JP3375129B2 - 炭水化物の酵素的合成法 - Google Patents
炭水化物の酵素的合成法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ガラクトースを含む炭水化物およびグルコ
ースを含む炭水化物の誘導体であって、例えば血液型決
定因子のような生物学的レセプター構造体の合成にも好
適なもの、または医学／診断への応用に直接用いること
のできる他の誘導体の合成法に関する。
ースを含む炭水化物の誘導体であって、例えば血液型決
定因子のような生物学的レセプター構造体の合成にも好
適なもの、または医学／診断への応用に直接用いること
のできる他の誘導体の合成法に関する。
炭水化物は、生体において、その代謝におけるエネル
ギー源として、環境に対する防護のために生物学的指標
として、レセプター物質としておよび抗原決定基とし
て、中枢的機能を有する。糖タンパクおよび糖脂質のオ
リゴサッカライド部分は、インビボで重要なものである
（Biology of Carbohydrates,vol.2,Ginsburg et al.,W
iley,New York,1984;The Glycoconjugates,vol.I−V,Ac
ademic Press,New York;S.Hakomori,Ann.Rev.BioChem.,
vol.50,pp.733−64;Feizi,Nature,pp.314,1985;S.Hakom
ori,Chemistry and Physics of Lipids,vol.42,pp.209
−33）。とりわけ、下記のことが見出されている。
ギー源として、環境に対する防護のために生物学的指標
として、レセプター物質としておよび抗原決定基とし
て、中枢的機能を有する。糖タンパクおよび糖脂質のオ
リゴサッカライド部分は、インビボで重要なものである
（Biology of Carbohydrates,vol.2,Ginsburg et al.,W
iley,New York,1984;The Glycoconjugates,vol.I−V,Ac
ademic Press,New York;S.Hakomori,Ann.Rev.BioChem.,
vol.50,pp.733−64;Feizi,Nature,pp.314,1985;S.Hakom
ori,Chemistry and Physics of Lipids,vol.42,pp.209
−33）。とりわけ、下記のことが見出されている。
この炭水化物構造体は、糖タンパクの安定性、活性、
局在化、抗原性および分解にとって重要である。
局在化、抗原性および分解にとって重要である。
炭水化物は、抗原決定基（例えば血液型抗原）であ
る。
る。
炭水化物は、病原体、タンパク質、ホルモン、毒素の
細胞表面に結合したときおよび細胞−細胞の相互作用中
に、レセプターとして機能する。
細胞表面に結合したときおよび細胞−細胞の相互作用中
に、レセプターとして機能する。
特異的オリゴサッカライドが癌関連の抗原決定基であ
ることが見出されており、炭水化物は発癌性にとって重
要である。
ることが見出されており、炭水化物は発癌性にとって重
要である。
十分な生物学的活性（例えばレセプター活性）には、
複合糖質の炭水化物部分の小配列（ジ−またはトリサッ
カライド）しか必要でないことが多い。
複合糖質の炭水化物部分の小配列（ジ−またはトリサッ
カライド）しか必要でないことが多い。
１種類以上の修飾／誘導したモノサッカライド単位、
例えばデオキシ−、ホスホ−、スルフェート−、誘導体
形成したアミノ−またはチオ基を含むオリゴサッカライ
ド誘導体は、物質の代謝を修飾し、および／または天然
物質の生物学的効果を増加させるための、炭水化物の医
薬または診断への応用における大きな関心事となってい
る。
例えばデオキシ−、ホスホ−、スルフェート−、誘導体
形成したアミノ−またはチオ基を含むオリゴサッカライ
ド誘導体は、物質の代謝を修飾し、および／または天然
物質の生物学的効果を増加させるための、炭水化物の医
薬または診断への応用における大きな関心事となってい
る。
また炭水化物誘導体は通常、合成中間体として用い
て、炭水化物の選択的有機化学的合成を行うのにも用い
られる（例えばBinkley:Modern Carbohydrate Chemistr
y,Marcel Dekker,New York,1988を参照されたい）。炭
水化物の選択的な化学合成には、多くの合成段階による
最新の保護基の化学が必要であるが、これはとりわけ、
選択的に修飾された炭水化物中間体の合成が複雑だから
である。このようなことから、前記のような炭水化物中
間体の調製に、効率的技術が所望されるのである。
て、炭水化物の選択的有機化学的合成を行うのにも用い
られる（例えばBinkley:Modern Carbohydrate Chemistr
y,Marcel Dekker,New York,1988を参照されたい）。炭
水化物の選択的な化学合成には、多くの合成段階による
最新の保護基の化学が必要であるが、これはとりわけ、
選択的に修飾された炭水化物中間体の合成が複雑だから
である。このようなことから、前記のような炭水化物中
間体の調製に、効率的技術が所望されるのである。
本発明では、誘導体形成／修飾したジ−、トリ−およ
び高級オリゴサッカライドの、格段に簡略化した合成を
可能にする方法について説明する。従来の方法で合成を
行うのに数段階の反応を必要とした炭水化物誘導体は、
本発明による方法によって僅か１段階のみの反応で、か
つ絶対立体特異的に得ることができ、またこの方法は、
幾分毒性のある試薬、例えばAg−トリフレートまたはシ
アン化水銀を用い、しかも所望なα−またはβ−異性体
が望ましくない立体異性体と共に得られるような化学的
方法とも異なる。
び高級オリゴサッカライドの、格段に簡略化した合成を
可能にする方法について説明する。従来の方法で合成を
行うのに数段階の反応を必要とした炭水化物誘導体は、
本発明による方法によって僅か１段階のみの反応で、か
つ絶対立体特異的に得ることができ、またこの方法は、
幾分毒性のある試薬、例えばAg−トリフレートまたはシ
アン化水銀を用い、しかも所望なα−またはβ−異性体
が望ましくない立体異性体と共に得られるような化学的
方法とも異なる。
本発明による合成法は、グリコシダーゼ（EC3.2）を
蝕媒として用いて、ガラクトース誘導体またはグルコー
ス誘導体から成るアクセプター（acceptor）物質、モノ
サッカライド、オリゴサッカライドまたはグリコシドで
あるグリコシルドナーとの平衡反応またはグリコシル基
転移反応を行い、および生成物を後続する合成に用い、
および／または生成物の混合物から単離することを特徴
とする少なくとも１つの方法を包含している。
蝕媒として用いて、ガラクトース誘導体またはグルコー
ス誘導体から成るアクセプター（acceptor）物質、モノ
サッカライド、オリゴサッカライドまたはグリコシドで
あるグリコシルドナーとの平衡反応またはグリコシル基
転移反応を行い、および生成物を後続する合成に用い、
および／または生成物の混合物から単離することを特徴
とする少なくとも１つの方法を包含している。
このように本発明によれば、直接にまたは別の合成を
行った後に、様々な応用、例えば医薬／医療／診断の研
究に、治療、診断への応用に、化粧品または食品の添加
物として、分離材料の修飾に、アフィニティークロマト
グラフィー、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、脂肪
酸、脂質、酵素、組換えタンパク質の修飾などに用いる
ことができるジ−、トリ−または高級オリゴサッカライ
ド誘導体の立体特異的合成法が得られる。
行った後に、様々な応用、例えば医薬／医療／診断の研
究に、治療、診断への応用に、化粧品または食品の添加
物として、分離材料の修飾に、アフィニティークロマト
グラフィー、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、脂肪
酸、脂質、酵素、組換えタンパク質の修飾などに用いる
ことができるジ−、トリ−または高級オリゴサッカライ
ド誘導体の立体特異的合成法が得られる。
本発明による合成において、グリコシダーゼが、グリ
コシルドナー（下図のDORであり、Ｄは転移した炭水化
物部分を表す）とグリコシルアクセプター（HOA）の間
の立体特異的グリコシド結合を形成する能力は下図に要
約した通りである。
コシルドナー（下図のDORであり、Ｄは転移した炭水化
物部分を表す）とグリコシルアクセプター（HOA）の間
の立体特異的グリコシド結合を形成する能力は下図に要
約した通りである。
DOR＋HOADOA＋HOR （１）
本発明による反応は、平衡制御合成（Ｒ＝Ｈ）または
グリコシル基転移反応（Ｒ＝Ｆまたは有機基：速度制御
した反応）の２つの原理にしたがって行うことができ
る。これらの型の反応は専門家に周知であり、それらの
実行並びにグリコシルドナーおよびグリコシダーゼの選
択は、本発明の範囲を制限するものではない。
グリコシル基転移反応（Ｒ＝Ｆまたは有機基：速度制御
した反応）の２つの原理にしたがって行うことができ
る。これらの型の反応は専門家に周知であり、それらの
実行並びにグリコシルドナーおよびグリコシダーゼの選
択は、本発明の範囲を制限するものではない。
本発明による方法に用いることのできるアクセプター
物質の例としては、Ｄ−ガラクタル、Ｄ−グルカル、お
よびＤ−ガラクタル、Ｄ−グルカルであって１種類以上
の有機または無機の基によってＣ−３、Ｃ−４、Ｃ−５
またはＣ−６の１つ以上の位置で修飾されたもの、およ
びＤ−ガラクトピラノース−またはＤ−グルコピラノー
スであって１種類または数種類の有機または無機の基に
よってＣ−２、Ｃ−３、Ｃ−４またはＣ−６の１つまた
はそれ以上の位置で修飾されたもの、またはそれらの誘
導体のグリコシドが挙げられる。同様なＮ−アセチル−
グルコピラノースおよびＮ−アセチル−ガラクトピラノ
ースの誘導体を、本発明による方法に用いることもでき
る。
物質の例としては、Ｄ−ガラクタル、Ｄ−グルカル、お
よびＤ−ガラクタル、Ｄ−グルカルであって１種類以上
の有機または無機の基によってＣ−３、Ｃ−４、Ｃ−５
またはＣ−６の１つ以上の位置で修飾されたもの、およ
びＤ−ガラクトピラノース−またはＤ−グルコピラノー
スであって１種類または数種類の有機または無機の基に
よってＣ−２、Ｃ−３、Ｃ−４またはＣ−６の１つまた
はそれ以上の位置で修飾されたもの、またはそれらの誘
導体のグリコシドが挙げられる。同様なＮ−アセチル−
グルコピラノースおよびＮ−アセチル−ガラクトピラノ
