DK172544B1

DK172544B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af 1-0-alfa-D-glucopyranosido-D-fructose ved enzymatisk omdannelse af saccharose

Info

Publication number: DK172544B1
Application number: DK199200096A
Authority: DK
Inventors: Mohammad Munir
Original assignee: Suedzucker Ag
Priority date: 1982-04-07
Filing date: 1992-01-27
Publication date: 1998-12-14
Also published as: IE54643B1; DK9692A; JPS592695A; IE830642L; EP0091063A2; FI831105L; EP0091063A3; DE3372294D1; DK122983A; CA1185551A; ATE28084T1; DK9692D0; JPH0661274B2; ES521240A0; DE3213107A1; DK167366B1; DK122983D0; ES8401985A1; FI72345C; FI831105A0

Description

DK PR 172544 B1 i

Den foreliggende opfindelse angår en særlig fremgangsmåde til fremstilling af 1-0-a-glucopyranosido-D-fructose ved enzymatisk omdannelse af saccharose ved hjælp af mikroorganismer, som kan danne isomaltulose (6-0-a-D-glu-5 copyranosido-D-fructose) ud fra saccharose. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er særegen ved det i krav 1 ’ s kendetegnende del angivne.

Fra dansk patentansøgning nr. 4349/81 kendes en frem-10 gangsmåde til fremstilling af isomaltulose ved enzymatisk omdannelse af saccharose, hvorved man bringer rene sac-charoseopløsninger i kontakt med døde, immobiliserede celler af mikroorganismer, som kan danne isomaltulose ud fra saccharose. Ved denne fremgangsmåde leder man ved en 15 temperatur på 40-65 *C kontinuerligt saccharoseopløsnin-ger i koncentrationsområdet 45-75 vægt-%, fortrinsvis 65-75 vægt-% gennem en reaktor, der er fyldt med immobilise-rede celler. Den derved dannede isomaltulose udvindes i krystallinsk form på i og for sig kendt måde.

20

De mikroorganismer, der anvendes ved denne kendte fremgangsmåde, kan f.eks. være Protaminobacter rubrum (CBS 574.77), Serratla plymuthica (ATCC 15928), Serratia mar-cescens (NCIB 8285) eller Leuconostoc mesenteroides (NRRL 25 B-512 F (ATCC 10830a)), men er fortrinsvis Protaminobac- ter rubrum (CBS 574.77).

Det har ved gennemførelsen af denne kendte fremgangsmåde vist sig, at en stor andel (op til 1/3) af den tilførte 30 saccharose hyppigt ikke omdannes til den ønskede forbindelse (isomaltulose), men derimod til biprodukter, og/el-ler at den forbliver 1 uomsat tilstand i reaktionsopløsningen. Eftersom disse biprodukter også hæmmer krystallisationen af den dannede isomaltulose og derved yderligere 35 sænker udbyttet af krystaller, har det været af stor økonomisk Interesse at tilvejebringe en fremgangsmåde, som 2 DK PR 172544 B1 helt eller i det mindste delvis forhindrer dannelsen af uønskede og generende biprodukter.

Dette lykkedes med stamansøgningen til nærværende ansøg-5 ning (dansk patentansøgning nr. 1229/83), ifølge hvilken det er muligt at udvinde isomaltulose med høj renhedsgrad og i stort udbytte ud fra saccharose, hvis man deler saccharoseopløsningen med en koncentration på 40-75 vægt-%, fortrinsvis 45-60 vægt-%, i to dele og leder den før-10 ste del gennem en reaktor, som er fyldt med immobiliserede, døde celler af mikroorganismer, som kan danne isomaltulose ud fra saccharose, ved 25-40 *C, fortrinsvis 30-40 *C på en sådan måde, at 80-90% af saccharosen bliver omdannet. Derefter blander man den anden del af saccha-15 roseopløsningen med moderluden fra en forudgående isomal-tulose-krystallisation, hvorpå man leder denne opløsning igennem en anden reaktor, der er fyldt med immobilisere-de, døde celler af mikroorganismer, som kan danne isomaltulose ud fra saccharose, ved 25-40 *C, fortrinsvis 30-40 20 * C, på en sådan måde, at saccharosen omdannes næsten fuldstændigt. Endelig udvinder man på i og for sig kendt måde den opnåede isomaltulose fra denne opløsning i krystallinsk form, opløser krystallerne i den først opnåede isomaltuloseopløsning og fremkalder en krystalli-25 sation, fraseparerer de således dannede isomaltulose-kry-staller og anvender moderluden til blanding med endnu en saccharoseopløsning.

