JPH01104089A - 二官能性オリゴ糖類およびそれから誘導される活性化合物類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、非−還元性端部に末端△４．５−ウロン酸基
を含をしている二官能性オリゴ糖類に関するものである
。

アプライド・バイオケミストリイ・アンド・バイオチク
ノロシイ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｃｈｍｉｓｔｒｙ　
ａｎｄ　Ｂｉ。

ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、上２（１９８６）、１３５−
１７６頁から、各自のウロン酸−含有多糖類を△６．ｓ
−ウロン酸−含有オリゴ糖類に分解させ得る種々の多糖
類リアーゼが知られている。そのようなリアーゼは一般
的に微生物源のものであり、そして病原性および非−病
原性のバクテリアおよび菌・かび（ｆｕｎｇｉ）から単
離される。そのようなリアーゼ類の例は特に、対応する
基質を特定位置で分解させるヘパリン、コンドロイチン
、ペクチン、ペクチン酸塩およびアルギン酸塩リアーゼ
類である。

特に、例えば下記のものである： ａ）ヘパリン中で−４）−ｇ−Ｄ−ＧｌｃＮＳＯ３−（
６−５Ｏａ−）−（１−／−４）−ｇ−Ｌ−１ｄＵＡ（
２−５Ｏ＊つ−（ｌ−結合を分解させるヘパリン・リア
ーゼ、および ｂ）ペクチン酸塩中で−４）−ｇ−Ｄ−ＧａＬＵＡ（１
−／−４）−ｇ−Ｄ−ＧａＬＵＡ−（１−結合を分解さ
せるペクチン酸塩・リアーゼ （ここでＧｌｃＮＳＯ，−は２−デオキシ−２−スル７
アミノグリコピラノースを表わし、 ＩｄＵＡはイドピラノシルウロン酸を表わし、そしてＧ
ａＬＵＡはガラクトピラノシルウロン酸を表わす）。

リアーゼを用いて得られる不飽和オリゴ糖類は、還元性
端部はそのままにしながらアクリル酸塩官能基をオリゴ
糖類の非−還元性端部に加えるという理由のために、関
心がもたれている化合物である。該アクリル酸塩官能基
の作用により、ミハエル付加により親核性基を含有して
いる種々の化合物を前記の△４．ｓ−ウロン酸基含有オ
リゴ糖類に結合させることができる。

例えば、ウロン酸構造を有する薬学的に活性な化合物は
米国特許４，６０７，０２５から公知である。これらの
化合物は有利には、式ｌ ［式中、 Ｍは水素原子またはＳｏ、Ｍ、基を表わし、ここでＭｌ
はカチオンを表わし、Ｂは水素原子または例えばアセチ
ルもしくは硫酸塩基の如き官能基を表わし、Ｑ、は水素
原子、炭素数が１−４のアルキル基またはカチオンを表
わし、そしてＱは炭素数が１−４のアルキル基またはア
リール基を表わす］ を有する。

驚くべきことに、多糖類中のグルコース−グルクロン酸
結合を分解させて△４．′−グルクロン酸基含有オリゴ
糖類を生成する微生物リアーゼを見いだした。

従って、本発明はまず式１ （ＪＨ １式中、 Ｒ，は水素原子、炭素数が１−４のアルキル基、または
アルカリ金属を表わし、 Ｒ２は単結合または単糖類からなる２価の基を示し、そ
して ｇｌｃはグルコースを表わす］ を有するオリゴ糖類に関するものである。

記号Ｒ１の例としては、グルコース、マンノース、ガラ
クトース、アラビノース、７コース、キシロース、ラム
ノース、ウロン酸類およびそれらの誘導体類、例えば酢
酸塩類（ａｃｅｔａｔｅｓ）、ピルビン酸塩類（ｐｙｒ
ｕｖａｔｅｓ）、ア、ミン類および硫酸塩類（Ｓｕｌｐ
ｈａｔｅｓ）が挙げられる。

