CN113666980B - 一种高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖及其制备方法与应用,本发明首先采用肝素酶III辅助的化学酶法高效合成具特征UV吸收且方便脱除的PNZ为氨基保护基的二糖受体,然后将其进行酶法延长糖链及合理组合的化学酶法N‑硫酸化、酶法C‑5差向异构化/2‑O‑硫酸化、酶法6‑O‑硫酸化与3‑O‑硫酸化修饰,最后以温和的化学法脱除PNZ基团,得到含AT结合序列的真正“天然”肝素七糖,本发明所述肝素七糖具有与磺达肝癸钠相当的、强效特异抗FXa活性,且合成步数明显少、总产率显著高,适合用于制备具显著成本优势的新型抗凝血药物,具有重大产业化和临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖及其制备方法与应用,属于生物医药技术领域。
背景技术
肝素是高度硫酸化、结构复杂且不均一的糖胺聚糖,作为抗凝和抗血栓药物广泛应用于临床上已经超过80年。当前市售肝素产品主要指提取自猪小肠黏膜等动物组织的未分级肝素(unfractionated heparin,UFH)及其部分解聚得到的新一代低分子量肝素(low-molecular-weight heparin,LMWH)。相比这下,低分子量肝素LMWH具有皮下注射生物利用度高、半衰期长,副作用减小及使用安全等优点,近年逐渐成为临床首选抗凝药物。然而动物源LMWH是高度不均一的混合物,有明显的临床局限性,且存在污染风险、有限的原料供应问题。因此寻求新的非动物源肝素受到广泛关注。
磺达肝癸钠(fondaparinux)是目前唯一上市的全化学合成的肝素寡糖类抗凝药物,为还原末端以O-甲基保护的抗凝血酶(antithrombin,AT)结合五糖序列的类似物。与上述动物源肝素相比,磺达肝癸钠是化学合成制得的单一化合物,为高选择性Xa因子抑制剂,不会引起Ila因子灭活和血小板活化,因此出血风险等副作用明显降低,而且皮下注射半衰期长(~17hr)、生物利用度高。尽管磺达肝癸钠临床效果出色,但其化学合成难度极大,如:据美国专利US4818816报道,合成需要65步,总产率0.1%~0.3%,导致生产成本居高不下,不利于药物的推广。
最近,美国北卡大学教堂山分校Jian Liu教授模拟肝素的体内生物合成途径,建立了一种多酶催化为主、温和化学合成为辅的化学酶法合成技术,能够以极少的反应步数、超高的产率制得含AT结合序列的不同肝素寡糖分子,各化合物均具有AT依赖的强效抗Xa因子活性(Science,2011,334(6055):498–501;Nat Chem Biol,2014,10:248-50)。由于肝素本身无特征吸收,为便于酶促合成反应过程中的检测和纯化,合成选择以在310nm具紫外吸收的、非天然的对硝基苯基β-D-葡糖醛酸(GlcA-PNP)为起始原料进行,故所得化合物实际上为还原末端具有疏水的对硝基苯基的肝素寡糖衍生物。为消除对硝基苯配基对活性难以预测的影响及潜在的致癌风险(http://www.epa.gov/ttnatw01/hlthef/nitrophe.html),有学者曾尝试采取化学法将硝基苯基从合成的肝素分子末端脱除,并保持糖链完整性和抗Xa活性,但未能取得成功(PNAS,2019,116:9208-9213)。
迄今为止,现有经典的化学酶法策略尚无法制备不含对硝基苯基非天然基团“未被修饰”的肝素寡糖,严重制约着将化学酶法合成的肝素寡糖开发成为与磺达肝癸钠类似的、安全的抗凝血药物。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明提供一种高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖及其制备方法与应用。
本发明的第一个目的是提供一种用来制备肝素七糖的二糖受体或二糖受体的甲苷衍生物。
第二个目的是提供上述二糖受体或二糖受体的甲苷衍生物的制备方法。
第三个目的是提供一种高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖。
本发明的肝素七糖除具有天然肝素的磺酰基、乙酰基取代基外,同时不含对硝基苯基等任何非天然修饰基团,可作为AT依赖的Xa因子间接抑制剂。
第四个目的是提供上述高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖的制备方法。
本发明的制备方法简单,制备步骤远远少于磺达肝癸钠,且总产率≥10%。
第五个目的是提供一种高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖的应用。
本发明的肝素七糖用于抗凝血和血栓,具有强效抗FXa活性,可作为磺达肝癸钠的替代药物,与磺达肝癸钠相比成本更低、抗凝血疗效相当。