Et af aspekterne ved fremgangsmåden ifølge dansk patent-30 ansøgning nr. 1229/83 er, at man fra moderluden fra iso-maltuloseudvindingen efter forudgående opkoncentrering kan udvinde en vandig opløsning indeholdende 1-O-a-D-glu-copyranosido-D-fructose. Fra denne vandige opløsning kan man derefter på i og for sig kendt måde opnå 1-0-a-D-glu-35 copyranosido-D-fructose i tør form. Den forudgående opkoncentrering sker ved udkrystallisation af en yderligere 3 DK PR 172544 B1 del af isomaltulosen fra methanol og fjernelse af de med gær forgærbare sukkerarter ved behandling med fri eller immobiliseret gær og påfølgende kromatografisk separation med ionbyttere eller andre egnede separationsmaterialer.

5

Denne særlige fremgangsmåde til fremstilling af l-0-α-glucopyranosido-D-fructose er genstand for nærværende ansøgning .

10 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen illustreres i det nedenstående eksempel 3. Eksempel 1 og 2 er sammenlign!ngs-eksempler, hvor eksempel 1 svarer til eksempel 1 i DK patentansøgning nr. 4349/81.

* 15 EKSEMPEL 1 (Sammenligningseksempel) a) Man skyller celler fra en podning af stammen Protami-nobacter rubrum (CBS 574.77) med 10 ml af et sterilt næringssubstrat, som består af 8 kg tyksaft fra en sukker-20 fabrik (tørstofindhold - 65%), 2 kg majsstøbevand, 0,1 kg (NH«)j HPO« og 89,9 kg destilleret vand, efter behov indstillet på pH 7,2. Denne suspension tjener som podemateriale for en forkultur i rystemaskine i 1 liter kolber Indeholdende 200 ml næringsopløsning med den ovenfor be-25 skrevne sammensætning.

Efter 30 timers dyrkning ved 39 *C podes 16 liter næringsopløsning med den ovennævnte sammensætning i en 30 liter mlnifermentor med indholdet af 20 kolber (4 1), og 30 der fermenteres ved 29 *C med 20 1 luft pr. minut og en omrøringshastighed på 350 omdr./min. Det tiltagende kimtal bestemmes mikroskopisk. Efter at man har opnået et kimtal på 5 x 109 kim/ml, overføres fermentorens Indhold til en anden beholder, hvor der tilsættes et kationaktivt 35 flokkuleringsmiddel (som f.eks. "Primafloc C7" fra firmaet Rohm & Haas, Philadelphia, USA). Man lader de udflok- DK PR 172544 B1 4 kede celler sætte sig, fradekanterer, vasker med 0,1 M phosphatpuffer (pH 7,0) og fjerner vandet ved centrifugering. Massen ekstruderes derpå til stænger, som lufttør-res og formales.

5 b) Sigtefraktionen 0,3-0,8 mm af det ovenfor udvundne præparat omrøres i en 0,1% glutaraldehydopløsning i 10 minutter, vaskes med phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,0) og fyldes under vand på en søjle, hvis temperatur kan regu-10 leres. Søjlen opvarmes derpå til 50 °C og gennemstrømmes kontinuerligt med en 70 vægt-% saccharoseopløsning. Strømningshastigheden afpasses således, at man ved søjlens udløb ikke længere kan påvise nogen saccharose. Den på denne måde indvundne isomaltuloseopløsning har følgen-15 de gennemsnitlige sammensætning (HPLC = højtryksvæskekromatografi) :

Fructose 7,4 g/100 g tørstof

Glucose 0,3 g/100 g " 20 Saccharose 0,1 g/100 g "

Isomaltulose 62,6 g/100 g " 1-0-a-D-glucopyranosido-D-fructose 16,6 g/100 g "

Oligosaccharider 13,0 g/100 g " 25 Denne opløsning overføres til en nedkølingskrystallisator og køles til 20 °C, hvorefter den udkrystalliserede isomaltulose separeres fra moderluden i en sigtekurvcentri-fuge.

