JP3650409B2 - 低分子量分岐β−１，３−グルカン及び分岐ラミナリオリゴ糖の製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、抗腫瘍活性を有する低分子量の分岐β−１，３−グルカン及び分岐ラミナリオリゴ糖の製造方法、特に分岐β−１，３−グルカンの３重らせん高次構造を保持した低分子量の分岐β−１，３−グルカン及び分岐ラミナリオリゴ糖を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
低分子量β−１，３−グルカン及びラミナリオリゴ糖には、有用な生化学的や医薬的性質を有することが報告されているように、これらの糖には幅広い用途が期待されている。具体的には、このような有用な性質として、例えば、分岐β−１，３−グルカンは強い免疫賦活作用を有し、抗腫瘍効果（臨床免疫１７（Suppl. 9）２００〜２１７，１９８５），抗ウィルス効果（近大医誌，第６巻３号３８７〜３９１，１９８１），傷の修復効果（JOURNAL OF THE RETICULOENDOTHELIAL SOCIETY27（１）.,１９８０）など広範な活性を有することが知られている。また、それら多糖の構成単位である分岐オリゴ糖には、ラットの成長と腸内細菌糞に対する影響（土橋昇、渡辺智子ら、千葉県立衛生短期大学紀要 Vol７、No. ２ P３３−４１（１９８８））や植物エリシター活性の増加、硫酸化ラミナリオリゴ糖の低副作用抗エイズ効果（生島直也、東海林忠生ら、高分子学会予稿集 Vol39、No８ P２７５７−２７５９（１９９０））等が知られている。また、これらの分岐オリゴ糖はその多糖の構造解析や生理活性の発現メカニズムの解明など基礎的研究への応用面で有効である。
これらラミナリオリゴ糖の調製は、β−１，３−グルカンまたは分岐β−１，３−グルカンの酸による部分加水分解や酵素（ J.Ferment Technol Vol 63 No１ P６１−６６（１９８５））による加水分解等により得られることが知られている。また、グルコースホスホリラーゼの転移反応（ Agric Biol Chem Vol 55 No５ P１４３１−１４３２（１９９１））や有機合成法によって得られることも知られている。
【０００３】
従来の分岐β−１，３−グルカンの分解方法として、酸加水分解法、超音波照射法（Carbohydrate Research,８９（１９８１）１２１−１３５）、高速噴射法（ Agric.Biol.Chem. ４８（４）９１５〜９２１，１９８４）、γ線照射法（日本農芸化学会誌６６巻１１号 １６３３〜１６４０，１９９２）及び酵素加水分解法など各種の方法が知られている。これらのうち超音波照射法、高速噴射法、γ線照射法では高分子体の低分子化には有効であるが、通常これらの低分子化方法では多糖の高次構造は破壊される場合が多く、もとの多糖がもっている三重らせん高次構造を保持した分子量２０万から１万の低分子量体を調製するのは非常に困難である。また、オリゴ糖の調製には長時間の処理が必要であり、短期間の処理では物理的に困難である。酸加水分解法では分岐β−１，３−グルカンが無秩序に加水分解されるので、特定の分岐オリゴ糖を得るのが難しい。酵素加水分解では得られるオリゴ糖は主にグルコース，ラミナリビオース，ゲンチビオースであり、それ以上の重合度を持つオリゴ糖や分岐オリゴ糖の調製は非常に困難である。
