KR100440237B1 - 써머스 칼도필러스 지케이24 균주 유래의베타-글라이코시데이즈를 이용한 갈락토올리고당의 합성방법 및 이 방법에 이용되는 써머스 칼도필러스 지케이24베타-글라이코시데이즈의 재조합 대량발현 시스템 - Google Patents

써머스 칼도필러스 지케이24 균주 유래의베타-글라이코시데이즈를 이용한 갈락토올리고당의 합성방법 및 이 방법에 이용되는 써머스 칼도필러스 지케이24베타-글라이코시데이즈의 재조합 대량발현 시스템 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고온균 써머스 칼도필러스 지케이24 (Thermus caldophilusGK24) 균주 유래 내열성 베타-글라이코시데이즈 (Thermus caldophilusGK24 β-glycosidase, 이하 'Tcaβ-glycosidase'라고 함) 유전자의 대장균 (Escherichia coli) 내에서의 대량발현을 위한 시스템의 개발과 이 시스템을 통해 대량생산된Tca베타-글라이코시데이즈를 이용한 갈락토올리고당 (galactooligosaccharide)의 합성에 관한 것이다.
본 발명은 식품산업 등에 많이 이용되어지는 갈락토올리고당의 생산에 있어 가장 중요한 요소인 우수한 갈락토스 전이 활성을 가지는 효소를 제공한다는 데에 의의가 있다. 특히, 본 발명의Tca베타-글라이코시데이즈는 내열성을 가지고 있어 반응시 기질로 사용되는 락토스의 농도를 높일 수 있으므로 갈락토올리고당의 합성율을 높일 수 있다는 데에 큰 의의가 있다. 또한, 내열성Tca베타-글라이코시데이즈 유전자의 대량발현 시스템은 갈락토올리고당 합성 효소의 대량생산을 용이하게 할 뿐만 아니라 생산비용 절감 효과가 있어, 상기 합성율을 높일 수 있다는 장점과 함께 결과적으로는 산업적으로 유용한 갈락토올리고당의 생산량은 늘이면서 생산단가는 낮출 수 있다는 데에 의의가 있다.

Description

써머스 칼도필러스 지케이24 균주 유래의 베타-글라이코시데이즈를 이용한 갈락토올리고당의 합성 방법 및 이 방법에 이용되는 써머스 칼도필러스 지케이24 베타-글라이코시데이즈의 재조합 대량발현 시스템{Synthesis of galactooligosaccharide by Thermus caldophilus GK24 β-glycosidase and high-level expression system of recombinant Thermus caldophilus GK24 β-glycosidase for use in the synthesis}
본 발명은 내열성 베타-글라이코시데이즈 (thermostable β-glycosidase) 유전자의 대량발현 시스템 (high-level expression system)과 이 효소를 이용한 갈락토올리고당 (galactooligosaccharide)의 합성에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 고온균에 속하는 써머스 (Thermus) 속 (genus) 균주의 일종인 써머스 칼도필러스 지케이24 (Thermus caldophilusGK24)로부터의 내열성 베타-글라이코시데이즈 (Thermus caldophilusGK24 β-glycosidase,Tcaβ-glycosidase) 유전자를 대장균 (Escherichia coli) 내에서 대량발현시키기 위한 재조합 플라스미드 (recombinant plasmid) 및 이 재조합 플라스미드로 형질전환된 대장균과,Tca베타-글라이코시데이즈를 이용하여 적절한 합성 조건 하에서 이당류 (disaccharide)인 락토스 (유당, lactose) 또는 베타-결합 (β-linkage)을 하는 당류로부터 일반식 Gal-(Gal)n-Glu (식에서 Gal은 갈락토스 잔기, Glu는 글루코스 잔기, n은 일반적으로 1 ∼ 4의 정수를 나타낸다)로 표시되는 갈락토올리고당을 높은 합성율로 생산하는 방법에 관한 것이다.
베타-글라이코시데이즈 (β-glycosidase, β-glycosyl hydrolase)는 알도스(aldose) 또는 케토스 (ketose)의 헤미아세탈 하이드록실기 (hemiacetal hydroxyl group)와 또 다른 화합물의 하이드록실기 사이에 형성된 베타-글라이코사이드 결합 (β-glycosidic linkage)을 가수분해하는 효소이다. 즉, 베타-글라이코시데이즈는 베타-갈락토시데이즈 (β-galactosidase), 베타-글루코시데이즈 (β-glucosidase), 베타-프럭토시데이즈 (β-fructosidase), 베타-만노시데이즈 (β-mannosidase) 등과 같은 배당체의 베타-결합을 가수분해하는 효소들의 총칭으로서 사용된다. 또한, 베타-글라이코시데이즈라는 명칭은 하나의 효소가 상기의 여러 가지 효소 활성들을 동시에 가질 때도 사용된다. 예를 들어,Tca베타-글라이코시데이즈는 베타-갈락토시데이즈, 베타-글루코시데이즈 및 베타-프럭토시데이즈 활성을 모두 가짐으로 인해 베타-글라이코시데이즈라 명명되었다.
써머스 칼도필러스 지케이24는 일본 도치기현 (Tochigi-ken)의 가와마타 온천 (Kawamata hot spring)에서 분리되어진 균주로서, 70 ∼ 75℃의 최적 생장 온도를 가지는 고온균이다 (참조: Taguchi, H.et al., 1982,J. Biochem.91, 1343-1348). 본 발명자들이 속한 연구팀은 락토스를 유도물질 (inducer)로 포함하는 배지에 써머스 속에 속하는 9가지 균주를 배양하여 본 결과, 써머스 칼도필러스 지케이24에서 베타-갈락토시데이즈 활성을 가지는 효소의 생산이 활발함을 알 수 있었으며 (참조: 유진상 외, 1997,Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol.25, 298-304), 이 효소를 정제하여 여러 가지 특성을 조사해 본 결과, 상기 효소는 베타-갈락토시데이즈 활성 이외에도 베타-글루코시데이즈 및 베타-프럭토시데이즈 활성을 모두 가지고 있어Tca베타-글라이코시데이즈라 명명하였다 (참조: Yoo, J.etal., 2000,J. Microbiol. Biotechnol.10, 638-642). 또한, 본 발명자들이 속한 연구팀은Tca베타-글라이코시데이즈 유전자를 선별하여 염기 서열 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 결정한 다음, 상기 유전자를 발현벡터 (expression vector) pJR에 삽입하여 대장균에 클로닝 (cloning)함으로써 대장균 내에서의 발현을 시도하였다 (참조: Han, K.-W.et al., 2001,Biotechnol. Lett.23, 379-384).
동·식물 및 미생물 등에 다양하게 존재하며 락토스의 소화 및 복합당질의 대사 등에 관여하는 베타-갈락토시데이즈는 베타-1,4-갈락토사이드 결합 (β-1,4-galactosidic linkage)을 가수분해하는 효소인 동시에, 갈락토스 전이 반응 (transgalactosylation)을 촉매하는 효소이다. 즉, 베타-갈락토시데이즈 활성은 락토스를 글루코스 (포도당, glucose)와 갈락토스 (galactose)로 가수분해시키는 활성일 뿐만 아니라, 반응 조건에 따라서는 당질에 갈락토스를 결합시켜 갈락토올리고당을 합성시킬 수 있는 활성이다 (참조: Prenosil, J. E.et al., 1987,Biotechnol. Bioeng.30, 1019-1025).
