骤5)，6OST催化的具体方法为：将底物与6OST1和6OST3、硫酸基供体PAPS在缓冲溶液中混合进行硫酸化修饰，反应液经强阴离子交换柱层析。
进一步优选的，所述缓冲溶液为50mmol/L的MES，pH7.0～7.4。
进一步优选的，所述硫酸基供体PAPS的加入量为底物七糖中间体摩尔质量的3.0倍以上。
进一步优选的，所述修饰的反应温度为20℃～37℃。
步骤6)，3OST酶催化的具体方法为：将底物与3-O-硫酸基转移酶1(3OST)、1.1倍以上的硫酸基供体PAPS在缓冲溶液中混合进行硫酸化修饰，反应液经强阴离子交换柱层析，得到含AT结合序列的肝素七糖中间体。缓冲溶液为pH＝7.0～7.5、50mmol/L的MES缓冲液。
步骤7)，钯碳还原的具体方法为：于茄形瓶中，步骤6)所得肝素七糖中间体加溶解量水溶解后，加入大于等于1倍量的Pd/C，插上氢气球，室温搅拌反应直至PNZ基团完全脱除，透析得含AT结合序列、不含任何非天然修饰基团的的肝素七糖。
步骤8)，具体反应如下：
pH＝8～10弱碱性条件下，步骤7)的肝素七糖与大于等于3倍量的三氧化硫-三甲胺混合物混合，在15-40℃条件下反应，至还原末端单个GlcNH3 +残基完全转化为GlcNS；
或pH＝8～10弱碱性条件下，步骤7)的肝素七糖与大于等于3倍量的乙酸酐在15-40℃条件下反应，至还原末端单个GlcNH3 +残基完全转化为GlcNAc。
步骤7)、8)制备的肝素七糖的结构与结构通式V符合。
采用生色底物法测定本发明制备的肝素七糖的抗FXa和FIIa活性。本发明合成的肝素七糖具AT依赖的强效抗FXa活性且无抗FIIa活性，可作为磺达肝癸钠的替代药物，应用于抗凝血和血栓性疾病的治疗。
高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖的应用，用于制备抗凝血、抗血栓药物，作为磺达肝癸钠的替代药物。
有益效果：
1、本发明的制备方法为肝素七糖的拓展的化学酶法合成的新方法，包括采用肝素酶III辅助的化学酶法高效合成具特征UV吸收且方便脱除的PNZ为氨基保护基的二糖受体，然后将其进行酶法延长糖链及合理组合的化学酶法N-硫酸化、酶法C-5差向异构化/2-O-硫酸化、酶法6-O-硫酸化与3-O-硫酸化修饰，最后以温和的化学法脱除PNZ基团，得到含AT结合序列的真正“天然”肝素七糖，其为AT依赖的Xa因子间接抑制剂，具有与磺达肝癸钠相当的、强效特异抗FXa活性，与磺达肝癸钠相比，合成步数明显少、总产率显著高(≥10％)，而磺达肝癸钠总产率仅为0.1％～0.3％。
2、本发明的肝素七糖不含任何有安全隐患的非天然修饰基团，其抗FⅩa活性的IC50值与磺达肝癸钠接近，并且无显著的抗IIa因子活性，为AT依赖的强效Xa因子间接抑制剂，为成本低的磺达肝癸钠替代药物。
附图说明
图1是本发明实施例5制得的肝素七糖7mer-1的1H NMR(A)和HSQC(B)谱图；
图2是本发明实施例5制得的肝素七糖(A)和磺达癸肝癸钠(B)的体外抗Xa因子活性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的药品及试剂，若无特殊说明，均为普通市售产品。
实施例1：以PNZ为氨基保护基的三糖中间体3mer-2的制备
取500mg对硝基苯基-β-D-葡糖醛酸苷(GlcA-PNP)、1.2倍当量的UDP-GlcNTFA及适量KfiA酶置于50mmol/L、pH＝7.3且含6mmol/L MnCl2的Tris-HCl缓冲液，反应液总体积为300mL，室温过夜反应。以PAMN-HPLC(检测波长为310nm)检测反应进程，至底物转化率为93％，反应液用三氟乙酸调调pH＝2-3，用C18柱层析(3cm×50cm)纯化得二糖骨架2mer-4。以得到的二糖为底物，连同1.2倍当量的UDP-GlcA、适量PmHS2酶混合于上述缓冲液中，终体积为200mL，室温过夜反应，PAMN-HPLC测得底物转化率达98％，反应液调pH＝2-3，于C18柱层析纯化得三糖骨架3mer-1，PAMN-HPLC测得其纯度>96％，ESI-MS测定其分子量为748.36Da。
3mer-1溶于100mL pH＝12的氢氧化锂溶液，室温搅拌2h，调节pH＝7.0中止反应，ESI-MS检测以确保三氟乙酰基完全脱除。然后以1mol/L的氢氧化钠调节pH至10，加入1.5倍当量的对硝基氯甲酸苄酯(PNZ-Cl，乙腈溶解)，室温搅拌，以PAMN-HPLC每隔8h检测一次，检测波长310nm和270nm，根据需要补加适量PNZ-Cl，反应完成后，以C18柱层析(3cm×50cm)纯化，所得产物3mer-2的纯度>98％。ESI-MS测定其分子量为831.38Da，表明对硝基苄氧羰基(PNZ)成功引入。