従って、これまでの低分子化方法では特定の３重らせん構造を有する低分子量β−１，３−グルカンおよび特定の結合を有する分岐オリゴ糖を大量に調製することが困難であるため、このような低分子量グルカンおよび分岐ラミナリオリゴ糖の性質やこれらの糖を用いた構造研究などに関する基礎的研究は殆ど行われていないのが実情であり、これらの糖の簡便で効率のよい製造方法の開発が望まれている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、分岐β−１，３−グルカンを選択的に加水分解して分岐β−１，３−グルカンの基本構造を保持したまま低分化できる方法および分岐ラミナリオリゴ糖の製造方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、分岐β−１，３−グルカンの高次構造である３重らせん構造をランダム構造にすると、これまで殆ど反応しなかったエンドタイプのβ−１，３−グルカナーゼに対する基質親和性が増加し、該グルカナーゼがβ−１，３−結合のある一部分を特異的に効率よく加水分解し、分岐β−１，３−グルカンの３重らせん高次構造を保持した低分子量の分岐β−１，３−グルカンを製造することができ、同時に特定の構造を持つ３糖以上の分岐ラミナリオリゴ糖を短時間でしかも大量に製造できるとの知見によりなされたのである。
すなわち、本発明は、３重らせん構造を有する分岐β−１，３−グルカンの高次構造を少くとも部分的にランダム状態に導いた後、エンドタイプのβ−１，３−グルカナーゼを作用させて低分子化させることを特徴とする低分子量分岐β−１，３−グルカンの製造方法及びこの反応において副生する分岐ラミナリオリゴ糖の製造方法を提供する。
【０００６】
本発明に使用できる基質は、β−１，３−グルカン類で特に制限はなく、自然界に存在するものは勿論のこと、培養により得られるグルカンも任意に用いられ、例えばシゾフィラン、カードラン、パラミロン、スクレログルカンなどで分離精製したもの以外に培養ブロスでも利用することが出来る。
また、本発明に使用できる酵素は、市販のエンドタイプのβ−１，３−グルカナーゼ活性を有する酵素は勿論のこと培養により得られるエンドタイプのβ−１，３−グルカナーゼ活性を有するものであれば利用できる。市販のエンドタイプのβ−１，３−グルカナーゼ活性を有する酵素としては、例えば、生化学工業（株）のザイモリアーゼ(Zymolyaze-100T(Zase))や同20Ｔ、ケイアイ化成（株）のKitalase、天野製薬（株）の溶菌酵素YL−15などをあげることができる。
【０００７】
以下に、シゾフィランを基質としザイモリアーゼの酵素反応を利用する製造法について説明する。まず、基質である該多糖の高次構造を３重らせん構造から少なくとも部分的にランダムコイルに導く。これは、例えば、0.１Ｎ以上の水酸化ナトリウムや水酸化カリウム等のアルカリ溶液，ＤＭＳＯ等の有機溶剤或は尿素等の水素結合破壊剤を用いることにより行うことができる。そして、アルカリ溶液を用いた場合には、その後、酸により中和して少なくとも部分的にランダムコイルの多糖溶液を得ることができる。又、ＤＭＳＯ等の有機溶剤を添加した場合にはアルコール、アセトン等水混和性の有機溶剤を用いて多糖をランダムコイルのまま沈殿させると同時に、溶媒として用いたＤＭＳＯ等の脱有機溶剤後、沈殿物を水に再溶解することにより少なくとも部分的にランダムコイルの多糖溶液を調製することが出来る。また、多糖の溶液を加熱処理、例えば１３０℃以上１５０℃以下の温度で処理を行うことによっても３重らせん構造をランダムコイルに変化させることができる。
【０００８】
この様にして得られたランダムコイル多糖溶液は、２％以上の高濃度の場合ゲル状でそれ以下の低濃度では粘度の高い溶液となる。この溶液にザイモリアーゼを作用させて酵素反応を行わせ、例えば１時間でこれらの粘稠な溶液は低粘度の溶液に変化し目的の低分子量シゾフィラン及び分岐ラミナリオリゴ糖を得ることが出来る。酵素反応は３５〜４５℃で行うのが好ましい。図１に調製した分岐オリゴ糖画分のＨＰＬＣチャートを示したが３糖，４糖を中心に８糖まで確認することが出来る。また、未分解の多糖は、元の分子量と比較して１／２〜１／１００以下の分子量にシフトすることもわかった。