术语说明:
ABD:抗凝血酶(AT)结合域;
GlcA-PNP:对硝基苯基-β-D-葡糖醛酸;
PNZ:对硝基苄氧羰基;
UDP-GlcNTFA:尿苷二磷酸-N-三氟乙酰葡糖胺
UDP-GlcNAc:尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺
UDP-GlcA:尿苷二磷酸-葡糖醛酸
PAPS:3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸。
KfiA:大肠杆菌K5 N-乙酰氨基葡糖基转移酶
PmHS2:多杀巴斯德菌Heparosan合酶2
NST:N-硫酸基转移酶
C5-epi:C5-异构化酶
2OST:2-O-硫酸基转移酶
6OST:6-O-硫酸基转移酶
3OST:3-O-硫酸基转移酶
本发明的技术方案如下:
一种用来制备肝素七糖的二糖受体,结构式如式I所示:
一种用来制备肝素七糖的二糖受体的甲苷衍生物,结构式如式Ⅱ或式Ⅲ所示:
上述用来制备肝素七糖的二糖受体的制备方法,采用肝素酶III辅助化学酶法,包括步骤如下:
(1)以对硝基苯基-β-D-葡糖醛酸苷(GlcA-PNP)为起始原料、尿苷二磷酸-N-三氟乙酰葡糖胺(UDP-GlcNTFA)为糖基供体,在N-乙酰氨基葡糖基转移酶(KfiA)酶促催化下进行糖链延长,得到二糖骨架,然后以得到的二糖骨架为受体、UDP-葡糖醛酸(UDP-GlcA)为糖基供体,在Heparosan合酶2(PmHS2)酶促催化下进一步延长糖链,得到三糖骨架;
(2)将三糖骨架溶于氢氧化锂水溶液,于冰上静置至完全脱除GlcNTFA残基的三氟乙酰基,所得产物于弱碱性、室温下与对硝基氯甲酸苄酯(PNZ-Cl)混合反应,使N-未取代的葡糖胺(GlcNH3 +)残基的氨基保护,得到含N-对硝基苄氧羰基(PNZ)葡糖胺(GlcNPNZ)的三糖中间体;
(3)步骤(2)含GlcNPNZ的三糖于缓冲液中与肝素酶Ⅲ共同孵育,使GlcNPNZ与GlcA之间的糖苷键断裂,得到二糖受体。
上述用来制备肝素七糖的二糖受体的甲苷衍生物的制备方法,
将制备得到的二糖受体与乙酰氯、甲醇混合并加热回流,经NaOH处理后,纯化得到二糖受体的α-或β-型甲苷衍生物。
根据本发明优选的,步骤(1)中所述酶KfiA、PmHS2以大肠杆菌重组表达,N-乙酰氨基葡糖基转移酶(KfiA)来源于大肠杆菌(E.coli)K5,Heparosan合酶2(PmHS2)来源于多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)。
根据本发明优选的,步骤(1)中,酶促催化在缓冲液中进行,所用缓冲液为50mmol/L含5-8mmol/L MnCl2的Tris-HCl,pH=7.0~7.5,反应温度为20℃~37℃,反应液均以C18柱层析纯化。
根据本发明优选的,步骤(1)中,起始原料用量为400-600mg的对硝基苯基-β-D-葡糖醛酸苷(GlcA-PNP),糖基供体用量为1.2倍当量的尿苷二磷酸-N-三氟乙酰葡糖胺(UDP-GlcNTFA),1.2倍当量的UDP-葡糖醛酸(UDP-GlcA)。
根据本发明优选的,步骤(2)中,所述LiOH溶液的浓度<0.5mol/L,优选的,LiOH溶液的浓度为0.05mol/L~0.2mol/L。
根据本发明优选的,步骤(2)中,对硝基氯甲酸苄酯(PNZ-Cl)的加入量为三糖的1.5倍量以上。
根据本发明优选的,步骤(2)中,弱碱性pH为9-10。
根据本发明优选的,步骤(3)中,肝素酶Ⅲ切割反应缓冲液为含8-12mM CaCl2的Tris-HCl缓冲液,pH=7.0~7.5,浓度为50mmol/L,反应温度20℃~37℃。
根据本发明优选的,步骤(1)~(3)的反应液以C18柱层析纯化。
本发明建立的肝素III拓展的化学酶法,首次实现了以4步反应、>80%的高产率制备带PNZ保护基的二糖受体;以5步、>40%的产率制备二糖受体的α-或β-甲苷衍生物。所合成的受体以PNZ为保护基,具特征紫外吸收,方便检测。
一种高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖,含AT结合序列,具有如下如式Ⅴ结构式:
其中,R1为氢(-H)、甲基(-CH3)或其他烷基;R2为氢、乙酰基(-COCH3)或磺酰基(-SO3H);R3为磺酰基或乙酰基。
上述高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖的制备方法,以上述二糖受体或二糖受体的甲苷衍生物为起始受体,采用化学酶法制备,包括步骤如下:
1)以二糖受体或二糖受体的甲苷衍生物为起始受体,以尿苷二磷酸-N-三氟乙酰葡糖胺(UDP-GlcNTFA)为糖基供体,在N-乙酰氨基葡糖基转移酶(KfiA)酶促催化下进行糖链延长,然后以得到的三糖中间体为受体、UDP-葡糖醛酸(UDP-GlcA)为糖基供体,在Heparosan合酶2(PmHS2)酶促催化下进一步延长糖链,得到四糖骨架,重复上述交替糖链延长反应,得到六糖骨架;