ースの誘導体を、本発明による方法に用いることもでき
る。
下記の図は、アクセプター物質（前記の図１中のHO
A）として用いて本発明によるオリゴサッカライド誘導
体を形成することのできる構造体を例示している。
A）として用いて本発明によるオリゴサッカライド誘導
体を形成することのできる構造体を例示している。
この構造体は、各々誘導／修飾したＤ−ガラクトピラ
ノースおよびＤ−グルコピラノースを表す（Ｄ−ガラク
トピラノースおよびＤ−グルコピラノースにおいては、
R1＝R2＝R3＝R4＝R6＝OHであり、Ｎ−アセチル−グルコ
ースアミンおよびＮ−アセチル−ガラクトースアミンに
おいては、R2＝NHAc、AC＝アセチル基、Ph＝フェニル
基、Bz＝ベンゾイル基、All＝アリル基である）。
ノースおよびＤ−グルコピラノースを表す（Ｄ−ガラク
トピラノースおよびＤ−グルコピラノースにおいては、
R1＝R2＝R3＝R4＝R6＝OHであり、Ｎ−アセチル−グルコ
ースアミンおよびＮ−アセチル−ガラクトースアミンに
おいては、R2＝NHAc、AC＝アセチル基、Ph＝フェニル
基、Bz＝ベンゾイル基、All＝アリル基である）。
Ri（ｉ＝１−６）が、ヒドロキシル（−OH）、−Ｆ、ま
たは無機または有機の基であり、R2、R3、R4、またはR6
の１〜３個が、ヒドロキシル基ではないとき、−R1は、
例えば−OH、−Ｆ、−OMe、−OAll、−OPh、−OCH2Ph、
−OEtBr、−OEtSiMe3、−Ｏ（CH2）3CH＝CH2、−SMe、
−SEt、−SPh、炭水化物、脂質−またはアミノ酸−また
はペプチド誘導体またはアノマー炭素に結合した他の基
の１つであることができる。−R2、−R3、−R4および／
または−R6は、いずれも例えば前記の基の１つである
か、または例えば−NHAc、NHC（Ｏ）CH2Cl（Ｎ−クロロ
メトキシアセチル）、NHC（Ｏ）CH2OPh（Ｎ−フェノキ
シアセチル−）、−NHBOC、−NHOH、−N3、−ｐ−メト
キシベンジルエーテル（−OCH2Ph−OMe−ｐ）、トリチ
ル基（−OC（Ph）３）、トリアルキルシリルエーテル
基、ピバロイル基、テトラヒドロピラニル、（２−メト
キシエトキシ）メチルイソプロピリデンケタール、シク
ロヘキシリデンケタール、ベンジリデンアセタール、オ
ルトエステル、−ONO3、トシレート−、メシレート−、
スルフェート−、ホスフェート−、カルボキシレート
基、スルフェート−、ホスフェート−、カルボキシレー
ト、エステルの誘導体、すなわちアセチル−、ブタノイ
ル−、オクタノイル−、ベンゾイル−、ピバロイル−な
どのような−OC（Ｏ）Ｒ型の一つであることができる。
下記の構造体も、同様の方法で修飾して、本発明による
方法でアクセプター物質として用いることができる。
たは無機または有機の基であり、R2、R3、R4、またはR6
の１〜３個が、ヒドロキシル基ではないとき、−R1は、
例えば−OH、−Ｆ、−OMe、−OAll、−OPh、−OCH2Ph、
−OEtBr、−OEtSiMe3、−Ｏ（CH2）3CH＝CH2、−SMe、
−SEt、−SPh、炭水化物、脂質−またはアミノ酸−また
はペプチド誘導体またはアノマー炭素に結合した他の基
の１つであることができる。−R2、−R3、−R4および／
または−R6は、いずれも例えば前記の基の１つである
か、または例えば−NHAc、NHC（Ｏ）CH2Cl（Ｎ−クロロ
メトキシアセチル）、NHC（Ｏ）CH2OPh（Ｎ−フェノキ
シアセチル−）、−NHBOC、−NHOH、−N3、−ｐ−メト
キシベンジルエーテル（−OCH2Ph−OMe−ｐ）、トリチ
ル基（−OC（Ph）３）、トリアルキルシリルエーテル
基、ピバロイル基、テトラヒドロピラニル、（２−メト
キシエトキシ）メチルイソプロピリデンケタール、シク
ロヘキシリデンケタール、ベンジリデンアセタール、オ
ルトエステル、−ONO3、トシレート−、メシレート−、
スルフェート−、ホスフェート−、カルボキシレート
基、スルフェート−、ホスフェート−、カルボキシレー
ト、エステルの誘導体、すなわちアセチル−、ブタノイ
ル−、オクタノイル−、ベンゾイル−、ピバロイル−な
どのような−OC（Ｏ）Ｒ型の一つであることができる。
下記の構造体も、同様の方法で修飾して、本発明による
方法でアクセプター物質として用いることができる。
アクセプターの修飾の型の選択は、特定の状況で所望
されるものによって決定されるが、文献には通常の炭水
化物および炭水化物の合成における保護基／修飾に関す
る情報が豊富である（例えば“Modern Carbohydrate Ch
emistry",Binkley,Marcel Dekker,1988 with reference
s and Paulsen,Chem,Soc.Rev.13,p.15−45）。本発明に
したがって用いることのできる代表的なアクセプター物
質の数例を下記に示すが、これは本発明の範囲を制限す
るものではない。構造体Ｉ−XIは、ガラクトース誘導体
であり、XII−XVIIは、Ｎ−アセチルグルコースアミン
誘導体である。構造体VIIおよびVIIIによって表される
無水糖も、本発明にしたがって用いることができる。
されるものによって決定されるが、文献には通常の炭水
化物および炭水化物の合成における保護基／修飾に関す
る情報が豊富である（例えば“Modern Carbohydrate Ch
emistry",Binkley,Marcel Dekker,1988 with reference
s and Paulsen,Chem,Soc.Rev.13,p.15−45）。本発明に
したがって用いることのできる代表的なアクセプター物
質の数例を下記に示すが、これは本発明の範囲を制限す
るものではない。構造体Ｉ−XIは、ガラクトース誘導体
であり、XII−XVIIは、Ｎ−アセチルグルコースアミン
誘導体である。構造体VIIおよびVIIIによって表される
無水糖も、本発明にしたがって用いることができる。
上記の構造体Ｉ−XIにおいて、R3は、例えばアルキ
ル、ベンジル−、クロロベンジル、ベンゾイル基または
別の型の特定の合成に好適な保護基である。R6は、Ph−
のような芳香族基、またはアルキル基（例えば、プロピ
ル−または（CH3）３−基）であることができる。構造
体XII−XVIIにおいて、R3は、例えばアセチル−、フェ
ノキシアセチル−、メトキシアセチル−またはクロロメ
トキシアセチル基である。R6は、Ph−のような芳香族基
またはアルキル基（例えばプロピル−または（CH3）３
−基）であることができる。R2が例えばＨであるなら
ば、R1は前記４ページでR1について挙げた基の１つであ
り、また逆に、R1がＨである場合も同じである。
ル、ベンジル−、クロロベンジル、ベンゾイル基または
別の型の特定の合成に好適な保護基である。R6は、Ph−
のような芳香族基、またはアルキル基（例えば、プロピ
ル−または（CH3）３−基）であることができる。構造
体XII−XVIIにおいて、R3は、例えばアセチル−、フェ
ノキシアセチル−、メトキシアセチル−またはクロロメ
トキシアセチル基である。R6は、Ph−のような芳香族基
またはアルキル基（例えばプロピル−または（CH3）３
−基）であることができる。R2が例えばＨであるなら
ば、R1は前記４ページでR1について挙げた基の１つであ
り、また逆に、R1がＨである場合も同じである。
本発明を説明する１例としては、いかなる点でも本発
明の範囲の制限を意味したものではないが、もし例えば
α−ガラクトシダーゼを酵素として用い、Ｃ−２位で保
護されたα−Ｄ−ガラクトピラノースをアクセプター物
質、例えば前記の物質Ｉとして用い、およびR2が例えば
HO−、MeO−、PHCHO−またはCH2＝CH−CH2O−基であ
り、例えばラフィノース、メチルα−Ｄ−ガラクトピラ
ノシド、またはｐ−ニトロフェニルα−Ｄ−ガラクトピ
ラノシドを、グリコシルドナー（グリコシル基転移反
応）として用いるときには、 の型のα−グリコシド結合したジガラクトシル誘導体、
すなわちGalα１−3Galα−Ｒの２−Ｏ−誘導体が得ら
れる。もう一つの例として、Ｉをアクセプターとして使
用し、例えばChamelea gallina由来のα−ガラクトース
アミニダーゼ、および例えば GalNAcα−OPhまたは GalNAcα−OPhNO2−ｐをグリコシルドナーとして用いる
ならば、 GalNAcα１−3Galα−Ｒの２−Ｏ−誘導体が得られる。
明の範囲の制限を意味したものではないが、もし例えば
α−ガラクトシダーゼを酵素として用い、Ｃ−２位で保
護されたα−Ｄ−ガラクトピラノースをアクセプター物
質、例えば前記の物質Ｉとして用い、およびR2が例えば
HO−、MeO−、PHCHO−またはCH2＝CH−CH2O−基であ
り、例えばラフィノース、メチルα−Ｄ−ガラクトピラ
ノシド、またはｐ−ニトロフェニルα−Ｄ−ガラクトピ
ラノシドを、グリコシルドナー（グリコシル基転移反
応）として用いるときには、 の型のα−グリコシド結合したジガラクトシル誘導体、
すなわちGalα１−3Galα−Ｒの２−Ｏ−誘導体が得ら
れる。もう一つの例として、Ｉをアクセプターとして使
用し、例えばChamelea gallina由来のα−ガラクトース
アミニダーゼ、および例えば GalNAcα−OPhまたは GalNAcα−OPhNO2−ｐをグリコシルドナーとして用いる
ならば、 GalNAcα１−3Galα−Ｒの２−Ｏ−誘導体が得られる。
この生成物は、例えば化学合成による高級オリゴサッ
カライドなどの、別の合成に用いることもでき、このよ
うな部分的に保護した炭水化物の使用法についての文献
は豊富である（前記のBinkleyおよびPaulsenの文献を参
照されたい。）例えば、−OCH2Ph基をヒドロキシル基の
保護後にはずして例えばα−結合したＬ−フコピラノシ
ル基で置換することができ、このようにして血液型決定
因子ＡおよびＢは、それぞれGalNAcα１−3Gal−Ｒおよ
びGalα１−3Gal−Ｒの２−Ｏ−保護誘導体から合成さ
れる。
カライドなどの、別の合成に用いることもでき、このよ
うな部分的に保護した炭水化物の使用法についての文献
は豊富である（前記のBinkleyおよびPaulsenの文献を参
照されたい。）例えば、−OCH2Ph基をヒドロキシル基の
保護後にはずして例えばα−結合したＬ−フコピラノシ
ル基で置換することができ、このようにして血液型決定
因子ＡおよびＢは、それぞれGalNAcα１−3Gal−Ｒおよ
びGalα１−3Gal−Ｒの２−Ｏ−保護誘導体から合成さ
れる。
β−ガラクトシダーゼをα−ガラクトシダーゼの代り
に用いる場合、ラクトースまたは例えばｐ−ニトロフェ
ニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドをグリコシルドナー
として用いる場合、およびＮ−アセチルグルコースアミ
ン誘導体（例えば前記のXII−XVIIを参照されたい）を
アクセプターとして用いる場合には、β−結合したGal
−GlcNAc−Ｒの誘導体が得られる。このように部分的に
保護されたGal−GlcNAc−誘導体であって、例えばLewis
−ｘまたはLewis−ａトリサッカライド構造体の化学合
成に用いることのできるもの（またはこれらのジサッカ
ライド誘導体を合成する別の化学合成に用いることので
きるもの）の例を、下記に示す。
に用いる場合、ラクトースまたは例えばｐ−ニトロフェ
ニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドをグリコシルドナー
として用いる場合、およびＮ−アセチルグルコースアミ
ン誘導体（例えば前記のXII−XVIIを参照されたい）を
アクセプターとして用いる場合には、β−結合したGal
−GlcNAc−Ｒの誘導体が得られる。このように部分的に
保護されたGal−GlcNAc−誘導体であって、例えばLewis
−ｘまたはLewis−ａトリサッカライド構造体の化学合
成に用いることのできるもの（またはこれらのジサッカ
ライド誘導体を合成する別の化学合成に用いることので
きるもの）の例を、下記に示す。
また、その代りにα−フコシダーゼを、例えばグリコ
シルドナーとしてのニトロフェニルα−Ｌ−フコピラノ
シドなどと共に用いるならば、本発明による方法にした
がってα−結合したFuc−Gal−Ｒおよびα−結合したFu
c−GlcNAc−Ｒの対応する誘導体を合成することができ
る。Ｎ−アセチル−β−グルコースアミニダーゼまたは
Ｎ−アセチル−β−ガラクトースアミニダーゼを用いる
と、β−結合したGlcNAc−GalおよびGlcNAc−GlcNAc−
Ｒの誘導体、またはGalNAc−Gal−ＲおよびGalNAc−Glc
NAcの誘導体を、各々グリコシルドナーとしてGlcNAcお
よびGalNAcのβ−グリコシドを用いることによって調製
することができる。同様に、α−シリダーゼを用いるこ
とによって、シアリル化したガラクトース誘導体（Neu5
Acα−Galの誘導体）またはガラクトースアミン誘導体
（Neu5AcCα−GalNAcの誘導体）の合成を、例えばＮ−
アセチルノイラミニン酸のニトロフェニルグリコシドお
よび部分的に保護されたガラクトース誘導体またはガラ
クトースアミン誘導体を、各々アクセプターとして用い
ることによって蝕媒することができる。
シルドナーとしてのニトロフェニルα−Ｌ−フコピラノ
シドなどと共に用いるならば、本発明による方法にした
がってα−結合したFuc−Gal−Ｒおよびα−結合したFu
c−GlcNAc−Ｒの対応する誘導体を合成することができ
る。Ｎ−アセチル−β−グルコースアミニダーゼまたは
Ｎ−アセチル−β−ガラクトースアミニダーゼを用いる
と、β−結合したGlcNAc−GalおよびGlcNAc−GlcNAc−
Ｒの誘導体、またはGalNAc−Gal−ＲおよびGalNAc−Glc
NAcの誘導体を、各々グリコシルドナーとしてGlcNAcお
よびGalNAcのβ−グリコシドを用いることによって調製
することができる。同様に、α−シリダーゼを用いるこ
とによって、シアリル化したガラクトース誘導体（Neu5
Acα−Galの誘導体）またはガラクトースアミン誘導体
（Neu5AcCα−GalNAcの誘導体）の合成を、例えばＮ−
アセチルノイラミニン酸のニトロフェニルグリコシドお
よび部分的に保護されたガラクトース誘導体またはガラ
クトースアミン誘導体を、各々アクセプターとして用い
ることによって蝕媒することができる。
エンドグリコシダーゼを用いると、本発明の方法にし
たがって長鎖のオリゴサッカライド誘導体を調製するこ
とができる。
たがって長鎖のオリゴサッカライド誘導体を調製するこ
とができる。
前記の反応は、モノサッカライドをグリコシルドナー
として用いた平衡反応として行うこともできる。
として用いた平衡反応として行うこともできる。
またグルコフラノースの様々な誘導体、例えば1,2−
イソプロピリデン−α−Ｄ−グルコフラノシド（下記の
構造体18）を、本発明による方法におけるアクセプター
として用いることもできる。
イソプロピリデン−α−Ｄ−グルコフラノシド（下記の
構造体18）を、本発明による方法におけるアクセプター
として用いることもできる。
1,2−イソプロピリデン−α−Ｄ−グルコフラノシド
の様々なオリゴサッカライド誘導体、例えば1,2−Ｏ−
イソプロピリデン−３−Ｏ−3'−（N',N'−ジメチルア
ミノ−ｎ−プロピル）−Ｄ−グルコフラノースHClなど
の、1,2−Ｏ−イソプロピリデン−α−Ｄ−グルコフラ
ノースの３−誘導体（以後、テラフェクチンと称する。
リューマチ性関節炎、乾癬、幾つかの型の癌および喘息
に活性を有する物質:Gordon,P.,Chamical Abstracts vo
lume 95,abstract nr 54887およびInflammation:Mech.T
reat.Proc.Int.Meet.,4th 1980,169−80,University Pa
rk Press,Baltimore参照）は、このように本発明による
方法にしたがって、アクセプターとして18を用いるか
（前記のジサッカライド生成物は、酵素反応後に３−位
で修飾される）、または３−修飾した18の誘導体を用い
ることによって合成することができる。これが本発明に
よる方法によって得られる方法の、非制限的な例は、 テラフェクチンまたはその類似体を、例えばラクトー
スまたはニトロフェニルβ−ガラクトシドと、β−ガラ
クトシダーゼ（例えばE.coli eller Aspergillus niger
由来）を、好適な溶媒中の触媒として用いて反応させる
ことである。この方法で、β−グリコシド結合したガラ
クトピラノシル基によって修飾したテラフェクチンが得
られる。この物質は後に、医薬または化粧品への応用
に、または後続する化学的または酵素合成に用いること
ができる。例えば、別の炭水化物基は、同じまたは別の
グリコシダーゼを用いたグリコシダーゼによって触媒さ
れる合成を反復することによって、または例えばシアリ
ル転移酵素およびCMP−Neu5Acを用いて、Neu5Acα２−3
Galβ１−Ｏ−テラフェクチンまたは対応する２−６−
誘導体を合成することによって、最初の反応で得られる
生成物に加えることができる。ガラクトシル誘導体は、
結果としてこれらの後者の反応の前に、化学的に修飾す
ることができる。
の様々なオリゴサッカライド誘導体、例えば1,2−Ｏ−
イソプロピリデン−３−Ｏ−3'−（N',N'−ジメチルア
ミノ−ｎ−プロピル）−Ｄ−グルコフラノースHClなど
の、1,2−Ｏ−イソプロピリデン−α−Ｄ−グルコフラ
ノースの３−誘導体（以後、テラフェクチンと称する。
リューマチ性関節炎、乾癬、幾つかの型の癌および喘息
に活性を有する物質:Gordon,P.,Chamical Abstracts vo
lume 95,abstract nr 54887およびInflammation:Mech.T
reat.Proc.Int.Meet.,4th 1980,169−80,University Pa
rk Press,Baltimore参照）は、このように本発明による
方法にしたがって、アクセプターとして18を用いるか
（前記のジサッカライド生成物は、酵素反応後に３−位
で修飾される）、または３−修飾した18の誘導体を用い
ることによって合成することができる。これが本発明に
よる方法によって得られる方法の、非制限的な例は、 テラフェクチンまたはその類似体を、例えばラクトー
スまたはニトロフェニルβ−ガラクトシドと、β−ガラ
クトシダーゼ（例えばE.coli eller Aspergillus niger
由来）を、好適な溶媒中の触媒として用いて反応させる
ことである。この方法で、β−グリコシド結合したガラ
クトピラノシル基によって修飾したテラフェクチンが得
られる。この物質は後に、医薬または化粧品への応用
に、または後続する化学的または酵素合成に用いること
ができる。例えば、別の炭水化物基は、同じまたは別の
グリコシダーゼを用いたグリコシダーゼによって触媒さ
れる合成を反復することによって、または例えばシアリ
ル転移酵素およびCMP−Neu5Acを用いて、Neu5Acα２−3
Galβ１−Ｏ−テラフェクチンまたは対応する２−６−
誘導体を合成することによって、最初の反応で得られる
生成物に加えることができる。ガラクトシル誘導体は、
結果としてこれらの後者の反応の前に、化学的に修飾す
ることができる。
同様に、テラフェクチンまたはその類似体を、例えば
触媒としてグルコースアミニダーゼ、ガラクトースアミ
ニダーゼ、マンノシダーゼ、ガラクトシダーゼまたはグ
ルコシダーゼを用いて、GlcNAcβ−OR、GalNAcβ−OR、
Manα−OR、Galα−OR、Glcβ−OR（Ｒ＝Ｆ、Ｈ、アル
キル−、アリール−、または炭水化物基である）と反応
させることができる。
触媒としてグルコースアミニダーゼ、ガラクトースアミ
ニダーゼ、マンノシダーゼ、ガラクトシダーゼまたはグ
ルコシダーゼを用いて、GlcNAcβ−OR、GalNAcβ−OR、
Manα−OR、Galα−OR、Glcβ−OR（Ｒ＝Ｆ、Ｈ、アル
キル−、アリール−、または炭水化物基である）と反応
させることができる。
同様に、エンドグリコシダーゼを触媒として、および
オリゴサッカライドまたはオリゴサッカライド−誘導体
をグリコシルドナーとして、アクセプターとしてのテラ
フェクチンまたはその類似体と共に用いることができ
る。
オリゴサッカライドまたはオリゴサッカライド−誘導体
をグリコシルドナーとして、アクセプターとしてのテラ
フェクチンまたはその類似体と共に用いることができ
る。
前記の反応は、グリコシルドナーとして単純なモノサ
ッカライドを用い、平衡制御反応として行うことができ
る。
ッカライドを用い、平衡制御反応として行うことができ
る。
前記の生成物中のベンジル−またはアリル基（または
前記の図に関連して挙げた他の基）は、専門家によって
Ｌ−フコースより広汎に、他の基へと容易に化学的に変
化させることができ、この方法で、数種類のジサッカラ
イド誘導体（例えばＯ−リン酸塩、Ｏ−硫酸塩等）また
は高級オリゴサッカライドを、本発明にしたがって選択
的に合成できる。
前記の図に関連して挙げた他の基）は、専門家によって
Ｌ−フコースより広汎に、他の基へと容易に化学的に変
化させることができ、この方法で、数種類のジサッカラ