베타-갈락토시데이즈 활성에 의한 갈락토스 전이 반응에 대해 자세히 살펴보면 다음과 같다. 베타-갈락토시데이즈 또는 베타-갈락토시데이즈 활성을 가지는 베타-글라이코시데이즈를 락토스에 작용시켜 갈락토올리고당을 얻는 갈락토스 전이 반응에서, 상기 효소들은 락토스를 가수분해하여 얻게 되는 갈락토스를 수용체에 베타-결합시키는 기능을 한다. 이 수용체가 물인 경우에는 락토스가 글루코스와 갈락토스로 단지 가수분해만 일어나게 되는 것이지만, 수용체가 글루코스인 경우에는 락토스 또는 알로락토스 (allolactose)와 같은 이당류가 생성되고, 수용체가 이당류인 경우에는 삼당류 (trisaccharide)의 갈락토올리고당, 수용체가 삼당류인 경우에는 사당류 (tetrasaccharide)의 갈락토올리고당, 수용체가 사당류인 경우에는 오당류 (pentasaccharide)의 갈락토올리고당이 각각 생성된다. 베타-갈락토시데이즈 또는 베타-갈락토시데이즈 활성을 가지는 베타-글라이코시데이즈들의 갈락토올리고당 합성율은 이용되는 효소의 특성과 농도 및 활성 정도, 기질의 종류 및 농도, 반응 조건 등에 따라 다르나, 일반적인 갈락토스 전이 반응은 락토스의 가수분해 반응과 경쟁하며, 갈락토스 전이 반응을 통해 증가된 글루코스가 수용체로서 락토스와 경쟁할 뿐만 아니라 효소 활성을 저해하여 반응 속도를 지연시키기 때문에 갈락토올리고당의 합성율이 감소하게 된다. 또한, 반응 후 반응액에 단당류 및 이당류가 다량으로 함유되어 있을 경우에, 반응액을 거의 그대로 사용하게 되면 큰 효과가 없는 단당류 및 이당류가 같이 포함되어 갈락토올리고당을 첨가한 제품의 칼로리를 높게 만들 뿐만 아니라 락토스 가수분해 효소를 가지고 있지 않은 사람 (유당불내증, lactose-intolerant)들의 경우 섭취하기 곤란하게 할 수도 있는 반면에, 합성된 갈락토올리고당만을 사용하려고 하게 되면 분리·정제를 위해 많은 시간과 비용이 들게 된다. 따라서, 갈락토스 전이 반응이 가수분해 반응에 비해 우세하게 진행되도록 하고 글루코스의 증가를 최소화시키면서 여러 가지 상기 조건들을 최적화시켜야만이 갈락토올리고당을 높은 수율로 얻을 수 있으며, 이용 범위 및 사용량을 늘일 수 있고, 생산 시간 및 비용을 절감시킬 수 있다. 이를 위해, 갈락토스 전이 반응 시에 서로 특성이 다른 두 종류의 베타-갈락토시데이즈 활성을 가지는 효소들을 사용하여 각각의 장점들을 이용하는 방법 (참조: 대한민국특허청 등록번호특0168718), 반응 부산물인 글루코스의 농도를 낮추기 위해 반응 시에 베타-갈락토시데이즈 활성을 가지는 효소와 함께 글루코스 아이소머레이즈 (glucose isomerase)를 사용하여 글루코스를 프럭토스 (과당, fructose)로 전환시키는 방법 (참조: 대한민국특허청 등록번호 특0130938) 등이 개발되어져 왔으나, 현재까지도 가장 많은 연구가 진행되어지는 방향은 기본적으로 갈락토스 전이 반응에 있어 가장 중요한 요소인 우수한 갈락토스 전이 활성 (transgalactosylation activity)을 가지는 베타-갈락토시데이즈 또는 베타-갈락토시데이즈 활성을 가지는 베타-글라이코시데이즈의 개발이다. 특히, 내열성을 가지는 상기 효소들의 경우 락토스의 용해도 (solubility)를 증가시킬 수 있는 고온에서의 반응이 가능하여 고농도의 락토스를 기질로 사용할 수 있으므로, 갈락토올리고당의 합성율을 높일 수 있을 뿐만 아니라 반응 후 고농도의 갈락토올리고당을 얻을 수 있고, 반응 시에 다른 미생물에 의한 오염을 막을 수 있다는 장점들이 있어, 기존의 대장균 (참조: Huber, R. E.et al., 1976,Biochemistry15, 1994-2001), 바실러스 서큘란스 (Bacillus circulans)(참조: Yanahira, S.et al., 1995,Biosci. Biotechnol. Biochem.59, 1021-1026), 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis)(참조: Toba, T., 1985,Rakunokagaku Syokuhin no Kenkyu(in Japanese) 34, A169-182), 아스퍼질러스 (Aspergillus) 속 (참조: Toba, T. and Adachi, S., 1978,Dairy Sci.61, 33-38; Toba, T.et al., 1981,Dairy Sci.64, 185-192) 등과 같은 중온성 미생물들로부터 유래된 갈락토스 전이 활성을 가지는 효소들을 더 효과적으로 대체할 수 있으나, 아직까지 그 예가 많지 않아 내열성 갈락토스 전이 효소에 대한 연구 및 개발이 상당히 중요하다.
올리고당 (oligosaccharide)은 단당 2개로 이루어지는 이당류로부터 단당 10개로 이루어지는 십당류까지의 당류를 총칭하는 것으로서, 감미를 가지는 수용성의 결정성 물질이다. 갈락토올리고당은 모유에 존재하는 올리고당의 주요 구성성분으로 올리고당 중 유일하게 동물성 소재를 이용한 것으로서, 다음과 같은 몇 가지 특징을 가진다. 첫째, 유산균이나 비피더스균과 같은 장내 유용 세균들의 선택적 증식 촉진 인자로서 뛰어난 정장작용을 제공한다. 둘째, 체내에서 대사가 이루어지지 않는 저칼로리 소재이다. 셋째, 설탕과 같은 일반 당류들과는 달리 충치를 유발하지 않는다. 넷째, 열과 산에 대한 안정성이 뛰어나 기능성 식품의 소재로 사용이 용이하다. 즉, 건강의 측면에서 매우 유용하게 사용될 수 있는 생물 소재인 것이다. 현재 광범위하게 이용되고 있는 올리고당류들은 갈락토올리고당, 프럭토올리고당 (fructooligosaccharide), 이소말토올리고당 (isomaltooligosaccharide) 등으로, 대개 효소에 의하여 당류로부터 합성되어진다. 올리고당은 유산균 음료, 두유, 탄산 음료 등과 같은 각종 음료, 아이스크림 등과 같은 각종 빙과류, 과자, 빵, 쨈, 탁상 감미료 등과 같은 각종 음식물 또는 기호물에 감미료로 많이 사용되어지고 있다. 또한, 올리고당은 유아용 분유나 발효유에 첨가되어지며, 사료 첨가물로도 사용되어지고 있다.
상기와 같이 효과에 비해 그 예가 많지 않은 내열성 베타-갈락토시데이즈 또는 베타-갈락토시데이즈 활성을 가지는 내열성 베타-글라이코시데이즈를 개발하여, 건강 측면에서 매우 유용하며 다양하게 이용될 수 있는 갈락토올리고당을 높은 합성율로 대량생산해 낼 수 있다면 산업적으로 매우 유용할 것이다. 따라서, 본 발명자들은 갈락토올리고당을 높은 합성율로 대량생산하는 방법의 일환으로 내열성 갈락토올리고당 합성 효소를 대량생산하여 갈락토올리고당을 고효율로 합성하는 방법을 연구하던 중, 고온균 써머스 칼도필러스 지케이24로부터의 내열성 베타-글라이코시데이즈 유전자를 대장균 내에서 대량발현시켜 얻은 재조합 효소를 이용하여 갈락토올리고당을 합성하는 방법이 적절한 합성 조건 하에서 상당히 높은 합성율을 나타낸다는 것을 발견하여 본 발명에 이용하였다.
