JP3062591B2 - ｐ−ニトロフェニル ２−アセチルアミノ−４−Ｏ−（２−アミノ−２−デオキシ−β−Ｄ −グルコピラノシル）−２−デオキシ−β−Ｄ −グルコピラノシドおよびその塩並びにその製造法 - Google Patents
ｐ−ニトロフェニル ２−アセチルアミノ−４−Ｏ−（２−アミノ−２−デオキシ−β−Ｄ −グルコピラノシル）−２−デオキシ−β−Ｄ −グルコピラノシドおよびその塩並びにその製造法Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ｐ−ニトロフェニ
ル ２−アセチルアミノ−４−Ｏ−（２−アミノ−２−
デオキシ−β−D −グルコピラノシル）−２−デオキシ
−β−D −グルコピラノシドおよびその塩、並びにその
製造法に関する。本物質は、キチン分解酵素のうち、エ
キソ型のものには反応せず、エンド型の酵素により分解
を受け、呈色性のｐ−ニトロフェノールを遊離する性質
を有している。このことから、本物質は現在市販されて
いる基質と比較して、酵素の分解様式に対する特異性お
よび感度の高い酵素活性測定基質となり得る。
ル ２−アセチルアミノ−４−Ｏ−（２−アミノ−２−
デオキシ−β−D −グルコピラノシル）−２−デオキシ
−β−D −グルコピラノシドおよびその塩、並びにその
製造法に関する。本物質は、キチン分解酵素のうち、エ
キソ型のものには反応せず、エンド型の酵素により分解
を受け、呈色性のｐ−ニトロフェノールを遊離する性質
を有している。このことから、本物質は現在市販されて
いる基質と比較して、酵素の分解様式に対する特異性お
よび感度の高い酵素活性測定基質となり得る。
【０００２】
【従来の技術】キチン分解酵素は、細菌，菌類，植物，
節足動物および脊椎動物に広く分布しており、それぞれ
における存在意義の解明および産業への活用を目的とし
た研究が活発に行われている。一方、キチン分解酵素の
活性測定法としては、比濁法，粘度法，放射活性を利用
した方法および還元糖定量法等があるが、どの方法も測
定に長時間を要したり、手間がかかる等の問題があっ
た。
節足動物および脊椎動物に広く分布しており、それぞれ
における存在意義の解明および産業への活用を目的とし
た研究が活発に行われている。一方、キチン分解酵素の
活性測定法としては、比濁法，粘度法，放射活性を利用
した方法および還元糖定量法等があるが、どの方法も測
定に長時間を要したり、手間がかかる等の問題があっ
た。
【０００３】また、糖鎖工学の発展に伴い、還元末端に
ｐ−ニトロフェニル基を有する単糖誘導体を用いる酵素
活性測定法が開発され、主にエキソ型の酵素に対する迅
速な活性測定法となった。しかしながら、エンド型の酵
素に対する活性測定法については、有効な方法が開発さ
れていない。さらに、エンド型の酵素活性を測定するこ
とができると考えられたキチンオリゴ糖のｐ−ニトロフ
ェニル誘導体についても、オリゴ糖を端から順次分解す
るエキソ型の酵素に対する基質にもなり得ることから、
エンド型の酵素に対して特異性の高い基質の開発が待た
れている。実際に、エンド型かエキソ型を見分けるのに
は、反応の進行に伴う粘度の低下速度が速い（エンド型
酵素による）、または遅い（エキソ型酵素による）かを
調べるというような煩雑な方法がとられている。
ｐ−ニトロフェニル基を有する単糖誘導体を用いる酵素
活性測定法が開発され、主にエキソ型の酵素に対する迅
速な活性測定法となった。しかしながら、エンド型の酵
素に対する活性測定法については、有効な方法が開発さ
れていない。さらに、エンド型の酵素活性を測定するこ
とができると考えられたキチンオリゴ糖のｐ−ニトロフ
ェニル誘導体についても、オリゴ糖を端から順次分解す
るエキソ型の酵素に対する基質にもなり得ることから、
エンド型の酵素に対して特異性の高い基質の開発が待た
れている。実際に、エンド型かエキソ型を見分けるのに
は、反応の進行に伴う粘度の低下速度が速い（エンド型
酵素による）、または遅い（エキソ型酵素による）かを
調べるというような煩雑な方法がとられている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
した従来の課題を解決し、エキソ型のキチン分解酵素に