こうして得られた酵素反応液より、目的とする低分子量の多糖或は分岐ラミナリオリゴ糖は、ＵＦ膜処理やエタノールなどの有機溶剤による沈澱分離法により簡単に分離することが出来る。低分子量体はその分子量が６０万から１万までの混合物であるが、アセトンやアルコールによる分子量分別沈殿により簡単に、分子量分画を行うことができる。また、低分子量体は、再度酵素処理することにより全てをオリゴ糖に導くことが出来る。集めたオリゴ糖は、活性炭カラムクロマト分離、ゲルろ過カラムクロマト分離、ＯＤＳカラムクロマト分離により純度９０％以上に精製できる。また、糖液を水またはアルコール−水の２溶媒系で結晶化する事により更に高純度標品に導くことが出来る。
【０００９】
クロマト分離により精製したオリゴ糖の構造は、箱守法によるメチル化及び還元末端を還元後箱守法によるメチル化を行い、ＴＦＡによる加水分解後還元しアセチル誘導体に導きＳｉ１８８キャピラリーカラムでガスクロマト分析を行った結果、構成糖はグルコースでその構造式は図２に示すものであることが分かった。また、還元末端をピリジルアミノ化後ＯＤＳカラムによるＨＰＬＣ分析の結果、図２の構造に間違いないことを確認し、その純度は１００％であった。また、このようにして得られた分子量約２0,０００の多糖は、コンゴレッドとの錯体形成および熱容量測定により３重らせん構造を保持していることが確認された。
以上のようにして、本発明によれば分子量６００万以上の分岐β−１，３−グルカンから、分岐β−１，３−グルカンの３重らせん構造を保持したまま分子量１０万以下の低分子量分岐β−１，３−グルカン及び３〜８糖の分岐ラミナリオリゴ糖を得ることができる。さらに、エタノール分別沈殿やゲル濾過分画を行い、分子量８0,０００〜２0,０００の任意の分子量のものを得ることもできる。
次に実施例により本発明を説明する。
【００１０】
【実施例】
実施例１
シゾフィラン（分子量６０万）１ｇを0.２Ｎ水酸化ナトリウム溶液２０mlに完全に溶解してシゾフィラン溶液を得た。このシゾフィラン溶液を0.１Ｎ塩酸溶液４０ml中に撹拌しながら添加し、添加後pH６に調整し全量を１００mlとした。この溶液にザイモリエイス−２０Ｔ（生化学工業製）を2.５mg加えて溶解し４０℃〜４５℃で撹拌しながら１０時間反応させた。得られたもののＨＰＬＣチャートを図１に、又その構造式を図２に示す。
比較例
シゾフィラン１ｇをpH６のリン酸緩衝液１００mlに溶解し、ザイモリエイス−２０Ｔを2.５mg加え溶解後、４０℃〜４５℃で撹拌しながら１０時間反応させた。
実施例１及び比較例で得られた反応液１mlを反応の所定時間ごとに採取後煮沸しザイモリエイスを完全に失活させた。その後、１００μｌをソモジーネルソン法に供し還元糖測定を行い、残りの溶液は高速液体クロマトグラフィー（HPLCカラム：TSK-Gel G5000PWXL ＋G3000PWXL ，PolyspherCHNA)に供してオリゴ糖について分析した。各反応系に於ける全糖量を１００として各時間のオリゴ糖量を算出し、分解率とした。結果を図３に示す。
図３より、比較例の反応系に於いては、殆どオリゴ糖が生成しないのに対し、実施例１の反応系では５時間でほぼ８０％が分解しオリゴ糖が効率よく生成することがわかる。また、ＨＰＬＣチャートより比較例の反応系に於ては、殆ど分子量が変化しないのに対し、実施例１の反応系では１時間でその平均分子量は１０万となっていることがわかる。
【００１１】
実施例２
ザイモリエイス−２０Ｔ（生化学工業製）をキトパールＢＣＷ−３５０１（富士紡績製）にグルタールアルデヒドを介して固定化した固定化酵素をジャケット付きカラムに詰め、別に調製した実施例１と同様のアルカリ処理ＳＰＧ溶液を空間速度；ＳＶ＝0.５にて流し連続的に反応を行った。反応液からオリゴ糖生成と分解率を実施例１と同様にして算出した。また、カラム内の固定化酵素の残存活性を測定するため繰り返し反応を行い分解率を算出した。その結果、オリゴ糖については生成率が多少低下するものの残存活性の半減期（５０％）になるには実施例１のバッチ方式と比較して１０倍以上の基質を処理できることを確認した。
【００１２】
実施例３