이에, 본 발명자들은 고온균에 속하는 써머스 (Thermus) 속 (genus) 균주의 일종인 써머스 칼도필러스 지케이24 (Thermus caldophilusGK24)로부터의 우수한 갈락토스 전이 활성 (transgalactosylation activity)을 가지는 내열성 베타-글라이코시데이즈를 대량생산하여 갈락토올리고당 (galactooligosaccharide)의 합성에 이용하고자 예의 연구노력한 결과, 써머스 칼도필러스 지케이24 베타-글라이코시데이즈 (Thermus caldophilusGK24 β-glycosidase,Tcaβ-glycosidase) 유전자를 대장균 (Escherichia coli) 내에서 대량발현시킬 수 있는 시스템을 구축하고, 이 시스템으로부터 대량발현된Tca베타-글라이코시데이즈를 정제한 후, 상기Tca베타-글라이코시데이즈가 갈락토스 전이 반응 (transgalactosylation)을 촉매할 수 있음을 확인한 다음, 락토스 (lactose)를 기질로 상기 효소를 이용한 갈락토올리고당 합성의 최적 조건을 결정함으로써, 내열성Tca베타-글라이코시데이즈의 우수한 갈락토스 전이 활성, 즉 상당히 높은 합성율로 갈락토올리고당을 합성할 수 있음을확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 우수한 갈락토스 전이 활성을 가지는 써머스 칼도필러스 지케이24 균주 유래의 베타-글라이코시데이즈를 이용하여 적절한 합성 조건 하에서 갈락토올리고당을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 갈락토올리고당의 합성에 있어 유용한 효소임이 입증되어 본 발명의 갈락토올리고당 생산 방법에 이용하기 위한 써머스 칼도필러스 지케이24 베타-글라이코시데이즈를 대량생산하는 대장균 내에서의 대량발현 시스템을 제공하는 것이다.
도 1은 새로운 발현벡터 pTRPES와Tca베타-글라이코시데이즈 유전자의 대량발현을 위한 재조합 플라스미드 pTTGL의 구축 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 재조합 플라스미드 pTTGL로 형질전환된 대장균의 배양에 있어 2시간 간격으로 균체 생장 정도와Tca베타-글라이코시데이즈의 발현율을 나타낸 것이다.
도 3은Tca베타-글라이코시데이즈가 갈락토올리고당의 합성에 필요한 갈락토스 전이 활성을 가지고 있음을 보여주는 박층 크로마토그래피 결과를 나타낸 것이다.
도 4는Tca베타-글라이코시데이즈를 이용한 갈락토올리고당의 합성에 있어 반응 시간에 따른 갈락토스 전이 반응의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는Tca베타-글라이코시데이즈를 이용한 갈락토올리고당의 합성에 있어반응 온도에 따른 갈락토스 전이 반응의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은Tca베타-글라이코시데이즈를 이용한 갈락토올리고당의 합성에 있어 반응 pH에 따른 갈락토스 전이 반응의 결과를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 일 관점으로서 고온균 써머스 칼도필러스 지케이24 (Thermus caldophilusGK24) 균주 유래의 베타-글라이코시데이즈 (Thermus caldophilusGK24 β-glycosidase,Tcaβ-glycosidase)를 이용하여 적절한 합성 조건 하에서 갈락토올리고당 (galactooligosaccharide)을 높은 합성율로 생산하는 방법을 제공한다.
바람직한 일 구체예로서, 본 발명은 대량발현 시스템 (high-level expression system)으로부터 생산된 재조합Tca베타-글라이코시데이즈 효소를 이용하여 적절한 합성 조건 하에서 갈락토올리고당을 높은 합성율로 생산하는 방법을 제공한다.
바람직한 다른 구체예로서, 30% (weight/volume, wt/vol) 락토스 (lactose)를 기질로 70℃, pH 6.0에서 6시간 동안 반응 시, ㎖당 18 ㎍까지는 상기Tca베타-글라이코시데이즈 효소의 첨가량이 증가함에 따라 갈락토올리고당의 합성율이약 70% 정도까지 증가하다가, ㎖당 18 ㎍ 이상의 효소가 첨가되면 갈락토올리고당의 합성율이 약 70% 정도로 일정하므로, 상기 조건 하에서 갈락토올리고당을 합성하고자 하는 경우에는 ㎖당 18 ㎍의Tca베타-글라이코시데이즈를 사용하는 것이 합성율 및 생산단가 측면에서 바람직하며, 본 발명을 통해 결정된Tca베타-글라이코시데이즈를 이용한 갈락토올리고당 합성의 최적 조건 하에서 갈락토올리고당을 합성하고자 하는 경우에는 합성율 및 생산단가를 고려하여 효소의 첨가량을 줄여주는 것이 바람직하다.
또 다른 바람직한 구체예로서, 본 발명의 갈락토올리고당 합성 시, 반응 시간의 경우 12시간 이상의 반응 시간에서는 합성율이 약 70% 정도로 일정하므로 12시간 이상 반응시키는 것이 바람직하며, 특히 12시간 반응시키는 것이 가장 바람직하다. 반응 온도의 경우 약 70% 정도 또는 그 이상의 합성율을 나타내는 70 ∼ 90℃에서 반응시키는 것이 바람직하며, 특히 약 75% 정도의 가장 높은 합성율을 나타내는 80℃에서 반응시키는 것이 가장 바람직하다. 반응 pH의 경우 약 70% 이상의 합성율을 나타내는 pH 5.0 ∼ 6.0에서 반응시키는 것이 바람직하며, 특히 약 75% 정도의 가장 높은 합성율을 나타내는 pH 6.0에서 반응시키는 것이 가장 바람직하다.
본 발명은 다른 관점으로서 갈락토올리고당의 합성에 있어 유용한 효소인 써머스 칼도필러스 지케이24 균주 유래 베타-글라이코시데이즈의 대량생산을 위한 대장균 (Escherichia coli) 내에서의 대량발현 시스템을 제공한다.
이 대량발현 시스템은trp프로모터 (trppromoter,P trp )를 가지는 새로이구축된 발현벡터 (expression vector) pTRPES에Tca베타-글라이코시데이즈 유전자가 삽입되어 있는 재조합 플라스미드 (recombinant plasmid) pTTGL로 형질전환된 대장균 W3110 (Escherichia coliW3110 / pTTGL)으로서, 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터에 2002년 8월 22일 기탁번호 KCCM 10414로서 기탁되어 있다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
먼저, 본 발명자들은 고온균 써머스 칼도필러스 지케이24로부터의 내열성 베타-글라이코시데이즈 유전자를trp프로모터를 가지는 새로운 발현벡터를 이용하여 대장균 내에서 대량발현시키고자 하였다. 이를 위해,trp프로모터 부위의 염기서열을 참조하여 프라이머 (primer)를 제작한 후, 대장균의 게놈 DNA (genomic DNA)를 주형 (template)으로 한 중합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction, PCR)을 통해trp프로모터 부위를 증폭시킨 다음, 제한효소 (restriction enzyme) 절단 부위를 이용하여 기존의 발현벡터 pJR에 존재하는tac프로모터 (tacpromoter,P tac )를trp프로모터로 치환시킨 새로운 발현벡터 pTRPES를 제작하였다. 이어서, 이미 본 발명자들이 속한 연구팀에 의해 염기서열이 결정된Tca베타-글라이코시데이즈 유전자의 5′ 말단과 3′ 말단에 상보적인 프라이머를 제작한 후, 써머스 칼도필러스 지케이24의 게놈 DNA를 주형으로 한 PCR을 통해Tca베타-글라이코시데이즈 유전자를 증폭시킨 다음, 제한효소 절단 부위를 이용하여 상기 발현벡터 pTRPES에 삽입하고, 이를 대장균 W3110에 클로닝 (cloning)함으로써, 내열성Tca베타-글라이코시데이즈 유전자의 새로운 발현 시스템인 대장균 W3110 / pTTGL (Escherichia coliW3110 / pTTGL)을 구축하였다.