根据3mer-2的1H NMR(600MHz,D2O)谱，可得重要数据为：δ8.12(d，J＝8.4Hz，2H)，8.11(d，J＝9.0Hz，2H)，7.47(d，J＝8.6Hz，2H)，7.08(d，J＝9.6Hz，2H)，5.31(d，J＝3.7Hz，1H，B1)，5.13(d，J＝7.6Hz，1H，A1)，5.11(s，2H)，4.42(d，J＝7.9Hz，1H，C1)；根据新出现的苯环、亚甲基信号峰可知，PNZ基团被成功引入到三糖的GlcN上，且未导致三糖的其他结构变化。
PNZ为氨基保护基的三糖中间体3mer-2合成路线见式Ⅵ所示，
实施例2：以PNZ为氨基保护基的二糖受体的制备
纯化后的3mer-3溶于pH＝～7.3、50mmol/L的Tris-HCl缓冲液(含10mmol/LCaCl2)，并加入足量肝素酶Ⅲ，反应总体积为100mL，室温搅拌过夜。PAMN-HPLC检测反应进程，所用检测波长为310nm和270nm。待3mer-3完全消失，调pH＝2-3终止反应，反应液用C18柱层析纯化。所得产物以PAMN-HPLC测得纯度>99％；ESI-MS测定其分子量为534.34Da，与二糖2mer-1(GlcA-GlcNPNZ)理论分子量相符。
根据产物的1H NMR和HSQC可得其重要数据为1H NMR(400MHz，CD3OD)δ5.02(d，J＝3.6Hz，1H，B1-α)，4.51(d，J＝8.0Hz，1H，B1-β)，4.41(d，J＝8.0Hz，1H，C1)，可以确认其为二糖受体2mer-1，其还原末端为α-、β-型共存。
2mer-1溶于无水甲醇中，与1％乙酰氯混合，于72℃油浴加热回流，待ESI-MS检测2mer-1基本消失后，停止加热回流，于旋转蒸发仪浓缩以除去反应溶剂。样品用水复溶，用1mol/L氢氧化钠溶液调pH＝10，室温搅拌2h，PAMN-HPLC检测其反应结束，用C18柱层析纯化得两个产物2mer-2、2mer-3，纯度均>90％。ESI-MS测得其分子量为548.00Da，与甲苷二糖的理论分子量相符。根据产物的1H NMR(600MHz，D2O)谱，可得2mer-2的重要核磁数据为：δ4.62(d，J＝3.7Hz，1H，B1)，4.43(d，J＝7.9Hz，1H，C1)，说明其还原末端为α-型；2mer-3的重要核磁数据为：δ4.43(d,J＝8.0Hz，1H，C1)，4.30(d，J＝8.5Hz，1H，B1)，说明其还原末端为β-型；
以PNZ为氨基保护基的二糖受体合成路线见式Ⅶ所示，
实施例3：以二糖2mer-1为受体制备肝素七糖中间体7mer-2
以实施例2制备的2mer-1为起始原料，参照实施例1所述的KfiA、PmHS2酶促反应方法依次进行糖链延长，得到四糖骨架，PAMN-HPLC检测反应，检测波长为270nm。然后以四糖骨架为原料，重复交替进行KfiA、PmHS2酶法糖链延长得六糖骨架6mer-1。然后参照实施例1将6mer-1的三氟乙酰基完全脱除，接着置于终浓度为50mmol/L的MES缓冲液(pH＝7.5)，同时加入1.5倍当量的硫酸基供体PAPS、适量NST酶，调整反应体积为200mL，室温过夜反应，并根据情况补加酶或PAPS。待底物转化率>99％，反应液用稀醋酸调pH＝3-4，后用Q-Sepharose强阴离子柱(2cm×30cm)纯化，得到N-硫酸化肝素六糖6mer-2，其纯度>98％。ESI-MS测定其分子量为1368.24Da，表明全部GlcNTFA被修饰为GlcNS。
六糖6mer-2于pH＝7.0～7.5、50mmol/L的MES缓冲液中加入2mmol/L CaCl2及适量酶C5-epi，调整反应体积为150mL，于37℃水浴反应2h。然后加入约1.5倍当量的PAPS、额外C5-epi和足量2OST酶，室温反应过夜。PAMN-HPLC检测反应，并根据需要补加酶或PAPS，至反应结束。反应液用Q-Sepharose强阴离子柱(2cm×30cm)纯化得到产物6mer-3。ESI-MS测定其分子量为1448.00Da，产物6mer-3较6mer-2增加一个硫酸酸基团。
根据1H NMR(400MHz，D2O)和HSQC谱图，6mer-3核磁数据如下：
1H NMRδ5.51(d，J＝3.7Hz，1H，C1)，5.24(d，J＝3.6Hz，1H，E1)，5.20(s，1H，D1)，5.15(d，J＝3.2Hz，1H，A1-α)，4.80(s，1H，D5)，4.49(d，J＝7.9Hz，1H，F1)，4.46(d，J＝7.9Hz，1H，B1)，可推知GlcNS残基之间的GlcA残基被修饰为IdoA2S残基。
以六糖6mer-3为底物，参照参照实施例1的方法进行KfiA酶法糖链延长，以Q-Sepharose强阴离子柱(2cm×30cm)纯化得七糖中间体7mer-1，然后参照上述方法依次进行化学三氟乙酰基脱除、酶法N-硫酸化修饰得七糖中间体7mer-2，其纯度>99％。ESI-MS测定其分子量为1689.26Da，与理论值相符。
根据1H NMR(400MHz，D2O)和HSQC，7mer-2核磁数据如下：
