JPH04507345A - Ｍｏｌｌｕｓｃからのグリコシダーゼを用いてオリゴ糖化合物を製造するための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＭＯＬＬＵＳＣからのグリコンダーゼを用いてオリゴ糖化合物を製造するための 方法 〔技術分野〕 本発明は、オリゴ糖化合物を酵素合成するための方法に関する。ここで言うオリ ゴ糖とは、複合糖質の糖鎖部分のフラグメント或いはその類似体から構成されて いてもよいし、複合糖質の糖鎖部分のフラグメント或いはその類似体であっても よい。更に、本発明は、本方法によって製造された生成物の利用に関する。

〔背景技術〕

種々の複合糖質（特に、糖脂質や糖蛋白）のオリゴ糖部分がｉｎ　ｖｉｖｏで多 くの重要な因子となっていることか見出されている。（Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　 Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ、　ｖｏｌ、　２．　Ｇａｎｓｂｕｒｇ　ｅｌａｌ、 、　Ｗｉｌｅｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８４：　Ｔｈｅ　Ｇｌｙｃｏｅｏｎ ｉｕｇａｔｅｓ、ｙｏｌ。

１−Ｖ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　ＰｒｅｓＳ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｌｋ；　Ｓ、　ｌ１ ａｋｏｌＩｌｏｒｉ、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、ｖｏｌ、５０．　ｐｐ、７３３−６４）；　Ｆｅ１ｘｙ、　 Ｎａｔｕｒｅ、ｐｐｊ１４゜１９８５；　Ｓ、　Ｈａｋｏｍｏｒｉ、　Ｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｐｈｙｓｉｃｓ　ｏｆＬｉｐｉｄａ。

ｖｏｌ、　４２．　ｐｐｊ０９−３３）。他のものとして、以下のようなものが 見出されている。

御粘鎖構造は、糖蛋白の安定性、局在化、免疫原性、及び減成（ｄｅｇｒａｄａ ｔｉｏｎ）にとって重要である。

−糖鎖は、抗原決定基である（例えば、血液型抗原）。

−糖鎖は細胞表面に接着しているとき、病原体、蛋白質、ホレセプターとして作 用する。

御粘鎖は、腫瘍形成にとって重要である。これは、特異な糖鎖が癌関連抗原決定 基として見い出されているからである。

−複合糖質の糖鎖部分のより小さなシーケンス（二糖或いは三糖）のみが、たび たび完全な生物活性（例えばレセプター活性）に必要とされる。

大学や企業は、現在、生物学的に活性なオリゴ糖を開発するために、以下のよう な沢山の異なった分野で熱心に研究をしている。

一新しい診断法や血液型を診断する試薬−アフィニティーク口マトグラフィ−（ ａｆ［１ｎｉｌｙ　ｃｈｒｏｍａｔｏ−ｇｒａｐｈｙ）における非常に特異的な 物質−細胞に特異的な凝集剤 一医薬品のターゲツティング 一モノクローナル抗体、即ち、例えば癌に関連した構造に対して特異的な抗体 一治療 一特異的な糖鎖を有する細胞表面上でのバクテリアやヴイールスの付着を阻害す ることによって、抗生物質に代わるような新しいタイプの医療を開発すること− 植物の成長を刺激すること及び、病原体に対して保護すること 上記分野以外に考えられる将来の市場としては、生物学的に活性な糖鎖を基本と したファインケミカルを思い浮かべることが出来る。

〔発明の開示〕

約１０種類の単糖が複合糖質の糖鎖部分に含まれている。

これらは、Ｄ−グルコース（Ｇｌｃ）、Ｄ−ガラクトース（Ｇ三ｌ）、Ｎ−アセ チル−Ｄ−グルコサミン（ＧＩｃＮＡｃ）　、Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅ ｕ５Ａｃ）　、Ｄ−７ンノース（Ｍａｎ）、Ｌ−フコース（Ｆｕｃ）、Ｎ−アセ チル−Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、キシロース（Ｘｙ　ｌ）　、及び 、アラビノース（Ａｒｘ）である。（括弧内の略号は、１υＰＡＣ−ＩＵＢに抄 録された単糖の用語である。

Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、ｖｏｌ、２５７．　１１１１．３３４７−３３５４ ．　１９８２．オリゴ糖シーケンスを記述するために本明細書中で用いた命名法 を該論文中に見い出すことが出来る）。可能な構造の数はほとんど無限に大きく なる。これは、アノメリック配位及びＯ−グリコシド結合の位置の両方が多様な ためである。

これらの糖鎖構造を合成するために、今日用いられる有機化学的手法は、多数の 合成ステップと高価な触媒を用いた広範な保護基の化学を必要とする。これらの 複雑な反応スキームで得られるのは、低い総収率であり、この手法は特に、大量 の仕事には不利である。

酵素は、例えば、高い立体選択性、位置選択性、及び基質選択性に加え、温和な 条件下での高い触媒活性のような、多くの魅力のある性質を持った自然界に特有 の触媒である。従って、今日、有機化学的な方法論によるよりも少ない反応ステ ップで、そして結果的に高い総収率で、オリゴ糖の大量で選択的な合成に酵素を 用いることができるという大きな期待がかけられている。

加水分解酵素（グリコシダーゼ、ＥＣ３，２）と糖転移酵素（ＥＣ４，２）の両 方が、合成に用いられる（グリコシダーゼＮｉ＋ｈｉｒａｖｘ　ｅｌ　ａｔ、ｉ ｎ　”Ｔｈｅ　Ｃｕｂｏｈｙｄｒｘｌｒｓ、Ｃｈｓｍｉｓｌ＋ｙ　ａｎｄＦｉ： ａｃｈｅｃｉｓ（ｔｌ”　、２ｎｄ　ｅｄ、、ｙｏｌ　ＩＩＡ、ｐｐ、２４２− ２９０．　Ａｃａｄｅｍｉｃｈｒｓｈ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９７０を参照） 。

