JP3045509B2 - マンノース含有オリゴ糖の製造法 - Google Patents
マンノース含有オリゴ糖の製造法Info
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- JP3045509B2 JP3045509B2 JP1296484A JP29648489A JP3045509B2 JP 3045509 B2 JP3045509 B2 JP 3045509B2 JP 1296484 A JP1296484 A JP 1296484A JP 29648489 A JP29648489 A JP 29648489A JP 3045509 B2 JP3045509 B2 JP 3045509B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、複合糖質の糖鎖中に含まれるマンノース含
有オリゴ糖の製造法に関するものである。
有オリゴ糖の製造法に関するものである。
〈従来の技術〉 近年、糖蛋白質や糖脂質などの複合糖質の生体におけ
る意義が次第に明らかとなってきた。これは細胞膜上の
糖蛋白質や糖脂質が、細胞の癌化、分化、増殖、免疫な
どの基本的な生命現象に深くかかわっていることであ
り、この現象と関連して注目されているのが特にその糖
鎖である。この糖鎖は、ガラクトース、マンノース、グ
ルコース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−
アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸な
どの単糖の組み合せの結合により構成されるオリゴ糖で
あり、微量ながらきわめて有用な物質で医薬品、診断薬
あるいは機能性食品素材としての利用が考えられている
物質である。
る意義が次第に明らかとなってきた。これは細胞膜上の
糖蛋白質や糖脂質が、細胞の癌化、分化、増殖、免疫な
どの基本的な生命現象に深くかかわっていることであ
り、この現象と関連して注目されているのが特にその糖
鎖である。この糖鎖は、ガラクトース、マンノース、グ
ルコース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−
アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸な
どの単糖の組み合せの結合により構成されるオリゴ糖で
あり、微量ながらきわめて有用な物質で医薬品、診断薬
あるいは機能性食品素材としての利用が考えられている
物質である。
従来、このようなオリゴ糖は天然物からの抽出によっ
て製造されているが、最近では化学合成法もしくは糖ヌ
クレオチドを基質としたトランスフェラーゼの反応によ
り糖鎖の全合成あるいはそのフラグメント化合物の合成
が盛んに行なわれるようになってきた。
て製造されているが、最近では化学合成法もしくは糖ヌ
クレオチドを基質としたトランスフェラーゼの反応によ
り糖鎖の全合成あるいはそのフラグメント化合物の合成
が盛んに行なわれるようになってきた。
〈発明が解決しようとする問題点〉 しかしながら、いずれの方法も工程が複雑で、収量が
きわめて少なく工業的には適さない製造法である。そこ
で本発明者は、簡便でしかも収量の多い製造法を検討し
た結果、リゾチームおよびβ−ガラクトシダーゼの糖転
移反応を利用し、簡便でしかも収量の多いマンノース含
有オリゴ糖の合成に成功し本発明を完成したものであ
る。
きわめて少なく工業的には適さない製造法である。そこ
で本発明者は、簡便でしかも収量の多い製造法を検討し
た結果、リゾチームおよびβ−ガラクトシダーゼの糖転
移反応を利用し、簡便でしかも収量の多いマンノース含
有オリゴ糖の合成に成功し本発明を完成したものであ
る。
〈問題を解決するための手段〉 本発明は、 式 （式中Ｒは水素またはメチル基、エチル基、フェニル
基、フェニル誘導体を示す）を受容体基質とし、ジ−Ｎ
−アセチルキトビオースを供与体基質として、リゾチー
ムの糖転移反応によりβ−Ｎ−アセチルグルコサミン残
基を転移させること及び、 式 （式中Ｒは水素またはメチル基、エチル基、フェニル
基、フェニル誘導体を示す）を受容体基質とし、ラクト
ースを供与体基質としてβ−ガラクトシダーゼの糖転移
反応によりβ−ガラクトース残基を転移させることを特
徴とする、 式 （式中Ｒは水素またはメチル基、エチル基、フェニル
基、フェニル誘導体を示し、Ｒ′はβ−Ｎ−アセチルグ
ルコサミン残基またはβ−Ｎ−アセチルラクトサミン残
基を示す）で表わされるマンノース含有オリゴ糖の製造
法を提供することを目的とする。
基、フェニル誘導体を示す）を受容体基質とし、ジ−Ｎ
−アセチルキトビオースを供与体基質として、リゾチー
ムの糖転移反応によりβ−Ｎ−アセチルグルコサミン残
基を転移させること及び、 式 （式中Ｒは水素またはメチル基、エチル基、フェニル
基、フェニル誘導体を示す）を受容体基質とし、ラクト
ースを供与体基質としてβ−ガラクトシダーゼの糖転移
反応によりβ−ガラクトース残基を転移させることを特
徴とする、 式 （式中Ｒは水素またはメチル基、エチル基、フェニル
