SE452776B - Forfarande for framstellning av oligosackarider - Google Patents

Description

15 20 25 30 35 452 776 reaktionen förlöper väsentligt sabbare.

Föreliggande upppfinning har sålunda till ändamål att åstad- komma ett förfarande för enzymatisk syntes av oligoeackaridet utgående fran lägre byggstenar ned till monomerer, och det för uppfinningen kännetecknande är att man i närvaro av ett glykosidas utför omvänd hydrolys genom att reaktionen utföres i en lösning innehållande substrat i hög koncentration, dvs en lösning med mot- svarande lag vattenhalt.

Vid en föredragen utföringsform av förfarandet enligt upp- finningen utföres reaktionen vid förhöjd temperatur, exempelvis vid minst ca 30°C, och temperaturen kan vara sa hög som ända upp till temperaturer liggande nära vattnets kokpunkt, exempelvis ca 75°C.

Det är lämpligt att utföra reaktionen i en lösning som in- nehàller minst ca 50 vikti substrat och särskilt minst ca 70 vikt! subetrat. Även om uppfinningen ej är inskränkt härtill utföres reak- tionen lämpligen utgående fran monomera byggstenar, varvid oli- goeackarider innehållande upp till ca 15 monomera enheter kan framställas. Det är speciellt föredraget att i enlighet med tek- niken enligt uppfinningen utföra den enzymatiska eyntesen under bildning av oligosackarider innehållande 2-5 monomera enheter. Även om uppfinningen kan tillämpas pà samtliga kända socker under användning av motsvarande glykosidas är det dock att föredra att vid reaktionen använda byggstenar utvalda bland följande socker: Ribos, arabinos, xylos, glukos, mannos (Man), galaktoe (Gal), N-acetylglukosamin (GNAc), N-acetylgalaktosamin (GalNAc), N-acetylmannosamin (ManNAc), N-acetylneuraminsyra (NeuNAc), glu- kuronsyra, galakturonsyra, mannuronsyra, iduronsyra, fucos och rhamnos.

Det är särskilt föredraget att vid reaktionen använda ett eller flera av följande socker: Glukos, mannos, galaktos, N-acetylglukosamin, N-acetylga- laktosamin, N-scetylneuraminsyra och fucos.

Uppfinningen är tillämpbar även vid förfaranden där man sam- tidigt utgår från byggstenar, vilka vid en och samma reaktion in- nefattar tva eller flera av de ovan uppräknade sockertyperna, och 10 15 20 25 30 35 452 776 speciellt föredragna kombinationer av socker är härvid utvalda bland: Han-GNAc, Gal-GNAc, Gal-GalNAc, NeuNAc-Gal, NeuNAc-GNAC, NeuNAc-GalNAc, fucos-Gal och fucos-GNAC.

Uppfinningen kan naturligtvis även tillämpas för framställ- ning av oligomerer uppbyggda av en och samma monomera byggsten.

Vid användning av monomera byggstenar är det föredraget att inrikta förfarandet pa framställning av dimerer uppbyggda av en och samma typ av monomer resp, svarande mot ovannämnda särskilda kombinationer.

Reaktionen kan naturligtvis även utföras sä, att en bland- ning av oligomerer erhalles, där de enskilda oligomerslagen sedan kan separeras pa lämpligt sätt.

Tekniken enligt uppfinningen medför väsentliga fördelar, vilka i första hand härrör fran utnyttjningen av höga substrat- koncentrationer, dvs laga vattenhalter i den använda reaktions- lösningen. Den förbättrade enzymstabilitet som uppnas vid an- vändningen av de höga substratkoncentrationer som tekniken enligt uppfinningen anvisar leder i sin tur till att reaktionen kan ut- föras vid väsentligt förhöjd temperatur. Det sammanlagda resul- tatet av dessa särdrag vid uppfinningen ger som resultat följande fördelar: a) väsentligt förhöjda produktutbyten; b) väsentligt förhöjd koncentration av den önskade produk- ten; c> väsentligt förhöjd reaktionshastighet; d) förbättrad stabilitet hos enzymet och därmed utsträckt livslängd.