30 Udbytte 100 kg af en opløsning indeholdende 70 kg saccharose indeholder efter omsætningen 43,8 kg isomaltulose (62,6% af tørstofindholdet). Heraf udvinder man ved den første kry-35 stallisation 15,9 kg ren isomaltulose og ved den anden krystallisation 13,4 kg isomaltulose med 98% renhed. Det- 5 DK PR 172544 B1 te svarer til et samlet udbytte på 29 kg ren isomaltulose ud fra 70 kg saccharose eller 41,4% af råstoffet. (I dette eksempel og i de efterfølgende eksempler regnes der med vandfri isomaltulose).

5 EKSEMPEL 2

Sigtefraktionen 0,3-0,8 mm af et analogt med eksempel la fremstillet præparat omrøres i 10 minutter i en 0,1% glu-10 taraldehydopløsning, vaskes med phosphatpuffer (0,1 M, pH

7,0) og fyldes under vand på en søjle, hvis temperatur kan reguleres. Søjlen opvarmes derpå til 30 *C og gennemstrømmes kontinuerligt med en 50 vægt-% saccharoseopløs-ning. Strømningshastigheden afpasses således, at man ved 15 søjlens udløb ikke længere kan påvise nogen saccharose.

Den således udvundne isomaltuloseopløsning har følgende gennemsnitlige sammensætning (HPLC):

Fructose 3,6 g/100 g tørstof 20 Glucose 1,8 g/100 g "

Saccharose O

isomaltulose 78,4 g/100 g " l-O-a-D-glucopyranosido-D-fructose 12,6 g/100 g "

Oligosaccharider 3,6 g/100 g " 25

Denne opløsning inddampes til 78-82% tørstofindhold, overføres til en nedkølingskrystallisator og køles til 20 *C, hvorefter den udkrystalliserede isomaltulose separeres fra moderluden i en sigtekurvcentrifuge. Moderluden 30 Inddampes igen til 78-82% tørstofindhold og underkastes et andet nedkølingskrystallisationstrin til 20 *C, hvorpå den udkrystalliserede anden isomaltulosemængde separeres fra moderluden i en sigtekurvcentrifuge.

35 6 DK PR 172544 B1

Udbytte: 100 kg af en opløsning indeholdende 50 kg saccharose indeholder efter omsætningen 39,2 kg isomaltulose (78,4% af 5 tørstofindholdet). Deraf udvinder man ved den første krystallisation 25,0 kg ren isomaltulose og ved den anden krystallisation 9,6 kg isomaltulose med 98% renhed. Dette svarer til et samlet udbytte på 34,4 kg ren isomaltulose ud fra 50 kg saccharose eller 68,8% af råstoffet.

10 EKSEMPEL 3

Sigtefraktionen 0,3-0,8 mm af et analogt med eksempel la fremstillet præparat omrøres i 10 minutter i en 0,1% glu-15 taraldehydopløsning, vaskes med phosphatpuffer (0,1M, pH

7,0) og fyldes under vand på to søjler, hvis temperatur reguleres til 30 *C.

Fremgangsmåden belyses nærmere ved hjælp af skemaet vist 20 på fig. 1.

Den ene af søjlerne (1) gennemstrømmes kontinuerligt af en 50 vægt-% saccharoseopløsning. Strømningshastigheden reguleres således, at der ved gennemstrømning af søjlen 25 kun omdannes ca. 90% af saccharosen. Den herved opnåede reaktionsopløsning har følgende sammensætning (HPLC):

Fructose 2,9 g/100 g tørstof

Glucose 1,6 g/100 g " 30 Saccharose 10,8 g/100 g "

Isomaltulose 75,2 g/100 g " 1-0-a-D-glucopyranosido-D-fructose 6,4 g/100 g "

Oligosaccharider 3,1 g/100 g " 35 Parallelt med den første søjle tilføres den anden søjle (2) et substrat, som består af en blanding af saccharose 7 DK PR 172544 B1 og moderlud fra en forudgående isomaltulose-krystallisa-tion. Dette substrat har sammensætningen (HPLC): Tørstofindhold 50 vægt-% 5 Fructose 2,0 g/100 g tørstof

Glucose 1,0 g/100 g "

Saccharose 76,2 g/100 g "