イド誘導体（例えばＯ−リン酸塩、Ｏ−硫酸塩等）また
は高級オリゴサッカライドを、本発明にしたがって選択
的に合成できる。
更にこの生成物は、グリコシダーゼまたはグリコシル
転移酵素を用いて別の酵素合成に用いることができる。
例えば、α−シアリル転移酵素は、シアリル化したGal
−GlcNAc−誘導体の形成を触媒するのに用いることがで
き、β−ガラクトシル転移酵素は、Gal−GlcNAc−Gal−
Ｒ型のオリゴサッカライド誘導体を形成するのに用いる
ことができ、これらは結果としてシリアル化して、およ
び／または別の化学合成等に用いることができる。
転移酵素を用いて別の酵素合成に用いることができる。
例えば、α−シアリル転移酵素は、シアリル化したGal
−GlcNAc−誘導体の形成を触媒するのに用いることがで
き、β−ガラクトシル転移酵素は、Gal−GlcNAc−Gal−
Ｒ型のオリゴサッカライド誘導体を形成するのに用いる
ことができ、これらは結果としてシリアル化して、およ
び／または別の化学合成等に用いることができる。
修飾したガラクトシドまたはグリコシドをアクセプタ
ーとして用いるならば、アグリコンの選択は、この生成
物の応用に合わせて行う。特に興味深いアグリコンは、
アミノ酸（セリン、スレオニン、ヒドロキシプロリン、
ヒドロキシリシン、アスパラギン等）、ペプチド、脂質
およびこれら３基の物質の誘導体または類似体である。
アミノ酸またはペプチドグリコシドは、通常ペプチド合
成に用いる基（FMOC、CBZ、BOC等）によって、それらの
アミノ−および／またはカルボキシル機能を保護するこ
とができる。アクセプター物質として修飾したアルキル
グリコシド（例えば修飾したメチル−、オクチル−、ド
デシルグリコシド）を用いて得られるこの生成物は、ア
フィニティークロマトグラフィーまたは凝集試験、抑制
に基づいて治療における阻害剤または薬剤の標的設定の
ために、別の酵素合成の構造体単位として用いることが
できる。ニトロフェニルグリコシドは、アミノフェニル
グリコシドに還元することができる。重合可能なアグリ
コンを有するグリコシド、例えば２−ヒドロキシエチル
メタクリレートなどを用いることができる。Ｎ−グリコ
シド結合したアグリコンの例としては、−NHCO（CH2）5
NH2を挙げることができる。他の型のアグリコンで用い
ることのできるものは、例えば糖脂質／類似体を、セラ
ミド／類似体に転換するために行う合成に用いるもので
あって、例えばMagnusson等がJ.Org.Chem.,（1990年）
に記載した型のアグリコンである。チオグリコシド（例
えば、−SEtまたは−SPh）は、本発明による方法と共に
用いて、別の化学合成に好適な生成物を生成することが
できる。この保護基／誘導体、アグリコン、誘導したヒ
ドロキシル基の位置を選択することにより、本発明の方
法による反応の収率および位置選択性に影響を及ぼすこ
とができる。このように、例えば疎水性の高いアグリコ
ン（例えばアリル−と比較して、例えばｐ−メトキシ−
ベンジル−、ベンジル−）を用いると、同じアクセプタ
ー濃度でより高い収率を得ることができる。
ーとして用いるならば、アグリコンの選択は、この生成
物の応用に合わせて行う。特に興味深いアグリコンは、
アミノ酸（セリン、スレオニン、ヒドロキシプロリン、
ヒドロキシリシン、アスパラギン等）、ペプチド、脂質
およびこれら３基の物質の誘導体または類似体である。
アミノ酸またはペプチドグリコシドは、通常ペプチド合
成に用いる基（FMOC、CBZ、BOC等）によって、それらの
アミノ−および／またはカルボキシル機能を保護するこ
とができる。アクセプター物質として修飾したアルキル
グリコシド（例えば修飾したメチル−、オクチル−、ド
デシルグリコシド）を用いて得られるこの生成物は、ア
フィニティークロマトグラフィーまたは凝集試験、抑制
に基づいて治療における阻害剤または薬剤の標的設定の
ために、別の酵素合成の構造体単位として用いることが
できる。ニトロフェニルグリコシドは、アミノフェニル
グリコシドに還元することができる。重合可能なアグリ
コンを有するグリコシド、例えば２−ヒドロキシエチル
メタクリレートなどを用いることができる。Ｎ−グリコ
シド結合したアグリコンの例としては、−NHCO（CH2）5
NH2を挙げることができる。他の型のアグリコンで用い
ることのできるものは、例えば糖脂質／類似体を、セラ
ミド／類似体に転換するために行う合成に用いるもので
あって、例えばMagnusson等がJ.Org.Chem.,（1990年）
に記載した型のアグリコンである。チオグリコシド（例
えば、−SEtまたは−SPh）は、本発明による方法と共に
用いて、別の化学合成に好適な生成物を生成することが
できる。この保護基／誘導体、アグリコン、誘導したヒ
ドロキシル基の位置を選択することにより、本発明の方
法による反応の収率および位置選択性に影響を及ぼすこ
とができる。このように、例えば疎水性の高いアグリコ
ン（例えばアリル−と比較して、例えばｐ−メトキシ−
ベンジル−、ベンジル−）を用いると、同じアクセプタ
ー濃度でより高い収率を得ることができる。
本発明による方法に用いることのできるドナー基質
は、従来用いられた平衡制御反応またはグリコシル基転
移反応を介した合成であってグリコシダーゼによるもの
と同じである。
は、従来用いられた平衡制御反応またはグリコシル基転
移反応を介した合成であってグリコシダーゼによるもの
と同じである。
本発明による工程で用いることのできるドナー物質の
例としては、モノサッカライド、モノサッカライドグリ
コシドおよびジ−またはオリゴサッカライド（またはそ
のグリコシド）であって、その炭水化物部分が１種類ま
たはそれ以上のモノサッカライド、Ｄ−ガラクトース、
Ｄ−マンノース、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸、Ｎ−ア
セチル−Ｄ−ガラクトースアミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−
グルコースアミンおよびＬ−フコースを含むものが挙げ
られる。好適なグリコシルドナーの例としては、前記の
モノサッカライドのニトロフェニルα−またはβ−グリ
コシド、ラクトース、ジマンノースおよびラフィノース
を挙げることができる。エンドグリコシダーゼの好適な
ドナー物質は、例えば生物学的に活性を有する炭水化物
配列のニトロフェニルグリコシド（例えば、Galβ１−3
GlcNAcβ−OPhNO2−ｐ）、生物学的に活性を有するオリ
ゴサッカライドまたはGlc（β−3Glc）ｎβ１−3Glc
（ｎ＞１）の型の構造体である。
例としては、モノサッカライド、モノサッカライドグリ
コシドおよびジ−またはオリゴサッカライド（またはそ
のグリコシド）であって、その炭水化物部分が１種類ま
たはそれ以上のモノサッカライド、Ｄ−ガラクトース、
Ｄ−マンノース、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸、Ｎ−ア
セチル−Ｄ−ガラクトースアミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−
グルコースアミンおよびＬ−フコースを含むものが挙げ
られる。好適なグリコシルドナーの例としては、前記の
モノサッカライドのニトロフェニルα−またはβ−グリ
コシド、ラクトース、ジマンノースおよびラフィノース
を挙げることができる。エンドグリコシダーゼの好適な
ドナー物質は、例えば生物学的に活性を有する炭水化物
配列のニトロフェニルグリコシド（例えば、Galβ１−3
GlcNAcβ−OPhNO2−ｐ）、生物学的に活性を有するオリ
ゴサッカライドまたはGlc（β−3Glc）ｎβ１−3Glc
（ｎ＞１）の型の構造体である。
反応混合物中のグリコシルドナーの濃度は、合成する
オリゴサッカライド、および酵素の特性に合わせて選択
し、したがって本発明の使用を制限するものではない。
通常ドナーを少量ずつ加えることが、グリコシル基転移
反応において有利であり、ドナーがアクセプターとして
も作用する危険性を最小限にすることができる。平衡反
応では、最初のドナーの濃度が高いことが好ましい場合
が多い。
オリゴサッカライド、および酵素の特性に合わせて選択
し、したがって本発明の使用を制限するものではない。
通常ドナーを少量ずつ加えることが、グリコシル基転移
反応において有利であり、ドナーがアクセプターとして
も作用する危険性を最小限にすることができる。平衡反
応では、最初のドナーの濃度が高いことが好ましい場合
が多い。
酵素は、主として合成を行うオリゴサッカライド誘導
体に合わせて選択する。この酵素はin situで用いる
か、またはそれらの天然の環境から部分的または完全に
精製した後に用いることができる。この酵素は可溶性の
形態で用いるか、または例えば吸着、カプセル封入、キ
レート化、沈殿または共有結合などによって固形の担体
に固定して用いることができる。
体に合わせて選択する。この酵素はin situで用いる
か、またはそれらの天然の環境から部分的または完全に
精製した後に用いることができる。この酵素は可溶性の
形態で用いるか、または例えば吸着、カプセル封入、キ
レート化、沈殿または共有結合などによって固形の担体
に固定して用いることができる。
本発明に用いることのできるα−およびβ−グリコシ
ダーゼの例は、Ｄ−マンノシダーゼ、Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ、Ｌ−フコシダーゼ、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクト
ースアミニダーゼ、ヘキソサミニダーゼおよびその他の
グリコシダーゼのEC3.2群である（Enzyme Nomenclatur
e,Academic Press,1984）。エンド−およびエキソグリ
コシダーゼのいずれも、本発明の方法に用いることがで
きる。
ダーゼの例は、Ｄ−マンノシダーゼ、Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ、Ｌ−フコシダーゼ、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクト
ースアミニダーゼ、ヘキソサミニダーゼおよびその他の
グリコシダーゼのEC3.2群である（Enzyme Nomenclatur
e,Academic Press,1984）。エンド−およびエキソグリ
コシダーゼのいずれも、本発明の方法に用いることがで
きる。
用いる酵素の純度は重要でない。この酵素は、in sit