ウロン酸類とは、グルクロン酸、ガラクトウロン酸、イ
デュロン酸、マンヌロン酸およびグルロン酸を意味する
ものと理解すべきである。有利には、Ｒ２は−ｇ　１ｃ
−ｒｈａ−基（ここでｒｈａはメチル−ペントースラム
ノースを表わす）を表わす。

さらに、記号Ｒ１は有利には水素原子、メチル基または
ナトリウム原子を表わす。

さらに、本発明は式 ［クルクロン酸−Ｒ２−グル上コースＩｎ１式中、 ｎは２以上の、例えば２−５０００の、値を有し、そし
て Ｒ２は上記の意味を有する］ を有する多糖類を好適にはバシラス属のバクテリア菌株
から得られるグルコース−グルクロン酸結合を分解させ
る対応するリアーゼの作用にかけることによる式ｌを有
するオリゴ糖類の製造方法にも関するものである。

有利にはバシラス・サーキュランス菌株、好適にはスコ
ツトランドのナショナル・コレクション・オブ・インダ
ストリアル・バクテリア（ＮＣＩ　Ｂ）に番号Ｎ　ＣＩ
　Ｂ　１２４８２として保管されている菌株、が使用さ
れる。

式［グルクロン酸−Ｒ１−グルコース］　ｎを有する多
糖類としては、例えば式［グルクロン酸−グルコース−
ラムノース−グルコースＩｎ（ここでｎは約１５００の
値を有する）を有する市販の［ゲルライト（Ｇｅｌｒｉ
ｔｅ）Ｊを使用できる。該多糖類は特に、ラムノースの
高い抗原決定子の作用のために本発明によりそれから誘
導されるオリゴ糖類中基にした活性物質の重要な薬学的
用途が可能になるという利点を有しており、該活性物質
は比較的簡単な方法で△４．′−グルクロン酸基のアク
リル酸塩官能性の作用により製造できる。本発明で使用
できる多糖類の別の例は、四量体中に存在する２個のグ
ルコース残基のうちの１個の６位置でアセチル化されて
いるゲルライトであるゲランゴムである（Ｐ、Ｅ、ジャ
ンソン（Ｊａｎｓｏｎ）、Ｂ、リンドバーグ（Ｌｉｎｄ
ｂｅｒｇ）およびＰ、Ａ、サンド７オート（Ｓａｎｄｆ
ｏｒｔ）、カーボハイドレート・リサーチ（Ｃａｒｂｏ
ｈｙｄｒａｋｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、１２４　（１９
８３）、１３５−１３９）。

グルコース−グルクロン酸結合を分解させる本発明に従
うリアーゼの活性は２２９ｎｍにおける吸収増加により
検査できそして追跡できる。この吸収増加は、上記の式
１を有する生成したオリゴ糖類中でリアーゼの影響下で
生じた共役カルボキシアルケン系に因るものといえる。

活性化合物の上記の参照事項に従い、種々の活性化合物
類、例えば式２ ［式中、 Ｒ，ＳＲ，およびｇｌｃは上記ｌの意味を有し、そして ＸはＲ１０−１Ｒ，５−１Ｒ，ＮＨ−およびＲｓ　Ｎ　
（Ｒａ　）を表わし、ここでＲ１およびＲ１は任意に１
個以上のへテロ原子により中断されていてもよい任意に
（多）環式のおよび／または不飽和であってもよい炭化
水素基を表わす］ を有するグリコ蛋白質類およびグリコ脂質類が本発明に
従うオリゴ糖類を基にしてミハエル付加作用により製造
できる。本発明に従うオリゴ糖類と反応することのでき
る化合物の例は、チオール類、たとえばシスティンおよ
びシスティン−含有蛋白質類、並びに薬学的チオール化
合物類、例えばカプトグリルおよびスパルコマイシン、
である。

本発明に従うオリゴ糖類に対する蛋白質の付加により蛋
白質は改質され、そしてこれは分子量増加結果として安
定性、溶解度（親脂肪性蛋白質の場合）および膜反応器
中の保持性に影響を与える。