2)步骤1)的六糖骨架溶于氢氧化锂水溶液,于冰上静置至完全脱除GlcNTFA残基的三氟乙酰基,调pH至中性,然后经N-硫酸基转移酶(NST)催化,以3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸(PAPS)为硫酸基供体,使糖链中的GlcNH3 +残基发生N-硫酸化(GlcNS),得到N-硫酸化六糖;
3)在肝素C-5差向异构化酶(C5-epi)和2-O-硫酸基转移酶(2OST)共同催化下,以PAPS为硫酸基供体,使步骤2)的N-硫酸化六糖两个GlcNS残基之间的GlcA残基直接转变为2-O-硫酸化艾杜糖醛酸(IdoA2S),得含单一IdoA2S残基的六糖;
4)在KfiA催化下,以UDP-GlcNTFA或UDP-GlcNAc为糖基供体,使步骤3)的含单一IdoA2S残基的六糖进行糖链延长,然后按步骤2)的脱除三氟乙酰基、NST催化方法使糖链中的GlcNH3 +残基发生N-硫酸化(GlcNS),得七糖中间体;
5)步骤4)得到的七糖中间体,经肝素6-O-硫酸基转移酶(6OST1/3)催化,以PAPS为硫酸基供体,使中间体中的GlcNS或GlcNAc残基全部发生6-O-硫酸化修饰(GlcNS6S或GlcNAc6S),得到6-O-硫酸化的七糖中间体;
6)步骤5)得到的6-O-硫酸化的七糖中间体,在肝素3-O-硫酸基转移酶(3OST)催化下,以PAPS为硫酸基供体,6-O-硫酸化七糖的特定葡糖胺发生3-O-硫酸化修饰(GlcNS6S3S),得到含AT结合五糖序列的肝素七糖中间体;
7)采用钯碳还原脱除肝素七糖中间体中的PNZ基团,得到不含任何非天然修饰基团的“天然”肝素七糖;
8)步骤7)得到的肝素七糖在弱碱性条件下与三氧化硫-三甲胺混合物反应,使其还原末端单个GlcNH3 +残基转变为GlcNS,或与乙酸酐混合,使还原末端单个GlcNH3 +残基转化为GlcNAc残基;得到高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖。
本发明提供的式I、II和III中所示的葡糖胺的氨基保护基对硝基苄氧羰基(PNZ)为优选的氨基保护基,在270nm处具最大紫外吸收且可以在温和的特定条件下脱除,其可以用同样具紫外吸吸收的其他基团替代,如在220nm处具最大紫外吸收的苄氧羰基(Cbz)等。
本发明首次证实,肝素酶III除能切割-GlcNAc-GlcA-或-GlcNS-GlcA-之间的糖苷键,还能切割N-PNZ(或N-Cbz)葡糖胺(GlcNPNZ或GlcNCbz)与GlcA残基之间的糖苷键。
本发明提供的高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖的制备方法,利用肝素酶III切割N-PNZ(或N-Cbz)葡糖胺(GlcNPNZ或GlcNCbz)与GlcA残基之间的糖苷键制得以PNZ或Cbz为氨基保护基的二糖受体,然后采用化学酶法得到了高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖,制备工艺简单,总产率高。
高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖的制备方法中,优选方案如下:
步骤1)中,KfiA、PmHS2酶促催化在缓冲液中进行,所用缓冲液为50mmol/L含5-8mmol/L MnCl2的Tris-HCl,pH=7.0~7.5,反应温度为20℃~37℃,反应液以C18柱层析纯化。
步骤1)中,起始受体用量为400-600mg,糖基供体用量为1.2倍当量的尿苷二磷酸-N-三氟乙酰葡糖胺(UDP-GlcNTFA),1.2倍当量的UDP-葡糖醛酸(UDP-GlcA)。
步骤2)中,所述LiOH溶液的浓度<0.5mol/L,优选的,LiOH溶液的浓度为0.05mol/L~0.2mol/L。
步骤2)中,NST催化的修饰反应所用缓冲液为50mmol/L、pH=7.0~7.4的2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES),硫酸基供体PAPS加入量为被修饰GlcNH3 +残基摩尔质量的1.1倍以上;反应液以强阴离子交换柱层析纯化。
步骤3)中C5-epi和2OST共同催化修饰的具体方法为:将底物与C5-epi先于缓冲溶液中进行异构化反应0.5h以上,再加入2OST酶和硫酸基供体PAPS以进行硫酸化修饰,反应液经强阴离子柱层析纯化;所述缓冲溶液为含2mM CaCl2的50mmol/L MES,pH7.0~7.4。