は作用せず、エンド型のものに対して特異的な基質にな
り得る化合物およびその製造法を提供することである。
した従来の課題を解決し、エキソ型のキチン分解酵素に
は作用せず、エンド型のものに対して特異的な基質にな
り得る化合物およびその製造法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】請求項１に記載の本発明
は、下記の式（１）で表されるｐ−ニトロフェニル２−
アセチルアミノ−４−Ｏ−（２−アミノ−２−デオキシ
−β−D −グルコピラノシル）−２−デオキシ−β−D
−グルコピラノシドまたはその酸付加塩である。
は、下記の式（１）で表されるｐ−ニトロフェニル２−
アセチルアミノ−４−Ｏ−（２−アミノ−２−デオキシ
−β−D −グルコピラノシル）−２−デオキシ−β−D
−グルコピラノシドまたはその酸付加塩である。
【０００６】
【化２】
【０００７】請求項２に記載の本発明は、キチン２量体
のｐ−ニトロフェニル誘導体にコレトトリカム・リンデ
ムチアナムＡＴＣＣ５６６７６株由来の脱アセチル化酵
素（以下、微生物由来の脱アセチル化酵素と略記するこ
とがある。）を作用させることを特徴とする請求項１記
載のｐ−ニトロフェニル ２−アセチルアミノ−４−Ｏ
−（２−アミノ−２−デオキシ−β−D −グルコピラノ
シル）−２−デオキシ−β−D −グルコピラノシドまた
はその酸付加塩の製造法である。請求項３に記載の本発
明は、キチン２量体のｐ−ニトロフェニル誘導体が、ｐ
−ニトロフェニル−ジ−Ｎ−アセチル−β−D −キトビ
オシドである請求項２記載の方法である。
のｐ−ニトロフェニル誘導体にコレトトリカム・リンデ
ムチアナムＡＴＣＣ５６６７６株由来の脱アセチル化酵
素（以下、微生物由来の脱アセチル化酵素と略記するこ
とがある。）を作用させることを特徴とする請求項１記
載のｐ−ニトロフェニル ２−アセチルアミノ−４−Ｏ
−（２−アミノ−２−デオキシ−β−D −グルコピラノ
シル）−２−デオキシ−β−D −グルコピラノシドまた
はその酸付加塩の製造法である。請求項３に記載の本発
明は、キチン２量体のｐ−ニトロフェニル誘導体が、ｐ
−ニトロフェニル−ジ−Ｎ−アセチル−β−D −キトビ
オシドである請求項２記載の方法である。
【０００８】
【発明の実施の形態】ｐ−ニトロフェニル基の結合した
糖鎖誘導体は、糖質加水分解酵素等の活性測定基質等と
して製造、市販されているが、本発明に係る上記式
（１）で表される化合物は、文献未記載の新規化合物で
ある。また、本化合物の塩としては酸付加塩があり、例
えば塩酸塩，酢酸塩などがある。このものは下記の式
（２）で表される。
糖鎖誘導体は、糖質加水分解酵素等の活性測定基質等と
して製造、市販されているが、本発明に係る上記式
（１）で表される化合物は、文献未記載の新規化合物で
ある。また、本化合物の塩としては酸付加塩があり、例
えば塩酸塩，酢酸塩などがある。このものは下記の式
（２）で表される。
【０００９】
【化３】
【００１０】以下に、本発明のｐ−ニトロフェニル ２
−アセチルアミノ−４−Ｏ−（２−アミノ−２−デオキ
シ−β−D −グルコピラノシル）−２−デオキシ−β−
D −グルコピラノシドおよびその塩の製造法について説
明する。本発明に係る化合物は、キチン２量体のｐ−ニ
トロフェニル誘導体に微生物由来の脱アセチル化酵素を
作用させることによって得ることができる。キチン２量
体のｐ−ニトロフェニル誘導体としては、市販品を用い
ることができ、例えばｐ−ニトロフェニル−ジ−Ｎ−ア
セチル−β−D −キトビオシドなどは好ましいものであ
る。
−アセチルアミノ−４−Ｏ−（２−アミノ−２−デオキ
シ−β−D −グルコピラノシル）−２−デオキシ−β−
D −グルコピラノシドおよびその塩の製造法について説
明する。本発明に係る化合物は、キチン２量体のｐ−ニ
トロフェニル誘導体に微生物由来の脱アセチル化酵素を
作用させることによって得ることができる。キチン２量
体のｐ−ニトロフェニル誘導体としては、市販品を用い
ることができ、例えばｐ−ニトロフェニル−ジ−Ｎ−ア
セチル−β−D −キトビオシドなどは好ましいものであ
る。
【００１１】また、微生物由来の脱アセチル化酵素とし
ては、例えば不完全菌由来のキチン脱アセチル化酵素、