そのような改質は天然のグリコ蛋白質類とは対照的に糖
の還元性端部はそのままにであり、そしてこれにより予
期せぬ性質を有する人工的なグリコ配合体が得られる。

同じ方法で薬品誘導体類を改質することもでき、そして
それぞれの薬品に改質された物理的性質（溶解度、寸法
、電荷など）、または改質された化学的性質（目標決定
された薬品）を付与する。

さらに、本発明に従うオリゴ糖類はワクチンの製造にお
いても使用できる。特に、病原性の有機体の適当な細胞
壁（多糖類）がこのリアーゼにより分解可能な場合に使
用でき、そしてこのようにして得られたオリゴ糖類を処
理してワクチンを製造できる。

本発明を下記の実施例により説明するが、これらの実施
例は限定用のものではない。

実施例１ ゲルライトからの四量体：△４．′−グルクロン酸−グ
ルコースーラムノースーグルコースの製造方法段階１．
ゲルライトリアーゼの製造 この酵素を単離するために使用される有機体はスコツト
ランドのナショナル・コレクション・オブ・インダスト
リアル・バクテリアに番号ＮＣＩＢ　１２４８２として
保管されている。この有機体は下記の組成を有するＧ媒
体上で３０°Ｃにおいて好気的に培養されｔ；： Ｇ媒体の組成ニ ゲルライト　　　　　５ｇ／！ に２ＨＰ０４４ｇ／１ ＫＨ２ＰＯ４１ｇ／　１ （ＮＨ４）２Ｓ０４　　　　　１ｇ／ｌＭｇ５Ｏ，・７
Ｈ２００，５ｇ／　ｌ ＮａＣ１’　０．５ｇ／　Ｌ　　最終的ｐＨ−７，０ゲ
ルライトリアーゼの製造用の細胞物質は、■。

５リツトルの作業容量を有する撹拌されている反応器中
で上記の微生物（３％接種）を上記のＧ媒体上で培養す
ることにより得られた。約１８時間の培養時間後に、細
胞を遠心した（９０００Ｘｇにおいて３０分間）。

上澄み液中のオリゴ糖類および塩類を酵素から限外濾過
（１０ミリボールの「ミニ−タン」中のＰＭＩＯフィル
ター）により分離した。４ｍＭトリス（ｐＨ−７，８）
で２−３回洗浄した後に、１リツトル当たり約１４０単
位（Ｕ／１２）の酵素溶液が生成し、それは凍結状態で
安定であることがわかった。

得られたゲルライトリアーゼ酵素の活性を、△４．′−
ウロン酸基の生成による２２９ｎｍにおける吸光率の増
加を基にして測定した。ＮＭＲおよび元素分析を基にし
、そしてｐＨ７において測定すると、四量体の吸光率（
Ｅ）は約Ｅ２□、５６００Ｍ−’ｃｍ−’であった。

ゲルライトリアーゼ活性を測定するために、１００μＱ
の酵素溶液を２００μｇの５０ｍＭトリス−ＭＣＩ（ｐ
Ｈ−７，８）、５００μｍ２の２　ｇ／Ｑのゲル化され
たゲルライトおよび２００μＱの水の混合物に加えた。

■酵素単位は１分間当たり２２９ｎｍにおいて５．６の
吸光率の変化を与えた。

法 ５．２ｇの△４．Ｓ−四量体を製造するために、ゲルラ
イトリアーゼ溶液（合計８．１リツトル）を４ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ（ｐ　Ｈ７，８）中のゲルライト溶液（２，
０ｇ／Ｑ）を用いて３０°Ｃにおいて１７時間培養した
。

酵素の投与量は、１ｇのゲルライト当たり２゜５単位の
酵素活性が加えられるようなものであった。流出液の吸
光率（２２９ｎｍ）は約１４（理論的最大値Ｅ”’−１
５）であった。