シゾフィリューム・コミューン培養ブロスから遠心分離除去した菌体２５０ｇに0.５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液２５０mlを加え撹拌後１Ｎ塩酸にてpH７に調製した。これにザイモリエイス−２０Ｔ（生化学工業製）５mgを加え溶解し４５℃にて１０時間反応を行った。反応液を実施例１と同様にＨＰＬＣ分析した結果、同様のオリゴ糖を生成していることを確認した。
実施例４
スクレログルカン１ｇを0.２Ｎ水酸化ナトリウム溶液２０mlに完全に溶解させた。このスクレログルカン溶液を0.１Ｎ塩酸溶液４０ml中に撹拌しながら添加し、添加後pH６に調整し全量を１００mlとした。この溶液にザイモリエイス−２０Ｔ（生化学工業製）を2.５mg加え溶解し４０℃〜４５℃で撹拌しながら１０時間反応させた。生成したオリゴ糖をＨＰＬＣ分析により確認したところシゾフィランと比較してやや重合度の多いオリゴ糖が生成していることを確認した。
【００１３】
実施例５
上記の方法により調製した低分子量分岐β−１，３−グルカンの抗腫瘍効果を次のようにして測定した。すなわち、対照群および試料投与群それぞれ１０匹ずつのマウスに、Sarcoma １８０腫瘍細胞２×１０6 個を皮下に移植し、２４時間後に対照群には生食水を、試料投与群には１０mg／kg−マウス体重の投与量になるように調製した試料生食水溶液をそれぞれ0.０５mlずつ筋注した。腫瘍移植後３１日後の腫瘍重量を測定し、以下の式によって抑制率を求めた。
抑制率（％）＝〔１−（試料投与群の平均腫瘍重量（ｇ）／（対照群の平均腫瘍重量（ｇ）〕×１００
結果を表−１に示す。
【００１４】
【表１】
【００１５】
実施例６
シゾフィラン１ｇに水２０mlを加え耐圧耐熱のステンレス製容器に入れ１４０℃の恒温機に１時間放置した後、これにpH６のリン酸緩衝液１mlとザイモリエイス−２０Ｔを2.５mg加えて溶解し４０〜４５℃で１０時間、振盪反応させた。１０時間後、ＨＰＬＣ分析により、実施例１と同様のオリゴ糖を生成していることを確認した。また未分解の多糖も、低分子量であることを確認した。
【００１６】
【発明の効果】
エンドタイプの加水分解酵素では、従来殆ど反応しなかった分岐β−１，３−グルカンを、本発明の方法によればその高次構造を変化させることにより８０％以上の分解率で分解することができた。この方法によって、従来の低分子化方法によっては得ることができなかった３重らせん構造を保持した低分子量のβ−１，３−グルカンを短時間で効率よく得ることが出来た。また、この反応で生成する分岐ラナミリオリゴ糖は有機合成等の手法では得ることの困難な特殊な構造を有しているものも高収率で得られた。これら低分子量の分岐β−１，３−グルカンおよび分岐ラミナリオリゴ糖やそれらの誘導体の生理的性質として、例えば抗腫瘍作用、抗エイズ作用、ファイトアレキシンのエリシター活性、整腸作用、酵素阻害活性等が考えられ、今後医薬品や機能性食品としての用途が期待される。また、これまで行なわれていない分岐β−１，３−グルカンのオリゴ糖レベルからの物性、構造、生化学等の基礎的研究の発展に寄与することが期待できる。
【００１７】
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の方法により製造した低分子量分岐β−１，３−グルカン及びオリゴ糖のＨＰＬＣチャートを示す。
【図２】 本発明の方法により製造した分岐ラミナリオリゴ糖を構成する糖の構造式を示す。
【図３】 本発明の方法における酵素の作用時間による分岐β−１，３−グルカンの分解率を示す。
【産業上の利用分野】
本発明は、抗腫瘍活性を有する低分子量の分岐β−１，３−グルカン及び分岐ラミナリオリゴ糖の製造方法、特に分岐β−１，３−グルカンの３重らせん高次構造を保持した低分子量の分岐β−１，３−グルカン及び分岐ラミナリオリゴ糖を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