具体的にはコレトトリカム・リンデムチアナム（Collet
otrichum lindemuthianum）ＡＴＣＣ５６６７６株由来
のキチン脱アセチル化酵素(Biosci. Biotech. Bioche
m., 60(10), 1598-1603,1996) がある。この酵素は、例
えば次の方法によって得ることができる。上記の不完全
菌の胞子を液体培地で培養した後、培養物から活性画分
を回収する。これを粗酵素液として用いる他、常法によ
り精製して精製酵素とすることができる（特開平８−２
８９７８５号公報）。本酵素を原料化合物である上記の
キチン２量体のｐ−ニトロフェニル誘導体に作用させる
ことにより、該誘導体の非還元末端のＮ−アセチルグル
コサミン残基のアセチル基のみを脱離し、グルコサミン
残基に変換して、目的とするｐ−ニトロフェニル ２−
アセチルアミノ−４−Ｏ−（２−アミノ−２−デオキシ
−β−D −グルコピラノシル）−２−デオキシ−β−D
−グルコピラノシドを製造することができる。
ては、例えば不完全菌由来のキチン脱アセチル化酵素、
具体的にはコレトトリカム・リンデムチアナム（Collet
otrichum lindemuthianum）ＡＴＣＣ５６６７６株由来
のキチン脱アセチル化酵素(Biosci. Biotech. Bioche
m., 60(10), 1598-1603,1996) がある。この酵素は、例
えば次の方法によって得ることができる。上記の不完全
菌の胞子を液体培地で培養した後、培養物から活性画分
を回収する。これを粗酵素液として用いる他、常法によ
り精製して精製酵素とすることができる（特開平８−２
８９７８５号公報）。本酵素を原料化合物である上記の
キチン２量体のｐ−ニトロフェニル誘導体に作用させる
ことにより、該誘導体の非還元末端のＮ−アセチルグル
コサミン残基のアセチル基のみを脱離し、グルコサミン
残基に変換して、目的とするｐ−ニトロフェニル ２−
アセチルアミノ−４−Ｏ−（２−アミノ−２−デオキシ
−β−D −グルコピラノシル）−２−デオキシ−β−D
−グルコピラノシドを製造することができる。
【００１２】具体的には、キチン２量体のｐ−ニトロフ
ェニル誘導体を四ほう酸ナトリウム・塩酸緩衝液（ｐＨ
８．５）に溶解し、基質濃度０．１〜０．５％、好まし
くは０．２％程度の溶液とする。この溶液に微生物由来
のキチン脱アセチル化酵素を０．０１〜０．３ユニッ
ト、好ましくは０．１ユニット程度加えたのち、３０〜
６０℃、好ましくは４５℃で１〜６時間、好ましくは２
〜４時間反応させる。その後、反応生成物を陽イオン交
換樹脂に吸着させることによって、未反応の原料物質を
除去し、さらにｐＨを上げることによって目的物を溶出
させる。このとき用いる陽イオン交換樹脂としては、ア
ンバーライトＣＧ−１２０カラム，ＣＭ−セファデクス
等が好ましい。次いで、溶出液を水で平衡化した逆相カ
ラムに供し、吸着した目的物をメタノールで溶出させて
脱塩、精製する。このときに用いる逆相カラムとして
は、Sep-Pak plus C-18 が好ましい。所望により、これ
に塩酸，酢酸等の適当な酸を加えることにより、塩形成
された化合物を調製することができる。
ェニル誘導体を四ほう酸ナトリウム・塩酸緩衝液（ｐＨ
８．５）に溶解し、基質濃度０．１〜０．５％、好まし
くは０．２％程度の溶液とする。この溶液に微生物由来
のキチン脱アセチル化酵素を０．０１〜０．３ユニッ
ト、好ましくは０．１ユニット程度加えたのち、３０〜
６０℃、好ましくは４５℃で１〜６時間、好ましくは２
〜４時間反応させる。その後、反応生成物を陽イオン交
換樹脂に吸着させることによって、未反応の原料物質を
除去し、さらにｐＨを上げることによって目的物を溶出
させる。このとき用いる陽イオン交換樹脂としては、ア
ンバーライトＣＧ−１２０カラム，ＣＭ−セファデクス
等が好ましい。次いで、溶出液を水で平衡化した逆相カ
ラムに供し、吸着した目的物をメタノールで溶出させて
脱塩、精製する。このときに用いる逆相カラムとして
は、Sep-Pak plus C-18 が好ましい。所望により、これ
に塩酸，酢酸等の適当な酸を加えることにより、塩形成
された化合物を調製することができる。