Isomaltulose 10,8 g/100 g " 1-0-a-D-glucopyranosido-D-fructose 8,2 g/100 g " 10 Oligosaccharider 1,8 g/100 g "

Strømningshastigheden gennem denne søjle reguleres på en sådan måde, at opløsningen ved udgangen fra søjlen højst indeholder 1 g saccharose pr. 100 g tørstof. Den på denne 15 måde opnåede reaktionsopløsning har følgende sammensætning (HPLC):

Fructose 5,4 g/100 g tørstof

Glucose 2,2 g/100 g " 20 Saccharose 1,0 g/100 g "

Isomaltulose 72,3 g/100 g " 1-0-a-D-glucopyranosido-D-fructose 16,6 g/100 g "

Oligosaccharider 2,5 g/100 g " 25 Denne opløsning inddampes til 78-82% tørstofindhold og underkastes en nedkølingskrystallisation ved 20 *C, hvorefter den udkrystalliserede isomaltulose separeres fra denne anden moderlud i en sigtekurvcentrifuge.

30 Den på dette trin opnåede isomaltulose opløses i den reaktionsopløsning, der opnås fra den første søjle, og som inddampes til 78-82% tørstofindhold. Opløsningen afkøles i en nedkølingskrystallisator til 20 *C, og den udkry-stalliserede, rene Isomaltulose adskilles fra moderluden 35 i en sigtekurvcentrifuge. Den moderlud, der opstår på 8 DK PR 172544 B1 dette trin, anvendes til substratfremstillingen for den anden søjle.

Den anden moderlud, der også kan betegnes som melasse, 5 indeholder ca. 30-40% af tørstoffet i form af 1-O-a-D-glucopyranosido-D-fructose og kan ifølge opfindelsen anvendes som råstof ved udvinding af denne sukkerart. Udvindingen af denne sukkerart kan f.eks. gennemføres ved kromatografisk adskillelse på en ionbytter eller på et 10 andet egnet separationsmateriale efter en forudgående koncentration ved udkrystallisation af endnu en del af isomaltulosen fra methanol og fjernelse af sukkerarter, der er forgærbare med gær, ved behandling med frit eller immobiliseret gær.

15

Udbytte

Ved at gå frem på den måde, der er beskrevet i dette eksempel, udvinder man pr. 100 kg saccharose 80,0 kg ren 20 isomaltulose.

Claims

1. Fremgangsmåde til fremstilling af 1-0-a-glucopyranosi-5 do-D-fructose ved enzymatisk omdannelse af saccharose ved hjælp af mikroorganismer, som kan danne isomaltulose ud fra saccharose, kendetegnet ved, at man deler en saccharoseopløsning med en koncentration på 40-75 vægt-%, fortrinsvis 45-60 vægt-% i to og leder den første 10 del gennem en reaktor fyldt med immobiliserede døde celler af sådanne mikroorganismer ved 25-40 °C, fortrinsvis 30-40 °C, på en sådan måde, at 80-90% af saccharosen bliver omdannet, og at man blander en anden del af sac-charoseopløsningen med moderluden fra en forudgående 15 isomaltulose-krystallisation og leder denne opløsning gennem en anden reaktor fyldt med immobiliserede døde celler af sådanne mikroorganismer ved 25-40 °C, fortrinsvis 30-40 °C, på en sådan måde, at saccharosen omdannes næsten fuldstændigt, og på i og for sig kendt måde udvin-20 der den således dannede isomaltulose i krystallinsk form, hvorpå man efter opkoncentrering af den opståede anden moderlud ved udkrystallisation af en yderligere del af isomaltulosen fra methanol og fjernelse af de med gær forgærbare sukkerarter ved behandling med fri eller immo-25 biliseret gær først udvinder 1-O-a-glucopyranosido-D-fructosen som vandig opløsning ved chromatografisk adskillelse med ionbyttere eller andre egnede adskillelsesmaterialer og derpå ved i og for sig kendte metoder overfører den i tør form. 30

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at de anvendte mikroorganismer er valgt blandt Protaminobacter rubrum {CBS 574.77), Serratia plymuthica (ATCC 15928), Serratia marcescens (NCIB 8285) eller Leu- 35 conostoc mesenteroides (NRRL B-512 F (ATCC 10830 a)), fortrinsvis Protaminobacter rubrum (CBS 574.77).