低分子量β−１，３−グルカン及びラミナリオリゴ糖には、有用な生化学的や医薬的性質を有することが報告されているように、これらの糖には幅広い用途が期待されている。具体的には、このような有用な性質として、例えば、分岐β−１，３−グルカンは強い免疫賦活作用を有し、抗腫瘍効果（臨床免疫１７（Suppl. 9）２００〜２１７，１９８５），抗ウィルス効果（近大医誌，第６巻３号３８７〜３９１，１９８１），傷の修復効果（JOURNAL OF THE RETICULOENDOTHELIAL SOCIETY27（１）.,１９８０）など広範な活性を有することが知られている。また、それら多糖の構成単位である分岐オリゴ糖には、ラットの成長と腸内細菌糞に対する影響（土橋昇、渡辺智子ら、千葉県立衛生短期大学紀要 Vol７、No. ２ P３３−４１（１９８８））や植物エリシター活性の増加、硫酸化ラミナリオリゴ糖の低副作用抗エイズ効果（生島直也、東海林忠生ら、高分子学会予稿集 Vol39、No８ P２７５７−２７５９（１９９０））等が知られている。また、これらの分岐オリゴ糖はその多糖の構造解析や生理活性の発現メカニズムの解明など基礎的研究への応用面で有効である。
これらラミナリオリゴ糖の調製は、β−１，３−グルカンまたは分岐β−１，３−グルカンの酸による部分加水分解や酵素（ J.Ferment Technol Vol 63 No１ P６１−６６（１９８５））による加水分解等により得られることが知られている。また、グルコースホスホリラーゼの転移反応（ Agric Biol Chem Vol 55 No５ P１４３１−１４３２（１９９１））や有機合成法によって得られることも知られている。
【０００３】
従来の分岐β−１，３−グルカンの分解方法として、酸加水分解法、超音波照射法（Carbohydrate Research,８９（１９８１）１２１−１３５）、高速噴射法（ Agric.Biol.Chem. ４８（４）９１５〜９２１，１９８４）、γ線照射法（日本農芸化学会誌６６巻１１号 １６３３〜１６４０，１９９２）及び酵素加水分解法など各種の方法が知られている。これらのうち超音波照射法、高速噴射法、γ線照射法では高分子体の低分子化には有効であるが、通常これらの低分子化方法では多糖の高次構造は破壊される場合が多く、もとの多糖がもっている三重らせん高次構造を保持した分子量２０万から１万の低分子量体を調製するのは非常に困難である。また、オリゴ糖の調製には長時間の処理が必要であり、短期間の処理では物理的に困難である。酸加水分解法では分岐β−１，３−グルカンが無秩序に加水分解されるので、特定の分岐オリゴ糖を得るのが難しい。酵素加水分解では得られるオリゴ糖は主にグルコース，ラミナリビオース，ゲンチビオースであり、それ以上の重合度を持つオリゴ糖や分岐オリゴ糖の調製は非常に困難である。
従って、これまでの低分子化方法では特定の３重らせん構造を有する低分子量β−１，３−グルカンおよび特定の結合を有する分岐オリゴ糖を大量に調製することが困難であるため、このような低分子量グルカンおよび分岐ラミナリオリゴ糖の性質やこれらの糖を用いた構造研究などに関する基礎的研究は殆ど行われていないのが実情であり、これらの糖の簡便で効率のよい製造方法の開発が望まれている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、分岐β−１，３−グルカンを選択的に加水分解して分岐β−１，３−グルカンの基本構造を保持したまま低分化できる方法および分岐ラミナリオリゴ糖の製造方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、分岐β−１，３−グルカンの高次構造である３重らせん構造をランダム構造にすると、これまで殆ど反応しなかったエンドタイプのβ−１，３−グルカナーゼに対する基質親和性が増加し、該グルカナーゼがβ−１，３−結合のある一部分を特異的に効率よく加水分解し、分岐β−１，３−グルカンの３重らせん高次構造を保持した低分子量の分岐β−１，３−グルカンを製造することができ、同時に特定の構造を持つ３糖以上の分岐ラミナリオリゴ糖を短時間でしかも大量に製造できるとの知見によりなされたのである。