δ5.59(d，J＝3.7Hz，1H，G1)，5.52(d，J＝3.7Hz，1H，C1)，5.26(d，J＝3.6Hz，1H，E1)，5.22(s，1H，D1)，5.17(d，J＝5.6Hz，1H，A1-α)，4.81(s，1H，D5)，4.51(d，J＝8.4Hz，1H，F1)，4.48(d，J＝9.2Hz，1H，B1)，与6mer-3相比，7mer-2增加了葡糖胺信号峰，而其他信号峰基本未发生明显改变。
肝素七糖中间体7mer-2合成路线见式Ⅷ所示，
实施例4：肝素七糖中间体7mer-4的制备
将七糖底物7mer-2置于pH＝7.0～7.5、50mmol/L的MES缓冲液中，加入1.5倍当量PAPS，4mL的6-OST-1和4mL的6-OST-3酶，调整反应体积为100mL，29℃水浴反应过夜。PAMN-HPLC检测反应，根据需要补加酶或PAPS。待7mer-2反应率>99％，反应液用稀醋酸调节pH＝3-4终止反应，-20℃冰箱冻融除酶，无需纯化。
将上述反应液调节pH＝7.0～7.5，并加入约1.5倍当量PAPS、4mL的3-OST-1酶，调整反应体积为200mL，29℃水浴反应过夜。PAMN-HPLC检测反应至底物修饰率为99％以上，反应液用稀醋酸调pH＝3-4后，用Q-Sepharose强阴离子柱(2cm×30cm)纯化得到产物7mer-4,其纯度达99％以上。
ESI-MS检测7mer-4的分子量为2009.28Da，表明与7mer-2相比新增4个硫酸基团，与预期相符合。
根据1H NMR(400MHz，D2O)，7mer-4核磁数据如下：
δ5.58(d，J＝3.6Hz，2H，G1/C1)，5.53(s，1H，E1)，5.45(s，1H，D1)，5.17(d，J＝3.2Hz，1H，A1-α)，4.58(d，J＝7.3Hz，1H，F1)，4.52(d，J＝7.8Hz，1H，B1)，结构与预期相符，为含AT结合序列的产物。
实施例5：肝素七糖7mer-1的制备
将7mer-4置于250mL茄形瓶中，加适量水溶解，加入约400mg的Pd/C，而后插上氢气球，排气三次后开始室温搅拌反应。此过程利用PAMN-HPLC检测反应，检测波长为270nm。每隔12h以PAMN-HPLC检测一次，至7mer-4完全消失。反应液过滤去除Pd/C、透析得到终产物7mer-5。7mer-5经肝素酶I、II和III共同完全酶解后，用SAX柱进行双糖分析，检测波长为232nm，可测得产物含双糖ΔU-GlcNH3 +而无ΔU-GlcNPNZ，表明PNZ基团被完全脱除。ESI-MS测得其分子量为1830.02Da，与理论值相符。
肝素七糖7mer-1的1H NMR和HSQC谱图见图1所示，根据1H NMR和HSQC谱图，核磁数据如下：
δ5.57(d，J＝3.7Hz，2H，G1/C1)，5.53(d，J＝3.7Hz，1H，E1)，5.44(s，1H，D1)，5.40(d，J＝3.6Hz，1H，A1-α)，4.91(d，J＝8.4Hz，1H，A1-β)，4.81(s，1H，D5)，4.58(d，J＝7.2Hz，1H，F1)，4.50(d，J＝7.8Hz，1H，B1)；与7mer-4相比，低场区的苯环信号以及亚甲基信号消失，证明脱除PNZ反应完全。因此，7mer-5为不含其他修饰基团的“天然”肝素七糖。
肝素七糖7mer-1合成路线见式Ⅸ所示，
实验例：肝素七糖7mer-1体外活性测定
采用生色底物法测得本发明制备得到的新型肝素七糖抗FⅩa活性的IC50值为19.68ng/mL(9.5nmol/L)，同样条件下测得磺达肝癸钠的IC50值分别为14.19ng/mL(8.2nmol/L)，以摩尔浓度计新型肝素七糖抗FⅩa活性的IC50值与磺达肝癸钠接近，结果见图2。同时本发明制备的肝素七糖无显著的抗IIa因子活性。
因此，本发明制备的肝素七糖是不含对硝基苯基等非天然基团的“未被修饰的”肝素分子，为AT依赖的强效Xa因子间接抑制剂，抗FⅩa活性的IC50值与磺达肝癸钠接近，可用于制备与磺达肝癸钠类似的抗凝抗血栓药物，用于替代磺达肝癸钠。
Claims (10)
1.一种用来制备肝素七糖的二糖受体，结构式如式I所示：
2.一种用来制备肝素七糖的二糖受体的甲苷衍生物，结构式如式Ⅱ或式Ⅲ所示：
3.权利要求1所述的用来制备肝素七糖的二糖受体的制备方法，采用肝素酶III辅助化学酶法，包括步骤如下：
(1)以对硝基苯基-β-D-葡糖醛酸苷(GlcA-PNP)为起始原料、尿苷二磷酸-N-三氟乙酰葡糖胺(UDP-GlcNTFA)为糖基供体，在N-乙酰氨基葡糖基转移酶(KfiA)酶促催化下进行糖链延长，得到二糖骨架，然后以得到的二糖骨架为受体、UDP-葡糖醛酸(UDP-GlcA)为糖基供体，在Heparosan合酶2(PmHS2)酶促催化下进一步延长糖链，得到三糖骨架；
(2)将三糖骨架溶于氢氧化锂水溶液，于冰上静置至完全脱除GlcNTFA残基的三氟乙酰基，所得产物于弱碱性、室温下与对硝基氯甲酸苄酯(PNZ-Cl)混合反应，使N-未取代的葡糖胺(GlcNH3 +)残基的氨基保护，得到含N-对硝基苄氧羰基(PNZ)葡糖胺(GlcNPNZ)的三糖中间体；