进一步优选的,异构化反应的条件为20℃~37℃下反应0.5h~1.5h。
进一步优选的,硫酸基供体PAPS的加入量为N-硫酸化六糖的摩尔质量的1.1倍以上。
进一步优选的,C5-epi单独异构化和与2OST硫酸化共同修饰的温度为20℃~37℃。
步骤4)KfiA酶促催化反应与步骤1)条件相同;脱除三氟乙酰基、NST酶催化反应条件与步骤2)相同。
步骤5),6OST催化的具体方法为:将底物与6OST1和6OST3、硫酸基供体PAPS在缓冲溶液中混合进行硫酸化修饰,反应液经强阴离子交换柱层析。
进一步优选的,所述缓冲溶液为50mmol/L的MES,pH7.0~7.4。
进一步优选的,所述硫酸基供体PAPS的加入量为底物七糖中间体摩尔质量的3.0倍以上。
进一步优选的,所述修饰的反应温度为20℃~37℃。
步骤6),3OST酶催化的具体方法为:将底物与3-O-硫酸基转移酶1(3OST)、1.1倍以上的硫酸基供体PAPS在缓冲溶液中混合进行硫酸化修饰,反应液经强阴离子交换柱层析,得到含AT结合序列的肝素七糖中间体。缓冲溶液为pH=7.0~7.5、50mmol/L的MES缓冲液。
步骤7),钯碳还原的具体方法为:于茄形瓶中,步骤6)所得肝素七糖中间体加溶解量水溶解后,加入大于等于1倍量的Pd/C,插上氢气球,室温搅拌反应直至PNZ基团完全脱除,透析得含AT结合序列、不含任何非天然修饰基团的的肝素七糖。
步骤8),具体反应如下:
pH=8~10弱碱性条件下,步骤7)的肝素七糖与大于等于3倍量的三氧化硫-三甲胺混合物混合,在15-40℃条件下反应,至还原末端单个GlcNH3 +残基完全转化为GlcNS;
或pH=8~10弱碱性条件下,步骤7)的肝素七糖与大于等于3倍量的乙酸酐在15-40℃条件下反应,至还原末端单个GlcNH3 +残基完全转化为GlcNAc。
步骤7)、8)制备的肝素七糖的结构与结构通式V符合。
采用生色底物法测定本发明制备的肝素七糖的抗FXa和FIIa活性。本发明合成的肝素七糖具AT依赖的强效抗FXa活性且无抗FIIa活性,可作为磺达肝癸钠的替代药物,应用于抗凝血和血栓性疾病的治疗。
高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖的应用,用于制备抗凝血、抗血栓药物,作为磺达肝癸钠的替代药物。
有益效果:
1、本发明的制备方法为肝素七糖的拓展的化学酶法合成的新方法,包括采用肝素酶III辅助的化学酶法高效合成具特征UV吸收且方便脱除的PNZ为氨基保护基的二糖受体,然后将其进行酶法延长糖链及合理组合的化学酶法N-硫酸化、酶法C-5差向异构化/2-O-硫酸化、酶法6-O-硫酸化与3-O-硫酸化修饰,最后以温和的化学法脱除PNZ基团,得到含AT结合序列的真正“天然”肝素七糖,其为AT依赖的Xa因子间接抑制剂,具有与磺达肝癸钠相当的、强效特异抗FXa活性,与磺达肝癸钠相比,合成步数明显少、总产率显著高(≥10%),而磺达肝癸钠总产率仅为0.1%~0.3%。
2、本发明的肝素七糖不含任何有安全隐患的非天然修饰基团,其抗FⅩa活性的IC50值与磺达肝癸钠接近,并且无显著的抗IIa因子活性,为AT依赖的强效Xa因子间接抑制剂,为成本低的磺达肝癸钠替代药物。
附图说明
图1是本发明实施例5制得的肝素七糖7mer-1的1H NMR(A)和HSQC(B)谱图;
图2是本发明实施例5制得的肝素七糖(A)和磺达癸肝癸钠(B)的体外抗Xa因子活性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的药品及试剂,若无特殊说明,均为普通市售产品。
实施例1:以PNZ为氨基保护基的三糖中间体3mer-2的制备
取500mg对硝基苯基-β-D-葡糖醛酸苷(GlcA-PNP)、1.2倍当量的UDP-GlcNTFA及适量KfiA酶置于50mmol/L、pH=7.3且含6mmol/L MnCl2的Tris-HCl缓冲液,反应液总体积为300mL,室温过夜反应。以PAMN-HPLC(检测波长为310nm)检测反应进程,至底物转化率为93%,反应液用三氟乙酸调调pH=2-3,用C18柱层析(3cm×50cm)纯化得二糖骨架2mer-4。以得到的二糖为底物,连同1.2倍当量的UDP-GlcA、适量PmHS2酶混合于上述缓冲液中,终体积为200mL,室温过夜反应,PAMN-HPLC测得底物转化率达98%,反应液调pH=2-3,于C18柱层析纯化得三糖骨架3mer-1,PAMN-HPLC测得其纯度>96%,ESI-MS测定其分子量为748.36Da。
3mer-1溶于100mL pH=12的氢氧化锂溶液,室温搅拌2h,调节pH=7.0中止反应,ESI-MS检测以确保三氟乙酰基完全脱除。然后以1mol/L的氢氧化钠调节pH至10,加入1.5倍当量的对硝基氯甲酸苄酯(PNZ-Cl,乙腈溶解),室温搅拌,以PAMN-HPLC每隔8h检测一次,检测波长310nm和270nm,根据需要补加适量PNZ-Cl,反应完成后,以C18柱层析(3cm×50cm)纯化,所得产物3mer-2的纯度>98%。ESI-MS测定其分子量为831.38Da,表明对硝基苄氧羰基(PNZ)成功引入。