すなわち、本発明は、３重らせん構造を有する分岐β−１，３−グルカンの高次構造を少くとも部分的にランダム状態に導いた後、エンドタイプのβ−１，３−グルカナーゼを作用させて低分子化させることを特徴とする低分子量分岐β−１，３−グルカンの製造方法及びこの反応において副生する分岐ラミナリオリゴ糖の製造方法を提供する。
【０００６】
本発明に使用できる基質は、β−１，３−グルカン類で特に制限はなく、自然界に存在するものは勿論のこと、培養により得られるグルカンも任意に用いられ、例えばシゾフィラン、カードラン、パラミロン、スクレログルカンなどで分離精製したもの以外に培養ブロスでも利用することが出来る。
また、本発明に使用できる酵素は、市販のエンドタイプのβ−１，３−グルカナーゼ活性を有する酵素は勿論のこと培養により得られるエンドタイプのβ−１，３−グルカナーゼ活性を有するものであれば利用できる。市販のエンドタイプのβ−１，３−グルカナーゼ活性を有する酵素としては、例えば、生化学工業（株）のザイモリアーゼ(Zymolyaze-100T(Zase))や同20Ｔ、ケイアイ化成（株）のKitalase、天野製薬（株）の溶菌酵素YL−15などをあげることができる。
【０００７】
以下に、シゾフィランを基質としザイモリアーゼの酵素反応を利用する製造法について説明する。まず、基質である該多糖の高次構造を３重らせん構造から少なくとも部分的にランダムコイルに導く。これは、例えば、0.１Ｎ以上の水酸化ナトリウムや水酸化カリウム等のアルカリ溶液，ＤＭＳＯ等の有機溶剤或は尿素等の水素結合破壊剤を用いることにより行うことができる。そして、アルカリ溶液を用いた場合には、その後、酸により中和して少なくとも部分的にランダムコイルの多糖溶液を得ることができる。又、ＤＭＳＯ等の有機溶剤を添加した場合にはアルコール、アセトン等水混和性の有機溶剤を用いて多糖をランダムコイルのまま沈殿させると同時に、溶媒として用いたＤＭＳＯ等の脱有機溶剤後、沈殿物を水に再溶解することにより少なくとも部分的にランダムコイルの多糖溶液を調製することが出来る。また、多糖の溶液を加熱処理、例えば１３０℃以上１５０℃以下の温度で処理を行うことによっても３重らせん構造をランダムコイルに変化させることができる。
【０００８】
この様にして得られたランダムコイル多糖溶液は、２％以上の高濃度の場合ゲル状でそれ以下の低濃度では粘度の高い溶液となる。この溶液にザイモリアーゼを作用させて酵素反応を行わせ、例えば１時間でこれらの粘稠な溶液は低粘度の溶液に変化し目的の低分子量シゾフィラン及び分岐ラミナリオリゴ糖を得ることが出来る。酵素反応は３５〜４５℃で行うのが好ましい。図１に調製した分岐オリゴ糖画分のＨＰＬＣチャートを示したが３糖，４糖を中心に８糖まで確認することが出来る。また、未分解の多糖は、元の分子量と比較して１／２〜１／１００以下の分子量にシフトすることもわかった。
こうして得られた酵素反応液より、目的とする低分子量の多糖或は分岐ラミナリオリゴ糖は、ＵＦ膜処理やエタノールなどの有機溶剤による沈澱分離法により簡単に分離することが出来る。低分子量体はその分子量が６０万から１万までの混合物であるが、アセトンやアルコールによる分子量分別沈殿により簡単に、分子量分画を行うことができる。また、低分子量体は、再度酵素処理することにより全てをオリゴ糖に導くことが出来る。集めたオリゴ糖は、活性炭カラムクロマト分離、ゲルろ過カラムクロマト分離、ＯＤＳカラムクロマト分離により純度９０％以上に精製できる。また、糖液を水またはアルコール−水の２溶媒系で結晶化する事により更に高純度標品に導くことが出来る。
【０００９】