상기 발현 시스템으로부터 발현되어지는Tca베타-글라이코시데이즈의 양을 측정한 결과, 새로운 발현 시스템 대장균 W3110 / pTTGL은 기존에 본 발명자들이 속한 연구팀에 의해 보고된 발현 시스템 대장균 MV1184 / pRTGL (Escherichia coliMV1184 / pRTGL)에 비해 약 2.2배 정도 높은 발현율을 나타냈다.
다음으로, 본 발명자들은 대량발현된 내열성Tca베타-글라이코시데이즈를 얻기 위해, 상기 재조합 플라스미드 pTTGL을 가지는 대장균 W3110을trp프로모터를 이용하는 유전자의 발현을 위한 배지에서 대량으로 배양한 다음, 균체를 회수하여 초음파 파쇄 (ultrasonication)한 후, 스트렙토마이신 썰페이트 (streptomycin sulfate) 처리 및 80℃에서의 열처리를 통해 각각 핵산 및 대장균 유래의 단백질들을 대부분 제거하고, 최종적으로 DEAE-Sephacel 컬럼 크로마토그래피 (column chromatography)를 통해 정제함으로써, 내열성Tca베타-글라이코시데이즈를 대량생산하였다.
마지막으로, 본 발명자들은 대량생산된 내열성Tca베타-글라이코시데이즈를 이용하여 갈락토올리고당을 합성하고자 하였다. 이를 위해, 락토스를 기질로Tca베타-글라이코시데이즈를 6 ㎍/㎖ 농도로 첨가하여 갈락토스 전이 반응 (transgalactosylation)을 수행한 후, 박층 크로마토그래피 (thin layer chromatography, TLC)를 통해 확인한 결과,Tca베타-글라이코시데이즈가 갈락토올리고당의 합성에 필요한 갈락토스 전이 활성 (transgalactosylation activity)을 가지고 있음을 알 수 있었으며, 합성된 갈락토올리고당의 거의 대부분은 삼당류 (trisaccharide)임을 알 수 있었다. 이어서, 30% (wt/vol) 락토스를 기질로Tca베타-글라이코시데이즈를 9 ㎍/㎖ 농도로 첨가하여 반응 시간, 반응 온도 및 반응 pH를 달리 하여 여러 가지 조건들에서 갈락토스 전이 반응을 수행한 후, 박층 크로마토그래피를 통한 정성적 분석과 덴시토미터 (densitometer)를 이용한 정량적 분석 결과, 80℃, pH 6.0에서 12시간 이상 반응시킬 때 약 75% 정도로 갈락토올리고당의 합성율이 가장 높았으며, 최고 합성율에 도달한 이후에도 시간이 흐름에 따라 그 합성율이 거의 변하지 않는다는 특징을 나타냈다. 또한, 50% (wt/vol) 락토스를 기질로Tca베타-글라이코시데이즈를 9 ㎍/㎖ 농도로 첨가하여 상기 최적 조건 하에서 갈락토스 전이 반응을 수행한 후, 박층 크로마토그래피를 통한 정성적 분석과 덴시토미터를 이용한 정량적 분석 결과, 30% (wt/vol) 락토스를 기질로 하여 얻은 결과와 유사하였다.Tca베타-글라이코시데이즈는 내열성을 가지고 있어 고온에서 고농도의 락토스를 기질로 갈락토스 전이 반응을 촉매할 수 있으므로, 높은 갈락토올리고당 합성율을 나타내며, 내열성Tca베타-글라이코시데이즈의 대량생산을 위해 구축된 대량발현 시스템과 상기 효소가 나타내는 높은 갈락토올리고당 합성율은 산업적으로 유용한 갈락토올리고당의 생산량은 늘이면서 생산단가는 낮추는데 큰 도움을 줄 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 국한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야 및 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명할 것이다.
실시예 1: 써머스 칼도필러스 지케이24 (Thermus caldophilusGK24) 균주의배양
써머스 칼도필러스 지케이24 균주 (참조: Taguchi, H.et al., 1982,J. Biochem.91, 1343-1348)는 약간 변형된 써머스 배지 461 (참조: Ramaley, R. F. and Hixson, J., 1970,J. Bacteriol.103, 527-528)에서 배양하였다. 약간 변형된 써머스 배지 461의 조성은 다음과 같다: 박토트립톤 (bactotrypton) 10 g/ℓ, 효모추출물 (yeast extract) 10 g/ℓ, 10X 카스텐홀쯔 기초염 (Castenholz basal salts) 용액 (1 ℓ당 니트릴로트리아세트산 (nitrilotriacetic acid) 1 g, 니쯔 미량원소 (Nitsch's trace elements) 용액 10 ㎖, 0.03% FeCl3용액 10 ㎖, CaSO4·2H2O 0.6 g, MgSO4·7H2O 1 g, NaCl 0.08 g, KNO31.05 g, NaNO37 g, Na2HPO41.1 g, pH 8.2로 조정) 100 ㎖/ℓ. 1 ℓ 플라스크에 상기 배지 용액 200 ㎖을 넣고 121℃에서 20분간 멸균한 다음, 써머스 칼도필러스 지케이24 균주를 접종한 후, 70℃에서 진탕배양하였다.
실시예 2: 써머스 칼도필러스 지케이24 게놈 DNA의 분리
게놈 DNA의 분리는 마머 (Marmur)의 방법을 다음과 같이 약간 변형하여 수행하였다 (참조: Marmur, J., 1961,J. Mol. Biol. 3, 208-218). 200 ㎖의 진탕배양한 균체를 원심분리를 통해 회수한 다음, SETB (20% 수크로스 (sucrose) / 50 mM EDTA / 50 mM Tris-HCl (pH 7.6))로 현탁하고, 얼렸다 녹이기 (freezing and thawing)를 5회 반복하여 세포막을 약화시킨 후, 각각 최종 농도가 10 ㎎/㎖과 100 ㎍/㎖이 되도록 라이소자임 (lysozyme)과 RNase A를 첨가하여 37℃에서 40분간 반응시켰다. 상기 용액에 최종 농도가 1%가 되도록 SDS를 첨가한 다음, 클로로포름 / 이소아밀알코올 (chloroform / isoamylalcohol)(24 : 1)을 첨가하여 천천히 흔들어주면서 하룻밤 반응시킨 후, TE 포화 페놀 (TE saturated phenol) 및 클로로포름 / 이소아밀알코올 (24 : 1) 동량으로 DNA를 추출하였다. 다음으로, 최종 농도가 1 ㎎/㎖이 되도록 단백질 분해효소 K (proteinase K)를 첨가하여 37℃에서 30분, 55℃에서 20분간 반응시킨 후, TE 포화 페놀 및 클로로포름 / 이소아밀알코올 (24 : 1) 동량으로 DNA를 추출하였다. 이 추출액에 2배 부피의 100% 에탄올 (ethanol)과 1/10배 부피의 3 M 아세트산 나트륨 (sodium acetate)(pH 5.2)를 첨가하여 게놈 DNA를 침전시킨 후, 70% 에탄올로 3회 세척하여 진공건조시킨 다음, TE 완충용액 (10 mM Tris-HCl (pH 7.6) / 1 mM EDTA)에 녹이고, 260 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 정량하였다.