根据3mer-2的1H NMR(600MHz,D2O)谱,可得重要数据为:δ8.12(d,J=8.4Hz,2H),8.11(d,J=9.0Hz,2H),7.47(d,J=8.6Hz,2H),7.08(d,J=9.6Hz,2H),5.31(d,J=3.7Hz,1H,B1),5.13(d,J=7.6Hz,1H,A1),5.11(s,2H),4.42(d,J=7.9Hz,1H,C1);根据新出现的苯环、亚甲基信号峰可知,PNZ基团被成功引入到三糖的GlcN上,且未导致三糖的其他结构变化。
PNZ为氨基保护基的三糖中间体3mer-2合成路线见式Ⅵ所示,
实施例2:以PNZ为氨基保护基的二糖受体的制备
纯化后的3mer-3溶于pH=~7.3、50mmol/L的Tris-HCl缓冲液(含10mmol/LCaCl2),并加入足量肝素酶Ⅲ,反应总体积为100mL,室温搅拌过夜。PAMN-HPLC检测反应进程,所用检测波长为310nm和270nm。待3mer-3完全消失,调pH=2-3终止反应,反应液用C18柱层析纯化。所得产物以PAMN-HPLC测得纯度>99%;ESI-MS测定其分子量为534.34Da,与二糖2mer-1(GlcA-GlcNPNZ)理论分子量相符。
根据产物的1H NMR和HSQC可得其重要数据为1H NMR(400MHz,CD3OD)δ5.02(d,J=3.6Hz,1H,B1-α),4.51(d,J=8.0Hz,1H,B1-β),4.41(d,J=8.0Hz,1H,C1),可以确认其为二糖受体2mer-1,其还原末端为α-、β-型共存。
2mer-1溶于无水甲醇中,与1%乙酰氯混合,于72℃油浴加热回流,待ESI-MS检测2mer-1基本消失后,停止加热回流,于旋转蒸发仪浓缩以除去反应溶剂。样品用水复溶,用1mol/L氢氧化钠溶液调pH=10,室温搅拌2h,PAMN-HPLC检测其反应结束,用C18柱层析纯化得两个产物2mer-2、2mer-3,纯度均>90%。ESI-MS测得其分子量为548.00Da,与甲苷二糖的理论分子量相符。根据产物的1H NMR(600MHz,D2O)谱,可得2mer-2的重要核磁数据为:δ4.62(d,J=3.7Hz,1H,B1),4.43(d,J=7.9Hz,1H,C1),说明其还原末端为α-型;2mer-3的重要核磁数据为:δ4.43(d,J=8.0Hz,1H,C1),4.30(d,J=8.5Hz,1H,B1),说明其还原末端为β-型;
以PNZ为氨基保护基的二糖受体合成路线见式Ⅶ所示,
实施例3:以二糖2mer-1为受体制备肝素七糖中间体7mer-2
以实施例2制备的2mer-1为起始原料,参照实施例1所述的KfiA、PmHS2酶促反应方法依次进行糖链延长,得到四糖骨架,PAMN-HPLC检测反应,检测波长为270nm。然后以四糖骨架为原料,重复交替进行KfiA、PmHS2酶法糖链延长得六糖骨架6mer-1。然后参照实施例1将6mer-1的三氟乙酰基完全脱除,接着置于终浓度为50mmol/L的MES缓冲液(pH=7.5),同时加入1.5倍当量的硫酸基供体PAPS、适量NST酶,调整反应体积为200mL,室温过夜反应,并根据情况补加酶或PAPS。待底物转化率>99%,反应液用稀醋酸调pH=3-4,后用Q-Sepharose强阴离子柱(2cm×30cm)纯化,得到N-硫酸化肝素六糖6mer-2,其纯度>98%。ESI-MS测定其分子量为1368.24Da,表明全部GlcNTFA被修饰为GlcNS。
六糖6mer-2于pH=7.0~7.5、50mmol/L的MES缓冲液中加入2mmol/L CaCl2及适量酶C5-epi,调整反应体积为150mL,于37℃水浴反应2h。然后加入约1.5倍当量的PAPS、额外C5-epi和足量2OST酶,室温反应过夜。PAMN-HPLC检测反应,并根据需要补加酶或PAPS,至反应结束。反应液用Q-Sepharose强阴离子柱(2cm×30cm)纯化得到产物6mer-3。ESI-MS测定其分子量为1448.00Da,产物6mer-3较6mer-2增加一个硫酸酸基团。
根据1H NMR(400MHz,D2O)和HSQC谱图,6mer-3核磁数据如下:
1H NMRδ5.51(d,J=3.7Hz,1H,C1),5.24(d,J=3.6Hz,1H,E1),5.20(s,1H,D1),5.15(d,J=3.2Hz,1H,A1-α),4.80(s,1H,D5),4.49(d,J=7.9Hz,1H,F1),4.46(d,J=7.9Hz,1H,B1),可推知GlcNS残基之间的GlcA残基被修饰为IdoA2S残基。