グリコシダーゼでは、逆加水分解（ｔｓｙｅｒｕｄ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉ＋）（ 平衡反応）、又はｌ・ランスグリコジル化（（「３０＋ｇｌｙｃｏｓｙ−ｌａｌ ｉｏ１１）　（動力学的反応）が、合成を達成するのにしばしば用いられる（例 えば、Ｋ、　Ｇ、１．　Ｎｉ１ｉｓｏｎ、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、　Ｒｓｔ、。

ｙｏｌ、１６７、ｐｐ、９５−１０３．　１９８７．７＋ｅｎｄ＋　ｉｎ　Ｂｉ ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、。

ｖｏｌ、　６．　ｐｐ、２５６−２６４．　１９８８を参照）。

逆加水分解：　Ｄｏｈ　＝　ＨｏＡ：；プＤＯＡ〒Ｈ汐（ＤＯＨは供与糖であり 、ＤＯＲはα又はβグリコシドでアグリコン（＝Ｒ）と結合した供与糖であり、 ＩＯＡは受容糖であり、ＥＨは酵素である） 転移酵素では、ヌクレ万チド糖（ｎｕｃｔｅｏｌｉｄｅ　ｓｕｇａｒ）　（ＩＩ ＤＰ−Ｇａｌ　、ＣＭＰ−Ｓｉａ　、υＤＰ−ＧａｌｆｌＡｃ、　ＧＤＰ−Ｆｕ ｃ　、　５ｌｅ）が、相対的に高価ではあるが、供与体として用いられる。更に 、グリコシダーゼは豊富にあり、しばしば精製せずに直接に用いられる。しかし 、不利な点は、相対的に低い収率にあり、誤って生成した異性体が時々得られる 。従って、かなり１−６結合（即ち、受容体の一級水酸基に結合した）の形成が 起こる。

これに対して、複合糖質で一般的である１−２，１−３、及び１−４結合は、そ れ程多くは得られない。

本発明は、以前にグリコシダーゼでは合成されていないオリゴ糖の合成を可能に する。本方法の鍵は、ｍｏｌｌｕｓｃ（例えば、いかや、はまくりや、からす貝 ）及び、特に、Ｖｅｎｅｒｉｄａｅ科の二枚貝（例えば、Ｖｅｎｕｉ　ｖｅ＋ｕ ｃｏｓａ、　Ｃｈａｍｅｌｅａ　ｇａｌｌｉｎａ。

Ｔａｐｅｓ　ｐｕｌｌａｓｒｔａ、丁ａｐｅ＋　ｄｅｃｕｓ＋ａｌｕｓ）、　Ｍ ７１ｉ１ｉｄａｅ　、Ｏｓｌ＋ｅ−ｉｄａｅ、　Ｐｅｃ＋ｅｎｉｄａｅ、及び、 ５ｏｌｅｏｉｄａｅからのグリコンダーゼを用いることである。例えば、Ｃｈａ ｍｅｌｓａ　ｇａｌｌｉｎｇは、平衡反応、又はトランスグリコジル化反応で生 物学的に活性な糖鎖の合成を触媒する大量のグリコンダーゼを含有している。

基質は合成されるオリゴ糖を考慮して選択される。そして、基質は、時には市販 品として入手可能か、又は、有機的な方法や酵素法によって合成されるので、本 発明の使用を制限しない。本発明に記載の供与体と受容体は、以前のトランスグ リコジル化反応で使用されたものと同様である（例えば、上記ｐ４に示した、Ｃ ａ篩ｏｈｙｄｒａ＋？Ｒｅｓ、ｖｏｌ、１６７、及びＴｒｅｎｄｓｉａ　ＢＩｏ ｌｅｃｈｎｏＩｏｇ７　ｙｏｌ、６中のＸ、　Ｇ、　１．　Ｎｉ　ｌ５ｓｏｏの 文献を参照）Ｄ本発明に記載の方法に用いられる受容体の例は、単糖、三糖、又 はオリゴ糖（或いは、それらのグリコシド）を挙げることが出来る。これらのう ち、糖鎖部分は以下の単糖を一つ又はそれ以上含んでいる。即ち、Ｄ−グルコー ス、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−アセ チル−Ｄ−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、及びＬ−フコー ス、又は、これらの類似体である。

受容体かグリコンドであるとき、アグリコンは、脂肪族或いは芳香族化合物とグ リコシド的に（αまたはβ配位）結合［。

でいる（例としては、メチル、エチル、２−ブロモエチル、（ＣＨ２）　ｎＣＯ ＯＭ　ｅ、ｎ　＞　１、アリル又は高分子化できる他の物質、ベンジル、ペンテ ニル、トリメチルシリルエチル、アミノ酸、アミノ酸の誘導体、ペプチド、ペプ チドの誘導体、ニトロフェニル、ｃｌｃ　）。受容体として用いられる三糖の例 は、ラクト−ス、Ｇ！ｅＮＡｃＢｌ−３Ｇａｌ、Ｇａｌαｌ−４Ｇａｌ、１＋！ ａｎαｌ−２Ｍａｎ、　ＧｘｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌ、及び、上述したものの０ −１Ｎ−１Ｃ−或いはＳ−グリコンド（α又はβ配位）である。