실시예 3: 발현벡터 pTRPES의 구축
Tca베타-글라이코시데이즈 유전자의 대량발현을 위한 새로운 발현벡터를 다음과 같이 구축하였다. 기존에 알려진trp프로모터 부위의 염기서열을 참조 (참조: Tacon, W. C.et al., 1983,Gene23, 255-265)하여, 이 프로모터 부위의 5′ 말단과 3′ 말단에 각각 상보적인 프라이머들을 제작하였다. 서열번호 1로 제시되는 5′ 말단 프라이머 (5′-NNNNGGATCCGCTGTTGACAATTAATCATCGAAC-3′)는 제한효소BamHI 절단 부위 (GGATCC) 및trp프로모터 부위의 5′ 말단을 포함하는 34개의 염기 (nucleotide)로 합성하였으며, 서열번호 2로 제시되는 3′ 말단 프라이머 (5′-NNNNGAATTCCCTTTTTACGTGAACTTG-3′)는 샤인-달가노 서열 (Shine-Dalgarnosequence)(참조: Shine, J. and Dalgarno, L., 1975,Nature254, 34-38) 및 제한효소EcoRI 절단 부위 (GAATTC)를 포함하는 28개의 염기로 합성하였다. 이어서, 대장균의 게놈 DNA를 주형으로 다음과 같이 PCR을 수행하여trp프로모터 부위를 증폭시켰다.TaqDNA 중합효소 (TaqDNA polymerase)를 제외한 PCR 반응 혼합물 (0.5 ㎍ 대장균 게놈 DNA, 0.1 pmole 5′ 말단 프라이머 및 3′ 말단 프라이머, 200 μM dNTPs, 1XTaqDNA 중합효소 반응 완충용액)에 100℃에서 5분간 열을 가하여 상기 게놈 DNA를 변성시키고 얼음에서 급냉시킨 다음,TaqDNA 중합효소 2.5 유닛 (unit)을 첨가하여 DNA 변성 (DNA denaturation, 94℃, 1분), 프라이머 어닐링 (primer annealing, 55℃, 1분) 및 DNA 증폭 (DNA extension, 72℃, 1분, 단 마지막 회에서는 5분)의 3단계 과정을 30회 반복한 후, DNA 사이즈 마커 (DNA size marker)와 함께 2% 아가로스 겔 (agarose gel)에 전기영동 (electrophoresis)하여 약 80 bp 위치에 밴드 (band)가 존재하는 것을 확인하였다. 다음으로, 반응이 끝난 PCR 반응 혼합물에 TE 포화 페놀 및 클로로포름 / 이소아밀알코올 (24 : 1)을 동량으로 처리하여 PCR을 통해 증폭된 DNA 단편을 추출한 후, 에탄올 침전을 통해 회수하였다. 회수된 DNA 단편을 제한효소BamHI 및EcoRI으로 절단한 후, DNA 사이즈 마커와 함께 2% 저융점 아가로스 겔 (low melting agarose gel)에 전기영동한 다음, 약 70 bp 위치에 존재하는 밴드를 포함하는 겔 조각으로부터 제한효소 절단된 DNA 단편을 다음과 같이 회수하였다. 겔 조각을 65℃에서 열을 가하여 완전히 녹인 다음, 3배 부피의 TE 완충용액을 첨가하고 다시 5분간 열을 가한 후, TE 포화 페놀 및 클로로포름 / 이소아밀알코올 (24 : 1) 동량으로 DNA를 추출하고 에탄올 침전을통해 제한효소 절단된 DNA 단편을 회수하였다. 회수된trp프로모터 부위를 포함하는 제한효소 절단된 DNA 단편을 T4 DNA 라이게이즈 (T4 DNA ligase)를 이용하여 동일한 제한효소로 절단된 발현벡터 pJR (참조: Kwon, S.-T.et al., 1997,Mol. Cells7, 264-271)에 삽입한 다음, 일렉트로포레이션 (electroporation) 방법으로 대장균 W3110에 클로닝하였다 (참조: Sambrook, J.et al., 1989, Molecular cloning, a laboratory manual,2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press). 이어서, 형질전환체 (transformant)들로부터 알카리 용균법 (alkaline lysis method)에 의해 플라스미드 DNA (plasmid DNA)를 분리한 다음, 제한효소BamHI 및EcoRI으로 절단한 후, DNA 사이즈 마커와 함께 2% 아가로스 겔에 전기영동하여trp프로모터 부위를 포함하는 DNA 단편이 정확히 삽입되어 있는 형질전환체를 선별하였다. 이와 같이 구축된 새로운 발현벡터를 pTRPES라 명명하였다 (참조: 도 1). 도 1은 새로운 발현벡터 pTRPES와Tca베타-글라이코시데이즈 유전자의 대량발현을 위한 재조합 플라스미드 pTTGL의 구축 과정을 나타낸 것으로서, 도 1에서 Ori는 복제 개시 부위를 나타내며, Ampr은 암피실린 저항성 유전자를 나타내고, Ptac과 Ptrp은 각각tac프로모터와trp프로모터를 나타낸다.
실시예 4:Tca베타-글라이코시데이즈 유전자의 대량발현을 위한 재조합 플라스미드 및 발현 시스템의 구축
본 발명자들이 속한 연구팀에 의해 염기서열이 결정된Tca베타-글라이코시데이즈 유전자 (참조: Han, K.-W.et al., 2001,Biotechnol. Lett.23, 379-384)의 5′ 말단과 3′ 말단에 각각 상보적인 프라이머들을 제작하였다. 서열번호 3으로 제시되는 5′ 말단 프라이머 (5′- NNNNGAATTCATGACCGAGAACGCCGAAAAG-3′)는 제한효소EcoRI 절단 부위 (GAATTC) 및Tca베타-글라이코시데이즈 유전자의 개시코돈 (start codon)을 포함하는 31개의 염기로 합성하였으며, 서열번호 4로 제시되는 3′ 말단 프라이머 (5′-NNNNGTCGACGCTCAGAGCTGGGCCC-3′)는Tca베타-글라이코시데이즈 유전자의 종지코돈 (stop codon) 및 제한효소SalI 절단부위 (GTCGAC)를 포함하는 26개의 염기로 합성하였다. 이어서, 상기 실시예 2에서 분리된 써머스 칼도필러스 지케이24의 게놈 DNA를 주형으로 다음과 같이 PCR을 수행하여Tca베타-글라이코시데이즈 유전자를 증폭시켰다.TaqDNA 중합효소를 제외한 PCR 반응 혼합물 (0.5 ㎍ 써머스 칼도필러스 지케이24 게놈 DNA, 0.1 pmole 5′ 말단 프라이머 및 3′ 말단 프라이머, 200 μM dNTPs, 1XTaqDNA 중합효소 반응 완충용액)에 100℃에서 5분간 열을 가하여 상기 게놈 DNA를 변성시키고 얼음에서 급냉시킨 다음,TaqDNA 중합효소 2.5 유닛을 첨가하여 DNA 변성 (DNA denaturation, 94℃, 1분), 프라이머 어닐링 (primer annealing, 58℃, 1분) 및 DNA 증폭 (DNA extension, 72℃, 1분, 단 마지막 회에서는 5분)의 3단계 과정을 30회 반복한 후, DNA 사이즈 마커와 함께 0.8% 아가로스 겔에 상기영동하여 약 1.3 kb 위치에 밴드가 존재하는 것을 확인하였다. 다음으로, 반응이 끝난 PCR 반응 혼합물에 TE 포화 페놀 및 클로로포름 / 이소아밀알코올 (24 : 1)을 동량으로 처리하여 PCR을 통해 증폭된 DNA 단편을 추출한 후, 에탄올 침전을 통해 회수하였다. 회수된 DNA 단편을 제한효소EcoRI 및SalI으로 절단한 후, DNA 사이즈 마커와 함께 0.8% 저융점 아가로스 겔에 전기영동한 다음, 상기 실시예 3에서와 같이 제한효소 절단된 DNA 단편을 회수하였다. 회수된Tca베타-글라이코시데이즈 유전자를 포함하는 제한효소 절단된 DNA 단편을 T4 DNA 라이게이즈를 이용하여 상기 실시예 3에서 구축되어 동일한 제한효소로 절단된 발현벡터 pTRPES에 삽입한 다음, 일렉트로포레이션 방법으로 대장균 W3110에 클로닝하였다. 이어서, 형질전환체들로부터 알카리 용균법에 의해 플라스미드 DNA를 분리한 다음, 제한효소EcoRI 및SalI으로 절단한 후, DNA 사이즈 마커와 함께 0.8% 아가로스 겔에 전기영동하여Tca베타-글라이코시데이즈 유전자를 포함하는 DNA 단편이 정확히 삽입되어 있는 형질전환체를 선별하였다. 이와 같이 구축된Tca베타-글라이코시데이즈 유전자의 발현을 위한 재조합 플라스미드를 pTTGL이라 명명하였으며 (참조: 도 1), 이 재조합 플라스미드 pTTGL을 가지는 형질전환된 대장균 W3110을 대장균 W3110 / pTTGL이라 명명하였다.