基、フェニル誘導体を示し、Ｒ′はβ−Ｎ−アセチルグ
ルコサミン残基またはβ−Ｎ−アセチルラクトサミン残
基を示す）で表わされるマンノース含有オリゴ糖の製造
法を提供することを目的とする。
本発明に用いるリゾチームは、市販の卵白リゾチーム
が使用でき、またβ−ガラクトシダーゼとしては、Kluy
veromyces fragilis,Kluyveromyces lactis,Escherichi
a coli,Aspergillus niger,Lactobacillus bulgaricus,
Streptococcus thermophilus,Aspergillus oryzae,Baci
llus circulanceを起源とする酵素が例示でき、これら
市販されている酵素を使用できるが好ましくはBacillus
circulance起源の酵素が挙げられる。
が使用でき、またβ−ガラクトシダーゼとしては、Kluy
veromyces fragilis,Kluyveromyces lactis,Escherichi
a coli,Aspergillus niger,Lactobacillus bulgaricus,
Streptococcus thermophilus,Aspergillus oryzae,Baci
llus circulanceを起源とする酵素が例示でき、これら
市販されている酵素を使用できるが好ましくはBacillus
circulance起源の酵素が挙げられる。
リゾチームの糖転移反応に用いる供与体基質（ジ−Ｎ
−アセチルキトビオース）と受容体基質（式〔Ｉ〕で表
わされる化合物）の量はモル比で1:0.1〜1:5とし、でき
るだけ高濃度にして反応を行なうことが好ましく、さら
には基質の溶解度あるいは転移反応を向上させるために
ジメチルスルホキシド、メタノールなどの有機溶剤を酵
素が失活しない範囲で添加することが好ましい。反応
は、pH4〜９、温度５℃〜50℃で行ない、反応時間は、
２時間〜500時間作用させるのが好ましい。この反応に
より式〔Ｉ〕で表わされる化合物にβ−Ｎ−アセチルグ
ルコサミン残基が転移し、式〔II〕で表わされる化合物
が生成する。
−アセチルキトビオース）と受容体基質（式〔Ｉ〕で表
わされる化合物）の量はモル比で1:0.1〜1:5とし、でき
るだけ高濃度にして反応を行なうことが好ましく、さら
には基質の溶解度あるいは転移反応を向上させるために
ジメチルスルホキシド、メタノールなどの有機溶剤を酵
素が失活しない範囲で添加することが好ましい。反応
は、pH4〜９、温度５℃〜50℃で行ない、反応時間は、
２時間〜500時間作用させるのが好ましい。この反応に
より式〔Ｉ〕で表わされる化合物にβ−Ｎ−アセチルグ
ルコサミン残基が転移し、式〔II〕で表わされる化合物
が生成する。
一方、β−ガラクトシダーゼの糖転移反応に用いる供
与体基質（ラクトース）と受容体基質（式〔II〕で表わ
される化合物）の量は、モル比で1:0.1〜1:5とし、でき
るだけ高濃度にして反応を行なうことが好ましい。反応
はpH4〜９、温度５℃〜50℃で行ない、反応時間は、２
時間〜50時間作用させるのが好ましい。この反応により
式〔II〕で表わされる化合物にβ−ガラクトース残基が
転移し、式〔III〕で表わされる化合物（ただしＲ′は
β−Ｎ−アセチルラクトサミン残基を示す）が生成す
る。
与体基質（ラクトース）と受容体基質（式〔II〕で表わ
される化合物）の量は、モル比で1:0.1〜1:5とし、でき
るだけ高濃度にして反応を行なうことが好ましい。反応
はpH4〜９、温度５℃〜50℃で行ない、反応時間は、２
時間〜50時間作用させるのが好ましい。この反応により
式〔II〕で表わされる化合物にβ−ガラクトース残基が
転移し、式〔III〕で表わされる化合物（ただしＲ′は
β−Ｎ−アセチルラクトサミン残基を示す）が生成す
る。
上記のようにして得られた反応液は凍結等により反応
を停止させ、生成したマンノースを含むオリゴ糖を必要
に応じて活性炭カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過、
高速液体クロマトグラフィー等の手段を組み合わせて精
製することができる。
を停止させ、生成したマンノースを含むオリゴ糖を必要
に応じて活性炭カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過、
高速液体クロマトグラフィー等の手段を組み合わせて精
製することができる。
〈実施例〉 以下に、本発明の実施例について、さらに具体的に説
明するがかかる説明によって本発明が何ら限定されない
ことは勿論である。なお、実施例において、GlcNAc:N−
アセチルグルコサミン、Man:マンノース、Gal:ガラクト
ース、PNP:パラニトロフェニル基を表わす。
明するがかかる説明によって本発明が何ら限定されない
ことは勿論である。なお、実施例において、GlcNAc:N−
アセチルグルコサミン、Man:マンノース、Gal:ガラクト
ース、PNP:パラニトロフェニル基を表わす。
（１）GlcNAcβ−（１→４）Manの製造。
0.1M酢酸緩衝液（pH 4.5）に、ジ−Ｎ−アセチルキト