uで用いるか、またはそれらの天然の環境から部分的に
または完全に単離した後に用いることができる。また、
生体の粗抽出物またはその組織を用いることもできる。
この酵素は、例えば硫酸アンモニウムによる沈殿後にも
得ることができる。この酵素は、結晶形で、またはミセ
ル中に密閉して提供することができる。前記の生化学の
文献には、グリコシダーゼの精製および単離に関する詳
細な情報が豊富である。この酵素は、組換え技術によっ
て産生させることができる。次に所望ならば、この酵素
のアミノ酸配列中の１種類以上のアミノ酸を変化させ
て、酵素の特性、例えば耐熱性、触媒効率および／また
は位置選択性などを最適なものにすることができる。
uで用いるか、またはそれらの天然の環境から部分的に
または完全に単離した後に用いることができる。また、
生体の粗抽出物またはその組織を用いることもできる。
この酵素は、例えば硫酸アンモニウムによる沈殿後にも
得ることができる。この酵素は、結晶形で、またはミセ
ル中に密閉して提供することができる。前記の生化学の
文献には、グリコシダーゼの精製および単離に関する詳
細な情報が豊富である。この酵素は、組換え技術によっ
て産生させることができる。次に所望ならば、この酵素
のアミノ酸配列中の１種類以上のアミノ酸を変化させ
て、酵素の特性、例えば耐熱性、触媒効率および／また
は位置選択性などを最適なものにすることができる。
この酵素は可溶性の形態で用いるか、または例えば吸
着、カプセル封入、キレート化、沈殿または共有結合に
よって、固体の担体、例えばポリマー性物質、またはそ
の誘導体であってプロトン性または非プロトン性の溶媒
に不溶解性のものに固定することができる（Methods in
Enzymology,vol.44,Academic Press,1976）。選択され
る形態は、本発明にとって重要ではない。酵素を可溶性
の形態で用いる場合には、最初に好適な手段で化学的に
修飾して、例えば有機の補助溶媒中の耐熱性または安定
性を増加させる。例えばアガロース、セルロース、ヒド
ロキシエチルアセチレート、ガラス、シリカ、ポリアク
リルアミド、ポリアクリレートを基材としたプラスチッ
ク等を含んで成る不溶解性ポリマーに固定した酵素は、
容易にこの生成物混合物から分離され、したがって酵素
は再利用することができる。別の利点は、多くの場合に
高温および有機補助溶媒に対してある一定の安定化が得
られることである。
着、カプセル封入、キレート化、沈殿または共有結合に
よって、固体の担体、例えばポリマー性物質、またはそ
の誘導体であってプロトン性または非プロトン性の溶媒
に不溶解性のものに固定することができる（Methods in
Enzymology,vol.44,Academic Press,1976）。選択され
る形態は、本発明にとって重要ではない。酵素を可溶性
の形態で用いる場合には、最初に好適な手段で化学的に
修飾して、例えば有機の補助溶媒中の耐熱性または安定
性を増加させる。例えばアガロース、セルロース、ヒド
ロキシエチルアセチレート、ガラス、シリカ、ポリアク
リルアミド、ポリアクリレートを基材としたプラスチッ
ク等を含んで成る不溶解性ポリマーに固定した酵素は、
容易にこの生成物混合物から分離され、したがって酵素
は再利用することができる。別の利点は、多くの場合に
高温および有機補助溶媒に対してある一定の安定化が得
られることである。
本発明による合成工程は、例えばpH、緩衝液の型、反
応物の温度および濃度に関して非常に様々な条件下で行
うことができる。様々な補助溶媒（N,N−ジメチルホル
ムアミド、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジ
オキサン、ピリジン、メタノール、エタノール、エチレ
ングリコール等）は、水と共に様々な濃度で用いること
ができる。更にこの反応は、二相系、すなわち水−有機
溶媒中で行うことができる。
応物の温度および濃度に関して非常に様々な条件下で行
うことができる。様々な補助溶媒（N,N−ジメチルホル
ムアミド、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジ
オキサン、ピリジン、メタノール、エタノール、エチレ
ングリコール等）は、水と共に様々な濃度で用いること
ができる。更にこの反応は、二相系、すなわち水−有機
溶媒中で行うことができる。
反応条件は重要ではないが、主として本合成に用いる
反応物の特性に基づいて、かつ実用性に基づいて選択さ
れる。例えば、通常は酵素には室温を用い、水が多い溶
媒の場合には、pH4−11の範囲であることが好都合であ
ることが挙げられる。
反応物の特性に基づいて、かつ実用性に基づいて選択さ
れる。例えば、通常は酵素には室温を用い、水が多い溶
媒の場合には、pH4−11の範囲であることが好都合であ
ることが挙げられる。
有機補助溶媒を用いて、加水分解による副反応を最小
限にすることができる。同じ理由で、二相系を用いるこ
とができる。補助溶媒の例としては、テトラヒドロフラ
ン、アセトニトリル、DMFである。溶媒およびその濃度
または有機溶媒の選択は、専門家が容易に行うことがで
き、本発明の範囲を制限するものではない。高濃度の有
機溶媒を用いると（溶媒の総体積の約50％からほぼ100
％）、有機溶媒中で良好な溶解度を有する疎水性のアク
セプター誘導体を用いるとき、例えばエステル基（例え
ばアセチル−、ベンゾイル−、ブタノイル−、ピバロイ
ル−、オクタノイル−基等）によって修飾したアクセプ
ター、および／または例えばアリル−、ベンジル−、ト
リチル−または他の基によって修飾したアクセプターを
用いるときに、特に有利になることができる。この方法
では、有機溶媒中で比較的高濃度のアクセプターを得る
ことができ、水の含有量が低いために加水分解による副
反応を減少することができる。本発明による方法によ
り、有機溶媒中で、例えばサッカライド誘導体および高
級オリゴサッカライド誘導体のエキソグリコシダーゼに
よる合成を、ジ−またはオリゴサッカライドの疎水性の
保護誘導体であって１個または数個の遊離ヒドロキシル
基のみを有するものを、アクセプターとして用いて行う
ことができる。
限にすることができる。同じ理由で、二相系を用いるこ
とができる。補助溶媒の例としては、テトラヒドロフラ
ン、アセトニトリル、DMFである。溶媒およびその濃度
または有機溶媒の選択は、専門家が容易に行うことがで
き、本発明の範囲を制限するものではない。高濃度の有
機溶媒を用いると（溶媒の総体積の約50％からほぼ100
％）、有機溶媒中で良好な溶解度を有する疎水性のアク
セプター誘導体を用いるとき、例えばエステル基（例え
ばアセチル−、ベンゾイル−、ブタノイル−、ピバロイ
ル−、オクタノイル−基等）によって修飾したアクセプ
ター、および／または例えばアリル−、ベンジル−、ト
リチル−または他の基によって修飾したアクセプターを
用いるときに、特に有利になることができる。この方法
では、有機溶媒中で比較的高濃度のアクセプターを得る
ことができ、水の含有量が低いために加水分解による副
反応を減少することができる。本発明による方法によ
り、有機溶媒中で、例えばサッカライド誘導体および高
級オリゴサッカライド誘導体のエキソグリコシダーゼに
よる合成を、ジ−またはオリゴサッカライドの疎水性の
保護誘導体であって１個または数個の遊離ヒドロキシル
基のみを有するものを、アクセプターとして用いて行う
ことができる。
溶解度／利用可能性を増大し、ドナー物質との反応を
促進するためには、例えばフェニルボロネートであって
ビシナルジオールを有するサッカライドによる複合体を
形成し、得られたドナー−ボロネート複合体が、そのフ
ェニル基のために有機溶媒中で一層高い溶解度を有する
ものを用いることができる。
促進するためには、例えばフェニルボロネートであって
ビシナルジオールを有するサッカライドによる複合体を
形成し、得られたドナー−ボロネート複合体が、そのフ
ェニル基のために有機溶媒中で一層高い溶解度を有する
ものを用いることができる。
反応温度を変化させて、生成物の収率および酵素の安
定性に影響を及ぼすようにすることができ、本発明の範
囲を制限するものではない。最も頻繁に用いる温度は４
−55℃の範囲であるが、さらに低温および０℃を下回る
温度も、有機補助溶媒を用いるならば適用できる。高温
は、熱安定性のグリコシダーゼおよび基質と共に用いる
ことができ、また例えば高濃度の基質を採用することに
よって熱変性に対し安定化させた酵素を用いるときにも
適用できる（Johanssonet al,Biotechnol.Lett.,8（198
6）421−424。高温による利点は、例えば高い基質濃度
を用いることができ、これが水の活性を減少させること
から、生成物の収率を増加させるということである。も
う一つの利点は、酵素の活性が増すことであり、これは
温度が上がることによって反応時間が短くなることを意
味する。さらにもう一つの利点は、グリコシド、例えば
室温で緩やかに加水分解されるメチルまたはエチルグリ
コシドを、高温（50−60℃）で好適なグリコシルドナー
として用いることができることである。この温度の上限
は、反応培養液中の酵素の耐熱性によって決定される。
数種の糖転移反応では、低温で生成物グリコシドの一層
高い収率をもたらすことが分かった。
定性に影響を及ぼすようにすることができ、本発明の範
囲を制限するものではない。最も頻繁に用いる温度は４
−55℃の範囲であるが、さらに低温および０℃を下回る
温度も、有機補助溶媒を用いるならば適用できる。高温
は、熱安定性のグリコシダーゼおよび基質と共に用いる
ことができ、また例えば高濃度の基質を採用することに
よって熱変性に対し安定化させた酵素を用いるときにも
適用できる（Johanssonet al,Biotechnol.Lett.,8（198
6）421−424。高温による利点は、例えば高い基質濃度
を用いることができ、これが水の活性を減少させること
から、生成物の収率を増加させるということである。も
う一つの利点は、酵素の活性が増すことであり、これは
温度が上がることによって反応時間が短くなることを意
味する。さらにもう一つの利点は、グリコシド、例えば
室温で緩やかに加水分解されるメチルまたはエチルグリ
コシドを、高温（50−60℃）で好適なグリコシルドナー
として用いることができることである。この温度の上限
は、反応培養液中の酵素の耐熱性によって決定される。
数種の糖転移反応では、低温で生成物グリコシドの一層
高い収率をもたらすことが分かった。
アクセプターの濃度は、パラメーターとして本発明に
よる反応の収率に影響を与える上で用いることができ
る。高濃度は、加水分解の副反応を最小限にする上で、