酵素および未反応のゲルライトを限外様過により互いに
分離した（留分１０．０００）。酵素が依然として初期
活性の７２％を有していることが見いだされ、そしてそ
れを新しいゲルライト溶液（２，５０／ｇのゲルライト
）を用いて再び培養した。最初の酵素転化物の限外濾液
を第二および第三の酵素転化物のものと一緒に貯蔵した
。この方法で、３．２ｇのゲルライトが最初に転化され
、そして次に２ｇおよび１ｇのゲルライトが転化された
。限外濾過後に、生成物をアンベルライト（Ａｍｂｅｒ
ｌｉｔｅ）　ｌＲ１２０カラム（溶離剤Ｈ２０）中に通
すことにより正に荷電された粒子（例えばトリス）から
三量体を精製した。溶離剤のｐＨは約３であるため、そ
れのｐＨを１ＭＮａＯＨの添加により７に調節するとＮ
ａ塩が得られた。凍結乾燥後に乾燥重量は５．２ｇとな
り、それは８３％の収率に相当していた。不飽和四量体
の他に、得られた生成物は２−３種類の塩類を含有して
いたが、入量体は含んでいないことが見いだされた。吸
光率を基にすると、生成速度は約２ｇ／Ｑ／日であつｔ
こ　。

２０　ｇ／ＱのゲルライトおよびＩｇのゲルライト当た
り約５の酵素単位を４８°Ｃにおいて使用した場合、製
造速度を約２９０ｇ／４／日に増加させることができた
。

実施例２ 不飽和△４．′−グルクロン酸−グルコースーラムノー
スーグルコースの製造方法 段階１．ゲルライトリアーゼの製造 ゲルライトリアーゼの製造方法は、実施例１と同じ方法
で実施された。

段階２．ゲルライトから不飽和△４．Ｓ−グルクロン酸
−クルコースーーラムノースーグルコース四量体この段
階では、４．６リツトルの作業容量を有する反応器中で
１８．４ｇのゲルライトを１３４単位のゲルライトリア
ーゼを用いてｐＨ７，８（５ｍＭトリス−ＨＣＩ）およ
び３０°Ｃにおいて転化させた。反応器からの液体を連
続的にポンプにより限外濾過装置（ＰＭＩＯフィルター
を有するミリポール・ミニタン）中に送った。最初の４
時間の反応時間中に、吸光率（２２９ｎｍ）が約１８と
なるまで透過物質を戻した。次に基質（５ｍＭトリス−
ＨＣｌ、ｐＨ７，８中の４ｇ／Ｑのゲルライト）を透過
物質が除去されるのと全く同じ速さで反応器中にポンプ
で加えた。合計３２ｇのゲルライトをポンプで反応器中
に加えた後に供給ポンプを切り、そして限外濾過装置を
通してポンプ供給することにより反応器を空にした。透
過物質の吸光率は１８．４であると観察され、そしてこ
れは約６０％の転化率に相当していた。この方法で２６
．８ｇの生成物が得られ、それは約８５％の不飽和四量
体および５％の不飽和入量体を含有していた（吸光率に
基づく）。

４ｇ／Ｑのゲルライト濃度および４．２Ｕ／ｇのゲルラ
イトの酵素投与量を用いると、生成速度は４．１ｇ／α
／日であっｔこ。

本発明の主なる特徴および態様は以下のとおりである。

１１式１ ［式中、 Ｒ１は水素原子、炭素数が１−４のアルキル基、または
アルカリ金属を表わし、 Ｒ２は単結合または単糖類の２価の基を示し、そして ｇｌｃはグルコースを表わす１ により特徴づけられているオリゴ糖類。

２、Ｒ１が上記ｌに記されている意味を有し、そ１７て
Ｒ２がグルコース、マンノース、ガラクトース、アラビ
ノース、フコース、キシロース、ラムノース、ウロン酸
類およびそれらの誘導体類、すなわちアセテート類、ピ
ルベート類、アミン類およびサルフェート類、からなる
群から選択されるｌ−５種の単糖類を含有している基を
示す、式ｌにより特徴づけられている上記１に従うオリ
ゴ糖類。