クロマト分離により精製したオリゴ糖の構造は、箱守法によるメチル化及び還元末端を還元後箱守法によるメチル化を行い、ＴＦＡによる加水分解後還元しアセチル誘導体に導きＳｉ１８８キャピラリーカラムでガスクロマト分析を行った結果、構成糖はグルコースでその構造式は図２に示すものであることが分かった。また、還元末端をピリジルアミノ化後ＯＤＳカラムによるＨＰＬＣ分析の結果、図２の構造に間違いないことを確認し、その純度は１００％であった。また、このようにして得られた分子量約２0,０００の多糖は、コンゴレッドとの錯体形成および熱容量測定により３重らせん構造を保持していることが確認された。
以上のようにして、本発明によれば分子量６００万以上の分岐β−１，３−グルカンから、分岐β−１，３−グルカンの３重らせん構造を保持したまま分子量１０万以下の低分子量分岐β−１，３−グルカン及び３〜８糖の分岐ラミナリオリゴ糖を得ることができる。さらに、エタノール分別沈殿やゲル濾過分画を行い、分子量８0,０００〜２0,０００の任意の分子量のものを得ることもできる。
次に実施例により本発明を説明する。
【００１０】
【実施例】
実施例１
シゾフィラン（分子量６０万）１ｇを0.２Ｎ水酸化ナトリウム溶液２０mlに完全に溶解してシゾフィラン溶液を得た。このシゾフィラン溶液を0.１Ｎ塩酸溶液４０ml中に撹拌しながら添加し、添加後pH６に調整し全量を１００mlとした。この溶液にザイモリエイス−２０Ｔ（生化学工業製）を2.５mg加えて溶解し４０℃〜４５℃で撹拌しながら１０時間反応させた。得られたもののＨＰＬＣチャートを図１に、又その構造式を図２に示す。
比較例
シゾフィラン１ｇをpH６のリン酸緩衝液１００mlに溶解し、ザイモリエイス−２０Ｔを2.５mg加え溶解後、４０℃〜４５℃で撹拌しながら１０時間反応させた。
実施例１及び比較例で得られた反応液１mlを反応の所定時間ごとに採取後煮沸しザイモリエイスを完全に失活させた。その後、１００μｌをソモジーネルソン法に供し還元糖測定を行い、残りの溶液は高速液体クロマトグラフィー（HPLCカラム：TSK-Gel G5000PWXL ＋G3000PWXL ，PolyspherCHNA)に供してオリゴ糖について分析した。各反応系に於ける全糖量を１００として各時間のオリゴ糖量を算出し、分解率とした。結果を図３に示す。
図３より、比較例の反応系に於いては、殆どオリゴ糖が生成しないのに対し、実施例１の反応系では５時間でほぼ８０％が分解しオリゴ糖が効率よく生成することがわかる。また、ＨＰＬＣチャートより比較例の反応系に於ては、殆ど分子量が変化しないのに対し、実施例１の反応系では１時間でその平均分子量は１０万となっていることがわかる。
【００１１】
実施例２
ザイモリエイス−２０Ｔ（生化学工業製）をキトパールＢＣＷ−３５０１（富士紡績製）にグルタールアルデヒドを介して固定化した固定化酵素をジャケット付きカラムに詰め、別に調製した実施例１と同様のアルカリ処理ＳＰＧ溶液を空間速度；ＳＶ＝0.５にて流し連続的に反応を行った。反応液からオリゴ糖生成と分解率を実施例１と同様にして算出した。また、カラム内の固定化酵素の残存活性を測定するため繰り返し反応を行い分解率を算出した。その結果、オリゴ糖については生成率が多少低下するものの残存活性の半減期（５０％）になるには実施例１のバッチ方式と比較して１０倍以上の基質を処理できることを確認した。
【００１２】
実施例３
シゾフィリューム・コミューン培養ブロスから遠心分離除去した菌体２５０ｇに0.５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液２５０mlを加え撹拌後１Ｎ塩酸にてpH７に調製した。これにザイモリエイス−２０Ｔ（生化学工業製）５mgを加え溶解し４５℃にて１０時間反応を行った。反応液を実施例１と同様にＨＰＬＣ分析した結果、同様のオリゴ糖を生成していることを確認した。
実施例４