平衡反応およびグリコシル基転移反応のいずれにおいて
も好ましく、これは通常、アクセプターの溶解度に依存
することを意味しており、約0.2−7Mのアクセプター濃
度を用いることを意味する。高濃度のドナーは、平衡反
応に用いることが多い。通常、高濃度の基質は、反応混
合物を沸点付近まで数分間加熱し、この溶液を酵素基質
の耐熱性に応じて37−75℃に冷却し、次に酵素を加える
ことによって得ることができる。補助溶媒は、疎水基を
有する基質の溶解度を増加させるのに用いることができ
る。
よる反応の収率に影響を与える上で用いることができ
る。高濃度は、加水分解の副反応を最小限にする上で、
平衡反応およびグリコシル基転移反応のいずれにおいて
も好ましく、これは通常、アクセプターの溶解度に依存
することを意味しており、約0.2−7Mのアクセプター濃
度を用いることを意味する。高濃度のドナーは、平衡反
応に用いることが多い。通常、高濃度の基質は、反応混
合物を沸点付近まで数分間加熱し、この溶液を酵素基質
の耐熱性に応じて37−75℃に冷却し、次に酵素を加える
ことによって得ることができる。補助溶媒は、疎水基を
有する基質の溶解度を増加させるのに用いることができ
る。
この反応は、TLC、HPLCによって、または遊離したア
グリコンの分光光度法による測定（例えば、ｐ−ニトロ
フェノール 400nm）によって観察することができる。
この生成物グリコシドの最大の収率が得られたならば、
pHを変化させ、温度を上昇させ、および／または有機補
助溶媒（例えばエタノール）を加えて酵素を変性させる
ことによって、反応を終了させる。通常は80−85℃に３
−５分間加熱し、続いて約80％の濃度までエタノールを
加えれば十分である。
グリコンの分光光度法による測定（例えば、ｐ−ニトロ
フェノール 400nm）によって観察することができる。
この生成物グリコシドの最大の収率が得られたならば、
pHを変化させ、温度を上昇させ、および／または有機補
助溶媒（例えばエタノール）を加えて酵素を変性させる
ことによって、反応を終了させる。通常は80−85℃に３
−５分間加熱し、続いて約80％の濃度までエタノールを
加えれば十分である。
様々な技術を用いて生成物の単離することができる。
例えばエタノールのような有機溶媒による沈殿は、特に
反応物の１つを過剰量で用いるとき、またはドナー、ア
クセプターまたは生成物の溶解度が異なるときには有用
である。平衡制御合成またはグリコシル基転移反応の後
で、および例えば前記のような熱処理および反応混合物
の希釈後に、第二のグリコシダーゼであって、合成に用
いたグリコシダーゼとは異なる位置選択性を有するもの
を加えることが有用である。この方法では、不必要な位
置異性体（例えば１−６−連鎖を有するもの）を、ある
程度選択的に加水分解することができ、所望な生成物の
単離を促進する。副生成物の沈澱および加水分解は、ク
ロマトグラフィー（吸着クロマトグラフィー、セファデ
ックスG10−G25などによるゲル濾過、例えばアミノシリ
カ、逆相シリカ、または新規なDionexカラムによるHPL
C）に相補的である。
例えばエタノールのような有機溶媒による沈殿は、特に
反応物の１つを過剰量で用いるとき、またはドナー、ア
クセプターまたは生成物の溶解度が異なるときには有用
である。平衡制御合成またはグリコシル基転移反応の後
で、および例えば前記のような熱処理および反応混合物
の希釈後に、第二のグリコシダーゼであって、合成に用
いたグリコシダーゼとは異なる位置選択性を有するもの
を加えることが有用である。この方法では、不必要な位
置異性体（例えば１−６−連鎖を有するもの）を、ある
程度選択的に加水分解することができ、所望な生成物の
単離を促進する。副生成物の沈澱および加水分解は、ク
ロマトグラフィー（吸着クロマトグラフィー、セファデ
ックスG10−G25などによるゲル濾過、例えばアミノシリ
カ、逆相シリカ、または新規なDionexカラムによるHPL
C）に相補的である。
本発明の実施例を下記に示すが、本発明の範囲の制限
を意味するものではない。
を意味するものではない。
実施例１
ペルアセチル化したGalα１−３（２−Ｏ−アリル）Gal
α−OMe:メチル（２−Ｏ−アリル−３−Ｏ−α−Ｄ−ガ
ラクトピラノシル）−α−Ｄ−ガラクトピラノシドの合
成： ２−Ｏ−アリル−Galα−OMe（メチル２−Ｏ−アリル
−α−Ｄ−ガラクトピラノシド:0.4g）を、リン酸ナト
リウム緩衝液（pH6.5、18ml、0.05M）に溶解し、ｐ−ニ
トロフェニルα−Ｄ−ガラクトピラノシドGalα−OPhNO
2−p:50mg）を、室温でα−Ｄ−ガラクトシダーゼ（Sig
ma:20U）400μｌと共に加えた。さらにドナー（Galα−
OPhNO2−ｐ）を数回に分けて（50mg:10回）反応の間に
加えたが、これはドナーが消費されたためである。約20
時間反応を行った後に、この溶液を約５分間加熱して酵
素を失活させ、生成物をカラムクロマトグラフィーによ
って精製した（セファデックスG10、その後シリカゲル
カラムを行い、アセチル化後に固相にキセロゲルを用い
たカラムクロマトグラフィーを行った）。アセチル化し
た生成物の核磁気共鳴を用いて構造を確認した。
α−OMe:メチル（２−Ｏ−アリル−３−Ｏ−α−Ｄ−ガ
ラクトピラノシル）−α−Ｄ−ガラクトピラノシドの合
成： ２−Ｏ−アリル−Galα−OMe（メチル２−Ｏ−アリル
−α−Ｄ−ガラクトピラノシド:0.4g）を、リン酸ナト
リウム緩衝液（pH6.5、18ml、0.05M）に溶解し、ｐ−ニ
トロフェニルα−Ｄ−ガラクトピラノシドGalα−OPhNO
2−p:50mg）を、室温でα−Ｄ−ガラクトシダーゼ（Sig
ma:20U）400μｌと共に加えた。さらにドナー（Galα−
OPhNO2−ｐ）を数回に分けて（50mg:10回）反応の間に
加えたが、これはドナーが消費されたためである。約20
時間反応を行った後に、この溶液を約５分間加熱して酵
素を失活させ、生成物をカラムクロマトグラフィーによ
って精製した（セファデックスG10、その後シリカゲル
カラムを行い、アセチル化後に固相にキセロゲルを用い
たカラムクロマトグラフィーを行った）。アセチル化し
た生成物の核磁気共鳴を用いて構造を確認した。
実施例２
ペルアセチル化したGalα１−３（２−Ｏ−ベンジル）G
alα−OMe:メチル（２−Ｏ−ベンジル−３−Ｏ−α−Ｄ
−ガラクトピラノシル）−α−Ｄ−ガラクトピラノシド
の合成： ２−Ｏ−ベンジル−Galα−OMe（メチル２−Ｏ−ベン
ジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド:0.4g）を、リン酸
ナトリウム緩衝液（pH6.5、18ml、0.05M）に溶解し、ｐ
−ニトロフェニルα−Ｄ−ガラクトピラノシド（Galα
−OPhNO2−p:50mg）を、室温でα−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ（Sigma:20U）400μｌと共に加えた。さらにドナー
（Galα−OPhNO2−ｐ）を、数回（50mg:10回）に分けて
反応の間に加え、ドナーの消費を補った。約20時間後に
溶液を約５分間加熱して酵素を失活させ、この生成物を
実施例１に記載したものと同じ手法を用いてカラムクロ
マトグラフィーによって単離した。アセチル化した物質
の核磁気共鳴を用いて構造を確認した。
alα−OMe:メチル（２−Ｏ−ベンジル−３−Ｏ−α−Ｄ
−ガラクトピラノシル）−α−Ｄ−ガラクトピラノシド
の合成： ２−Ｏ−ベンジル−Galα−OMe（メチル２−Ｏ−ベン
ジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド:0.4g）を、リン酸
ナトリウム緩衝液（pH6.5、18ml、0.05M）に溶解し、ｐ
−ニトロフェニルα−Ｄ−ガラクトピラノシド（Galα
−OPhNO2−p:50mg）を、室温でα−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ（Sigma:20U）400μｌと共に加えた。さらにドナー
（Galα−OPhNO2−ｐ）を、数回（50mg:10回）に分けて
反応の間に加え、ドナーの消費を補った。約20時間後に
溶液を約５分間加熱して酵素を失活させ、この生成物を
実施例１に記載したものと同じ手法を用いてカラムクロ
マトグラフィーによって単離した。アセチル化した物質
の核磁気共鳴を用いて構造を確認した。
実施例３
ペルアセチル化したGalα１−３（２−Ｏ−アリル−
６−Ｏ−アリル）Galα−OMe:メチル２−Ｏ−アリル−
６−Ｏ−アリル−３−Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシ
ル）−α−Ｄ−ガラクトピラノシド）の合成:2−Ｏ−ア
リル−６−Ｏ−アリル−Galα−OMe（メチル−２−Ｏ−
アリル−６−Ｏ−アリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド:0.4g）を、リン酸ナトリウム緩衝液（pH6.5、18ml、
0.05M）に溶解し、ｐ−ニトロフェニルα−Ｄ−ガラク
トピラノシド（Galα−OPhNO2−p:50mg）を、室温でα
−Ｄ−ガラクトシダーゼ（Sigma:20U）400μｌと共に加
えた。さらにドナー（Galα−OPhNO2−ｐ）を数回（50m
g:10回）に分けて反応の間に加え、消費されたドナーを
補った。約20時間後に溶液を約５分間加熱して酵素を失
活し、この生成物を実施例１に記載したものと同じ技術
を用いてカラムクロマトグラフィーによって単離した。
アセチル化した物質の核磁気共鳴を用いて構造を確認し
た。
６−Ｏ−アリル）Galα−OMe:メチル２−Ｏ−アリル−
６−Ｏ−アリル−３−Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシ
ル）−α−Ｄ−ガラクトピラノシド）の合成:2−Ｏ−ア
リル−６−Ｏ−アリル−Galα−OMe（メチル−２−Ｏ−
アリル−６−Ｏ−アリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド:0.4g）を、リン酸ナトリウム緩衝液（pH6.5、18ml、
0.05M）に溶解し、ｐ−ニトロフェニルα−Ｄ−ガラク
トピラノシド（Galα−OPhNO2−p:50mg）を、室温でα
−Ｄ−ガラクトシダーゼ（Sigma:20U）400μｌと共に加
えた。さらにドナー（Galα−OPhNO2−ｐ）を数回（50m
g:10回）に分けて反応の間に加え、消費されたドナーを