ビオース1.5gとマンノース2.5g（モル比約1:4）を溶解
した10mlの溶液に市販卵白リゾチームを３％添加し40℃
で400時間反応させた。反応終了後、反応液を活性炭カ
ラムクロマトグラフィーに供し、０→50％のエタノール
溶出により２糖画分を集め、さらにこれをバイオゲルＰ
−２（バイオラッド社製）のゲル濾過クロマトグラフィ
ーを行ない、糖転移生成物の画分を集め凍結乾燥した。
収量は204mgであった。本物質は、13C−NMR構造解析の
結果GlcNAcβ−（１→４）Manと同定した。
ビオース1.5gとマンノース2.5g（モル比約1:4）を溶解
した10mlの溶液に市販卵白リゾチームを３％添加し40℃
で400時間反応させた。反応終了後、反応液を活性炭カ
ラムクロマトグラフィーに供し、０→50％のエタノール
溶出により２糖画分を集め、さらにこれをバイオゲルＰ
−２（バイオラッド社製）のゲル濾過クロマトグラフィ
ーを行ない、糖転移生成物の画分を集め凍結乾燥した。
収量は204mgであった。本物質は、13C−NMR構造解析の
結果GlcNAcβ−（１→４）Manと同定した。
（２）GlcNAcβ−（１→４）Man β−PNPの製造。
60％ジメチルスルホキシドを含む0.1M酢酸緩衝液（pH
4.5）にジ−Ｎ−アセチルキトビオース140mgとパラニト
ロフェニル−β−マンノシド100mg（モル比約1:1）を溶
解した3mlの溶液に市販卵白リゾチームを３％添加し40
℃で60時間反応させた。反応終了後、反応液をトヨパー
ルHW40S（東ソー（株）製）のカラムクロマトグラフィ
ーに供し、糖転移生成物の画分を集め凍結乾燥した。収
量は21.2mgであった。本物質は、FAB−MS,13C−NMR構造
解析の結果GlcNAcβ−（１→４）Man β−PNPと同定し
た。
4.5）にジ−Ｎ−アセチルキトビオース140mgとパラニト
ロフェニル−β−マンノシド100mg（モル比約1:1）を溶
解した3mlの溶液に市販卵白リゾチームを３％添加し40
℃で60時間反応させた。反応終了後、反応液をトヨパー
ルHW40S（東ソー（株）製）のカラムクロマトグラフィ
ーに供し、糖転移生成物の画分を集め凍結乾燥した。収
量は21.2mgであった。本物質は、FAB−MS,13C−NMR構造
解析の結果GlcNAcβ−（１→４）Man β−PNPと同定し
た。
（３）Gal β−（１→４）GlcNAcβ−（１→４）Manの
製造。
製造。
次に示す反応液を調製し、40℃で16時間反応させた。
ラクトース 100 mg GlcNAcβ−（１→４）Man（実施例１で調製）187.8mg 0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0） 0.720ml 水 0.504ml β−ガラクトシダーゼ（1ml当り1mgの酵素溶液とし
た）（大和化成製） 0.216ml ラクトースとGlcNAcβ−（１→４）Manのモル比約1:
0.5 反応終了後、反応液を活性炭カラムクロマトグラフィ
ーに供し、０→50％のエタノール溶出により３糖画分を
集め、さらにこれをバイオゲルＰ−２（バイオラッド社
製）のゲル濾過クロマトグラフィーを行ない糖転移生成
物の画分を集め凍結乾燥した。収量は、19.9mgであっ
た。本物質は、13C−NMR構造解析の結果Galβ−（１→
４）GlcNAcβ−（１→４）Manと同定した。
た）（大和化成製） 0.216ml ラクトースとGlcNAcβ−（１→４）Manのモル比約1:
0.5 反応終了後、反応液を活性炭カラムクロマトグラフィ
ーに供し、０→50％のエタノール溶出により３糖画分を
集め、さらにこれをバイオゲルＰ−２（バイオラッド社
製）のゲル濾過クロマトグラフィーを行ない糖転移生成
物の画分を集め凍結乾燥した。収量は、19.9mgであっ
た。本物質は、13C−NMR構造解析の結果Galβ−（１→
４）GlcNAcβ−（１→４）Manと同定した。
（４）Gal β−（１→４）GlcNAcβ−（１→４）Man β
−PNPの製造。
−PNPの製造。
次に示す反応液を調製し、40℃で4.5時間反応させ
た。
た。
ラクトース 62.8 mg GlcNAcβ−（１→４）Man β−PNP（実施例２と同様
にして） 137.2mg 0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0） 1.0ml 水 0.7ml β−ガラクトシダーゼ（1ml当り1mgの酵素溶液とし
た）（大和化成製） 0.3ml ラクトースとGlcNAcβ−（１→４）Manβ−PNPのモル
比約1:0.3 反応終了後、反応液をトヨパールHW40S（東ソー
（株）製）のカラムクロマトグラフィーに供し、糖転移
生成物の画分を凍結乾燥した。収量は、11.6mgであっ
た。本物質は、FAB−MS,13C−NMR構造解析の結果Gal β
−（１→４）GlcNAcβ−（１→４）Man β−PNPと同定
した。
にして） 137.2mg 0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0） 1.0ml 水 0.7ml β−ガラクトシダーゼ（1ml当り1mgの酵素溶液とし