Som exempel pa tillämpning av tekniken enligt uppfinningen kan nämnas framställning av oligoeackarider utgående fran monomera enheter av mannos. Vid uppvärmning till ca 75°C kan mannos lösas till mycket hög koncentration, mer än 85 vikt%, och en sadan hög- koncentrerad mannoelösning kan bibehallas vid rumstemperatur under någon timme innan sockerkristallisation insätter. I anslutning till uppfinningens tillkomst gjordes nu den förvånande upptäckten att det använda enzymet, mannosidas, accepterade denna höga sub- stratkoncentration utan att påverkas negativt. 10 15 20 25 3U 35 452 776 Eftersom en substratlösning innehållande denna höga koncen- tration av socker lätt underkastas utkristallisation av sockret är det lämpligt att höja temperaturen, och det visar sig härvid helt överraskande att enzymet icke påverkas av den höga temperaturen.

Reaktionen kunde sålunda genomföras vid ca 75°C, varvid reak- tionshaetigheten var ca 30 gånger större än vid rumstemperatur.

Uppenbarligen medför den höga substrathalten att enzymet stabi- liseras så att någon värmeinaktivering icke uppträder.

Beträffande använda enzymer användes naturligtvis eadana som ger önskad produkt och som motsvarar den använda kolhydrattypen.

Vid framställning av exempelvis oligosackarider av mannos kan sa- lunda användas lämpligt mannosidas, exempelvis u-mannosidas.

Uppfinningen kommer nu att illustreras närmare genom icke inskränkande exempel. Dessa illustrerar framställningen av nagra olika typer av oligosackarider under tillämpning av tekniken en- ligt uppfinningen. I exemplen angivna procenttal avser vikten om ej annat anges.

EXEMPEL 1 Reverserino med ß-qalaktosidas fràn Eicoli i 36% qalaktos. 0,8 g galaktos och 1,2 g H20 upphettades i vattenbad tills all galaktos upplöste, och lösningen tilläts därefter svalna till rumstemperatur. Till 1,5 ml av galaktoslösningen sattes 20/ul 1M fosfatbuffert, pH 7,2 och 0,15 ml enzymlösning innehållande 185 enzymenheter. Blandningen inkuberades vid rumstemperatur, och pro- dukterna detekterades med HPLC. Efter det att jämvikt uppnåtts, avbröts reaktionen genom upphettning på kokande vattenbad 10 min., och en slutbestämning av utbytet gjordes medelst GC. Utbytet en- ligt GC blev 10% disackarid (w/w).

EXEHPEL 2 - als t sidas från E coli ut aende från alaktos och N-acetylgalaktgsamig, 9 mg galaktos upplöstes i 21 mg 20mM fosfatbuffert, pH 7,5, Reverserin med genom upphettning på kokande vattenbad. Efter avevalning till rumstemperatur tillsattes 24 mg GalNAc under omrörning. Frystor- kat, rent ßgalaktosidae (450 enzymenheter (U)) tillsattes till 200 U/ml. 10 15 20 25 30 35 452 776 I Efter 2 dygn avbröts reaktionen genom upphettning pa kokande vattenbad i 5 min. Analyser med GC-MS visade att 5% galaktos (w/w) baserat pa den totala sockermängden hade bundits in som disacka- rid. Av detta förelag 2-3! som Gal-GalNAc. Endast 1,6-isomeren kunde aterfinnas.

EXEMEEL 3 Reversering stor skala i 83% maggog, 5 g mannos upplöstes i 0,883 g buffert (20 mM fosfat-citrat, 50 mM KCl, 1 mM 2nCl, och 0,02% azid) genom upphettning pa kokande vattenbad i ett provrör med tättslutande skruvlock, och lösningen tilläts sedan svalna nagot. 0,3 ml<1-mannosidas fran jack bean i buffert (130 enzymenheter/ml) tillsattes, och blandningen inku- berades vid 75°C. Aktiviteten i reaktionsblandningen var efter 1 dygn uppe i 6 U/ml och höll sig oförändrad under tiden reaktionen tilläts fortgå. Produkter detekterades med HPLC.