特に興味のある他のタイプのアグリコンは、アミノ酸（セリン、スレオニン、ヒ ドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、アスパラギン、ｅｌｃ　）　、ペプチド 、脂質、及び、これら三種類の物質の誘導体或いは類似体である。アミノ酸やペ プチドのグリコシドは、ペプチド合成に一般に用いられる保護基（ＦＭＯＣ，Ｃ Ｂ２　、ＢＯＣ、ｅｔｃ　）でそれらのアミノ基及び／又はカルボキシル基を保 護され得る。このようなアグリコンを用いることによって、複合糖質のフラグメ ントや類似体が本発明に従って合成される。更に、アグリコンは、アミノ基、ニ トリル基或いはアミド基、又は、蛍光原物質であり、ホスフェート、サルフェー ト或いはカルボキシル基、またはそれらの誘導体を含んでいてもよい。本発明に 記載の受容体は、１位以外の一つ或いはそれ以上の位置で派生した糖からなって いてもよい。このような派生は、例えば、一つ或いはそれ以上の水酸基が水素又 は有ａ基で置換されていることを意味する。このような受容体の例には、ｐ−ニ トロフェニル−２＝デオキシ−α−Ｄ−ガラクトビラノンドがある。他の重要な タイプの糖は、環内の酸素（即ち、ヘキソースのＣ−５位の酸素）が硫黄や窒素 等によって置換された化合物からなる。

グルコースの誘導体であるモラノリン（ｍｏｒａｎｏｌｉｎｅ）は、Ｃ−５位の 酸素が窒素で置換したこのような誘導体の例である。

この様に、酵素や蛋白に結合した糖鎖に対して効果的な阻害剤となるオリゴ糖類 似体は、本発明に従って合成される。

受容体としてアルキルグリコシド（例えば、メチルグリコシド、オクチルグリコ シド、ドデシルグリコシド）を用いて得られる生成物は、アフィニティークロマ トグラフィー又は凝集試験の阻害剤として用いられたり、引き続き行なう酵素合 成や有機合成の構造単位等として用いられる。ニトロフェニルグリコシドは、例 えば、Ｐｄ／Ｃで簡単に還元されてアミノフェニルグリコシドになる。このもの は、直接に、或いは、化学的な修飾をした後に、種々のポリマー（アガロース、 セルロース、デキストラン、ポリエチレングリコール、シリカ等）だけでなく、 酵素、ペプチド脂質、又はそれらの誘導体等に共有的に結合する（Ｍｓ＋ｈｏｄ ＋　ｉｎ　ＥｎＢｍｏｌｏｇｙ、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ｖｏｌｕｍｅｓ 　３４．４４．　５０．　１０４）　ｏ更に、アミノ基は、ジアゾ基、Ｎ−ブロ モアセテート、イソチオンアネートのようないくつかの他の反応性に富んだ基に 容易に変換できる。直接に又は化学的に修飾した後に、上述したのと同じ方法で 、アミノフェニル基をいわゆるスペーサーアーム（ｓｐａｃ！＋　ａｒ＋ｎ）と して用いたり（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｉｍｏｌｏｇｙ、ｙｏｌ、３４） 、本発明に記載のアグリコンとして用いたりすることが出来る他の基には、例え ば２−アミノエチルと６−アミノヘキシル、２−ブロモエチル、２−　（２−カ ルボメトキシエチルチオ）基、又はそれらの誘導体がある。例えば、２−ヒドロ キシエチルメタアクリレートのような重合可能なアグリコンを持ったグリコシド も受容体として用いられる。Ｎ−グリコシドで結合したアグリコンの例としては 、６−アミノカプロン酸アミド（−ＮＨＣＯ（ＣＨ）ＮＨ２）が挙げられる。

本発明に記載の方法に用いられる供与体は、酵素を用いたトランスグリコジル化 を含んだ以前の方法で使用された供与体と同じであり（上記ｐ３の文献を参照） 、本発明の範囲を制限するものではない。

本発明に記載の方法に用いられる供与体の例は、単糖、三糖、又はオリゴ糖（或 いは、それらのグリコシド）を挙げることが出来る。これらの内、糖鎖部分は単 糖、即ち、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｎ−アセチル ノイラミン酸、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコ サミン、及びＬ−フコースの一つ又はそれ以上を含んでいる。適当なグリコジル ドナー（ｇｌｙｃｏｓｙｌｄｏｎｏｒ）の例としては、上記単糖のニトロフェニ ルのα又はβ誘導体、ラクト−ス、ジマンノース、及びラフィノースが挙げられ る。エンドグリコンダーゼに対する適当な供与体の例としては、生物学的に活性 な糖鎖シーケンスのニトロフェニル誘導体（例えば、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡ ｃβ−０Ｐｈ町−ｐ）、生物学的に活性なオリゴ糖、又は、Ｇｌｃ　（βｌ−３ Ｇｌｃ）　β１−３ＧＩｃ　（ｎ＞１）のタイプの構造をしたものが挙げられる 。

反応混合物中でのグリコジル供与体の濃度は合成されるオリゴ糖の観点から選択 され、そして酵素の性質の観点からも選択される。従って、本発明の使用を制限 しない。一般に、供与体が受容体としても作用するというリスクを（もしこれが 望まれていなければ）最小限にするために、小量ずつ供与体を加えることは有利 である。

酵素は、まず第一に合成されるオリゴ糖の観点から選ばれる。酵素は自然に存在 するままの状態で用いられるか又はそれらを部分的に、或いは完全に精製した後 に用いられる。酵素は可溶な形で用いられるか、又は例えば、吸着、カプセル化 、キレーンヨン、沈殿、或いは、共有結合によって固体支持体に固定することに よって用いられる。