【００１３】このようにして得られた物質の構造解析を
質量分析，核磁気共鳴分析により行った。さらに、ケミ
カルアブストラクツにより本物質を検索（1957〜1997）
した結果、文献上の記載が認められなかった。以上のこ
とから、本物質は新規な化合物であると判定された。
質量分析，核磁気共鳴分析により行った。さらに、ケミ
カルアブストラクツにより本物質を検索（1957〜1997）
した結果、文献上の記載が認められなかった。以上のこ
とから、本物質は新規な化合物であると判定された。
【００１４】また、本物質の主な利用法としては、エン
ド型キチナーゼの活性測定基質としての利用が挙げられ
る。前記したように、キチナーゼに関するこれまでの呈
色性活性測定基質では、エキソ型の酵素の混入した状態
で、エンド型酵素の活性のみを測定することが不可能で
あった。しかし、本発明による新規化合物は、エキソ型
のキチン分解酵素による分解を受けることなくエンド型
酵素によってのみ分解を受ける性質を有することから、
キチン分解酵素の分解機構の解析方法の提供、並びにエ
ンド型酵素の活性測定の効率化という観点から役立つと
考えられる。
ド型キチナーゼの活性測定基質としての利用が挙げられ
る。前記したように、キチナーゼに関するこれまでの呈
色性活性測定基質では、エキソ型の酵素の混入した状態
で、エンド型酵素の活性のみを測定することが不可能で
あった。しかし、本発明による新規化合物は、エキソ型
のキチン分解酵素による分解を受けることなくエンド型
酵素によってのみ分解を受ける性質を有することから、
キチン分解酵素の分解機構の解析方法の提供、並びにエ
ンド型酵素の活性測定の効率化という観点から役立つと
考えられる。
【００１５】
【実施例】次に、本発明を実施例によって詳しく説明す
るが、本発明はこれらによって制限されるものではな
い。 実施例１ （１）キチン脱アセチル化酵素の精製 不完全菌コレトトリカム・リンデムチアナム ＡＴＣＣ
５６６７６株を０．２８％グルコース，０．１２３％硫
酸マグネシウム（７水和物），０．２％プロテオース・
ペプトン，０．２７２％りん酸二水素カリウムおよび
２．０％寒天を含む培地に接種し、２５℃で暗所に７日
間静置培養して黒色の菌体を誘導した。
るが、本発明はこれらによって制限されるものではな
い。 実施例１ （１）キチン脱アセチル化酵素の精製 不完全菌コレトトリカム・リンデムチアナム ＡＴＣＣ
５６６７６株を０．２８％グルコース，０．１２３％硫
酸マグネシウム（７水和物），０．２％プロテオース・
ペプトン，０．２７２％りん酸二水素カリウムおよび
２．０％寒天を含む培地に接種し、２５℃で暗所に７日
間静置培養して黒色の菌体を誘導した。
【００１６】次いで、菌体を１％麦芽抽出物，０．４％
酵母抽出物，０．４％ブドウ糖を含む２００ｍｌの培地
（ｐＨ５．８）が入った５００ｍｌ容三角フラスコに接
種し、２２℃にて暗所下で１分間に１００回転の条件で
振とう培養を行った。８日目頃から酵素活性を示すもの
が培養液中に分泌され、１８日目まで該活性が増加し
た。１８日経過した時点で培養を終了し、菌体培養液を
ナイロンフィルターでろ過したのち、ガラスファイバー
を通過させて微粒子を除き、培養ろ液を回収した。該培
養ろ液に４℃下で８０％飽和になるように硫安を加え、
一晩静置したのち遠心分離により沈澱を回収した。この
沈澱を少量の５０ｍＭ 四ほう酸ナトリウム・塩酸緩衝
液（ｐＨ８．５）に溶解し、同緩衝液中で透析を行っ
た。透析後の粗酵素液を疎水クロマトグラフィーおよび
陰イオンクロマトグラフィーを用いて分画、精製し、Ｓ
ＤＳゲル電気泳動的に単一バンドを示すキチン脱アセチ
ル化酵素を得た（特開平８−２８９７８５号公報）。
酵母抽出物，０．４％ブドウ糖を含む２００ｍｌの培地
（ｐＨ５．８）が入った５００ｍｌ容三角フラスコに接
種し、２２℃にて暗所下で１分間に１００回転の条件で
振とう培養を行った。８日目頃から酵素活性を示すもの
が培養液中に分泌され、１８日目まで該活性が増加し
た。１８日経過した時点で培養を終了し、菌体培養液を
ナイロンフィルターでろ過したのち、ガラスファイバー
を通過させて微粒子を除き、培養ろ液を回収した。該培
養ろ液に４℃下で８０％飽和になるように硫安を加え、