３、Ｒ１が上記ｌに記されている意味を有し、そしてＲ
２がｇｌｃ−ｒｈａ基を表わす、式ｌにより特徴づけら
れている上記２に従うオリゴ糖類。

４、多糖類をリアーゼを用いて転化させることによるオ
リゴ糖類の製造方法において、式［グルクロン厳−Ｒ２
−グルコース１ｎ［式中、 ｎは２以上の、例えば２−５０００の、値を有し、そし
て Ｒ２は上記ｌ又は２に記載の意味を有する１を有する多
糖類をグルコース−グルクロン酸結合を分解させる微生
物リアーゼを用いて転化させることを特徴とする特許 ５、ナショナル・コレクション・オブ・インダストリア
ル・バクテリアに番号Ｎ　ＣＩ　Ｂ　　１２４８２とし
て保管されているバクテリア菌株バシラス・サーキュラ
ンス（Ｂ　ａｃｉｌｌｕｓ　Ｃ１ｒｃｕｌａｎｓ）から
単離されるリアーゼを使用することを特徴とする、上記
４の方法。

６、式２ ［式中、 Ｒ１およびＲ２は上記ｌまたは２に記載の意味を有し、
そして ＸはＲ１０−１Ｒ，５−１Ｒ，ＮＨ−およびＲ３Ｎ　（
Ｒａ　）−からなる群から選択される活性基であり、こ
こでＲ１およびＲ６は任意に１個以上のへテロ原子によ
り中断されていてもよい任意に（多）環式のおよび／ま
たは不飽和であってもよい炭化水素基を表わす］により
特徴づけられている化合物類。

７、ナショナル・コレクション・オブ・インダストリア
ル・バクテリアに番号Ｎ　ＣＩ　Ｂ　　１２４８２とし
て保管されているバクテリア菌株バシラス・サーキュラ
ンスから単離された、グルコース−グルクロン酸結合を
分解させるリアーゼ。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、式１ ▲数式、化学式、表等があります▼（１） ［式中、 Ｒ＿１は水素原子、炭素数が１−４のアルキル基、また
   はアルカリ金属を表わし、 Ｒ＿２は単結合または単糖類の２価の基を示し、そして ｇｌｃはグルコースを表わす］ により特徴づけられているオリゴ糖類。 ２、多糖類をリアーゼを用いて転化させることによるオ
   リゴ糖類の製造方法において、式 ［グルクロン酸−Ｒ＿２−グルコース］＿ｎ［式中、 ｎは２以上の、例えば２−５０００の、値を有し、そし
   て Ｒ＿２は上記１に記載の意味を有する］ を有する多糖類をグルコース−グルクロン酸結合を分解
   させる微生物リアーゼを用いて転化させることを特徴と
   する方法。 ３、式２ ▲数式、化学式、表等があります▼（２） ［式中、 Ｒ＿１およびＲ＿２は上記１または２に記載の意味を有
   し、そして ＸはＲ＿３Ｏ−、Ｒ＿３Ｓ−、Ｒ＿３ＮＨ−およびＲ＿
   ３Ｎ（Ｒ＿４）−からなる群から選択される活性基であ
   り、ここでＲ＿３およびＲ＿４は任意に１個以上のヘテ
   ロ原子により中断されていてもよい任意に（多）環式の
   および／または不飽和であってもよい炭化水素基を表わ
   す］ により特徴づけられている化合物類。 ４、ナショナル・コレクション・オブ・インダストリア
   ル・バクテリアに番号ＮＣＩＢ１２４８２として保管さ
   れているバクテリア菌株￥バシラス・サーキュランス￥
   から単離された、グルコース−グルクロン酸結合を分解
   させるリアーゼ。 ５、スコットランドのナショナル・コレクション・オブ
   ・インダストリアル・バクテリア（ＮＣＩＢ）に番号Ｎ
   ＣＩＢ１２４８２として保管されている￥バシラス・サ
   ーキュランス￥。