補った。約20時間後に溶液を約５分間加熱して酵素を失
活し、この生成物を実施例１に記載したものと同じ技術
を用いてカラムクロマトグラフィーによって単離した。
アセチル化した物質の核磁気共鳴を用いて構造を確認し
た。
実施例４
ペルアセチル化したしたGalβ１−３（２−Ｏ−ベン
ジル）Galβ−OBn:ベンジル（２−Ｏ−ベンジル−３−
Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシドの合成:2−Ｏ−ベンジル−Galβ−OBn（メチ
ル２−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド0.4
g）を、酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5、18ml、0.05M）
に溶解し、ｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノ
シド（Galβ−OPhNO2−ｏ）が消費されたので、これを
室温で数回（50mg、10回）に分けて加えた。反応および
精製は、主として前記の例の様に行ったが、但し蝕媒に
は、β−ガラクトシダーゼ（Aspergillus niger:Sigma:
St.Louis,USA）を用いた。アセチル化した物質の核磁気
共鳴を用いて構造を確認した。
ジル）Galβ−OBn:ベンジル（２−Ｏ−ベンジル−３−
Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシドの合成:2−Ｏ−ベンジル−Galβ−OBn（メチ
ル２−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド0.4
g）を、酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5、18ml、0.05M）
に溶解し、ｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノ
シド（Galβ−OPhNO2−ｏ）が消費されたので、これを
室温で数回（50mg、10回）に分けて加えた。反応および
精製は、主として前記の例の様に行ったが、但し蝕媒に
は、β−ガラクトシダーゼ（Aspergillus niger:Sigma:
St.Louis,USA）を用いた。アセチル化した物質の核磁気
共鳴を用いて構造を確認した。
実施例５
Neu5Acα２−３（（２−Ｏ−アリル−６−Ｏ−アリ
ル）Galβ−OMeの合成:2−Ｏ−アリル−６−Ｏ−アリル
−Galβ−OMe（メチル−２−Ｏ−アリル−６−Ｏ−アリ
ル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド0.4g）を、酢酸ナトリ
ウム緩衝液（pH5.0、18ml、0.05M）に溶解し、ｐ−ニト
ロフェニル５−アセタミド−3,5−ジデオキシ−α−Ｄ
−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノニュロピラノシロン
酸（Neu5Acα−OPhNO2−ｐ）が消費されたので、これを
室温で数回（50mgずつ、10回）に分けて加えた。この反
応および単離は、前記に記載の通り、但し蝕媒としてα
−シアリダーゼ（Vibrio cholerae:Sigma）を用いて行
い、この生成物は、予めアセチル化することなしにカラ
ムクロマトグラフィーによって精製した。
ル）Galβ−OMeの合成:2−Ｏ−アリル−６−Ｏ−アリル
−Galβ−OMe（メチル−２−Ｏ−アリル−６−Ｏ−アリ
ル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド0.4g）を、酢酸ナトリ
ウム緩衝液（pH5.0、18ml、0.05M）に溶解し、ｐ−ニト
ロフェニル５−アセタミド−3,5−ジデオキシ−α−Ｄ
−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノニュロピラノシロン
酸（Neu5Acα−OPhNO2−ｐ）が消費されたので、これを
室温で数回（50mgずつ、10回）に分けて加えた。この反
応および単離は、前記に記載の通り、但し蝕媒としてα
−シアリダーゼ（Vibrio cholerae:Sigma）を用いて行
い、この生成物は、予めアセチル化することなしにカラ
ムクロマトグラフィーによって精製した。
実施例６
ペルアセチル化したGlcNAcβ１−３（２−Ｏ−アリル−
６−Ｏ−アリル）Galβ−OMeの合成： ２−Ｏ−アリル−６−Ｏ−アリル−Galβ−OMe（メチ
ル−２−Ｏ−アリル−６−Ｏ−アリル−β−Ｄ−ガラク
ト−ピラノシド:0.4g）を酢酸ナトリウム緩衝液（pH6.
5、18ml、0.05M）に溶解し、GlcNAcβ−OPhNO2−ｐ（50
mg）が消費されたので、これを室温で加えた。反応およ
びこの生成物の精製は、主として前記の例と同様に行っ
たが、但しβ−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコース−アミニダ
ーゼを触媒として用いた。生成物の核磁気共鳴を用いて
構造を確認した。
６−Ｏ−アリル）Galβ−OMeの合成： ２−Ｏ−アリル−６−Ｏ−アリル−Galβ−OMe（メチ
ル−２−Ｏ−アリル−６−Ｏ−アリル−β−Ｄ−ガラク
ト−ピラノシド:0.4g）を酢酸ナトリウム緩衝液（pH6.
5、18ml、0.05M）に溶解し、GlcNAcβ−OPhNO2−ｐ（50
mg）が消費されたので、これを室温で加えた。反応およ
びこの生成物の精製は、主として前記の例と同様に行っ
たが、但しβ−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコース−アミニダ
ーゼを触媒として用いた。生成物の核磁気共鳴を用いて
構造を確認した。
実施例７
Galβ１−3GlcNAcおよびGalβ１−4GlcNAc各々の誘導
体の合成（Lewis−血液型物質の成分、例えばLewis−
ａ、Lewis−ｘおよびシアリル構造体）：誘導したＮ−
アセチルグルコースアミンのグリコシド、例えば構造体
XIIIまたはXIVなどを、例えば（1/1 V/V）テトラヒド
ロフラン：酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5、0.05M）に溶
解したアクセプターとして用い、Galβ−OPhNO2−ｏを
ドナーとして用い、およびβ−ガラクトシダーゼを蝕媒
として用いることによって、下記の型の構造体を得るこ
とができる。
体の合成（Lewis−血液型物質の成分、例えばLewis−
ａ、Lewis−ｘおよびシアリル構造体）：誘導したＮ−
アセチルグルコースアミンのグリコシド、例えば構造体
XIIIまたはXIVなどを、例えば（1/1 V/V）テトラヒド
ロフラン：酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5、0.05M）に溶
解したアクセプターとして用い、Galβ−OPhNO2−ｏを
ドナーとして用い、およびβ−ガラクトシダーゼを蝕媒
として用いることによって、下記の型の構造体を得るこ
とができる。
このような構造体は、直接に様々な応用に用いること
ができ、または別の化学もしくは酵素合成に用いること
ができる。ガラクトシル残基は、例えば化学的に、また
は酵素法（化学修飾を伴う、リパーゼまたはガラクトー
スオキシダーゼによるもの）によって、グルコースアミ
ニル残基中に遊離ヒドロキシル基の１個を残して修飾す
ることができ、これは続いて例えばフコジル基によって
修飾することができる。
ができ、または別の化学もしくは酵素合成に用いること
ができる。ガラクトシル残基は、例えば化学的に、また
は酵素法（化学修飾を伴う、リパーゼまたはガラクトー
スオキシダーゼによるもの）によって、グルコースアミ
ニル残基中に遊離ヒドロキシル基の１個を残して修飾す
ることができ、これは続いて例えばフコジル基によって
修飾することができる。
同様に、下記の型のアクセプターを用いることによっ
て、対応するβ−結合した３−Ｏ−保護したGal−GlcNA
C−誘導体を得ることができる。
て、対応するβ−結合した３−Ｏ−保護したGal−GlcNA
C−誘導体を得ることができる。
産物中の遊離ヒドロキシル基を保護し、３−Ｏ−位を
脱保護した後に、例えばα−結合したＬ−フコジル基で
あって、Lawis−ｘ構造体をもたらすものを導入するこ
とができ、これは例えば、シアリル化してNeuAcα２−3
Galβ１−４（Fucα１−２）GlcNAc−Ｒをもたらすこと
ができる。類似した方法で、位置異性体、例えばLewis
−ｘ、Lewis−ａの、およびシアリル化したLewis−物質
の類似体／誘導体を生成することができる。
脱保護した後に、例えばα−結合したＬ−フコジル基で
あって、Lawis−ｘ構造体をもたらすものを導入するこ
とができ、これは例えば、シアリル化してNeuAcα２−3
Galβ１−４（Fucα１−２）GlcNAc−Ｒをもたらすこと
ができる。類似した方法で、位置異性体、例えばLewis
−ｘ、Lewis−ａの、およびシアリル化したLewis−物質
の類似体／誘導体を生成することができる。
また６−位で修飾したグルカルをアクセプター物質と
して用い、β−ガラクトシダーゼを蝕媒として、および
Galβ−OPhNO2−ｏをドナーとして用いることによっ
て、β−結合したガラクトシル−（６−Ｏ−Ｒ）グルカ
ルが得られる。
して用い、β−ガラクトシダーゼを蝕媒として、および
Galβ−OPhNO2−ｏをドナーとして用いることによっ
て、β−結合したガラクトシル−（６−Ｏ−Ｒ）グルカ
ルが得られる。
実施例８
β−ガラクトシル−1,2−無水−α−Ｄ−グルコフラ
ノシドの合成:1,2−無水−α−Ｄ−グルコフラノシド
を、1/1（V/V）テトラヒドロフラン：酢酸ナトリウム緩
衝液（pH5.0、0.05M）に溶解し、Galβ−OPhNO2−ｏが
消費されたので、室温で数回に分けて加えた。反応は、
β−ガラクトシダーゼを触媒に用いて行い、生成物をカ
ラムクロマトグラフィーによって単離した。
ノシドの合成:1,2−無水−α−Ｄ−グルコフラノシド
を、1/1（V/V）テトラヒドロフラン：酢酸ナトリウム緩
衝液（pH5.0、0.05M）に溶解し、Galβ−OPhNO2−ｏが
消費されたので、室温で数回に分けて加えた。反応は、
β−ガラクトシダーゼを触媒に用いて行い、生成物をカ
ラムクロマトグラフィーによって単離した。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12P 19/00 - 19/64