以六糖6mer-3为底物,参照参照实施例1的方法进行KfiA酶法糖链延长,以Q-Sepharose强阴离子柱(2cm×30cm)纯化得七糖中间体7mer-1,然后参照上述方法依次进行化学三氟乙酰基脱除、酶法N-硫酸化修饰得七糖中间体7mer-2,其纯度>99%。ESI-MS测定其分子量为1689.26Da,与理论值相符。
根据1H NMR(400MHz,D2O)和HSQC,7mer-2核磁数据如下:
δ5.59(d,J=3.7Hz,1H,G1),5.52(d,J=3.7Hz,1H,C1),5.26(d,J=3.6Hz,1H,E1),5.22(s,1H,D1),5.17(d,J=5.6Hz,1H,A1-α),4.81(s,1H,D5),4.51(d,J=8.4Hz,1H,F1),4.48(d,J=9.2Hz,1H,B1),与6mer-3相比,7mer-2增加了葡糖胺信号峰,而其他信号峰基本未发生明显改变。
肝素七糖中间体7mer-2合成路线见式Ⅷ所示,
实施例4:肝素七糖中间体7mer-4的制备
将七糖底物7mer-2置于pH=7.0~7.5、50mmol/L的MES缓冲液中,加入1.5倍当量PAPS,4mL的6-OST-1和4mL的6-OST-3酶,调整反应体积为100mL,29℃水浴反应过夜。PAMN-HPLC检测反应,根据需要补加酶或PAPS。待7mer-2反应率>99%,反应液用稀醋酸调节pH=3-4终止反应,-20℃冰箱冻融除酶,无需纯化。
将上述反应液调节pH=7.0~7.5,并加入约1.5倍当量PAPS、4mL的3-OST-1酶,调整反应体积为200mL,29℃水浴反应过夜。PAMN-HPLC检测反应至底物修饰率为99%以上,反应液用稀醋酸调pH=3-4后,用Q-Sepharose强阴离子柱(2cm×30cm)纯化得到产物7mer-4,其纯度达99%以上。
ESI-MS检测7mer-4的分子量为2009.28Da,表明与7mer-2相比新增4个硫酸基团,与预期相符合。
根据1H NMR(400MHz,D2O),7mer-4核磁数据如下:
δ5.58(d,J=3.6Hz,2H,G1/C1),5.53(s,1H,E1),5.45(s,1H,D1),5.17(d,J=3.2Hz,1H,A1-α),4.58(d,J=7.3Hz,1H,F1),4.52(d,J=7.8Hz,1H,B1),结构与预期相符,为含AT结合序列的产物。
实施例5:肝素七糖7mer-1的制备
将7mer-4置于250mL茄形瓶中,加适量水溶解,加入约400mg的Pd/C,而后插上氢气球,排气三次后开始室温搅拌反应。此过程利用PAMN-HPLC检测反应,检测波长为270nm。每隔12h以PAMN-HPLC检测一次,至7mer-4完全消失。反应液过滤去除Pd/C、透析得到终产物7mer-5。7mer-5经肝素酶I、II和III共同完全酶解后,用SAX柱进行双糖分析,检测波长为232nm,可测得产物含双糖ΔU-GlcNH3 +而无ΔU-GlcNPNZ,表明PNZ基团被完全脱除。ESI-MS测得其分子量为1830.02Da,与理论值相符。
肝素七糖7mer-1的1H NMR和HSQC谱图见图1所示,根据1H NMR和HSQC谱图,核磁数据如下:
δ5.57(d,J=3.7Hz,2H,G1/C1),5.53(d,J=3.7Hz,1H,E1),5.44(s,1H,D1),5.40(d,J=3.6Hz,1H,A1-α),4.91(d,J=8.4Hz,1H,A1-β),4.81(s,1H,D5),4.58(d,J=7.2Hz,1H,F1),4.50(d,J=7.8Hz,1H,B1);与7mer-4相比,低场区的苯环信号以及亚甲基信号消失,证明脱除PNZ反应完全。因此,7mer-5为不含其他修饰基团的“天然”肝素七糖。
肝素七糖7mer-1合成路线见式Ⅸ所示,
实验例:肝素七糖7mer-1体外活性测定
采用生色底物法测得本发明制备得到的新型肝素七糖抗FⅩa活性的IC50值为19.68ng/mL(9.5nmol/L),同样条件下测得磺达肝癸钠的IC50值分别为14.19ng/mL(8.2nmol/L),以摩尔浓度计新型肝素七糖抗FⅩa活性的IC50值与磺达肝癸钠接近,结果见图2。同时本发明制备的肝素七糖无显著的抗IIa因子活性。
因此,本发明制备的肝素七糖是不含对硝基苯基等非天然基团的“未被修饰的”肝素分子,为AT依赖的强效Xa因子间接抑制剂,抗FⅩa活性的IC50值与磺达肝癸钠接近,可用于制备与磺达肝癸钠类似的抗凝抗血栓药物,用于替代磺达肝癸钠。
Claims (8)
1.一种高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖,含AT结合序列,具有如下如式Ⅴ结构式:
式Ⅴ,
其中,R1为氢、甲基;R2为氢、乙酰基或磺酰基;R3为磺酰基或乙酰基。