(3)步骤(2)含GlcNPNZ的三糖于缓冲液中与肝素酶Ⅲ共同孵育，使GlcNPNZ与GlcA之间的糖苷键断裂，得到二糖受体。
4.权利要求1所述的用来制备肝素七糖的二糖受体的甲苷衍生物的制备方法，
将权利要求3制备得到的二糖受体与乙酰氯、甲醇混合并加热回流，经NaOH处理后，纯化得到二糖受体的α-或β-型甲苷衍生物。
5.根据权利要求3或权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述酶KfiA、PmHS2以大肠杆菌重组表达，N-乙酰氨基葡糖基转移酶(KfiA)来源于大肠杆菌(E.coli)K5，Heparosan合酶2(PmHS2)来源于多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)；
步骤(1)中，酶促催化在缓冲液中进行，所用缓冲液为50mmol/L含5-8mmol/L MnCl2的Tris-HCl，pH＝7.0～7.5，反应温度为20℃～37℃，反应液均以C18柱层析纯化；
步骤(1)中，起始原料用量为400-600mg的对硝基苯基-β-D-葡糖醛酸苷(GlcA-PNP)，糖基供体用量为1.2倍当量的尿苷二磷酸-N-三氟乙酰葡糖胺(UDP-GlcNTFA)，1.2倍当量的UDP-葡糖醛酸(UDP-GlcA)；
步骤(2)中，所述LiOH溶液的浓度<0.5mol/L，优选的，LiOH溶液的浓度为0.05mol/L～0.2mol/L；
步骤(2)中，对硝基氯甲酸苄酯(PNZ-Cl)的加入量为三糖的1.5倍量以上；
步骤(2)中，弱碱性pH为9-10；
步骤(3)中，肝素酶Ⅲ切割反应缓冲液为含8-12mM CaCl2的Tris-HCl缓冲液，pH＝7.0～7.5，浓度为50mmol/L，反应温度20℃～37℃。
6.一种高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖，含AT结合序列，具有如下如式Ⅴ结构式：
其中，R1为氢(-H)、甲基(-CH3)或其他烷基；R2为氢、乙酰基(-COCH3)或磺酰基(-SO3H)；R3为磺酰基或乙酰基。
7.权利要求6所述的高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖的制备方法，以权利要求1或权利要求2所述的二糖受体或二糖受体的甲苷衍生物为起始受体，采用化学酶法制备，包括步骤如下：
1)以二糖受体或二糖受体的甲苷衍生物为起始受体，以尿苷二磷酸-N-三氟乙酰葡糖胺(UDP-GlcNTFA)为糖基供体，在N-乙酰氨基葡糖基转移酶(KfiA)酶促催化下进行糖链延长，然后以得到的三糖中间体为受体、UDP-葡糖醛酸(UDP-GlcA)为糖基供体，在Heparosan合酶2(PmHS2)酶促催化下进一步延长糖链，得到四糖骨架，重复上述交替糖链延长反应，得到六糖骨架；
2)步骤1)的六糖骨架溶于氢氧化锂水溶液，于冰上静置至完全脱除GlcNTFA残基的三氟乙酰基，调pH至中性，然后经N-硫酸基转移酶(NST)催化，以3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸(PAPS)为硫酸基供体，使糖链中的GlcNH3 +残基发生N-硫酸化(GlcNS)，得到N-硫酸化六糖；
3)在肝素C-5差向异构化酶(C5-epi)和2-O-硫酸基转移酶(2OST)共同催化下，以PAPS为硫酸基供体，使步骤2)的N-硫酸化六糖两个GlcNS残基之间的GlcA残基直接转变为2-O-硫酸化艾杜糖醛酸(IdoA2S)，得含单一IdoA2S残基的六糖；
4)在KfiA催化下，以UDP-GlcNTFA或UDP-GlcNAc为糖基供体，使步骤3)的含单一IdoA2S残基的六糖进行糖链延长，然后按步骤2)的脱除三氟乙酰基、NST催化方法使糖链中的GlcNH3 +残基发生N-硫酸化(GlcNS)，得七糖中间体；
5)步骤4)得到的七糖中间体，经肝素6-O-硫酸基转移酶(6OST1/3)催化，以PAPS为硫酸基供体，使中间体中的GlcNS或GlcNAc残基全部发生6-O-硫酸化修饰(GlcNS6S或GlcNAc6S)，得到6-O-硫酸化的七糖中间体；
6)步骤5)得到的6-O-硫酸化的七糖中间体，在肝素3-O-硫酸基转移酶(3OST)催化下，以PAPS为硫酸基供体，6-O-硫酸化七糖的特定葡糖胺发生3-O-硫酸化修饰(GlcNS6S3S)，得到含AT结合五糖序列的肝素七糖中间体；
7)采用钯碳还原脱除肝素七糖中间体中的PNZ基团，得到不含任何非天然修饰基团的“天然”肝素七糖；
8)步骤7)得到的肝素七糖在弱碱性条件下与三氧化硫-三甲胺混合物反应，使其还原末端单个GlcNH3 +残基转变为GlcNS，或与乙酸酐混合，使还原末端单个GlcNH3 +残基转化为GlcNAc残基；得到高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，KfiA、PmHS2酶促催化在缓冲液中进行，所用缓冲液为50mmol/L含5-8mmol/L MnCl2的Tris-HCl，pH＝7.0～7.5，反应温度为20℃～37℃，反应液以C18柱层析纯化；