一晩静置したのち遠心分離により沈澱を回収した。この
沈澱を少量の５０ｍＭ 四ほう酸ナトリウム・塩酸緩衝
液（ｐＨ８．５）に溶解し、同緩衝液中で透析を行っ
た。透析後の粗酵素液を疎水クロマトグラフィーおよび
陰イオンクロマトグラフィーを用いて分画、精製し、Ｓ
ＤＳゲル電気泳動的に単一バンドを示すキチン脱アセチ
ル化酵素を得た（特開平８−２８９７８５号公報）。
【００１７】（２）ｐ−ニトロフェニル ２−アセチル
アミノ−４−Ｏ−（２−アミノ−２−デオキシ−β−D
−グルコピラノシル）−２−デオキシ−β−D −グルコ
ピラノシドの製造ｐ −ニトロフェニル−ジ−Ｎ−アセチル−β−D −キト
ビオシド（生化学工業株式会社製）０．４０ｍｇを０．
２ｍｌの２０ｍＭ 四ほう酸ナトリウム・塩酸緩衝液
（ｐＨ８．５）に溶解し、これに上記（１）で得た不完
全菌コレトトリカム・リンデムチアナム由来の精製キチ
ン脱アセチル化酵素を０．０５ユニット加え、４５℃で
３時間反応させた。この反応を６回繰り返して得た反応
液をまとめたのち、塩酸で平衡化した後に水で洗浄した
陽イオン交換樹脂（アンバーライトＣＧ−１２０カラ
ム、オルガノ株式会社製）に通し、反応生成物を保持さ
せた後に、５０ｍＭ 四ほう酸ナトリウム・塩酸緩衝液
（ｐＨ８．５）を流して溶出させた。その後、水で平衡
化した固相抽出カラム（Sep-Pak plus C-18 、ウォータ
ーズ社製）に供して保持させた後に、１００％メタノー
ルで溶出した。
アミノ−４−Ｏ−（２−アミノ−２−デオキシ−β−D
−グルコピラノシル）−２−デオキシ−β−D −グルコ
ピラノシドの製造ｐ −ニトロフェニル−ジ−Ｎ−アセチル−β−D −キト
ビオシド（生化学工業株式会社製）０．４０ｍｇを０．
２ｍｌの２０ｍＭ 四ほう酸ナトリウム・塩酸緩衝液
（ｐＨ８．５）に溶解し、これに上記（１）で得た不完
全菌コレトトリカム・リンデムチアナム由来の精製キチ
ン脱アセチル化酵素を０．０５ユニット加え、４５℃で
３時間反応させた。この反応を６回繰り返して得た反応
液をまとめたのち、塩酸で平衡化した後に水で洗浄した
陽イオン交換樹脂（アンバーライトＣＧ−１２０カラ
ム、オルガノ株式会社製）に通し、反応生成物を保持さ
せた後に、５０ｍＭ 四ほう酸ナトリウム・塩酸緩衝液
（ｐＨ８．５）を流して溶出させた。その後、水で平衡
化した固相抽出カラム（Sep-Pak plus C-18 、ウォータ
ーズ社製）に供して保持させた後に、１００％メタノー
ルで溶出した。
【００１８】精製した化合物を質量分析計（ＪＥＯＬ社
製）により調べた結果、［Ｍ＋Ｈ+］＝５０４のシグナ
ルが検出され、分子量が５０３であると推定された。ま
た、1H−NMR による分析の結果、本物質の構造はｐ−ニ
トロフェニル ２−アセチルアミノ−４−Ｏ−（２−ア
ミノ−２−デオキシ−β−D −グルコピラノシル）−２
−デオキシ−β−D −グルコピラノシドであると決定さ
れた。図１は質量スペクトル、図２は1H−NMR スペクト
ルである。
製）により調べた結果、［Ｍ＋Ｈ+］＝５０４のシグナ
ルが検出され、分子量が５０３であると推定された。ま
た、1H−NMR による分析の結果、本物質の構造はｐ−ニ
トロフェニル ２−アセチルアミノ−４−Ｏ−（２−ア
ミノ−２−デオキシ−β−D −グルコピラノシル）−２
−デオキシ−β−D −グルコピラノシドであると決定さ
れた。図１は質量スペクトル、図２は1H−NMR スペクト
ルである。
【００１９】実施例２ 実施例１で得た精製ｐ−ニトロフェニル ２−アセチル
アミノ−４−Ｏ−（２−アミノ−２−デオキシ−β−D
−グルコピラノシル）−２−デオキシ−β−D−グルコ
ピラノシド ０．０５％に、エキソ型のキチン分解酵素
活性を備えたβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（Pe
nicillum oxalicum由来、生化学工業株式会社製）０．
００７ユニットを５０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ４．５）中で、３７℃で１時間反応させた。反応
液０．０１ｍｌを０．４９ｍｌの２００ｍＭ ほう酸緩
衝液（ｐＨ８．６）と混合して、黄色化したｐ−ニトロ