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (32)
- 【請求項１】ジ−、トリ−または高級オリゴサッカライ
ド生成物の合成方法であって、 （１）（ａ）モノサッカライド、ジサッカライド、オリ
ゴサッカライドまたはグリコシドからなるグリコシルド
ナー、 （ｂ）以下のいずれかの式で表わされるアクセプター （式中、R1、R2、R3、R4およびR6は、それぞれ−OH、
Ｆ、有機基また無機基を表わし、R5は−OHまたはＦであ
り、 但し、R2、R3、R4およびR6の１〜３個は−OHではなく、 R1が有機基である時、該有機基は、−Ｏ−アルキル；−
OAll、−OPh、−OCH2Ph、−OEtBr、−OEtSiMe3、−Ｏ
（CH2）3CH＝CH2、−SMe、−SEt、−SPh、炭水化物；お
よび脂質、アミノ酸およびペプチドおよびそれらの誘導
体またはアナログから選ばれる有機基であり、 R2、R3、R4および／またはR6は有機基または無機基であ
る時、該有機基は上記したR1の有機基、または該有機基
もしくは無機基は−NHAc、−Ｎ−クロロメトキシアセチ
ル、Ｎ−フェノキシアセチル、−NHBOC−、−NHOH、−N
3、ｐ−メトキシベンジルエーテル、トリチル、トリア
ルキルシリルエーテル、ピバロイル、テトラヒドロピラ
ニル、（２−メトキシエトキシ）メチル−イソプロピリ
デンケタール、シクロヘキシリデンケタール、ベンゾリ
デンアセタール、オルソエステル、−ONO3、トシレー
ト、メシレート、スルフェート、ホスフェート、カルボ
キシレートおよび−OC（Ｏ）Ｒエステルから選ばれるも
のである、）および （ｃ）E.C.グループ3.2エンドまたはエキソグリコシダ
ーゼを、反応させて、該グリコシルドナーが炭水化物基
を該アクセプターの２−、３−または４−位の位置に転
移して、該生成物を形成し、次いで （２）任意に、該生成物を単離し、または更に該生成物
を合成する、 ことからなる上記合成方法。 - 【請求項２】R1が有機基である時、該有機基は、−Ｏ−
メチル、−Ｏ−オクチルおよび−Ｏ−ドデシルから選ば
れる−Ｏ−アルキルである請求項１の合成方法。 - 【請求項３】アクセプターが以下のいずれかの式で表わ
されるアクセプターである請求項１の合成方法： （式中、R1またはR2はＨであり、式Ｉ〜XIにおいてR3は
アルキル、ベンジル、クロロベンジル、ベンゾイルまた
は他の保護基、R6は芳香族基またはアルキル、式XII〜X
VIIにおいてR3はアセチル、フェノキシアセチル、メト
キシアセチルまたはクロロメトキシアセチル、R6は芳香
族基またはアルキルであり、但しR2がＨの時、R1は請求
項１で定義したR1の１つであり、R2の代わりにR1がＨの
時、R2は請求項１で定義したR1の１つである）。 - 【請求項４】R6がフェニル、プロピルまたは（CH3）３
−である請求項３の合成方法。 - 【請求項５】アクセプター物質が、グルコフラノース誘
導体である請求項１の合成方法。 - 【請求項６】アクセプター物質が、1,2−イソプロピリ
デン−α−Ｄ−グルコフラノシドである請求項１の合成
方法。 - 【請求項７】アクセプター物質が、1,2−Ｏ−イソプロ
ピリデン−α−Ｄ−グルコフラノースの３−誘導体であ
る請求項１の合成方法。 - 【請求項８】アクセプター物質が1,2−Ｏ−イソプロピ
リデン−３−Ｏ−3'−（N',N'−ジメチルアミノ−ｎ−
プロピル）−Ｄ−グルコフラノース塩酸塩である請求項
１の合成方法。 - 【請求項９】該有機基が、アセチル、ベンゾイル、ピバ
ロイル、アリル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジルエー
テル、ｐ−イソプロピリデンまたはベンジリデンである
請求項１の合成方法。 - 【請求項１０】該無機基はスルフェート、ホスフェー
ト、−NHOH−または−N3である請求項１の合成方法。 - 【請求項１１】該グリコシドナーが１つもしくはそれ以
上のモノサッカライド残基、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マ
ンノース、Ｎ−アセチルニューラミン酸、Ｎ−アセチル
−Ｄ−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミ
ンまたはＬ−フコースを含む請求項１の合成方法。 - 【請求項１２】該グリコシダーゼがＤ−ガラクトシダー
ゼ、Ｌ−フコシダーゼ、ヘキソサミニダーゼ、Ｎ−アセ
チルグルコサミニダーゼまたはＮ−アセチル−Ｄ−ガラ
クトサミニダーゼである請求項１の合成方法。 - 【請求項１３】該グリコシダーゼはin situまたは単離
された天然のグリコシダーゼまたは組換えグリコシダー
ゼである請求項１から12のいずれかの合成方法。 - 【請求項１４】グリコシダーゼを、沈澱、吸着、密閉、
キレート化または共有結合を介してプロトン性または非
プロトン性溶媒に不溶解性のポリマー性物質に固定す
る、請求項１の合成方法。 - 【請求項１５】ポリマー性物質がポリサッカライド、プ
ラスチック、コポリマー、シリケートおよびガラスから
選ばれる請求項13または14の合成方法。 - 【請求項１６】該アクセプターが、Ｄ−ガラクタール、
Ｄ−グルカールまたはR3、R4、R5およびR6の少なくとも
１つが−OHでないＤ−ガラクタールまたはＤ−グルカー
ルである請求項１の合成方法。 - 【請求項１７】該アクセプターがＤ−ガラクトピラノー
スまたはR2、R3、R4およびR6の少なくとも１つが−OHで
ないＤ−グルコピラノースである請求項１の合成方法。 - 【請求項１８】１）ａ）請求項３に定義した式１の物
質、 ｂ）GalNAcα−OPhまたはGalNAcα−OPhNO2−ｐ、およ
び ｃ）α−ガラクトサミニダーゼ を反応させて、GalNAcα１−3Galαの２−Ｏ−誘導体を
形成し、次いで ２） 更に該導体を血液型決定因子Ａまたはその誘導体
に合成する請求項１の合成方法。 - 【請求項１９】１）ａ）Ｃ−２の位置が保護されR2がPh
CHO−またはCH2＝CH−CH2O−である、α−Ｄ−ガラクト
ピラノース、 ｂ）ラフイノース、メチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシ
ドまたはｐ−ニトロフェニル−α−ガラクトピラノシ
ド、および ｃ）α−ガラクトシダーゼ を反応させてGalα１−3Galαの２−Ｏ−誘導体を形成
し、 ２） 更に該誘導体を血液型決定因子Ｂまたはその誘導
体に合成する請求項１の合成方法。 - 【請求項２０】１）ａ）Ｎ−アセチル−グルコサミン誘
導体、 ｂ）ラクトースまたはｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノース、および ｃ）β−ガラクトシダーゼ を反応させてGal−GlcNAcのβ−結合誘導体を形成し、 ２） 更に該誘導体をルイス−Ｘまたはルイス−αまた
はその誘導体に合成する請求項１の合成方法。 - 【請求項２１】Gal−GlcNAcのβ−結合誘導体が以下の
いずれかで表されるものである請求項20の合成方法。 - 【請求項２２】１）ａ）部分的に保護されたガラスクト
ース誘導体またはガラクトサミン誘導体、 ｂ）Ｎ−アセチルノイラミニン酸のニトロフェニルグリ
コシド、および ｃ）α−シアリダーゼ を反応させて、シアリル化ガラクトシダーゼ誘導体また
はガラクトサミン誘導体を形成する請求項１の合成方
法。 - 【請求項２３】グリコシダーゼ触媒工程において得られ
る生成物を、ジサッカライド、トリサッカライドまたは
高級サッカライドまたはそれらの誘導体を合成するため
の酵素的合成に用いる請求項１の合成方法。 - 【請求項２４】該ポリサッカライドがセルロースまたは
アガロースであり、該プラスチックがポリアクリルアミ
ド、ポリビニルアルコールまたはポリスチレンである請
求項15の合成方法。 - 【請求項２５】該グリコシルドナーがGalα−OPhNO2−
ｐ、該アクセプターが２−Ｏ−アリル−Galα−OMe、該
グリコシダーゼがα−Ｄ−ガラクトシダーゼ、該生成物
が任意にパーアセチル化されたGalα１−３（２−Ｏ−
アリル）Galα−OMeである請求項１の合成方法。 - 【請求項２６】該グリコシルドナーがGalα−OPhNO2−
ｐ、該アクセプターが２−Ｏ−ベンジル−Galα−OMe、
該グリコシダーゼがα−Ｄ−ガラクトシダーゼ、該生成
物が任意にパーアセチル化されたGalα１−３（２−Ｏ
−ベンジル）Galα−OMeである請求項１の合成方法。 - 【請求項２７】該グリコシルドナーがGalα−OPhNO2−
ｐ、該アクセプターが２−Ｏ−アリル−６−Ｏ−アリル
−Galα−OMe、該グリコシダーゼがα−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼ、該生成物が任意にパーアセチル化されたGalα
１−３（２−Ｏ−アリル−６−Ｏ−アリル）Galα−OMe
である請求項１の合成方法。 - 【請求項２８】該グリコシルドナーがGalβ−OPhNO2−
ｏ、該アクセプターが２−Ｏ−ベンジル−Galβ−OBn、
該グリコシダーゼがβ−ガラクトシダーゼ、該生成物が
任意にパーアセチル化されたGalβ１−３（２−Ｏ−ベ
ンジル）Galβ−OBnである請求項１の合成方法。 - 【請求項２９】該グリコシルドナーがNeu5Acα−OPhNO2
−ｐ、該アクセプターが２−Ｏ−アリル−６−Ｏ−アリ
ル−Galβ−OMe、該グリコシダーゼがα−シアリダー
ゼ、該生成物がNeu5Acα２−３（２−Ｏ−アリル−６−
Ｏ−アリル）Galβ−OMeである請求項１の合成方法。 - 【請求項３０】該グリコシルドナーがGlcNAcβ−OPhNO2
−ｐ、該アクセプターが２−Ｏ−アリル−６−Ｏ−アリ
ル−Galβ−OMe、該グリコシダーゼがβ−Ｄ−Ｎ−アセ
チルグルコサミニダーゼ、該生成物が任意にパーアセチ
ル化されたGlcNAcβ１−３（２−Ｏ−アリル−６−Ｏ−
アリル）Galβ−OMeである請求項１の合成方法。 - 【請求項３１】該グリコシルドナーがGalβ−OPhNO2−
ｏ、該アクセプターが1,2−アンヒドロ−α−Ｄ−グル
コフラノシド、該グリコシダーゼがβ−ガラクトシダー
ゼ、該生成物がβ−ガラクトシル−1,2−アンヒドロ−
α−Ｄ−グルコフラノシドである請求項１の合成方法。 - 【請求項３２】−OC（Ｏ）Ｒエステルがアセチル、ブタ
ノイル、オクタノイル、ベンゾイルまたはピバロイルで
ある請求項１の合成方法。
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