步骤2)中，所述LiOH溶液的浓度<0.5mol/L，优选的，LiOH溶液的浓度为0.05mol/L～0.2mol/L；
步骤2)中，NST催化的修饰反应所用缓冲液为50mmol/L、pH＝7.0～7.4的2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)，硫酸基供体PAPS加入量为被修饰GlcNH3 +残基摩尔质量的1.1倍以上；反应液以强阴离子交换柱层析纯化；
步骤3)中C5-epi和2OST共同催化修饰的具体方法为：将底物与C5-epi先于缓冲溶液中进行异构化反应0.5h以上，再加入2OST酶和硫酸基供体PAPS以进行硫酸化修饰，反应液经强阴离子柱层析纯化；所述缓冲溶液为含2mM CaCl2的50mmol/L MES，pH7.0～7.4；
步骤4)KfiA酶促催化反应与步骤1)条件相同；脱除三氟乙酰基、NST酶催化反应条件与步骤2)相同。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤5)，6OST催化的具体方法为：将底物与6OST1和6OST3、硫酸基供体PAPS在缓冲溶液中混合进行硫酸化修饰，反应液经强阴离子交换柱层析；所述缓冲溶液为50mmol/L的MES，pH7.0～7.4；
步骤6)，3OST酶催化的具体方法为：将底物与3-O-硫酸基转移酶1(3OST)、1.1倍以上的硫酸基供体PAPS在缓冲溶液中混合进行硫酸化修饰，反应液经强阴离子交换柱层析，得到含AT结合序列的肝素七糖中间体，缓冲溶液为pH＝7.0～7.5、50mmol/L的MES缓冲液；
步骤7)，钯碳还原的具体方法为：于茄形瓶中，步骤6)所得肝素七糖中间体加溶解量水溶解后，加入大于等于1倍量的Pd/C，插上氢气球，室温搅拌反应直至PNZ基团完全脱除，透析得含AT结合序列、不含任何非天然修饰基团的的肝素七糖；
步骤8)，具体反应如下：
pH＝8～10弱碱性条件下，步骤7)的肝素七糖与大于等于3倍量的三氧化硫-三甲胺混合物混合，在15-40℃条件下反应，至还原末端单个GlcNH3 +残基完全转化为GlcNS；
或pH＝8～10弱碱性条件下，步骤7)的肝素七糖与大于等于3倍量的乙酸酐在15-40℃条件下反应，至还原末端单个GlcNH3 +残基完全转化为GlcNAc。
10.权利要求6所述的高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖的应用，用于制备抗凝血、抗血栓药物，作为磺达肝癸钠的替代药物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110794195.1A CN113666980B (zh) | 2021-07-14 | 2021-07-14 | 一种高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖及其制备方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110794195.1A CN113666980B (zh) | 2021-07-14 | 2021-07-14 | 一种高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖及其制备方法与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113666980A true CN113666980A (zh) | 2021-11-19 |
| CN113666980B CN113666980B (zh) | 2023-12-26 |
Family
ID=78539119
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110794195.1A Active CN113666980B (zh) | 2021-07-14 | 2021-07-14 | 一种高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖及其制备方法与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113666980B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024061270A1 (zh) * | 2022-09-21 | 2024-03-28 | 中国科学院上海药物研究所 | 基于肝素五糖的低分子量肝素模拟物及其制备方法和用途 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111154819A (zh) * | 2020-01-15 | 2020-05-15 | 山东大学 | 一种非动物源低分子量肝素及其制备方法与应用 |