フェノールを４００ｎｍでの吸光度を測定することによ
り定量した。なお、対照としてＮ−アセチルグルコサミ
ンのｐ−ニトロフェニル誘導体を基質として用いた。そ
の結果、同量のＮ−アセチルグルコサミンのｐ−ニトロ
フェニル誘導体を基質として用いた場合と比較して、本
発明の化合物のｐ−ニトロフェノールの遊離は２％程度
に抑えられていた。
アミノ−４−Ｏ−（２−アミノ−２−デオキシ−β−D
−グルコピラノシル）−２−デオキシ−β−D−グルコ
ピラノシド ０．０５％に、エキソ型のキチン分解酵素
活性を備えたβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（Pe
nicillum oxalicum由来、生化学工業株式会社製）０．
００７ユニットを５０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ４．５）中で、３７℃で１時間反応させた。反応
液０．０１ｍｌを０．４９ｍｌの２００ｍＭ ほう酸緩
衝液（ｐＨ８．６）と混合して、黄色化したｐ−ニトロ
フェノールを４００ｎｍでの吸光度を測定することによ
り定量した。なお、対照としてＮ−アセチルグルコサミ
ンのｐ−ニトロフェニル誘導体を基質として用いた。そ
の結果、同量のＮ−アセチルグルコサミンのｐ−ニトロ
フェニル誘導体を基質として用いた場合と比較して、本
発明の化合物のｐ−ニトロフェノールの遊離は２％程度
に抑えられていた。
【００２０】実施例３ 実施例１で得た精製ｐ−ニトロフェニル ２−アセチル
アミノ−４−Ｏ−（２−アミノ−２−デオキシ−β−D
−グルコピラノシル）−２−デオキシ−β−D−グルコ
ピラノシドを、ストレプトコッカス・グリセウス (Stre
ptomyces griseus)由来のエンド型キチナーゼ（ＳＩＧ
ＭＡ社製）０．００４ユニットを用い、２０ｍＭ リン
酸ナトリウム緩衝液中で３７℃で１時間反応させて分解
させた。その結果、反応開始直後より、ｐ−ニトロフェ
ノールの遊離に起因する反応液の黄色化が見られた。ま
た、この試料を高速液体クロマトグラフィー（DIONEX社
製カラム, CarbopakPA-1 ，溶離液：１５ｍＭ NaOH，
パルスド・アンペロメトリー検出器）によって分析し、
遊離した糖の構造を調べた。図３は、高速液体クロマト
グラフィーで分析したクロマトグラムである。その結
果、遊離糖は２−アセトアミド−２−デオキシ−４−Ｏ
−（２−アミノ−２−デオキシ−β−D −グルコピラノ
シル）−D −グルコース標品と同一の保持時間を示し、
本化合物がエンド型キチナーゼによって２糖単位で切断
を受けていることが確認された。
アミノ−４−Ｏ−（２−アミノ−２−デオキシ−β−D
−グルコピラノシル）−２−デオキシ−β−D−グルコ
ピラノシドを、ストレプトコッカス・グリセウス (Stre
ptomyces griseus)由来のエンド型キチナーゼ（ＳＩＧ
ＭＡ社製）０．００４ユニットを用い、２０ｍＭ リン
酸ナトリウム緩衝液中で３７℃で１時間反応させて分解
させた。その結果、反応開始直後より、ｐ−ニトロフェ
ノールの遊離に起因する反応液の黄色化が見られた。ま
た、この試料を高速液体クロマトグラフィー（DIONEX社
製カラム, CarbopakPA-1 ，溶離液：１５ｍＭ NaOH，
パルスド・アンペロメトリー検出器）によって分析し、
遊離した糖の構造を調べた。図３は、高速液体クロマト
グラフィーで分析したクロマトグラムである。その結
果、遊離糖は２−アセトアミド−２−デオキシ−４−Ｏ
−（２−アミノ−２−デオキシ−β−D −グルコピラノ
シル）−D −グルコース標品と同一の保持時間を示し、
本化合物がエンド型キチナーゼによって２糖単位で切断
を受けていることが確認された。
【００２１】
【発明の効果】本発明によれば、新規物質であるｐ−ニ
トロフェニル ２−アセチルアミノ−４−Ｏ−（２−ア
ミノ−２−デオキシ−β−D −グルコピラノシル）−２
−デオキシ−β−D −グルコピラノシドおよびその塩が
提供される。この化合物を用いることによって、混在す
るエキソ型の酵素の影響を受けることなく、エンド型キ
チナーゼの活性を迅速に測定することができる。
トロフェニル ２−アセチルアミノ−４−Ｏ−（２−ア