本発明に従って用いられるα−及びβ−グリコシダーゼの例は、Ｄ−マンノシダ ーゼ、Ｄ−ガラクトシダーゼ、Ｌ−フコシダーゼ、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクト サミニダーゼ、ヘキソサミニダーゼ、及び、ＥＣ群３．２のグリコシダーゼ（酵 素命名法、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐ＋ｅｔ＋、１９８４）である。エンド及びエキ ソグリコシダーゼの両方が本発明に記載の方法に用いられる。

使用される酵素の純度の程度は厳密ではない。酵素は、自然の生物学的環境に依 存するままの状態で、又はそのようなな環境から部分的に或いは完全に単離され た後に用いられる。

生物体やその組織からの粗製抽出物も用いられる。酵素は、例えば硫酸アンモニ ウムを用いて沈殿させた後に用いることもできる。酵素は結晶形で存在でき、又 、ミセルに封入することもできる。生物化学の文献はグリコンダーゼの精製や単 離に関する詳細な解説に富んでいる。酵素は組換え技術で製造され得る。従って 、もし望むならば、例えば熱的安定性、触媒の効率、及び／又は位置選択性の様 な酵素の性質を最適化するために、酵素のアミノ酸シーケンス中のアミノ酸の一 つ或いはそれ以上のアミノ酸を変化させ得る。

酵素は可溶型で用いてもよく、又は、例えば、吸着、カプセル化、キレ−ジョン 、沈殿、或いは、共有結合で、プロトン性溶媒や非プロトン性溶媒に溶けない高 分子物質又は固体支持体に固定することによって用いてもよい（Ｍｅｔｈｏｄｓ 　ｉｎＥｎＢｍｏｌｏｇｙ、　ｖｏ１４４　）　ｏ選択される形態は、本発明を 制限するものではない。酵素が可溶型で用いられるとき、有機共溶媒中での熱的 安定性、又は有機共溶媒中での安定性を増加させるために、酵素は最初に適当な 方法で化学的に修飾される。

例えば、アガロース、セルロース、ヒドロキシエチルアクリレート、ガラス、シ リカ、ポリアクリルアミド、ポリアクリレートベースのプラスチックなどを具備 した不溶性ポリマーに固定化された酵素は、反応混合物から容易に分離すること ができる。従って酵素は再利用できる。更に有利な点は、多くの場合、温度の増 加や有機共溶媒に対して確かな安定性が得られることである。

本発明に従った金製法は、例えば、ｐＨ１緩衝剤（ｂｕｙｅｒ）のタイプ、温度 及び反応剤の濃度によって非常に多様な条件で行なわれ得る。種々の共溶媒（ア セトニＩ・ジル、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルホルホキント、ジオ キサン、エタノール、エチレンゲルコール、メタノール、ピリジン、テトラヒド ロフランなと）を用いることができる。また、これらは、水と共にいろいろな濃 度で用いられる。更に、反応は二層系、即ち、水−有機溶媒（クロロホルム、シ クロヘキサン、塩化メチレンなど）中で行なわれる。次いで、酵素は逆ミセル中 に封入される（Ｐ、Ｌｕ１ｓｉ、Ａｎｇｅｗ、Ｃｈｅｍ、、ｖＯｌ、９７゜ｐｐ 、４９９−６０．　１９８５　）。反応は沈殿させた酵素を用いて有機溶媒中で も行なうことができる（Ｋａｚａｎｊｉａｎ　ｅｌ　ａｌ、ｌ、　＾ｍｅｒ。

Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、、ｖｏｌ、１０７１．９８５）　。反応条件は制限されな いが、主として、当該反応に使用される反応剤の性質や実用性に基づいて反応条 件が選択される。例えば、酵素を室温で用いることが通常は便利であると言える 。また、水か豊富な系ではｐＨは通常４−１１の範囲である。有機共溶媒は加水 分解の副反応を最小限にするために用いられる。同様な理由で二層系が用いられ る。しかし、ある場合には、共溶媒を加えない水中でかなり高い収率が得られる 。

温度も生成収率や酵素の安定性に影響するように変化させ得る。頻繁に用いられ る温度は５−５５℃の範囲にあるが、より高い温度が、熱的に安定な酵素や、例 えば高い基質濃度で熱的変性に対して安定化された酵素を用いる（　Ｊｏｈａｎ ｓｓｏｍｅｔ　ａｌ、Ｂｉｏｊｚｃｈｎｏｌ、Ｌｅｔｔ、８　（１９８６）　４ ２１−４２４）ときに使用される。例えば、高い温度を用いたときの利点は、高 い基質濃度を用い得ることにある。これは水の活性を低下させ、生成物の収率を 増加させる。他の利点は酵素の活性が増加することである。このことは増加させ た温度で、反応時間をより短くすることを意味する。温度を上げることによる一 つの利点は、例えば、室温でゆっくり加水分解するメチルグリコシドやエチルグ リコンドのようなグリコシドが、増加させた温度（５０−６０°Ｃ）で適当なグ リコジルドナーとして使用できることである。温度の下限は、反応系中での酵素 の熱的安定性で決定される。幾つかのトランスグリコジル化では、より低い温度 の方が高収率でグリコシド生成物を与えることが見出されている。

通常は、最大の収率て生成物を得るために、相対的に高い濃度で供与体と受容体 を用いる。これは、通常、０．１−ＩＭの濃度のニトロフェニルグリコシドと０ ．２−７Ｍの濃度のメチルグリコシドを意味する。一般に、反応混合物をその沸 点付近で短く加熱し、３７−７５°Ｃ（酵素の熱安定性に依存する）に溶液を放 冷し、さらに酵素を加えることによって、高濃度の物質が得られる。共溶媒は、 疎水性のアグリコンを持ったグリコシド、例えばニトロフェニルグリコシドの溶 解性を増加させるために加えられる。