2.权利要求1所述的高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖的制备方法,以二糖受体或二糖受体的甲苷衍生物为起始受体,
二糖受体,结构式如式I所示:
式I,
二糖受体的甲苷衍生物结构式如式Ⅱ或式Ⅲ所示:
式Ⅱ,
式Ⅲ;
采用化学酶法制备,包括步骤如下:
1)以二糖受体或二糖受体的甲苷衍生物为起始受体,以尿苷二磷酸-N-三氟乙酰葡糖胺UDP-GlcNTFA为糖基供体,在N-乙酰氨基葡糖基转移酶KfiA酶促催化下进行糖链延长,然后以得到的三糖中间体为受体、UDP-葡糖醛酸UDP-GlcA为糖基供体,在Heparosan合酶2PmHS2酶促催化下进一步延长糖链,得到四糖骨架,重复上述交替糖链延长反应,得到六糖骨架;
2)步骤1)的六糖骨架溶于氢氧化锂水溶液,于冰上静置至完全脱除GlcNTFA残基的三氟乙酰基,调pH至中性,然后经N-硫酸基转移酶NST催化,以3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸PAPS为硫酸基供体,使糖链中的GlcNH3 +残基发生N-硫酸化,得到N-硫酸化六糖;
3)在肝素C-5差向异构化酶C5-epi和2-O-硫酸基转移酶2OST共同催化下,以PAPS为硫酸基供体,使步骤2)的N-硫酸化六糖两个GlcNS残基之间的GlcA残基直接转变为2-O-硫酸化艾杜糖醛酸IdoA2S,得含单一IdoA2S残基的六糖;
4)在KfiA催化下,以UDP-GlcNTFA或UDP-GlcNAc为糖基供体,使步骤3)的含单一IdoA2S残基的六糖进行糖链延长,然后按步骤2)的脱除三氟乙酰基、NST催化方法使糖链中的GlcNH3 +残基发生N-硫酸化,得七糖中间体;
5)步骤4)得到的七糖中间体,经肝素6-O-硫酸基转移酶6OST1/3催化,以PAPS为硫酸基供体,使中间体中的 GlcNS或GlcNAc残基全部发生6-O-硫酸化修饰GlcNS6S或GlcNAc6S,得到6-O-硫酸化的七糖中间体;
6)步骤5)得到的6-O-硫酸化的七糖中间体,在肝素3-O-硫酸基转移酶3OST催化下,以PAPS为硫酸基供体,6-O-硫酸化七糖的特定葡糖胺发生3-O-硫酸化修饰,得到含AT结合五糖序列的肝素七糖中间体;
7)采用钯碳还原脱除肝素七糖中间体中的PNZ基团,得到不含任何非天然修饰基团的“天然”肝素七糖;
8)步骤7)得到的肝素七糖在弱碱性条件下与三氧化硫-三甲胺混合物反应,使其还原末端单个GlcNH3 +残基转变为GlcNS,或与乙酸酐混合,使还原末端单个GlcNH3 +残基转化为GlcNAc残基;得到高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,二糖受体是按如下方法制得,采用肝素酶III辅助化学酶法,包括步骤如下:
(1)以对硝基苯基-β-D-葡糖醛酸苷GlcA-PNP为起始原料、尿苷二磷酸-N-三氟乙酰葡糖胺UDP-GlcNTFA为糖基供体,在N-乙酰氨基葡糖基转移酶KfiA酶促催化下进行糖链延长,得到二糖骨架,然后以得到的二糖骨架为受体、UDP-葡糖醛酸UDP-GlcA为糖基供体,在Heparosan合酶2 PmHS2酶促催化下进一步延长糖链,得到三糖骨架;
(2)将三糖骨架溶于氢氧化锂水溶液,于冰上静置至完全脱除GlcNTFA残基的三氟乙酰基,所得产物于弱碱性、室温下与对硝基氯甲酸苄酯PNZ-Cl混合反应,使N-未取代的葡糖胺残基的氨基保护,得到含N-对硝基苄氧羰基葡糖胺的三糖中间体;
(3)步骤(2)含GlcNPNZ的三糖于缓冲液中与肝素酶Ⅲ共同孵育,使GlcNPNZ与GlcA之间的糖苷键断裂,得到二糖受体。
4.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,二糖受体的甲苷衍生物是按如下方法制得,将二糖受体与乙酰氯、甲醇混合并加热回流,经NaOH处理后,纯化得到二糖受体的α-或β-型甲苷衍生物。
5.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中所述酶KfiA、PmHS2以大肠杆菌重组表达,N-乙酰氨基葡糖基转移酶来源于大肠杆菌K5,Heparosan合酶2来源于多杀巴斯德菌Pasteurella multocida;
步骤(1)中,酶促催化在缓冲液中进行,所用缓冲液为50 mmol/L 含5-8 mmol/L MnCl2的Tris-HCl,pH=7.0~7.5,反应温度为20℃~37℃,反应液均以C18柱层析纯化;
步骤(1)中,起始原料用量为400-600mg的对硝基苯基-β-D-葡糖醛酸苷,糖基供体用量为1.2倍当量的尿苷二磷酸-N-三氟乙酰葡糖胺,1.2倍当量的UDP-葡糖醛酸;
步骤(2)中,所述LiOH溶液的浓度为0.05 mol/L~ 0.2 mol/L;