スクレログルカン１ｇを0.２Ｎ水酸化ナトリウム溶液２０mlに完全に溶解させた。このスクレログルカン溶液を0.１Ｎ塩酸溶液４０ml中に撹拌しながら添加し、添加後pH６に調整し全量を１００mlとした。この溶液にザイモリエイス−２０Ｔ（生化学工業製）を2.５mg加え溶解し４０℃〜４５℃で撹拌しながら１０時間反応させた。生成したオリゴ糖をＨＰＬＣ分析により確認したところシゾフィランと比較してやや重合度の多いオリゴ糖が生成していることを確認した。
【００１３】
実施例５
上記の方法により調製した低分子量分岐β−１，３−グルカンの抗腫瘍効果を次のようにして測定した。すなわち、対照群および試料投与群それぞれ１０匹ずつのマウスに、Sarcoma １８０腫瘍細胞２×１０6 個を皮下に移植し、２４時間後に対照群には生食水を、試料投与群には１０mg／kg−マウス体重の投与量になるように調製した試料生食水溶液をそれぞれ0.０５mlずつ筋注した。腫瘍移植後３１日後の腫瘍重量を測定し、以下の式によって抑制率を求めた。
抑制率（％）＝〔１−（試料投与群の平均腫瘍重量（ｇ）／（対照群の平均腫瘍重量（ｇ）〕×１００
結果を表−１に示す。
【００１４】
【表１】
実施例６
シゾフィラン１ｇに水２０mlを加え耐圧耐熱のステンレス製容器に入れ１４０℃の恒温機に１時間放置した後、これにpH６のリン酸緩衝液１mlとザイモリエイス−２０Ｔを2.５mg加えて溶解し４０〜４５℃で１０時間、振盪反応させた。１０時間後、ＨＰＬＣ分析により、実施例１と同様のオリゴ糖を生成していることを確認した。また未分解の多糖も、低分子量であることを確認した。
【００１６】
【発明の効果】
エンドタイプの加水分解酵素では、従来殆ど反応しなかった分岐β−１，３−グルカンを、本発明の方法によればその高次構造を変化させることにより８０％以上の分解率で分解することができた。この方法によって、従来の低分子化方法によっては得ることができなかった３重らせん構造を保持した低分子量のβ−１，３−グルカンを短時間で効率よく得ることが出来た。また、この反応で生成する分岐ラナミリオリゴ糖は有機合成等の手法では得ることの困難な特殊な構造を有しているものも高収率で得られた。これら低分子量の分岐β−１，３−グルカンおよび分岐ラミナリオリゴ糖やそれらの誘導体の生理的性質として、例えば抗腫瘍作用、抗エイズ作用、ファイトアレキシンのエリシター活性、整腸作用、酵素阻害活性等が考えられ、今後医薬品や機能性食品としての用途が期待される。また、これまで行なわれていない分岐β−１，３−グルカンのオリゴ糖レベルからの物性、構造、生化学等の基礎的研究の発展に寄与することが期待できる。
【００１７】
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の方法により製造した低分子量分岐β−１，３−グルカン及びオリゴ糖のＨＰＬＣチャートを示す。
【図２】 本発明の方法により製造した分岐ラミナリオリゴ糖を構成する糖の構造式を示す。
【図３】 本発明の方法における酵素の作用時間による分岐β−１，３−グルカンの分解率を示す。
Claims (2)
- シゾフィラン、パラミロン及びスクレログルカンからなる群より選ばれる、３重らせん構造を有する分岐β−１，３−グルカンの高次構造を、アルカリ溶液処理及び加熱処理からなる群より選ばれる処理により、少くとも部分的にランダム状態に導いた後、エンドタイプのβ−１，３−グルカナーゼを作用させて低分子化させることを特徴とする低分子量分岐β−１，３−グルカンの製造方法。
- シゾフィラン、パラミロン及びスクレログルカンからなる群より選ばれる、３重らせん構造を有する分岐β−１，３−グルカンの高次構造を、アルカリ溶液処理及び加熱処理からなる群より選ばれる処理により、少くとも部分的にランダム状態に導いた後、エンドタイプのβ−１，３−グルカナーゼを作用させて低分子化させることを特徴とする３から８糖の分岐ラミナリオリゴ糖の製造方法。
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