전술한 바와 같이, 상기 재조합 플라스미드 pTTGL을 가지는 대장균 W3110 (Escherichia coliW3110 / pTTGL)은 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터에 2002년 8월 22일 기탁번호 KCCM 10414로서 기탁되어 있다.
실시예 5: 베타-갈락토시데이즈 활성 측정을 통한Tca베타-글라이코시데이즈의 발현율 측정
상기 실시예 4에서 구축된Tca베타-글라이코시데이즈 유전자의 새로운 발현 시스템 대장균 W3110 / pTTGL의 발현율은 다음과 같이 측정하였다. 재조합 플라스미드 pTTGL을 가지는 대장균 W3110을 최종 농도가 100 ㎍/㎖이 되도록 암피실린 (ampicillin)을 첨가한 LB 배지 (LB medium, Luria-Bertani medium) 3 ㎖에 접종하여 37℃에서 하룻밤 전배양한 다음, 최종 농도가 100 ㎍/㎖이 되도록 암피실린을 첨가한trp프로모터를 이용하는 유전자의 발현을 위한 배지인 0.1% 글루코스 (glucose)와 0.5% 카사미노산 (casamino acids)을 포함하는 M9 최소 배지 (M9 minimal medium) 50 ㎖에 1% 접종하여 37℃에서 16시간 동안 배양하면서 2시간 간격으로 1 ㎖씩 배양액을 채취하였다. 채취된 배양액 중 100 ㎕는 600 nm 파장에서 흡광도를 측정함으로써 균체 생장 정도를 알아보았다. 이어서, 채취된 배양액 중 나머지 900 ㎕는 원심분리를 통해 균체를 회수한 후, 회수된 균체를 50 mM 인산 나트륨 (sodium phosphate) 완충용액 (pH 6.0) 500 ㎕로 현탁한 다음, 톨루엔 : 아세톤 (toluene : acetone)(2 : 1) 500 ㎕를 첨가하여 파쇄시켰다. 상기 용액에서 세포내 물질들을 포함하게 되는 하층을 조효소액으로 사용하여 하기와 같이 베타-갈락토시데이즈 활성을 측정함으로써Tca베타-글라이코시데이즈의 발현율을 결정하였다.
베타-갈락토시데이즈 활성은 다음과 같이 측정하였다 (참조: Yoo, J.et al., 2000,J. Microbiol. Biotechnol.10, 638-642). 반응 혼합물 (상기 조효소액 또는 상기 조효소액을 50 mM 인산 나트륨 완충용액 (pH 6.0)에 희석한 용액 100 ㎕, 50 mM 인산 나트륨 완충용액 (pH 6.0)에 녹인 15 mM 파라-니트로페닐갈락토사이드(p-nitrophenylgalactoside,pNPGal) 용액 200 ㎕, 50 mM 인산 나트륨 완충용액 (pH 6.0) 300 ㎕)을 75℃에서 5분간 반응시킨 후, 얼음에서 급냉시켰다. 상기 반응 혼합물에 1 M Na2CO3400 ㎕를 첨가하여 반응을 완전히 정지시킨 후, 원심분리를 통해 반응 혼합물에 첨가된 조효소액에 포함되어 있는 세포 침전물을 제거한 다음, 상층액을 가지고 410 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 베타-갈락토시데이즈 활성 1 유닛은 75℃에서 1분 동안pNPGal을 분해하여 1 μmol의 파라-니트로페놀(p-nitrophenol,pNP)을 생성시키는 효소량으로 정의하였다.
상기와 같이 발현율을 측정한 결과, 새로운 발현 시스템 대장균 W3110 / pTTGL로부터의Tca베타-글라이코시데이즈의 발현율은 배양액 1 ㎖당 2.25 유닛이었다(참조: 도 2). 이는 기존의 발현 시스템 대장균 MV1184 / pRTGL로부터의 발현율 (1.04 유닛/㎖)(참조: Han, K.-W.et al., 2001,Biotechnol. Lett.23, 379-384)에 비해 약 2.2배 정도 높은 수치로서, 이를 통해 본 발명의 새로운 발현 시스템 대장균 W3110 / pTTGL은Tca베타-글라이코시데이즈 유전자의 발현에 있어 현재까지 개발된 발현 시스템들 중 가장 우수한 발현율을 나타내는 대량발현 시스템임을 알 수 있었으며, 새로운 대량발현 시스템을 이용하여 내열성Tca베타-글라이코시데이즈를 저렴한 비용으로 빠른 시간 내에 대량생산할 수 있음을 알 수 있었다. 도 2는 재조합 플라스미드 pTTGL로 형질전환된 대장균의 배양에 있어 2시간 간격으로 균체 생장 정도와Tca베타-글라이코시데이즈의 발현율을 나타낸 것으로서, 도 2에서 ○는 균체 생장 정도를 나타내는 600 nm에서의 흡광도 값이며, ●는Tca베타-글라이코시데이즈의 발현율을 나타내는 배양액 1 ㎖당 베타-갈락토시데이즈 효소 활성 유닛이다.
실시예 6: 대장균 내에서 대량발현된Tca베타-글라이코시데이즈의 정제
상기 실시예 4에서 구축된 재조합 플라스미드 pTTGL을 가지는 대장균 W3110을 최종 농도가 100 ㎍/㎖이 되도록 암피실린을 첨가한 0.1% 글루코스와 0.5% 카사미노산을 포함하는 M9 최소 배지에서 대량으로 배양한 다음, 원심분리를 통해 균체를 회수하였다. 회수된 균체를 1 mM 페닐메틸썰포닐 플루오라이드 (phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF)를 포함하는 20 mM 인산 나트륨 완충용액 (pH 6.0)에 현탁하여 초음파 파쇄한 후, 원심분리를 통해 상층액을 회수하였다. 이어서, 최종 농도가 1% (wt/vol)가 되도록 스트렙토마이신 썰페이트를 첨가하여 실온에서 20분간 반응시킨 후, 원심분리를 통해 상층액을 회수함으로써 핵산을 제거하였다. 다음으로, 80℃에서 30분간 열처리한 후, 원심분리를 통해 상층액을 회수함으로써 대장균 유래의 단백질들을 대부분 제거하였다. 상기 상층액을 10 mM 인산 나트륨 완충용액 (pH 6.0)에 투석 (dialysis)한 후, 최종적으로 음이온 교환 수지 (anion exchange column)인 DEAE-Sephacel 컬럼을 통해 정제함으로써, 내열성Tca베타-글라이코시데이즈를 대량생산하였다.
실시예 7:Tca베타-글라이코시데이즈를 이용한 갈락토올리고당의 합성
본 발명자들은 상기 실시예 6에서 생산된 내열성Tca베타-글라이코시데이즈가 갈락토올리고당의 합성에 필요한 갈락토스 전이 활성을 가지는지의 여부를 알아보기 위해 다음과 같이 실험을 수행하였다 (참조: Rabiu, B. A.et al., 2001,Appl. Environ. Microbiol.67, 2526-2530).