步骤(2)中,对硝基氯甲酸苄酯的加入量为三糖的1.5倍量以上;
步骤(2)中,弱碱性pH为9-10;
步骤(3)中,肝素酶Ⅲ切割反应缓冲液为含8-12mM CaCl2的Tris-HCl缓冲液,pH=7.0~7.5,浓度为50mmol/L,反应温度20℃~37℃。
6.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤1)中,KfiA、PmHS2酶促催化在缓冲液中进行,所用缓冲液为50 mmol/L 含5-8 mmol/L MnCl2 的Tris-HCl,pH=7.0~7.5,反应温度为20℃~37℃,反应液以C18柱层析纯化;
步骤2)中, LiOH溶液的浓度为0.05 mol/L~ 0.2 mol/L;
步骤2)中,NST催化的修饰反应所用缓冲液为50 mmol/L、 pH=7.0~7.4的2-(N-吗啉代)乙烷磺酸, 硫酸基供体PAPS加入量为被修饰GlcNH3 +残基摩尔质量的1.1倍以上;反应液以强阴离子交换柱层析纯化;
步骤3)中C5-epi和2OST共同催化修饰的具体方法为:将底物与C5-epi先于缓冲溶液中进行异构化反应0.5h以上,再加入2OST酶和硫酸基供体PAPS以进行硫酸化修饰,反应液经强阴离子柱层析纯化;所述缓冲溶液为含2mM CaCl2的50mmol/L MES,pH7.0~7.4;
步骤4)KfiA酶促催化反应与步骤1)条件相同;脱除三氟乙酰基、NST酶催化反应条件与步骤2)相同。
7.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤5),6OST催化的具体方法为:将底物与6OST1和6OST3、硫酸基供体PAPS在缓冲溶液中混合进行硫酸化修饰,反应液经强阴离子交换柱层析;所述缓冲溶液为50 mmol/L的MES,pH7.0~7.4;
步骤6),3OST酶催化的具体方法为:将底物与3-O-硫酸基转移酶1、1.1倍以上的硫酸基供体PAPS在缓冲溶液中混合进行硫酸化修饰,反应液经强阴离子交换柱层析,得到含AT结合序列的肝素七糖中间体,缓冲溶液为pH=7.0~7.5、50 mmol/L的MES缓冲液;
步骤7),钯碳还原的具体方法为:于茄形瓶中,步骤6)所得肝素七糖中间体加溶解量水溶解后,加入大于等于1倍量的Pd/C,插上氢气球,室温搅拌反应直至PNZ基团完全脱除,透析得含AT结合序列、不含任何非天然修饰基团的的肝素七糖;
步骤8),具体反应如下:
pH=8~10弱碱性条件下,步骤7)的肝素七糖与大于等于3倍量的三氧化硫-三甲胺混合物混合,在15-40℃条件下反应,至还原末端单个GlcNH3 +残基完全转化为GlcNS;
或pH=8~10弱碱性条件下,步骤7)的肝素七糖与大于等于3倍量的乙酸酐在15-40℃条件下反应,至还原末端单个GlcNH3 +残基完全转化为GlcNAc。
8.权利要求1所述的高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖的应用,用于制备抗凝血、抗血栓药物。
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Citations (1)
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CN111154819A (zh) * | 2020-01-15 | 2020-05-15 | 山东大学 | 一种非动物源低分子量肝素及其制备方法与应用 |
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2021
- 2021-07-14 CN CN202110794195.1A patent/CN113666980B/zh active Active
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Chemoenzymatic synthesis of heparan sulfate and heparin oligosaccharides and NMR analysis: paving the way to a diverse library for glycobiologists;Xing Zhang 等;Chemical Science;第8卷(第12期);第7932-7940页 * |
Chemoenzymatic Synthesis of Homogeneous Ultralow Molecular Weight Heparins;Yongmei Xu 等;Science;第334卷(第6055期);第498-501页 * |
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