た）（大和化成製） 0.3ml ラクトースとGlcNAcβ−（１→４）Manβ−PNPのモル
比約1:0.3 反応終了後、反応液をトヨパールHW40S（東ソー
（株）製）のカラムクロマトグラフィーに供し、糖転移
生成物の画分を凍結乾燥した。収量は、11.6mgであっ
た。本物質は、FAB−MS,13C−NMR構造解析の結果Gal β
−（１→４）GlcNAcβ−（１→４）Man β−PNPと同定
した。
〈発明の効果〉 本発明によれば、複合糖質の糖鎖中に含まれる、生理
学上極めて重要な、オリゴ糖を効率よく製造することが
できる。
学上極めて重要な、オリゴ糖を効率よく製造することが
できる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖ ｏｌ．45 Ｎｏ．10（1981）ｐ．2329− 2335 Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｖｏｌ．27 Ｎｏ．19（1971）ｐ．4749−4757 Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．145（1985）ｐ. 322−330 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 19/26 C12P 19/44 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (2)
- 【請求項１】式 （式中Ｒは水素またはメチル基、エチル基、フェニル
基、フェニル誘導体を示す）を受容体基質として、ジ−
Ｎ−アセチルキトビオースを供与体基質として、リゾチ
ームの糖転移反応により、β−Ｎ−アセチルグルコサミ
ン残基を転移させることを特徴とする、 式 （式中Ｒは水素またはメチル基、エチル基、フェニル
基、フェニル誘導体を示す）で表わされるマンノース含
有オリゴ糖の製造法。 - 【請求項２】式 （式中Ｒは水素またはメチル基、エチル基、フェニル
基、フェニル誘導体を示す）を受容体基質とし、ラクト
ースを供与体基質としてβ−ガラクトシダーゼの糖転移
反応によりβ−ガラクトース残基を転移させることを特
徴とする、式 （式中Ｒは水素またはメチル基、エチル基、フェニル
基、フェニル誘導体を示す）で表わされるマンノース含
有オリゴ糖の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1296484A JP3045509B2 (ja) | 1989-11-15 | 1989-11-15 | マンノース含有オリゴ糖の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1296484A JP3045509B2 (ja) | 1989-11-15 | 1989-11-15 | マンノース含有オリゴ糖の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03157391A JPH03157391A (ja) | 1991-07-05 |
| JP3045509B2 true JP3045509B2 (ja) | 2000-05-29 |
Family
ID=17834155
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1296484A Expired - Fee Related JP3045509B2 (ja) | 1989-11-15 | 1989-11-15 | マンノース含有オリゴ糖の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3045509B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1359227A1 (en) * | 2002-04-29 | 2003-11-05 | Academisch Ziekenhuis bij de Universiteit van Amsterdam | Methods for detecting endoglycosidase activity |
-
1989
- 1989-11-15 JP JP1296484A patent/JP3045509B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．４５ Ｎｏ．１０（１９８１）ｐ．２３２９−２３３５ |
| Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．１４５（１９８５）ｐ．３２２−３３０ |
| Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｖｏｌ．２７ Ｎｏ．１９（１９７１）ｐ．４７４９−４７５７ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03157391A (ja) | 1991-07-05 |
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