ミノ−２−デオキシ−β−D −グルコピラノシル）−２
−デオキシ−β−D −グルコピラノシドおよびその塩が
提供される。この化合物を用いることによって、混在す
るエキソ型の酵素の影響を受けることなく、エンド型キ
チナーゼの活性を迅速に測定することができる。
【図１】 本発明の化合物の質量スペクトルを示す。
【図２】 本発明の化合物の1H−NMR スペクトルを示
す。
す。
【図３】 本発明の化合物をエンド型キチナーゼによっ
て分解し、高速液体クロマトグラフィーで分析したクロ
マトグラムを示し、（１）が２−アセトアミド−２−デ
オキシ−４−Ｏ−（２−アミノ−２−デオキシ−β−D
−グルコピラノシル）−D −グルコース標品を分析した
ときのクロマトグラムであり、（２）が本発明の化合物
をエンド型キチナーゼによって処理したときの分解物を
分析したクロマトグラムである。
て分解し、高速液体クロマトグラフィーで分析したクロ
マトグラムを示し、（１）が２−アセトアミド−２−デ
オキシ−４−Ｏ−（２−アミノ−２−デオキシ−β−D
−グルコピラノシル）−D −グルコース標品を分析した
ときのクロマトグラムであり、（２）が本発明の化合物
をエンド型キチナーゼによって処理したときの分解物を
分析したクロマトグラムである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 森 隆 茨城県つくば市松代５丁目９番地５ 626−２ (72)発明者 濱松 潮香 茨城県つくば市竹園１丁目13番２ 803 棟202号 (72)発明者 林 清 茨城県土浦市乙戸南１丁目５−３ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07H 15/203 C12P 19/26 (54)【発明の名称】 ｐ−ニトロフェニル ２−アセチルアミノ−４−Ｏ−（２−アミノ−２−デオキシ−β−Ｄ − グルコピラノシル）−２−デオキシ−β−Ｄ −グルコピラノシドおよびその塩並びにその製造 法
Claims (3)
- 【請求項１】 下記の式（１）で表されるｐ−ニトロフ
ェニル ２−アセチルアミノ−４−Ｏ−（２−アミノ−
２−デオキシ−β−D −グルコピラノシル）−２−デオ
キシ−β−D −グルコピラノシドまたはその酸付加塩。 【化１】 - 【請求項２】 キチン２量体のｐ−ニトロフェニル誘導
体にコレトトリカム・リンデムチアナムＡＴＣＣ５６６
７６株由来の脱アセチル化酵素を作用させることを特徴
とする請求項１記載のｐ−ニトロフェニル ２−アセチ
ルアミノ−４−Ｏ−（２−アミノ−２−デオキシ−β−
D −グルコピラノシル）−２−デオキシ−β−D −グル
コピラノシドまたはその酸付加塩の製造法。 - 【請求項３】 キチン２量体のｐ−ニトロフェニル誘導
体が、ｐ−ニトロフェニル−ジ−Ｎ−アセチル−β−D
−キトビオシドである請求項２記載の方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9156091A JP3062591B2 (ja) | 1997-05-30 | 1997-05-30 | ｐ−ニトロフェニル ２−アセチルアミノ−４−Ｏ−（２−アミノ−２−デオキシ−β−Ｄ −グルコピラノシル）−２−デオキシ−β−Ｄ −グルコピラノシドおよびその塩並びにその製造法 |
| US08/900,819 US5994520A (en) | 1997-05-30 | 1997-07-25 | p-Nitrophenyl 2-acetylamino-4-O-(2-amino-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-2-deoxy-β -D-Glucopyranoside and its salts, and method for producing them |