5 ∼ 40% (wt/vol) 락토스를 기질로 50 mM 인산 나트륨 완충용액 (pH 6.0) 하에서Tca베타-글라이코시데이즈를 6 ㎍/㎖ 농도로 첨가하여 70℃에서 6시간 동안 갈락토스 전이 반응을 수행한 후, 이 반응액에 50 mM 인산 나트륨 완충용액 (pH 6.0)을 첨가하여 1/3로 희석하였다. 이어서, 희석된 반응액 2 ㎕씩을 박층 크로마토그래피 플레이트 (TLC plate)에 점적 (spotting)한 다음, 부탄올 (butanol) : 에탄올 : 물이 5 : 3 : 2의 비율로 섞인 전개 용액 하에서 반응산물들을 분리시켰다. 전개가 끝나면, 상기 플레이트를 잠시 말린 다음, 15% 황산에 녹인 5% 황산 세륨 (ceric sulfate) 용액을 뿌려 120℃에서 10분 동안 놓아둔 후, 반응산물의 조성 및 분포를 확인하였다. 그 결과, 상기 실시예 6에서 생산된Tca베타-글라이코시데이즈는 갈락토올리고당의 합성에 필요한 갈락토스 전이 활성을 가지고 있음을 알 수 있었으며, 합성된 갈락토올리고당의 거의 대부분은 삼당류임을 알 수 있었고, 갈락토스 (galactose)가 거의 확인되지 않는다는 점에서 락토스가 가수분해되어 생기는 갈락토스는 거의 대부분 갈락토올리고당의 합성에 사용되어짐을 알 수 있었다 (참조: 도 3). 또한, 덴시토미터를 이용하여 상기 플레이트 상에서 분리된 반응산물들을 정량적으로 분석한 결과,Tca베타-글라이코시데이즈는 상기 조건 하에서 락토스 농도에 따라 약 20 ∼ 30% 정도의 합성율 (덴시토미터를 통해 계산된 분리된 반응산물들 각각이 나타내는 강도 (intensity)의 합에 대한 반응산물 중 갈락토올리고당이 나타내는 강도의 비율)로 갈락토올리고당을 합성함을 알 수 있었다 (참조: 도 3). 도 3은Tca베타-글라이코시데이즈가 갈락토올리고당의 합성에 필요한 갈락토스 전이 활성을 가지고 있음을 보여주는 박층 크로마토그래피 결과를 나타낸 것으로서, 도 3에서 M1은 갈락토스-갈락토스-글루코스로 이루어진 삼당류의 갈락토올리고당을 나타내며, M2, M3 및 M4는 각각 락토스, 갈락토스 및 글루코스를 나타낸다.
다음으로, 30% (wt/vol) 락토스를 기질로 50 mM 인산 나트륨 완충용액 (pH6.0) 하에서Tca베타-글라이코시데이즈의 양을 달리하여 70℃에서 6시간 동안 갈락토스 전이 반응을 수행한 후, 상기와 같이 박층 크로마토그래피를 통한 정성적 분석과 덴시토미터를 이용한 정량적 분석 결과, ㎖당 18 ㎍까지는Tca베타-글라이코시데이즈의 첨가량이 증가함에 따라 갈락토올리고당의 합성율이 약 70% 정도까지 증가하다가, ㎖당 18 ㎍ 이상의Tca베타-글라이코시데이즈가 첨가되면 갈락토올리고당의 합성율이 약 70% 정도로 일정하였다. 이 결과를 통해, 상기 실시예 6에서 생산된Tca베타-글라이코시데이즈가 갈락토올리고당의 합성에 필요한 갈락토스 전이 활성을 가지고 있음을 다시 한 번 확인할 수 있었다.
실시예 8 : 갈락토올리고당 합성 시Tca베타-글라이코시데이즈 효소의 특성 분석
Tca베타-글라이코시데이즈를 이용한 갈락토올리고당 합성의 최적 조건을 결정하기 위해, 30% (wt/vol) 락토스를 기질로Tca베타-글라이코시데이즈를 9 ㎍/㎖ 농도로 첨가하여 다음과 같이 반응 시간, 반응 온도 및 반응 pH를 달리 하여 여러 가지 조건들에서 갈락토스 전이 반응을 수행한 후,박층크로마토그래피를 통한 정성적 분석과 덴시토미터를 이용한 정량적 분석을 실시하였다.
반응 시간의 경우, 70℃, 50 mM 인산 나트륨 완충용액 (pH 6.0) 하에서 0 ∼ 24시간 반응시켜 본 결과, 12시간까지는 반응 시간이 길어짐에 따라 갈락토올리고당의 합성율이 약 70% 정도까지 증가하다가, 12시간 이상의 반응 시간에서는 갈락토올리고당의 합성율이 약 70% 정도로 일정하여,Tca베타-글라이코시데이즈를 이용한 갈락토올리고당 합성의 경우 최고 합성율에 도달한 이후에도 시간이 흐름에따라 그 합성율이 거의 변하지 않음을 알 수 있었다 (참조: 도 4). 도 4는Tca베타-글라이코시데이즈를 이용한 갈락토올리고당의 합성에 있어 반응 시간에 따른 갈락토스 전이 반응의 결과를 나타낸 그래프로서, 도 4에서 ▲는 글루코스를 나타내며, ■는 락토스, 혹은 일부 갈락토스가 전이된 이당류를 나타내고, ●는 삼당류의 갈락토올리고당을 나타낸다.
반응 온도의 경우, 50 mM 인산 나트륨 완충용액 (pH 6.0) 하에서 12시간 동안 40 ∼ 100℃로 반응시켜 본 결과, 80℃에서 가장 높은 약 75 % 정도의 갈락토올리고당 합성율을 나타냈으며, 70℃와 90℃에서도 약 70% 정도의 합성율을 나타냈다 (참조: 도 5). 도 5는Tca베타-글라이코시데이즈를 이용한 갈락토올리고당의 합성에 있어 반응 온도에 따른 갈락토스 전이 반응의 결과를 나타낸 그래프로서, 도 5에서 ▲는 글루코스를 나타내며, ■는 락토스, 혹은 일부 갈락토스가 전이된 이당류를 나타내고, ●는 삼당류의 갈락토올리고당을 나타낸다.
반응 pH의 경우, 80℃에서 12시간 동안 pH 3 ∼ 10 (pH 3 ∼ 5는 50 mM 구연산염 (citrate) 완충용액, pH 6 ∼ 8은 50 mM 인산 나트륨 완충용액, pH 9 ∼ 10은 50 mM 글라이신-NaOH (glycine-NaOH) 완충용액이 사용되었다)으로 반응시켜 본 결과, pH 6.0에서 가장 높은 약 75% 정도의 갈락토올리고당 합성율을 나타냈으며, pH 5.0에서도 비슷한 정도의 합성율을 나타냈다 (참조: 도 6). 도 6은Tca베타-글라이코시데이즈를 이용한 갈락토올리고당의 합성에 있어 반응 pH에 따른 갈락토스 전이 반응의 결과를 나타낸 그래프로서, 도 6에서 ▲는 글루코스를 나타내며, ■는 락토스, 혹은 일부 갈락토스가 전이된 이당류를 나타내고, ●는 삼당류의 갈락토올리고당을 나타낸다.