| US20200216573A1 (en) * | 2018-12-21 | 2020-07-09 | California Institute Of Technology | Expedient synthesis of core disaccharide building blocks from natural polysaccharides for heparan sulfate oligosaccharide assembly |
-
2021
- 2021-07-14 CN CN202110794195.1A patent/CN113666980B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20200216573A1 (en) * | 2018-12-21 | 2020-07-09 | California Institute Of Technology | Expedient synthesis of core disaccharide building blocks from natural polysaccharides for heparan sulfate oligosaccharide assembly |
| CN111154819A (zh) * | 2020-01-15 | 2020-05-15 | 山东大学 | 一种非动物源低分子量肝素及其制备方法与应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| XING ZHANG 等: "Chemoenzymatic synthesis of heparan sulfate and heparin oligosaccharides and NMR analysis: paving the way to a diverse library for glycobiologists", CHEMICAL SCIENCE, vol. 8, no. 12, pages 7932 - 7940, XP055618454, DOI: 10.1039/C7SC03541A * |
| YONGMEI XU 等: "Chemoenzymatic Synthesis of Homogeneous Ultralow Molecular Weight Heparins", SCIENCE, vol. 334, no. 6055, pages 498 - 501, XP055126707, DOI: 10.1126/science.1207478 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024061270A1 (zh) * | 2022-09-21 | 2024-03-28 | 中国科学院上海药物研究所 | 基于肝素五糖的低分子量肝素模拟物及其制备方法和用途 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113666980B (zh) | 2023-12-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wang et al. | Preactivation‐based, one‐pot combinatorial synthesis of heparin‐like hexasaccharides for the analysis of heparin–protein interactions | |
| Karst et al. | Recent chemical and enzymatic approaches to the synthesis of glycosaminoglycan oligosaccharides | |
| CN113583151B (zh) | 含at结合序列和连续2-o-葡糖醛酸残基的肝素分子及其制备方法与应用 | |
| Pawar et al. | Expedient synthesis of core disaccharide building blocks from natural polysaccharides for heparan sulfate oligosaccharide assembly | |
| EP0557887B1 (en) | Polysaccharide derivatives of heparin, heparan sulphate, fraction and fragments thereof, process for their preparation and pharmaceutical compositions containing them | |