| KR1019970038012A KR100269708B1 (ko) | 1997-05-30 | 1997-08-08 | P-니트로페닐2-아세틸아미노-4-O-(2-아미노-2-데옥시-β-D-글루코피라노실)-2-데옥시-베타-D-글루코피라노시드 및 그 염과 그 제조방법. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9156091A JP3062591B2 (ja) | 1997-05-30 | 1997-05-30 | ｐ−ニトロフェニル ２−アセチルアミノ−４−Ｏ−（２−アミノ−２−デオキシ−β−Ｄ −グルコピラノシル）−２−デオキシ−β−Ｄ −グルコピラノシドおよびその塩並びにその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10330392A JPH10330392A (ja) | 1998-12-15 |
| JP3062591B2 true JP3062591B2 (ja) | 2000-07-10 |
Family
ID=15620120
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9156091A Expired - Lifetime JP3062591B2 (ja) | 1997-05-30 | 1997-05-30 | ｐ−ニトロフェニル ２−アセチルアミノ−４−Ｏ−（２−アミノ−２−デオキシ−β−Ｄ −グルコピラノシル）−２−デオキシ−β−Ｄ −グルコピラノシドおよびその塩並びにその製造法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5994520A (ja) |
| JP (1) | JP3062591B2 (ja) |
| KR (1) | KR100269708B1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101956421B1 (ko) * | 2012-09-03 | 2019-03-08 | 갈릴레오 트라익스 엘티디. | 싱글모션 잠금해제기구를 갖춘 자유회전, 자유조향 접이식 다단 트라이시클 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5219749A (en) * | 1991-10-09 | 1993-06-15 | Institute For Molecular Biology & Biotechnology/Forth | Process for isolating and preparing purified chitin deacetylase |
| US5602020A (en) * | 1992-02-27 | 1997-02-11 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Thermostable, salt tolerant, wide PH range novel chitobiase |
-
1997
- 1997-05-30 JP JP9156091A patent/JP3062591B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-25 US US08/900,819 patent/US5994520A/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-08-08 KR KR1019970038012A patent/KR100269708B1/ko not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101956421B1 (ko) * | 2012-09-03 | 2019-03-08 | 갈릴레오 트라익스 엘티디. | 싱글모션 잠금해제기구를 갖춘 자유회전, 자유조향 접이식 다단 트라이시클 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR100269708B1 (ko) | 2000-10-16 |
| US5994520A (en) | 1999-11-30 |
| KR19980086365A (ko) | 1998-12-05 |
| JPH10330392A (ja) | 1998-12-15 |
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