反応は、ＴＬＣやＨＰＬＣよって、或いは、遊離したアグリコンの分光学的な測 定（例えば、ｐ−ニトロフェノール、４００ｎｍ　）によって追跡する。生成物 であるグリコシドの最大収率が得られたとき、ｐＨを変化させ酵素を変性させる ことにより、温度を上げることにより、及び／又は、有機共溶媒（エタノールの ような）を加えることによって反応を終了させる。８０−８５℃で３−５分加熱 し、次にエタノールを約８０％の濃度まで加えることで通常十分である。

いろいろなテクニックが生成物を単離するのに用いられる。

例えば、エタノールのような有機溶媒を用いた沈殿が有効である。特に、反応剤 の一つが過剰に用いられているときや、ドナー、アクセプター、或いは生成物が 異なった溶解性を持っているときに有効である。平衡制御合成（ｅｑｕｉｌｉｂ ｒｉｕｍｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　５７ｎｌｈｅｓｉｓ）またはトランスグリコジ ル化の後、及び、上述のような加熱処理や反応混合物の希釈の後、第二のグリコ シダーゼを加えることか有用である。このグリコシダーゼは合成に用いられたグ リコシダーゼと異なった位置選択性を持つものである。この方法では、不必要な 異性体（例えば１−６結合を持ったもの）が多少選択的に加水分解される。この ことは請求める生成物の単離を容易にさせる。沈殿と副生成物の加水分解は補助 的なものであり、クロマトグラフィー（吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過、例 えばＳ！ｐｈａｄｅｘ　ＧＩＯ−Ｇ２５を用いたもの、ＨＰ　Ｌ　Ｃ，例えばア ミノ−シリカ、逆相シリカ、又はｎｅｗ　Ｄｉｏｎｅｘカラムを用いたもの）に かけられる。例えば、有効であるのは、溶出液として塩化メチレン；メタノール ：水（例えば、６　：　４　：　１　；　ｖ／ｖ／ｖ　）を用い、固相にシリカ を使用したカラムクロマトグラフィーを行ない、次に、減圧下に乾燥し、更に部 分的に精製された生成物であるグリコシドを無水酢酸とビ１ノジン（例えば１： １；ｖ／ν）でアセチル化することである。次のカラムクロマトグラフィーステ ップ（シリカ、例えば、酢酸エチル、イソオクタンのような溶出液）で通常、純 粋なアセチル化物が得られる。疎水性のアグリコン（例えば、ニトロフェニルオ リゴ糖）を持った生成物の単離は、分取ＨＰＬＣ装置やＣ１８−シリカを用い一 段階で行なわれる。

本発明に従う合成方法は、一般に、複合糖質に含まれるオリゴ糖シーケンスの合 成に応用できる（上記ページ１の文献に与えられている構造や、以下の表に与え られている構造を参照）。特に興味のあるものは、生物学的な活性を移入するの に十分な、これらの構造の最小のフラグメントであり、平衡またはトランスグリ コジル化反応でのドナーとアクセプターの選択はこれによって決定される。

興味の持たれている構造は、血液型決定基、癌関連オリゴ糖構造、及び、生物学 的なレセプター活性を持った構造である（上記ベージ１の文献を参照）。

部分合成や全合成に興味が持たれている生物学的に活性な糖鎖の例は以下の表に 見い出される 表１（糖脂質糖鎖構造の例） Ｎｅｕ５Ａｃａ２−３　Ｇａ１１３１−３　Ｇａ１ＮＡｃβ１−４　Ｇａｌβ１ 　＝４Ｇｌｃ（３１−ＩＣｅｒ　ＧＭ１ｂＮｅｕ５Ａｃα２−８　Ｎｅｕ５Ａｃ ｃ＋；Ｇａ１ＮＡｃ（３１−３Ｇａ１ｃｃ１−４　Ｇａ１１３１−４　Ｇｌｃβ ｉ　−ｉ　ｃｅｒ　り”０　オパシト°゛ラクト系 ＦＬＩＣＣＥｌ　−２Ｇａ１（３１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３　Ｇａｌβ１−４ 　Ｇｌｃβ１−　Ｉ　Ｃｅｒラクトフコべ〉２才レルｖｃ、ｔ’ｒ ＧａｌＮＡｃｃｃｌ　−３Ｇａｌβ１−３　Ｇａｌβ１−４　Ｇｌｃβ１−Ｉ　 ＣｅｒＧａｌａｌ　−４Ｇａｌβ１−　Ｉ　Ｃｅｒ　ケ゛′ラビオー人表２（グ リコプロティンのＮ−または 〇−結合した糖鎖構造の例） オリゴマンノシド型 複合（Ｎ−アセチルラクトースアミン）型ＮｅｕＳＡｃｔＬ２−６　Ｇａ１１３ １−４　ＧｌｃＮＡｃｐｌ−２ＭａｎｃＬ１ハイブリッド型 噛り Ｎｅｕ５Ａｃｃｔ２ 表３（ヒトの血液型構造の例） 血液型　構造 ＨＦｕｃα１−２Ｇａｌ１３１− ｐ　Ｇａ１ａ１−４Ｇａｌｆ３１−４ＧｌｃＮＡｃ１３１−３Ｇａｌｆ３１−４ Ｇｌｃ［３１−ｐ　Ｇａ１ＮＡｃＢ１−３Ｇａｌａ１−４ＧａｌＢ１　：　４Ｇ Ｉｃ１３１−ｐ）（Ｇａ１ｃｔ１−４Ｇａｌａ１−４Ｇｌｃ（３１−ｐ　Ｇａｌ 　８１−４Ｇｌｃ１３１− 表４（癌に関連した糖鎖構造） Ｇａｌα１−４Ｇａｌ１３１−４Ｇｌｃｊ３　Ｇ　ｂ　Ｂｕ＋ｋｉｔ＋リンパ腫 Ｌｅ　結腸直腸 Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ癌 Ｇａｌβ１−３　Ｇａ１ＮＡｃａ　Ｔ抗原　種々の癌 ＧａＩＮＡｃａｉ−３ＨｅＸ−ＨｅｘＮＡｃ、、　血液型９　血液８８及“様の 抗原　０−の個体 Ｎｅｕ５Ａｃａ２−８　Ｎｅｕ５Ａｃｃ＋２−３　Ｇａｌβ１−４　Ｇｌｃ　（ Ｇ　Ｄ　３　）　ヒトメラノーマ Ｎｅｕ５Ａｃα２−３　Ｇａ１ｐ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ　Ｓ　 ロー　Ｌ　ｃ　’　結腸膵臓株（生物）／感染付着部位　示唆された特異性Ｅ、 ｃｏｌｉ　タイプ１線毛　ヒト ヒト尿管Ｆ−線毛　Ｇａ１ａ　ｌ−４Ｇ１１β−０ヒト尿管Ｘ−線毛　ＮｅｕＡ ｔ　ａ　２−Ｇａ　ｌ　。

ＧｌｃＮＡｃβ１−０− に８８豚、小腸　Ｇｚｌαｌ−３Ｇｘｌ−Ｃ１−ＯＫ９９．牛、小腸　ＧｘｌＮ ｘｃ　、　ＮｅｕＡｅ赤痢菌毒素　Ｃａｌαｌ−４Ｇａ　ｌ−末端位置Ｓ、　５ ａｐｒｏｐｈ７１ｉｃｕｓヒト尿管　Ｇｔｌβ１−４Ｇｌｃ　ＮＡｃβ−０゜Ｇ ｌｅ　ＮＡｅβｌ−４Ｃ１ｅＮＡｃ−ＯＨ３，ｐｎｅｕｍｏｃｏＣｃｕｓヒト呼 吸管　Ｃ１ｃ　ＮＡＣβｌ−３Ｇａｌβ−０インフルエンザウィルス ヒト呼吸Ｍ　Ｎｕ＋Ａｅ−Ｇ１１ ビブリオコイレラ及び　Ｇｅｌβｌ−１−３ＯＮＡｃβ１−４ｆ；ｇ　ｌβ１− ４Ｇ　ｌ　ｃ　（Ｇ　Ｍ　ｒ　）ｐｉ１口ｌｅｄ　ｇｏｎｏｅｏｃｃｕｓ　３膓 ／ヒト尿管 ｒｕＡｅ 以下の実施例において、実施に当り本発明をいかに使用することができるかにつ いてのいくつかの例を説明する力（これらは、本発明の範囲を限定することを意 図するものでは全くない（略号は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの推奨に従う、Ｊ、　Ｂ ｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、。

ｖｏｌ、　２５７．　ｌ１ｌ）、　３３４７−３３５４．１９８２）　。

実施例 軟体動物カメレア・ガリナ（Ｃｈａｍｅｌｅａ　ｇａｌｌｉｎａ）を南スペイン の地方店で入手した。肝臓をホモジナイズし、蒸留水で抽出し、上澄み中の物質 をレグレロ（Ｒｅｇｌｅｒｏ）及びカベザス（Ｃａｂｅｚａｓ）により記載され ている通り　（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

ｖｏｌ、　６６、　ｐｌ）、　３７９−３８７．１９７６）、硫酸アンモニウム で分別した。沈澱物を以下の実施例に記載されている合成に使用した。

以下の実施例における反応に続けて、１（ＰＬＣ（溶出剤アセトニトリル−水； 　７０　：３０；　ｖ７ｖ；吸着剤としてアミノ−シリカ）及び遊離したニトロ フェノールのｉＬ（４０５ｎｍにおける吸光度）の測定を行なった。溶媒は、回 転蒸発器で５　ついで低圧下で除去した。生成物は、カラムクロマトグラフィー （セファーデックスＧＩＯで、ついで半分数ＨＰＬＣ、溶出剤水−アセトニトリ ル：　３０−７０．　Ｖ／Ｖ；吸着剤としてアミノ−シリカ）により単離し、エ タノールから結晶化させた。生成物は、ＮＭＲ（１３Ｇ及びｌＨ−スペクトル） で特性決定した、実施例　１ メチル　３−Ｏ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシ ル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＧＩｃＮＡｃβ１−３Ｇａ　Ｉβ−（１Ｍ ｅ　）の合成：　ＧＩｃＮＡｃβ−０ＰｈＮ０２−１）　（０。

３４ｇ）、Ｇａｌβ−ＯＭｅ（２，０ｇ）及び０．０３Ｍクエン酸ナトリウム／ ホスフェートバッファ　（２０ｍｌ）（ｐＨ５，８）の混合物に、Ｎ−アセチル −β−Ｄ−グルコサミニダーゼを含有したカメレア・ガリナからの上記（「実施 例」参照）硫酸アンモニウム沈澱物（１００ｍｇ）を加えた。この混合物を３７ ℃で穏やかに攪拌した。８０時間後、ｓｏ’ｃで約５公開加熱することにより反 応を停止させた。上記した（ｒ実施例」参照）通りセファーデックスＧＩＯ及び Ｉ（ＰＬＣを用いた生成物の単離により、ＮＭＲで特性決定された結晶性生成物 を得た。

実施例　２ ＧＩｃＮＡｃβ１−６Ｍａｎα−ＯＭｅの合成：　この物質は、基質としてＧｌ ｃＮＡｃβ−０ＰｈＮ０２−ｐ　０　、６８　ｇ及びＭａｎ　ａ　−ＯＭｅ　２ 　ｇを用い、反応を上記バッファー１９ｍ１及びＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド １ｍｌ中で行なった以外は、実施例１と同様に合成し、単離した。室温で６５時 間後、反応を上記の通り停止させ、生成物を上記の通り（「実施例Ｊ参照）セフ ァーデックスＧＩＯ及びＨＰＬＣで単離した６　生成物をＮＭＲで特性決定した 。

実施例　３ ＧｌｃＮＡｃβ１−６Ｇａｌ　ａ　−ＯＭｅ　（メチル　６−Ｏ−（２−アセト アミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−α−ガラクトピラノシド ）の合成：　この生成物の合成及び単離は、上記クエン酸塩／ホスフェートバッ ファー（ｐＨ５，８）１９ｍｌ及びＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドｌ　ｍ　Ｉ中 のＧｌｃＮＡｃβ−０ＰｈＮＯ２−ｐｏ　、　３４　ｇ及びＧａ［ａ　−ＯＭｅ 　２　ｇを用い、カメレア・ガリナからの硫酸アンモニウム沈澱物１００ｍｇを 月いて、ＧｌｃＮＡｃβ１．−３Ｇａｌβ−ＯＭｅについて上記実施例１に記載 したように行なった。室温で６５時間後、反応を実施例１におけるように停止さ せ、生成物を上記「実施例」の下で記載した通りセファーデックスＧＩＯで、つ いでＨＰＬＣにより単離した。

実施例　４ メチル　３−０−　（２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトオビ ラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｇａ　ｌ　ＮＡｃβ１．−３０ａｌ β−ＯＭｅ）の合成：　この構造は、リン酸ナトリウムバッフｙ　（ｐＨ５，８ ）２０ｍｌ中のＧａ１ＮＡｃβ−０ＰｈＮＯ２−ｐｏ　、　５　ｇ及びＧａｌβ −０１＋ｌｅ２．５ｇ並びにカメレア・ガリナからの硫酸アンモニウム沈澱物１ ００ｍｇを用いて、実施例１に記載したと同様に行なった。室温で５日後５反応 を上記の通り停止させ、生成物を上記の通りセファーデックスＧ】０で、ついで ＨＰＬＣにより単離した。

実施例　５ メチル　３−Ｏ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノ シル）−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｇａ１ＮＡｃ　ａ　１−３Ｇａｌ　ａ− ＯＭｅ）の合成：　この生成物の合成及び単離は、Ｇ　Ｉ　ｃＮＡｃβ１−３Ｇ ａｌβ−ＯＭｅについて実施例１に記載した通り硫酸アンモニウム沈澱物を用い 、但し、基質としてＧａ１ＮＡｃα−０ＰｈＮＯｚ　ｐ　（７０ｍ　ｇ　）及び Ｇａｌα−ＯＭｅ　（１ｇ　）を用いて行なった。

実施例　６ Ｆｕｃａ　１−８Ｇａｌβ−ＯＭｅの合成二　この合成は、基質としてＦｕｃａ −ＯＰｈＮ０２−ｐｏ　、　４　ｇ及びＧａｌβ−ＯＭｅ２ｇを用いてＯ、、０ ５Ｍ酢酸ナトリウムバッフｙ　（２０ｍ　ｌ、　ｐＨ５，５）中３７℃で、及び カメレア・ガリナからの硫酸アンモニウム沈澱物０，５ｇを用いた以外は、実施 例１と同様に行なった。７０時間の反応後、生成物を以下の手順で単離した：カ ラムクロマトグラフィー（セファーデックスＧＩＯ）　、三糖フラクションを蒸 発させ、アセチル化（ピリジン−酢酸）、キーセルゲル６０上のカラムクロマト グラフィー（溶出剤トルエン−酢酸エチル、　１：　１　；　Ｖ／Ｖ）　ｉ：よ り、精製アセチル化Ｆｕｅｌ−６Ｇａｌβ−ＯＭｅを得、これをナトリウムメト キシドで脱アセチル化して首記化合物を得た。

実施例　７ ＧｌｃＮＡｃβｌ−３Ｇａ　ｌβ−ＯＭｅの合成：　Ｇａｌβ−ＯＭｅ（１，４ ｇ＞を０．０４Ｍリン酸ナトリウムバッフｙ　（ｐＨ６，０）１ｍｌに、該グリ コシドを９５〜１００°Ｃで該バッファーに徐々に加えることにより、溶解し、 ５５°Ｃに冷却した後、収穀カメレア・ガリナから得た硫酸アンモニウム沈澱物 を加えた（スエーデン特許出願第８９０２７６７−６号参照）、５５℃で３４時 間後、９０℃で加熱することにより反応を停止させ、生成物をクロマトグラフィ ー（セファーデックスＧＩＯ及びアミノ−シリカ、）ＩＰＬｃ）により単離した 。

実施例　８ ＧａｌＮＡｃ　ａ　１−３Ｇａｌ　ａ−ＯＭｅの合成：　Ｇａｌα−ＯＭｅ　（ １ｇ　）を上記の通りリン酸ナトリウム／クエン酸塩バッファー（ｐＨ５，０） ］、　ｍ　ｌに溶解し、Ｇａ１ＮＡｃα−０ＰｈＮＯ，−ｏ　（５０ｍ　ｇ　） を加えた。

５５℃に冷却した後、頭殻製剤（６０ｍｇ）を加え１反応を上記実施例のように 行なった。

上記高基買濃度を用いた技術は、上記頭殻製剤を用いた、Ｆｕｃα１−６Ｇａｌ β−ＯＭｅ、　Ｇａ１ＮＡｃβ１＝３Ｇａｌβ−ＯＭｅ、ＧｌｃＮＡｃβ１−６ ＧａＩ　ａ−ＯＭｅ、ＧＩｃＮＡｃβ１−６Ｍａｎ　ａ−ＯＭｅ及び他のオリゴ 糖の合成に使用される。

国際調査報告 ＋ｈｌｙｈｒｈ。。＋ｌ　１１．。１ｌｆｌｌ１１゜、、６．　ＰＣＴ／ＳＥ　 ９０１００５３７国際調査報告

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．オリゴ糖または単糖、及び単糖またはオリゴ糖であるところの受容体物質、 またはオリゴグリシドまたは糖類似体から、複合糖中の糖鎖部分よりなるか、そ のフラグメントまたは類似体である複合糖化合物を製造するための方法であって 、軟体動物からの少なくとも１種のグリコシダーゼ（ＥＣ３．２）を使用し、及 びオリゴ糖化合物を反応混合物から分離することを特徴とする方法。
2. ２．ベネリダエ（Ｖｅｎｅｒｉｄａｅ）、ミチリダエ（Ｍｙｔｉｌｉｄａｅ）、 オストレイダエ（Ｏｓｔｒｅｉｄａｅ）、ペクテニダエ（Ｐｅｃｔｅｎｉｄａｅ ）またはソレニダエ（Ｓｏｌｅｎｉｄａｅ）科の１つからの少なくとも１種のグ リコシダーゼを用いることを特徴とする請求項１記載の方法。
3. ３．カメレア・ガリナ（Ｃｈａｍｅｌｅａ　ｇａｌｌｉｎａ）からの少なくとも １種のグリコシダーゼを用いることを特徴とする請求項１記載の方法。
4. ４．組換え技術によりクローン化され、そのアミノ酸配列において対応する軟体 動物酵素と少なくとも７０％の相同性を有する少なくとも１種のグリコシダーゼ を用いることを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１項記載の方法。
5. ５．供与体及び受容体中の糖鎖部分が、単糖Ｄ−グルコースＤ−ガラクトース、 Ｄ−マンノース、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミ ン、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン及びＬ−フコースの１以上を含有するか、 それらの類似体であることを特徴とする請求項１記載の方法。
6. ６．受容体グリコシドが、アグリコンがグリコシド結合した小麦粉またはＯ−、 Ｎ−、Ｃ−またはＳ−グリコシド結合脂肪族もしくは芳香族化合物であるところ のグリコシドであることを特徴とする請求項１記載の方法。
7. ７．グリコシダーゼ（酵素）が、エンドまたはエキソグリコシダーゼであること を特徴とする請求項１ないし６のいずれか１項記載の方法。
8. ８．酵素がα−または特異性を有する、ガラクトシダーゼ、マンノシダーゼ、Ｎ −アセチル−ヘキソサミニダーゼ、Ｎ−アセチル−グルエコサミニダーゼ、Ｎ− アセチル−ガラクトサミニダーゼ、フコシダーゼまたはシアリダーゼであること を特徴とする請求項１ないし７のいずれか１項記載の方法。
9. ９．酵素をインシトゥで、またはその天然生物学的環境から完全にもしくは部分 的に単離した後に使用することを特徴とする請求項１ないし８のいずれか１項記 載の方法。
10. １０．酵素が、沈澱、吸着、封じ込め、キレート化または共有結合により、プロ トン性溶媒または非プロトン性溶媒に不溶性であるポリマー物質またはその誘導 体に固定化されていることを特徴とする請求項１ないし９のいずれか１項記載の 方法。
11. １１．ポリマー物質が、多糖（セルロース、アガロース等）、プラスチック（ポ リアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリスチレン等）、共重合体、多糖 −プラスチッ久、シリケート、またはガラスよりなり、かつ活性化され、例えば シアネート、有機スルホネート、アルデヒド、ジアゾニウム、エポキシ、ジビニ ルスルホンまたはトリアジン基のような反応性基を含有することを特徴とする請 求項１ないし１０のいずれか１項記載の方法。
12. １２．物質Ｆｕｃα１−６Ｇａｌβ−ＯＭｅ、ＧａｌＮＡｃα１−３Ｇａｌα− ＯＭｅ、ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ−ＯＭｅ、ＧｌｃＮＡｃβ１−６Ｇａｌ α−ＯＭｅ、ＧｌｃＮＡｃβ１−６Ｈａｎα−ＯＭｅまたはＧｌｃＮＡｃβ１− ３Ｇａ１β−ＯＭｅの１つが合成される請求項１ないし１１のいずれか１項記載 の方法。
13. １３．直接または化学修飾後、アフィニティークロマトグラフィー、２相系にお けるアフィニティー分配、診断、治療、免疫感作、免疫学的特性決定、血液型の 判定、酵素活性の測定、組換え蛋白の修飾、性細胞上への影響または植物防御／ 成長機構の修飾における、または食品もしくは化粧品中の添加剤としての、請求 の範囲１ないし３項のいずれか１項に従って得られた生成物の使用。