일반적으로 고농도의 락토스를 기질로 갈락토스 전이 반응을 수행하면, 갈락토올리고당의 합성율을 높일 수 있을 뿐만 아니라 반응 후 고농도의 갈락토올리고당을 얻을 수 있다는 장점이 있어 산업적으로 매우 유용하다. 하지만, 온도에 따른 락토스의 용해도 (solubility)를 시험해 본 결과, 37℃에서는 약 20% (wt/vol), 60℃에서는 약 40% (wt/vol), 80℃에서는 약 55% (wt/vol) 정도의 용해도를 나타내므로, 고농도의 락토스를 이용하기 위해서는 고온에서의 반응이 필수적이다. 이와 같은 락토스 용해도에 대한 시험 결과를 바탕으로, 50% (wt/vol) 락토스를 기질로Tca베타-글라이코시데이즈를 9 ㎍/㎖ 농도로 첨가하여 상기 최적 조건 하에서 갈락토스 전이 반응을 수행한 후, 박층 크로마토그래피를 통한 정성적 분석과 덴시토미터를 이용한 정량적 분석 결과, 30% (wt/vol) 락토스를 기질로 하여 얻은 결과와 유사하여, 50% (wt/vol) 락토스를 기질로 사용하면 30% (wt/vol) 락토스를 기질로 사용할 때보다 1회 반응 시 더 많은 갈락토올리고당을 얻을 수 있음을 알 수 있었다. 따라서, 내열성Tca베타-글라이코시데이즈는 락토스의 용해도를 증가시킬 수 있는 고온에서의 반응이 가능하여 고농도의 락토스를 기질로 사용할 수 있으므로, 갈락토올리고당의 합성율을 높일 수 있을 뿐만 아니라 반응 후 고농도의 갈락토올리고당을 얻을 수 있으며, 이와 같은 장점들은 산업적으로 유용한 갈락토올리고당의 생산량은 늘이면서 생산단가는 낮추는데 큰 도움을 줄 것이다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 내열성 써머스 칼도필러스 지케이24 베타-글라이코시데이즈 (Thermus caldophilusGK24 β-glycosidase,Tcaβ-glycosidase) 유전자의 대장균 (Escherichia coli) 내에서의 대량발현 시스템과 이 시스템으로부터 대량생산된Tca베타-글라이코시데이즈를 이용한 갈락토올리고당 (galactooligosaccharide)의 합성 조건을 제공한다. 본 발명은 건강의 측면에서 매우 유용하여 식품산업 등에 다양하게 이용될 수 있는 갈락토올리고당의 생산에 있어 가장 중요한 요소인 우수한 갈락토스 전이 활성 (transgalactosylation activity)을 가지는 효소를 제공한다는 데에 의의가 있다. 특히, 본 발명의Tca베타-글라이코시데이즈를 이용한 갈락토올리고당의 합성은 그 예가 많지 않은 내열성을 가지는 갈락토올리고당 합성 효소를 이용한 갈락토올리고당의 합성에 관한 것으로, 다음과 같은 몇 가지 특징 및 효과를 가진다. 첫째, 고온에서의 반응이 가능하여 고농도의 락토스 (lactose)를 기질로 사용할 수 있으므로, 갈락토올리고당의 합성율을 높일 수 있다. 둘째, 합성율이 높아 합성율을 높이기 위한 다른 방법들을 적용할 필요가 없다. 셋째, 반응 후 고농도의 갈락토올리고당을 얻을 수 있다. 넷째, 반응 속도가 빠르고 합성율이 높기 때문에 효소 사용량을 줄일 수 있다. 다섯째, 고온에서의 반응이 가능하여 반응 시에 다른 미생물에 의한 오염을 막을 수 있다. 또한, 본 발명의 내열성Tca베타-글라이코시데이즈 유전자의 대량발현 시스템은 갈락토올리고당 합성 효소의 대량생산을 용이하게 할 뿐만 아니라 생산비용 절감 효과가 있어 결과적으로는 산업적으로 유용한 갈락토올리고당의 생산량은 늘이면서 생산단가는 낮출 수 있다는 데에 의의가 있다.
<110> THE UNIVERSITY OF SUNG GEUN GWAN <120> Synthesis of galactooligosaccharide by Thermus caldophilus GK24 b eta-glycosidase and high-level expression system of recombinant T hermus caldophilus GK24 beta-glycosidase for use in the synthesis <130> 1 <160> 4 <170> KopatentIn 1.6 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 nnnnggatcc gctgttgaca attaatcatc gaac 34 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 nnnngaattc cctttttacg tgaacttg 28 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 nnnngaattc atgaccgaga acgccgaaaa g 31 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 nnnngtcgac gctcagagct gggccc 26

Claims (9)

  1. 고온균 써머스 칼도필러스 지케이24 균주 유래의 내열성 베타-글라이코시데이즈 효소 (thermostableThermus caldophilusGK24 β-glycosidase, thermostableTcaβ-glycosidase)를 이용하여 적절한 반응 조건 하에서 락토스 또는 베타-결합을 하는 당류를 기질로 반응시켜 갈락토올리고당을 생산함을 특징으로 하는 갈락토올리고당의 생산 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 적절한 반응 조건으로서 락토스의 농도가 약 30% ∼ 50% (wt/vol) 범위인 것이 특징인 갈락토올리고당의 생산 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 적절한 반응 조건으로서 상기 효소와 기질의 반응 온도가 약 70 ∼ 90℃ 범위인 것이 특징인 갈락토올리고당의 생산 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 적절한 반응 조건으로서 상기 효소와 기질의 반응 pH가 pH 5.0 ∼ 6.0 범위인 것이 특징인 갈락토올리고당의 생산 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 효소의 농도가 9 ㎍/㎖이고 락토스의 농도가 30 ∼ 50% (wt/vol)일 때, 적절한 반응 조건으로서 효소와 기질의 반응 시간이 12시간, 반응 온도가 80℃, 반응 pH가 6.0인 것이 특징인 갈락토올리고당의 생산 방법.
  6. 내열성 써머스 칼도필러스 지케이24 베타-글라이코시데이즈 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 pTTGL.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 유전자가trp프로모터의 조절 하에서 발현되는 것이 특징인 재조합 플라스미드 pTTGL.
  8. 제 6항의 재조합 플라스미드 pTTGL로 형질전환된 대장균 W3110 (대장균 W3110 / pTTGL)(KCCM 10414).
  9. 제 8항의 형질전환된 대장균 W3110 (대장균 W3110 / pTTGL)(KCCM 10414)에 의해 생산되어지는 재조합 내열성 써머스 칼도필러스 지케이24 베타-글라이코시데이즈 효소.
KR10-2002-0062979A 2002-10-15 2002-10-15 써머스 칼도필러스 지케이24 균주 유래의베타-글라이코시데이즈를 이용한 갈락토올리고당의 합성방법 및 이 방법에 이용되는 써머스 칼도필러스 지케이24베타-글라이코시데이즈의 재조합 대량발현 시스템 KR100440237B1 (ko)

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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS60126033A (ja) * 1983-12-12 1985-07-05 Chuichi Nagata 豆乳を使用する醗酵製品の製造法
WO1991002806A1 (en) * 1989-08-18 1991-03-07 Procur Ab Process for producing an oligosaccharide compound by using glycosidases from a mollusc
WO1997021822A2 (en) * 1995-12-12 1997-06-19 The University Of British Columbia Methods and compositions for synthesis of oligosaccharides using mutant glycosidase enzymes
JP2000041693A (ja) * 1998-07-27 2000-02-15 Morinaga Milk Ind Co Ltd ガラクトオリゴ糖の製造方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS60126033A (ja) * 1983-12-12 1985-07-05 Chuichi Nagata 豆乳を使用する醗酵製品の製造法
WO1991002806A1 (en) * 1989-08-18 1991-03-07 Procur Ab Process for producing an oligosaccharide compound by using glycosidases from a mollusc
WO1997021822A2 (en) * 1995-12-12 1997-06-19 The University Of British Columbia Methods and compositions for synthesis of oligosaccharides using mutant glycosidase enzymes
JP2000041693A (ja) * 1998-07-27 2000-02-15 Morinaga Milk Ind Co Ltd ガラクトオリゴ糖の製造方法

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