Efter 3 dygn avbröts reaktionen genom upphettning pa kokande vattenbad, och slutgiltig analys och utbytesbestämning utfördes med GC-MS. Utbytet av di-, tri-, tetra-, och högre oligosackarider blev 30, 25, 10 resp. 5%. .u EXEMPEL 4 Reversering i mannos: Utbvtesbeetämgigg vid olika mannoskoncentrg- tioner, Hannes, buffert (se Exempel 3 ovan), och enzymlösning (ca 150 enzymenheter/ml) vigdes upp och blandades , så att koncentra- tionen av mannos blev 20, 30, 55 resp. 85! (w/w>. I fallet med 85% mannos krävdes upphettning på kokande vattenbad av mannos och buf- fert innan enzymet tillsattes för att mannosen skulle lösa sig, medan i de övriga fallen mannosen kunde lösas vid rumstemperatur.

Proverna inkuberades vid 50°C, och bildningen av disackarider följdes med HPLC. Da mängden disackarid slutat öka i resp. prov avbröts reaktionen genom upphettning på kokande vattenbad i 12 min.

En slutbestämning av utbytet gjordes medelst GC. Utbytet av disackarider i 20, 30, 55 och 85% mannos blev 22, 25, 31, resp. 39% baserat pa den totala sockermângden. 452 776 Det bör observeras att föteliggande uppfinning ingalunda är inskränkt till de i ovanstående exempel angivna eockerarterna utan att den kan tillämpas pà alla kända typer av socker under använd- ning av motsvarande glykoeidae som enzym.

Claims (11)

452 776 BÅIEETKRAV

1. Förfarande för att enzymatiskt syntetisera oligosacka- rider utgående fran lägre byggstenar ned till monomerer, kännetecknat därav, att man i närvaro av ett glykoeidas utför omvänd hydrolys genom att reaktionen utföres i en lösning med en eubetrathalt av minst ca 50 viktprocent, och vid förhöjd temperatur, nämligen vid minst ca 30°C.

2. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat därav, att reaktionen utföres i en lösning innehållande minet ca 70 viktß substrat;

3. Förfarande enligt patentkrav 1 eller 2, kännetecknat därav, att reaktionen utföres utgående fran monomera byggstenar.

4. Förfarande enligt nagot av föregående patentkrav, kännetecknat därav, att reaktionen utföres under syntetisering av oligosackarider innehallande upp till ca 15 monomera enheter.

5. Förfarande enligt patentkrav 4, kännetecknar därav, att reaktionen utföres under syntetieering av oligosackarider inne- A hållande 2-5 monomera enheter.

6. Förfarande enligt nagot av föregående patentkrav, kännetacknat därav, att reaktionen utföres utgående fran bygg- stenar utvalda bland: Riboe, arabinos, xylos, glukos, mannoe (Man), galaktos (Gal), N-acetylglukosamin (GNAc), N-acety1- galaktoeamin (GalNAc), N-acetylmannosamin (ManNAc), N-acetyl- neuraminsyra (NeuNAc), glukuronsvra, galakturonsyra, mannuroneyra, iduronsyra, fucos och rhamnos.

7. Förfarande enligt patentkrav 6, kännetecknat därav, att reaktionen utföres utgående fran byggstenar utvalda bland: Glukos mannoe, galaktos, N-acetylglukosamin, N-acetylgalaktosamin, N- acetylneuraminsyra och fucos.

8. Förfarande enligt patentkrav 5, kännetacknat därav, att reaktionen utföres utgående fran byggstenskombinationer utvalda bland: Man-GNAc, Gal-GNAC, Gal-GalNAc, NeuNAc-Gal, NeuNAc-GNAC, NeuNAc-GalNAc, fucoe-Gal och fucos-GNAc.

9. Förfarande enligt patentkrav 7 för framställning av oligomerer uppbyggda av en och samma monomera byggsten.

10. Förfarande enligt patentkrav 8 för framställning av dimerer svarande mot nämnda kombinationer. _

11. Förfarande enligt patentkrav 7 för framställning av oligoeackarider utgående fran mannos som monomer byggaten.