| HU203565B (en) | Process for producing heparin, heparane-sulfat and dermatane-sulfat of small molecular mass and pharmaceutical compositions containing them as active components | |
| HU214986B (hu) | Eljárás N,O-szulfatált heparozánokat tartalmazó készítmények előállítására | |
| HUT64087A (en) | Process for producing n,o-sulfated heparosanes of high molecular weigh and pharmaceutical compositions comprising such compounds | |
| Jin et al. | Preactivation-based, iterative one-pot synthesis of anticoagulant pentasaccharide fondaparinux sodium | |
| CN111154819B (zh) | 一种非动物源低分子量肝素及其制备方法与应用 | |
| WO2024046048A1 (zh) | 一种抗凝血肝素寡糖苯联二聚体及其制备方法与应用 | |
| EP0165134B1 (fr) | Nouveaux oligosaccharides, leur préparation par voie de synthèse et leurs applications biologiques | |
| WO2024032575A1 (zh) | 一种含双抗凝血酶结合序列的肝素十二糖及其制备方法与应用 | |
| CN113666980B (zh) | 一种高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖及其制备方法与应用 | |
| EP1694714B1 (en) | Low molecular weight polysaccharides having antithrombotic activity | |
| JP4036755B2 (ja) | ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体の製造法 | |
| Duchaussoy et al. | Assessment through chemical synthesis of the size of the heparin sequence involved in thrombin inhibition | |
| CN108715875B (zh) | 酶化学法合成结构明确的硫酸肝素寡糖的方法 | |
| EP2980103B1 (en) | Low molecular weight glycosaminoglycan derivative, pharmaceutical composition thereof, preparation method therefor and use thereof | |
| Cai et al. | Preparation and application of a ‘clickable’acceptor for enzymatic synthesis of heparin oligosaccharides | |
| JP2005536577A (ja) | Ｎ−アシル−（エピ）ｋ５−アミン−ｏ−硫酸塩誘導体の製造方法およびｎ−アシル−（エピ）ｋ５−アミン−ｏ−硫酸塩誘導体 | |
| Zhang et al. | Uncovering the detailed mode of cleavage of heparinase I toward structurally defined heparin oligosaccharides | |
| Zhang et al. | Facile chemoenzymatic synthesis of unmodified anticoagulant ultra-low molecular weight heparin | |
| US5340932A (en) | Substances with heparin-like structure and their method of production | |
| CN117683830A (zh) | 一种抗凝血肝素-软骨素嵌合体糖分子及其制备方法与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |