SK281488B6

SK281488B6 - Spôsob syntézy di-, tri- alebo vyššieho oligosacharidového produktu

Info

Publication number: SK281488B6
Application number: SK132-94A
Authority: SK
Inventors: Kurt Nilsson
Original assignee: Kurt Nilsson
Priority date: 1991-08-06
Filing date: 1992-08-06
Publication date: 2001-04-09
Also published as: SE9102292D0; ATE177790T1; CA2115070C; SK13294A3; EP0598051A1; WO1993003168A1; DE69228692T2; DE69228692D1; EP0598051B1; CA2115070A1; CZ283463B6; JPH07500494A; SE9102292L; CZ23894A3; US5532147A; JP3375129B2

Abstract

Spôsob syntézy di-, tri- alebo vyššieho oligosacharidového produktu reakciou a) glykozylového donora zahrnujúceho monosacharid, disacharid, oligosacharid alebo glykozid, b) určitého špecifického akceptora, ktorým je derivát galaktózy alebo derivát glukózy definovaný v patentových nárokoch a c) glykozidázy, ktorou je endo- alebo exoglykozidáza zo skupiny E. C. 3. 2, kde sa potom vzniknutý produkt prípadne izoluje. Pri tejto reakcii glykozylový donor prenáša sacharidovú skupinu na akceptor za vzniku produktu.ŕ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka enzymatického spôsobu syntézy di-, tri- alebo vyššieho oligosacharidového produktu, ktorý sa hodí na ďalšiu syntézu, napríklad biologických receptorových štruktúr, ako sú determinanty krvnej skupiny alebo iné deriváty, ktoré je možné priamo používať v lekárskych alebo diagnostických aplikáciách.

Doterajší stav techniky

Sacharidy (uhľohydráty) majú ústrednú funkciu v živých organizmoch pri metabolizme, ako zdroj energie, pri ochrane proti vplyvu prostredia, ako biologické markery, ako receptorové látky a ako antigénne determinanty. Oligosacharidová časť glykoproteínov a glykolipidov je dôležitá in vivo (Biology of Carbohydrates, zv. 2, Ginsburg a ďalší, Wiley, New York, 1984; The Glycoconjugates, zv. I-V, Academic Press, New York; S. Hakomori, Ann, Rev. Biochem., zv. 50, str. 733 až 764; Feizi, Náture str. 314, 1985; S. Hakomori, Chemistry and Physics of Lipids, zv. 42, str. 209 až 233). Okrem iného bolo zistené, že

- sacharidové štruktúry sú dôležité pre stabilitu, aktivitu, lokalizáciu, imunogenicitu a degradáciu glykoproteínov;

- sacharidy sú antigénnymi determinantmi (napríklad antigény krvnej skupiny);

- ak sú naviazané na povrch bunky, fungujú sacharidy ako receptory pre patogény, proteíny, hormóny, toxíny a tiež pri vzájomných interakciách medzi bunkami;

- sacharidy sú dôležité pre onkogenézu, keďže bolo zistené, že špecifické oligosacharidy sú antigénnymi determinantmi, ktoré majú spojenie s rakovinou;

- na dosiahnutie úplnej biologickej aktivity (napríklad receptorovej aktivity je často nutná prítomnosť len malej sekvencie (di- alebo tri- sacharidu) sacharidovej časti glykokonjugátu.

Oligosacharidové deriváty obsahujúce jednu alebo viac modifikovaných alebo derivatizovaných monosacharidových jednotiek, ktoré napríklad obsahujú deoxy-, fosfo-, sulfáto-, derivatizované amino alebo tioskupiny, majú veľký význam pri farmaceutických alebo diagnostických aplikáciách sacharidov, pri ktorých dochádza k modifikácii metabolizmu určitej látky a/alebo k zvýšeniu biologického účinku prírodnej látky.

Deriváty sacharidov sa tiež všeobecne používajú ako syntetické medziprodukty pri selektívnej organickej chemickej syntéze sacharidov (pozri napríklad Binkley: Modem Carbohydrate Chemistry, Marcel Dekker, New York, 1988 a citácie v tejto publikácie uvedené). Selektívna chemická syntéza sacharidov vyžaduje v rozsiahlej miere používanie chrániacich skupín a zahrnuje veľký počet syntetických stupňov, okrem iného z toho dôvodu, že syntéza selektívne modifikovaných sacharidových medziproduktov býva komplikovaná. Je preto žiaduce vyvinúť účinné spô-

V EP-A-O 226 563 (SE-B-451849) (Svenska Seockerfabriks AB) je opísaný spôsob regulácie regioselektivity glykozidických väzieb.

V WO 91/02806 (Procur AB) je opísaný spôsob výroby oligosacharidovej zlúčeniny pri použití glykozidáz z mäkkýšov.

Úlohou EP-A-O 226 563 a WO 91/02806 je ovplyvniť regioselektivitu reakciou katalyzovaných glykozidázou použitím vhodných akceptorových glykozidov. Jedna alebo viac hydroxyskupín akceptorového glykozidu môže byť modifikovaná vodíkom alebo organickou skupinou. Ako príklady sú tu uvedené l-nitrofenyl-2-deoxygalaktopyranozid a nahradenie kruhového kyslíka atómom síry alebo atómom dusíka. Takéto akceptory je možné údajne použiť na získanie oligosacharidových analógov, ktoré sú užitočné ako inhibítory. Všetky ďalšie príklady a príklady s praktickými podrobnosťami opísané v týchto publikáciách sa týkajú použitia akceptorových glykozidov modifikovaných výlučne v polohe C-l akceptora.

V citovaných publikáciách nie je opísaný princíp tohto vynálezu spočívajúci v použití glukózových/galaktózových akceptorov modifikovaných v špecifickej polohe alebo polohách C-2, C-3, C-4, C-5 a/alebo C-6 pomocou chrániacej skupiny alebo skupín, ktoré je možné odstrániť pred reakciou katalyzovanou glykozidázou, za vzniku produktov, ktoré sa výborne hodia na ďalšie manipulácie uvedené v opise tohto vynálezu. Nie je tu uvedené ani príkladmi doložené použitie glykozidáz na výrobu sacharidov špecificky modifikovaných v polohách C-2, C-3, C-4, C-5 a/alebo C-6 takýmito odštiepiteľnými skupinami.

V Tibtech 6, 256 až 264 je opísaná enzymatická syntéza oligosacharidov. Predovšetkým je tu opísaná chemická metóda prípravy dimanozidov s obsahom 2,3-izopropylidén-a-manopyranozidu. Tento vynález sa oproti tomu týka spôsobu výroby sacharidov, ktoré sú pri použití glykozidáz špecificky modifikované v zvyšku galaktózy, galaktozamínu, glukózy alebo glukozaminu.

V Carbohydrate Research 167, 1987 str. 95 až 103 je opísaná zmena regioselektivity glykozidázou katalyzovanej tvorby disacharidov obsahujúcich substituent v polohe 1. Táto publikácia sa od tohto vynálezu odlišuje rovnakým spôsobom ako EP-A-O 226 563 a WO 91/02806, charakterizované.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je spôsob syntézy di, tri- alebo vyššieho oligosacharidového produktu reakciou

a) glykozylového donora zahrnujúceho monosacharid, disacharid, oligosacharid alebo glykozid,

b) akceptora a

c) glykozidázy, pri ktorej glykozylový donor prenáša sacharidovú skupinu na akceptor za vzniku produktu, ktorého podstata spočíva v tom, že sa ako akceptor použije niektorý zo všeobecných vzorcov

kde R] = R₂ = R₃ = R| = Rô = -OH, -F alebo anorganická alebo organická skupina definovaná ďalej, pričom aspoň jeden a najviac tri zo symbolov R₂, R₃, R4 a Re sú odlišné od hydroxyskupiny, a ak R] predstavuje organickú alebo anorganickú skupinu, je táto organická alebo anorganická skupina zvolená zo súboru zahrnujúceho -OMe, -OA11, -OPh, -OCH₂Ph, -OEtBr, -OEtSiMe₃, -0(01^01=(¾ -SMe, -SEt, -SPh, sacharidovú, lipidovú, aminokyselinovú a peptidovú skupinu, ak R₂, R₃, R, a/alebo Re predstavuje organickú alebo anorganickú skupinu, je táto organická alebo anorganická skupina zvolená zo súboru zahrnujúceho -OMe, -OA11, -OPh, -OCH₂Ph, -OEtBr, -OEtSiMe₃, -O(CH₂)₃CH=CH₂, -SMe, -SEt, -SPh, sacharidovú, lipidovú, aminokyselinovú a peptidovú skupinu, -NHAc, N-chlórmetoxyacetyl, N-fenoxyacetyl, -NHBOC, -NHOH, -N₃, p-metoxybenzyléterovú skupinu, trityl, trialkylsilyléterovú skupinu, pivaloyl, tetrahydopyranoyl, (2-metoxyetoxy)metylizopropylidénketalovú skupinu, cyklohexylidénketalovú skupinu, benzylidénacetalovú skupinu, ortoesterovú skupinu, -ONO₃, tosylátovú, mesylátovú, sulfátovú, fosfátovú a karboxylátovú skupinu a že sa ako glykozidáza použije endo alebo exoglykozidáza zo skupiny E.C.3.2 a potom sa vzniknutý produkt prípadne izoluje.

Tento spôsob umožňuje drasticky zjednodušiť syntézu derivatizovaných alebo modifikovaných di- alebo trisacharidov a vyšších oligasacharidov. Sacharidové deriváty, ktoré bolo nutné až doteraz známymi metódami syntetizovať v niekoľkých reakčných stupňoch, je možné spôsobom podľa tohto vynálezu teraz získať len v jednom reakčnom stupni a s absolútnou stereošpecificitou, čo tiež predstavuje rozdiel v porovnaní s chemickými metódami, pri ktorých boli používané viac alebo menej jedovaté reakčné činidlá, napríklad triflát striebra alebo kyanid ortuti a pri ktorých bol požadovaný a- alebo β- izomér získavaný spolu s nežiaducim stereoizomérom.

Syntetická metóda podľa tohto vynálezu zahrnuje aspoň jeden postup, ktorý sa vyznačuje tým, že sa používa glykozidáza (E. C. 3.2) na katalýzu rovnovážnej alebo transglykozylačnej reakcie medzi akceptomou látkou, ktorou je buď derivát galaktózy alebo derivát glukózy a glykozylovým donorom, ktorým je monosacharid, oligosacharid alebo glykozid, pričom produkt sa používa na ďalšiu syntézu a/alebo sa izoluje zo zmesi produktov.

Vynález teda umožňuje uskutočňovať stereošpecifickú syntézu derivátov di-, trisacharidov alebo vyšších oligosacharidov, ktoré sa dajú používať priamo alebo po ďalšej syntéze pri početných rôznych aplikáciách, napríklad pri farmaceutických, lekárskych alebo diagnostických štúdiách, pri liečbe alebo diagnostike, ako prísady do kozmetických výrobkov alebo potravín, na modifikáciu separačných látok, v afmitnej chromatografii, pri modifikácii aminokyselín, peptidov, proteínov, mastných kyselín, lipidov, enzýmov a rekombinantných proteínov.

Pri syntéze podľa tohto vynálezu sa dá schopnosť glykozidáz tvoriť stereošpecifické glykozidické väzby medzi glykozolovým donorom (v nasledujúcej reakčnej rovnici je glykozolový donor znázornený skratkou DOR, kde D predstavuje prenesenú uhľohydrátovovú časť) a glykozolovým akceptorom (HOA) znázorniť touto rovnicou:

DOR + HOA DO A + HOR (1)

Reakcia podľa tohto vynálezu sa môže uskutočňovať podľa dvoch princípov, buď ako syntéza, ktorá je riadená rovnováhou (R = H) alebo ako transglykozylačná reakcia (R = F alebo organický zvyšok); teda kinetický riadená reakcia. Tento typ reakcií je odborníkom dobre známy a konkrétny spôsob ich uskutočnenia ani výber glykozylových donorov a glykozidáz nepredstavujú pre rozsah tohto vynálezu žiadne obmedzenie.

Ako príklady akceptórnych látok, ktoré sa dajú použiť pri spôsobe podľa tohto vynálezu, je možné uviesť D-galaktal, D-glukal a D-galaktal alebo D-glukal, ktoré boli modifikované jednou alebo viacerými organickými alebo anorganickými skupinami v jednej alebo viacerých polohách C-3, C-4, C-5 alebo C-6 a D-galaktopyranózu alebo D-glukopyranózu, ktoré boli modifikované jednou alebo viacerými organickými alebo anorganickými skupinami v jednej alebo viacerých polohách C-2, C-3, C-4 alebo C-6 alebo glykozidy takýchto derivátov. Pri spôsobe podľa vynálezu je tiež možné použiť podobné deriváty N-acetylglukopyranózy a N-acetylgalaktopyranózy.

Príklady štruktúr, ktoré sa dajú použiť ako akceptóme látky (HOA v rovnici 1) na tvorbu oligosacharidových derivátov podľa tohto vynálezu sú uvedené ďalej. Tieto štruktúry symbolizujú derivatizovanú alebo modifikovanú D-galaktopyranózu (v D-galaktopyranóze a D-glukopyranóze platí, že R[ = R- = R₃ = R₄ = R5 = OH; v N-acetylglukozamíne a N-acetylgalaktozamíne R₂ = NHAc; pričom Ac znamená acetylskupinu, Ph znamená fenylskupinu, Bz znamená benzoylskupinu a All znamená alylskupinu).

Deriváty galaktózy

Deriváty glukózy »>

kde

Ri (i = 1 až 6) predstavuje hydroxyskupinu (-OH), fluoridovú skupinu alebo organickú alebo anorganickú skupinu a · aspoň jeden a najviac 3 zo symbolov ·

R₃₍ R4 alebo R< nepredstavuje hydroxyskupinu.

Symbol R] môže napríklad znamenať niektorý zo zvyškov, ktorý je zvolený zo súboru zahrnujúceho -OH, -F, -OMe, -OA11, OPh, -OCHjPh, OEtBr, -OEtSiMe,, -O(CH₂),CH=CH₂, -SMe, -SEt, -EPh, uhľohydrátové zvyšky, zvyšky derivátov lipidov, aminokyselín alebo peptidov alebo inú skupinu viazanú k anomémemu uhlíku.

Ktorýkoľvek zo zvyškov R₂, R₃, R4 a/alebo Re môže napríklad predstavovať niektorú z uvedených skupín alebo niektorú skupinu zvolenú zo súboru zahrnujúceho napríklad tieto skupiny: -NHAc, NHC(O)CH₂C1 (N-chlórmetoxyacetyl), NHC(O)CH₂OPh (N-fenoxyacetyl), -NHBOC, -NHOH, -N₃, p-metoxybenzyléterový zvyšok (-OCH₂Ph-OMe-p), tritylskupinu (-OC(Ph)₃), trialkylsilyléterovú skupinu, pivaloylskupinu, tetrahydropyranylskupinu, (2-metoxyetoxy)metylizopropylidénketalovú skupinu, cyklohexylidénketalovú skupinu, benzylidénacetalovú skupinu, ortoesterovú skupinu, -ONO₃, tozylátovú, mezylátovú, sulfátovú, fosfátovú alebo karboxylátovú skupinu, derivát sulfátovej, fosfátovej alebo karboxylátovej skupiny, esterovú skupinu, t. j. skupinu typu -OC(O)R, ako je acetylová, butanoylová, oktanoylová, benzoylová s pivaloylová skupina, atď.

Štruktúry, ktoré sú uvedené ďalej a ktoré sú modifikované podobným spôsobom, aký je uvedený, je tiež možné používať ako akceptóme látky pri spôsobe podľa tohto vynálezu.

Voľba typu modifikácie akceptora sa uskutočňuje podľa toho, aké sú požiadavky v určitej konkrétnej situácii s literatúra je bohatá na informácie, ktoré sa týkajú používania ochranných skupín alebo modifikácie uhľohydrátov a syntézy uhľohydrátov všeobecne (pozri napríklad Modem Carbohydrate Chemistry, Binkley, Marcel Dekker, 1988 a citácie v tejto publikácii uvedené a ďalej tiež Paulsen, Chem. Soc. Rev. 13, str. 15 až 45). Ďalej je uvedených niekoľko príkladov, ktoré sa dajú používať pri spôsobe podľa vynálezu. Na rozsah týchto látok sa však vynález neobmedzuje. Štruktúry I až XI predstavujú galaktózové deriváty a štruktúry XII až XVII sú deriváty N-acetylglukozamínu. Podľa vynálezu sa dajú tiež používať anhydrocukry, ktorc sú predstavované štruktúrami VII a VIII.

V štruktúrach I až XI, uvedených, predstavuje R₃ napríklad alkylovú, benzylovú, chlórbenzylová alebo benzoylovú skupinu alebo chrániacu skupinu iného typu, ktorá sa hodí na túto špecifickú syntézu. Symbol R« môže predstavovať aromatickú skupinu, ako napríklad skupinu Ph- alebo alkylskupinu (napríklad propylskupinu alebo skupinu (CH₃)₃. Keď napríklad R₂ znamená atóm vodíka, predstavuje R| jednu zo skupín, ktoré boli spomenuté, a naopak, keď R] znamená atóm vodíka, predstavuje R₂ niektorú z uvedených skupín.

Ako príklad ilustrujúci tento vynález, ktorý však v žiadnom smere neobmedzuje rozsah tohto vynálezu, sa dá uviesť, že keď sa napríklad použije ako enzým a-galaktozidáza, ako akceptóme látky sa použije a-D-galaktopyranóza, ktorá je chránená v polohe C-2, napríklad látka so vzorcom (I), uvedeným, kde R₂ napríklad predstavuje skupinu so vzorcom HO-, MeO-, PhCHO- alebo CH₂=CH-CH₂O- a ako glykozylový donor (pri transglykozylačnej reakcii) sa použije napríklad rafinóza, metyl-a-D-galaktopyranozid alebo p-nitrofenyl-a-D-galaktopyranozid, získa sa α-glykozidicky viazaný digalaktozylový derivát so vzorcom

t. j. 2-0-derivát Galal-3-Gala-R.

Ako iný príklad, keď sa zlúčenina so vzorcom (I) použije ako akceptor a α-galaktozaminidáza, napríklad z Cha melea gallina a napríklad GalNAca-OPh alebo GalNAca-OPhNO₂-p sa použije ako glykozylový donor, získa sa 2-0-derivát GalNAcal-3-Gala-R.

Získané produkty sa môžu používať pri ďalšej syntéze, napríklad pri chemickej syntéze vyšších oligosacharidov. Literatúra obsahuje mnoho informácii o tom, ako používať čiastočne chránené uhľohydráty (pozri odkazy uvedené v prácach Binkleya a Paulsena, ktoré sú citované). Ako príklad sa dá uviesť, že skupina -OCH₂Ph sa dá odštiepiť po chránení hydroxylových skupín a vymeniť napríklad za a-viazanú L-fukopyranozylskupinu. Týmto spôsobom sa syntetizuje z 2-0-chráneného-derivátu GalNAcal-3Gal-R a Galal-3Gal-R determinant A a B krvnej skupiny.

Keď sa použije β-galaktozidáza namiesto a-galaktozidázy, keď sa ako glykozylový donor použije laktóza alebo napríklad p-nitrofenyl-P-D-galaktopyranozid a keď sa ako akceptor použije N-acetylglukózaminový derivát (pozri napríklad uvedené vzorce (XII) až (XVII),), získajú sa β-viazané deriváty Gal-GlcNac-R. Ako príklady takýchto sčasti chránených derivátov Gal-GlcNac, ktoré sa dajú napríklad používať pri chemickej syntéze Lewisových-x alebo Lewisových-a trisacharidových štruktúr (alebo ktoré sa dajú používať pri chemickej syntéze disacharidových derivátov týchto látok) sa dajú uviesť tieto štruktúry.

Okrem toho, ak sa namiesto toho použije a-fukozidáza, napríklad s nitrofenyl-a-L-fukopyranozidom, ako glykozylovým donorom, môžu sa spôsobom podľa vynálezu, syntetizovať zodpovedajúce deriváty α-viazaného FucGal-R a α-viazaného Fuc-GlcNAc-R. Použitím N-acetyl-β-glukozaminidázy alebo N-acetyl-p-galaktozaminidázy sa môžu pripravovať deriváty β-viazaného GlcNAc-Gal a GlcNAc-GlcNAc-R alebo GalNAc-Gal-R a GalNAc-GlcNAc, použitím β-glykozidov GlcNAc alebo GalNAc, ako glykozylových donorov. Podobne sa môže použiť a-sialidáza na katalýzu syntézy sialylovaných derivátov galaktózy (derivátov Neu5Aca-Gal) alebo derivátov galaktózamínu (derivátov Ncu5Aca-GalNAc) použitím napríklad nitrofenylglykozidu N-acetylneuraminovej kyseliny a čiastočne chráneného derivátu galaktózy alebo derivátu galaktózamínu ako akceptora.

Použitím endoglykozidázy sa môžu pripravovať spôsobom podľa tohto vynálezu dlhšie oligosacharidové deriváty. Reakcie uvedené sa dajú tiež uskutočňovať ako rovnovážne reakcie, pri ktorých sa ako glykozylové donory používajú monosacharidy.

Pri spôsobe podľa vynálezu sa tiež môžu použiť rôzne deriváty glukofuranózy ako 1,2-izopropylidén-a-D-glukoíuranozid (štruktúra XVIII, uvedená ďalej) ako akceptor.

Tieto oligosacharidové deriváty 1,2-izopropylidén-a-D-glukofuranozidu, napríklad 3-deriváty 1,2-0-izopropylidén-a-D-glukoíuranózy, ako hydrochloridu 1,2-0-izopropylidén-3-0-3'-(N‘,N'-dimetylamino-n-propyl)-D-glukoflj-

ranózy (ďalej označovaného názvom terafektín, čo je látka, ktorá je účinná pri reumatoidnej artrítis, psoriasis, niektorých typoch rakoviny a astmy /Gordon P., Chemical Abstracts, zv. 95, abstrakt č. 54887 a Inflammation: 4. Mech. Treat. Proc. Int. Meet. (1980), 169 až 180, University Park Press, Baltimore, USA/ sa teda dajú syntetizovať spôsobom podľa tohto vynálezu buď tak, že sa ako akceptor použije zlúčenina so vzorcom (XVIII) (disacharidový produkt je modifikovaný po enzymatickej reakcii v polohe 3) alebo 3-modifikovaný derivát zlúčeniny so vzorcom (XVIII).

Neobmedzujúce príklady, ako sa to dá dosiahnuť spôsobom podľa vynálezu sú uvedené ďalej:

- Terafektín alebo jeho analógy sa nechajú reagovať napríklad s laktózou alebo nitrofenyl-P-galaktozidom vo vhodnom rozpúšťadle použitím β-galaktozidázy (napríklad z E. coli alebo Aspergillus niger) ako katalyzátora. Týmto spôsobom sa získa terafektín, modifikovaný β-glykozidicky viazanou galaktopyranozylovou skupinou. Tieto látky sa potom môžu použiť pri farmaceutických alebo kozmetických aplikáciách alebo na ďalšiu chemickú alebo enzymatickú syntézu. Tak napríklad sa môžu do produktu, ktorý sa získa pri prvej reakcii, zaviesť ďalšie uhľohydrátové skupiny opakovanou syntézou, katalyzovanou glykozidázou, použitím rovnakej alebo inej glykozidázy, alebo sa môže použiť napríklad sialyltransferáza a CMP-Neu5Ac na syntézu Neu5Aca2-3Gaipi-0-terafektínu, alebo jeho zodpovedajúceho 2,6-derivátu. Galaktozylový derivát sa prípadne môže pred týmito poslednými reakciami chemicky modifikovať.

- Podobným spôsobom sa môže terafektín alebo jeho analóg nechať reagovať napr. s GlcNAcp-OR, GalNAcP-OR, Mana-OR, Gala-OR, Glcp-OR (R=F, H, alkyl, aryl alebo uhľohydrátový zvyšok) použitím glukozaminidázy, galaktozaminidázy, mannozidázy, galaktozidázy alebo glukozidázy ako katalyzátora.

- Podobným spôsobom sa môže použiť endoglykozidáza ako katalyzátor a oligosacharid alebo jeho derivát ako glykozylový donor a terafektín alebo jeho analóg ako akceptor.

Uvedené reakcie sa dajú tiež uskutočňovať ako rovnovážne reakcie s jednoduchým monosacharidom ako glykozylovým donorom.

Benzylová alebo alylová skupina (alebo iné skupiny, ktoré boli spomenuté v súvislosti s uvedenými vzorcami) v uvedených produktoch sa dá ľahko chemicky previesť na celý rad iných skupín než je zvyšok L-fukózy, a týmto spôsobom sa dá spôsobom podľa vynálezu selektívne syntetizovať niekoľko rôznych disacharidových derivátov (napríklad O-fosfát, 0-sulfát, atď.) alebo vyšších oligosacharidov.

Okrem tohto sa dajú získané produkty používať na ďalšiu enzymatickú syntézu použitím galaktozidáz alebo glykozyltransferáz. Tak napríklad α-sialyltransferáza sa môže použiť na katalýzu tvorby sialylových Gal-GlcNAc-derivátov a β-galaktozyltransferáza sa môže použiť na tvorbu oligosacharidových derivátov typu Gal-GcNAc-Gal-R, ktoré sa dajú nakoniec sialylovať a/alebo ktoré sa dajú použiť na ďalšiu chemickú syntézu atď.

Keď sa ako akceptor použije modifikovaný galaktozid alebo glukozid, volí sa aglykón s ohľadom na aplikáciu produktu. Z aglykónov je špeciálny záujem zameraný na aminokyseliny (serín, treonín, hydroxyprolín, hydroxylyzín, asparagín, atď.), peptidy, lipidy a deriváty alebo analógy látok z týchto troch skupín. Aminokyselinové alebo peptidové glykozidy môžu byť chránené na svojich a/alebo karboxylových funkčných skupinách obvyklými skupinami, ktoré sa používajú pri syntéze peptidov (FMOC, CBZ, BOC, atď.).

Produkty, ktoré sa získajú použitím modifikovaných alkylgylkozidov (napríklad modifikovaného metyl-, oktyl a dodecylglykozidu) ako akceptorových látok, sa môžu používať v afinitnej chromatografii alebo pri aglutinačných testoch, inhibičnej terapii alebo na zacielenie liečiv a ďalej tiež ako štruktúrne jednotky na ďalšiu enzymatickú syntézu. Nitrofenylglykozidy sa môžu redukovať na aminofenylglykozidy. Môžu sa tiež použiť glykozidy s polymerizovateľným aglykónom, ako napríklad 2-hydroxyetylmetakrylátom. Ako príklad N-glykozidicky viazaného aglykónu sa dá uviesť skupina -NHCO(CH₂)₅NH₂. Inými použiteľnými typmi aglykónov sú agylkóny, ktoré sa napríklad používajú pri syntéze glykolipidov alebo ich analógov na konverziu na ceramidy alebo ich analógy. Príklady aglykónov tohto typu sú opísané v práci Magnusson a ďalší, J. Org. Chem., (1990). Tioglykozidy (napríklad -SEt alebo -SPh) sa dajú používať spôsobom podľa vynálezu na výrobu produktov, ktoré sa hodia na ďalšiu chemickú syntézu. Voľba chrániacej skupiny alebo derivátu, aglykónu a polohy derivatizovaných hydroxylových skupín sa pri spôsobe podľa vynálezu môže použiť na ovplyvnenie výťažku a regioselektivity reakcie. Tak napríklad použitie hydrofóbnejších aglykónov (napríklad p-metoxybenzvl- a benzylskupiny, v porovnaní s napríklad alylskupinou) môže viesť k vyššiemu výťažku pri rovnakej koncentrácii akceptora.

Ako donorové substráty sa môžu používať pri spôsobe podľa vynálezu rovnaké látky, aké sa používali skôr spolu s glykozidázami pri syntéze, uskutočňovanej rovnovážnymi alebo transglykozylačnými reakciami.

Ako príklady donorových látok, ktoré sa dajú používať pri spôsobe podľa vynálezu, sa dajú uviesť monosacharidy, monosacharidové glykozidy a di- alebo oligosacharidy (alebo ich glykozidy), v ktorých uhľohydrátová časť obsahuje jeden alebo viac monosacharidov, zvolených zo súboru zahrnujúceho L-galaktózu, D-manózu, N-acetylneuraminovú kyselinu, N-acetyl-D-galaktozamín, N-acetyl-D-glukozamin a L-fúkózu. Ako príklady vhodných glykozylavých donorov je možné uviesť nitrofenyl-α,- alebo β-glykozidy uvedených monosacharidov, laktózy, dimanózy a rafmózy. Vhodné donorové látky pre endoglykozidázy sú napríklad nitrofenylglykozidy biologicky účinných uhľohydrátových sekvencií (napríklad Gaipi-3-GlcNAc3-OPhNO₂-p), biologicky aktívne oligosacharidy alebo štruktúry typu Glc (βΐ-3Glc)„P 1 -3Glc (n > 1).

Koncentrácia glykozylového donora v reakčnej zmesi sa volí s ohľadom na syntetizovaný oligosacharid a tiež na vlastnosti enzýmu. Z tohto dôvodu nepredstavuje koncentrácie obmedzujúci faktor na tento vynález. Všeobecne môže byť výhodné pridávať donor po malých dávkach do transglykozylačnej reakčnej zmesi, aby sa minimalizovalo riziko, že bude donor pôsobiť tiež ako akceptor. Pri rovnovážnych reakciách sa často dáva prednosť tomu, aby bola začiatočná koncentrácia donora vysoká.

Enzým sa volí predovšetkým s ohľadom na oligosacharidový derivát, ktorý má byť syntetizovaný. Enzým sa môže používať in situ alebo po čiastočnej alebo úplnej purifikácii z jeho prírodného prostredia. Enzým sa môže používať v rozpustnej forme alebo imobilizovanej forme na pevnom nosiči, na ktorom je enzým zakotvený adsorpciou, zapuzdrením, chelatáciou, vyzrážaním alebo kovalentnou väzbou.

Ako príklady a- a β-glykozidáz, ktoré sa dajú používať pri spôsobe podľa vynálezu, sa dajú uviesť D-manozidázy, D-galaktozidázy, L-fukozidázy, N-acetyl-D-galaktozaminidázy, hexozaminidázy a iné glykozidázy z E. C. skupiny 3.2 (Enzýme Nomenclature (nomenklatúra enzýmov), Aca demic Press, 1984). Pri spôsobe podľa vynálezu sa môžu používať ako endo-, tak exoglykozidázy.

Stupeň čistoty použitého enzýmu nie je kritický. Enzým sa môže používať in situ alebo po úplnej alebo čiastočnej izolácii z jeho prírodného biologického prostredia. Tiež sa môže používať surový extrakt organizmu alebo jeho tkaniva. Použitý enzým sa dá tiež dopredu vyzrážať, napríklad síranom amónnym. Enzým môže byť prítomný v kryštalickej forme alebo môže byť obklopený micellami. Biochemická literatúra je bohatá na podrobné informácie, ktoré sa vzťahujú na purifikáciu a izoláciu glykozidáz. Enzým môže byť produkovaný rekombinantnými technikami. Potom sa prípadne môže jedna alebo viac aminokyselín v aminokyselinovej sekvencií enzýmu vymeniť, s cieľom optimalizácie vlastnosti enzýmu, napríklad jeho tepelnej stálosti, katalytickej účinnosti a/alebo regioselektivity.

Enzým sa môže používať v rozpustnej forme alebo môže byť izolovaný, napríklad adsorpciou, zapuzdrením, chelatáciou, vyzrážaním alebo kovalentnou väzbou, k pevnému nosiču, ako napríklad polymémej látke alebo jej derivátu, ktoré sú nerozpustné v protických alebo aprotických rozpúšťadlách (Methods in Enzymology, zv. 44, Academic Press, 1976). Zvolená forma nie je pre vynález kritická. Pokiaľ sa enzým používa v rozpustnej forme, môže sa dopredu vhodným spôsobom chemicky modifikovať, aby sa napríklad zvýšila jeho tepelná stálosť alebo stabilita v organických ko-rozpúšťadlách. Enzým, ktorý je imobilizovaný na nerozpustnom polyméri, napríklad agaróze, celulóze, hydroxyetylakryláte, skle, oxide kremičitom, polyakrylamide, plastoch typu polyakrylátov atď., sa ľahko oddelí z produkčnej zmesi sa môže sa znovu použiť. Prídavnou výhodou je, že sa v mnohých prípadoch imobilizáciou dosiahne určitá stabilizácia proti zvýšeným teplotám a organickým ko-rozpúšťadlám.

Syntetický postup podľa tohto vynálezu sa môže uskutočňovať pri veľmi rozmanitých podmienkach, čo sa napríklad týka pH, typu pufra, teploty a koncentrácie reakčných zložiek. Spolu s vodou sa môžu používať rôzne ko-rozpúšťadlá (ako napríklad Ν,Ν-dimetylformamid, acetonitril, dimetylsulfoxid, dioxán, pyridín, metanol, etanol, etylénglykol atď.), ktorých koncentrácia sa tiež môže meniť. Okrem toho, reakcie sa môžu tiež uskutočňovať v dvojfázovom systéme, zahrnujúcom vodu a organické rozpúšťadlo.

Reakčné podmienky nie sú kritické, ale volia sa predovšetkým podľa vlastností reakčných zložiek, ktoré sa používajú pri konkrétnej syntéze a tiež sa uplatňuje hľadisko praktickosti. Tak napríklad je obvykle účelné pracovať s enzýmami pri teplote miestnosti a v prípade, že sa používa médium bohaté na vodu, býva obvykle pH v rozmedzí od 4 do 11.

Organické ko-rozpúšťadlá sa môžu používať s cieľom minimalizácie hydrolytickej vedľajšej reakcie. Z rovnakého dôvodu sa môžu používať dvojfázové systémy. Ako príklady ko-rozpúšťadiel sa dá uviesť tetrahydrofúrán, acetonitril a dimetylformamid. Voľba rozpúšťadla a jeho koncentrácie neobmedzuje rozsah tohto vynálezu a odborník v tomto obore ju môže ľahko uskutočniť. Používanie vysokých koncentrácií organických rozpúšťadiel (približne 50 % a až takmer 100 %, vztiahnuté na celkový objem rozpúšťadla) môže byť osobitne výhodné v tom prípade, že sa používajú hydrofóbne akceptóme deriváty, ktoré vykazujú dobrú rozpustnosť v organických rozpúšťadlách, napríklad akceptory modifikované esterovými skupinami (napríklad acetyl-, benzoyl, butanoyl-, pivaloyl-, oktanoylskupinou atď.) a/alebo napríklad alylovými, benzylovými, tritylovými alebo inými skupinami. Týmto spôsobom sa dá v organických rozpúš ťadlách dosiahnuť pomerne vysoká koncentrácia akceptora a rozsah hydrolytickej vedľajšej reakcie sa môže vďaka nízkemu obsahu vody znížiť. Tento spôsob podľa vynálezu umožňuje syntetizovať v organickom rozpúšťadle napríklad trisacharidové deriváty a vyššie oligosacharidové deriváty pomocou exoglykozidáz použitím hydrofóbne chránených derivátov di- alebo oligosacharidov, ktoré obsahujú len jednu alebo niekoľko málo voľných hydroxylových skupín ako akceptorov.

Na zvýšenie rozpustnosti alebo dostupnosti a na uľahčenie reakcie s donorovou látkou sa napríklad môže používať fenylboronát, ktorý vytvára komplex so sacharidmi s vicinálnymi diolmi, pričom výsledný donor-boronátový komplex má vďaka prítomnosti fenylskupiny vyššiu rozpustnosť v organických rozpúšťadlách.

Tiež reakčná teplota sa môže meniť s cieľom ovplyvniť výťažok produktu a stabilitu enzýmu bez toho aby to predstavovalo pre rozsah vynálezu dajaké obmedzenie. Najčastejšie používaná teplota leží v rozmedzí od 4 do 55 °C, ale môže sa používať aj nižšia teplota. Teploty pod 0 °C sa môžu používať, pokiaľ sú prítomné organické ko-rozpúšťadlá. S tepelne stálymi glykozidázami a substrátmi sa dajú používať vyššie teploty, čo tiež platí pre enzýmy, ktoré sú stabilizované proti tepelnej denaturácii tým, že sa používajú vysoké koncentrácie substrátu (Johansson a ďalší, Biotechnol, Lett., 8 (1986, 421 až 424)). Výhodou použitia vysokých teplôt napríklad je, že sa môže používať substrát vo vysokej koncentrácii, čo má za následok zníženie aktivity vody, a teda aj zvýšenie výťažku produktu. Ďalšou výhodou je, že sa zvyšuje aktivita enzýmu, čo sa prejaví skrátením reakčného času pri zvýšených teplotách. Jednou prídavnou výhodou je, že sa ako vhodné glykozylové donory môžu pri zvýšených teplotách (50 až 60 °C) používať glykozidy, napríklad metyl alebo etylglykozid, ktoré sa pomaly hydrolyzujú pri teplote miestnosti. Horná hranica teploty je daná tepelnou stálosťou enzýmu v reakčnom prostredí. Pri niektorých transglykozyláciách sa zistilo, že práca pri nízkej teplote vedie k vyššiemu výťažku glykozidového produktu.

Koncentrácia akceptora predstavuje parameter, ktorý sa dá používať na ovplyvnenie výťažku reakcií podľa tohto vynálezu. Vysokým koncentráciám akceptora sa dáva prednosť ako pri rovnovážnych, tak aj pri transglykozylačných reakciách, s cieľom minimalizácie hydrolytických vedľajších reakcií. To obvykle znamená, že v závislosti od rozpustnosti sa akceptor používa približne v 0,2 až 7M koncentrácii. Pri rovnovážnych reakciách sa často používa vysoká koncentrácia donora. Obvykle sa vysoké koncentrácie substrátov dosahujú niekoľkominútovým zahrievaním reakčnej zmesi na teplotu blízku teplote varu, po ktorom sa nechá roztok schladiť na 37 až 75 °C (v závislosti od tepelnej stálosti enzýmu a substrátu) a potom sa pridá enzým. Na zvýšenie rozpustnosti substrátov s hydrofóbnymi skupinami sa používajú ko-rozpúšťadlá.

Reakcia sa dá monitorovať pomocou TLC (chromatografia na tenkej vrstve), HPLC (vysoko účinná kvapalinová chromatografia) alebo spektrofotometrickým stanovením uvoľneného aglykónu (napríklad p-nitrofenolu pri 400 nm). Pri dosiahnutí maximálneho výťažku glykozidového produktu sa reakcia ukončí denaturáciou enzýmu zmenou hodnoty pH, zvýšením teploty a/alebo prídavkom organického ko-rozpúšťadla (napríklad etanolu). Tri až päťminútové zahrievanie na 80 až 85 °C, po ktorom sa pridá etanol až do približne 80 % koncentrácie, je obvykle postačujúce.

Na izoláciu produktu sa môžu používať rôzne technológie. Užitočné je zrážanie, napríklad organickým rozpúšťadlom, ako je etanol, predovšetkým v tom prípade, keď sa používa jedna z reakčných zložiek v nadbytku alebo keď majú donor, akceptor, alebo produkty rôznu rozpustnosť.

Po uskutočnení syntézy rovnovážnou alebo transglykozylačnou reakciou a po napríklad opísanom tepelnom spracovaní, a zriedení reakčnej zmesi, môže byť užitočné pridať druhú glykozidázu, ktorá má odlišnú regioselektivitu než glykozidáza použitá pri syntéze. Týmto spôsobom sa dajú nežiaduce regioizoméry (napríklad s 1-6 väzbami) viac alebo menej selektívne hydrolyzovať, čo uľahčuje izoláciu požadovaného produktu. Zrážanie a hydrolýza vedľajších produktov predstavujú doplnkové metódy na chromatografiu (adsoipčnú chromatografiu; gélovú filtrácii, napríklad použitím stĺpca Sephadex G10 - G25; napríklad použitím aminomodifikovaného oxidu kremičitého, oxidu kremičitého s reverznou fázou alebo novšou náplňou Dionex).

Vynález je bližšie objasnený v nasledujúcich príkladoch uskutočnenia. Tieto príklady majú výhradne ilustratívny charakter a rozsah vynálezu, pre ktorý sú určujúce len pripojené nároky, v žiadnom ohľade neobmedzujú.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Syntéza peracetylovaného Galal-3(2-0-aiyl)Gala-OMe; metyl(2-0-alyl-3-0-a-D-galaktopyranozyl)-a-D-galaktopyranozidu

2-O-Alyl-Gala-OMe (metyl-2-0-alyl-a-D-galaktopyranozid; 0,4 g) sa rozpustí v pufri na báze fosforečnanu sodného (pH 6,5, 18 ml, 0,05M) a pridá sa p-nitrofenyl-a-D-galaktopyranozid (Gala-OPhNO₂-p; 50 mg), spolu so 400 μί α-D-galktozidázy (Sigma; 20 U) pri teplote miestnosti. Ďalší donor (Gala-OPhNO₂-p) sa pridáva po dávkach (50 mg; 10 dávok) v priebehu reakcie podľa toho, ako sa donor spotrebováva. Po asi 20 hodinách reakcie sa roztok približne 5 minút zahrieva, s cieľom inaktivácie enzýmu, a produkt sa prečistí stĺpcovou chromatografiou (najprv na stĺpci Sephadex G10, potom na stĺpci silikagélu a po acetylácii znovu na silikagéli ako pevnej fáze). Na potvrdenie štruktúry sa použije NMR acetylovaný produkt.

Príklad 2

Syntéza peracetylovaného Galal-3(2-0-benzyl)Gala-OMe; metyl(2-0-benzyl-3-0-a-D-galaktopyranozyl)-a-D-galaktopyranozidu

2-O-Benzyl-Gala-OMe (metyl-2-0-benzyl-a-D-galaktopyranozid; 0,4 g) sa rozpustí v pufri na báze fosforečnanu sodného (pH 6,5, 18 ml, 0,05M) a pridá sa p-nitrofenyl-a-D-galaktopyranozid (Gala-OPhNO₂-p; 50 mg), spolu so 400 μί α-D-galaktozidázy (Sigma; 20 U) pri teplote miestnosti. Ďalší donor (Gala-OPhNO₂-p) sa pridáva po dávkach (50 mg; 10 dávok) v priebehu reakcie podľa toho, ako sa donor spotrebováva. Po asi 20 hodinách reakcie sa roztok približne 5 minút zahrieva, s cieľom inaktivácie enzýmu, a produkt sa prečistí stĺpcovou chromatografiou použitím rovnakých techník, aké boli opísané v príklade 1. Na potvrdenie štruktúry sa použije NMR acetylovaný produkt.

Príklad 3

Syntéza peracetylovaného Gala 1-3 (2-0-alyl-6-0-alyl)Gala-OMe; metyl(2-0-alyl-6-0-alyl-3-0-a-D-galaktopyranozyl)-a-D-galaktopyranozidu

2-0-Alyl-6-alyl-Gala-OMe (metyl-2-0-alyl-6-0-alyl-a-D-galaktopyranozid; 0,4 g) sa rozpustí v pufri na báze fosforečnanu sodného (pH 6,5, 18 ml, 0,05M) a pridá sa p-nitrofenyl-a-D-galaktopyranozid (Gala-OPhNO₂-p; 50 mg), spolu s 400 μί α-D-galaktozidázy (Sigma; 20 U) pri teplote miestnosti. Ďalší donor (Gala-0PhNO₂-p) sa pridáva po dávkach (50 mg; 10 dávok) v priebehu reakcie podľa toho, ako sa donor spotrebováva. Po asi 20 hodinách reakcie sa roztok približne 7 minút zahrieva, s cieľom inaktivácie enzýmu, a produkt sa prečistí stĺpcovou chromatografiou použitím rovnakých technik, aké boli opísané v príklade 1. Na potvrdenie štruktúry sa použije NMR acetylovaný produkt.

Príklad 4

Syntéza peracetylovaného Galfl-3(2-0-benzyl)Galp-OBn; bcnzyl(2-0-benzyl-3-O-p-D-galaktopyranozyl)-fl-D-galaktopyranozidu

2-0-Benzyl-Gaip-OBn (metyl-2-0-benzyl-P-D-galaktopyranozid; 0,4 g) sa rozpustí v pufri na báze fosforečnanu sodného (pH 5,5, 18 ml, 0,05M) a pridáva sa pri teplote miestnosti o-nitrofenyl-(3-D-galaktopyranozid (Gaip-OPhNO₂-o) po dávkach (50 mg; 10 dávok) v priebehu reakcie podľa toho, ako sa donor spotrebováva. Reakcia a purifikácia sa uskutočňuje v podstate rovnakým spôsobom, ako je to opísané v príkladoch uvedených, len s tým rozdielom, že sa používa P-galaktozidázu (z Aspergillus niger; Sigma; St. Luis; USA), ako katalyzátor. Na potvrdenie štruktúry sa použije NMR acetylovaný produkt.

Príklad 5

Syntéza Neu5Aca2-3(2-0-alyl-6-0-alyl)Gaip-OMe

2-0-Alyl-6-0-alyl-Gaip-OMe (metyl-2-0-alyl-6-0-alyl-P-D-galaktopyranozid; 0,4 g) sa rozpustí v pufri na báze octanu sodného (pH 5,0, 18 ml, 0,05M) a k vzniknutému roztoku sa pri teplote miestnosti po dávkach pridáva (každá dávka 50 mg, celkovo 10 dávok) p-nitrofenyl-5-acetamido-3,5-dideoxy-a-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranozyló- , nová kyselina (Neu5Aca-OPhNO₂-p) takou rýchlosťou, ako sa spotrebováva. Reakcia a izolácia produktu sa uskutočňuje spôsobom opísaným, len s tým rozdielom, že sa ako katalyzátor použitej a-sialidáza (Vibrio cholerae; Sig-_tma) a produkt sa purifikuje stĺpcovou chromatografiou bez predchádzajúcej acetylácie.

Príklad 6

Syntéza peracetylovaného GlcNAcpi-3(2-0-alyl-6-0-alyl)GaiP-OMe

2-0-Alyl-6-0-alyl-Galp-OMe (metyl-2-0-alyl-6-0-alyl-β-D-galaktopyranozid; 0,4 g) sa rozpustí v pufri na báze octanu sodného (pH 6,5, 18 ml, 0,05M) a pri teplote miestnosti sa pridáva GlcNAcfl-OPhNOj-p (50 mg) takou rýchlosťou, akou sa spotrebováva. Reakcia a purifikácia produktu sa v podstate uskutočňuje spôsobmi opísanými v predchádzajúcich príkladoch, len s tým rozdielom, že sa ako katalyzátor použije β-D-N-acetylglukozaminidáza. Štruktúra produktu sa potvrdí NMR.

Príklad 7

Syntéza derivátov Gaipi-3GlcNAc a Galpl-4GlcNAc (zložky látok Lewisovej krvnej skupiny, ako sú Lewis-a, Lewis-x a sialylované štruktúry)

Produkty, ktorých štruktúra zodpovedá ďalej uvedeným všeobecným vzorcom, sa získajú použitím napríklad derivatizovaného glykozidu N-acetylglukozamínu, napríklad so vzorcom (XIII) alebo (XIV), ako akceptora, rozpusteného v zmesi tetrahydrofuránu a pufra na báze octanu sodného (pH 5,5,0,05M) v objemovom pomere 1:1, Galp-OPhNO₂-o ako donora a β-galaktozidázy ako katalyzátora.

Tieto zlúčeniny sa dajú priamo používať pri rôznych aplikáciách alebo môžu byť podrobené ďalšej chemickej alebo enzymatickej syntéze. Galaktozylový zvyšok sa dá napríklad modifikovať chemickými alebo enzymatickými metódami (použitím iipázy alebo galaktózaoxidázy, po ktorom nasleduje chemická modifikácia), pričom v glukózaminylovom zvyšku zostane len jedna voľná hydroxylová skupina, ktorá sa dá potom modifikovať napríklad fukozylskupinou.

Podobne sa môže použitím akceptora ďalej uvedeného všeobecného vzorca získať zodpovedajúci β-viazaný 3-0-chránený Gal-GlcNAc-derivát.

NHR,

Po chránení voľných hydroxylových skupín v produkte a deprotekcii 3-0-polohy sa napríklad môže zaviesť aviazaná L-fúkozylová skupina, pričom vzniká štruktúra typu Lewis-x, ktorá sa dá napríklad sialylovať, pričom vzniká napríklad NeuAca2-3Galpl-4(Fuccd-3)GlcNAc-R. Podobným spôsobom sa môžu vyrábať regioizoméry, ako Gaipi-3(Fucal-4)GlcNAc-R a analógy alebo deriváty látok Lewis-x, Lewis-a a sialylovaných Lewisových látok.

Keď sa použije glukal, ktorý je modifikovaný v polohe 6, ako akceptorová látka, β-galaktozidáza ako katalyzátor a Galp-OPhNO₂-o ako donor, získa sa β-viazaný galaktozyl(6-0-R)glukal.

Príklad 8

Syntéza 3-galaktozyl-l,2-anhydro-a-D-glukofuranozidu

1,2-Anhydro-a-D-glukofuranozid sa rozpustí v zmesi tetrahydrofuránu a pufru na báze octanu sodného (pH 5,0 0,05M) v objemovom pomere 1 : 1 a k vzniknutému roztoku sa pri teplote miestnosti po dávkach pridáva Gaip-OPhNO₂-o takou rýchlosťou, akou sa spotrebováva. Reakcia sa uskutočňuje použitím β-galaktozidázy ako katalyzátora a produkt sa izoluje stĺpcovou chromatografiou.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Spôsob syntézy di-, tri- alebo vyššieho oíigosacharidového produktu reakciou

a) glykozylový donor zahrnujúceho monosacharid, disacharid, oligosacharid alebo glykozid,

b) akceptora a

c) glykozidázy, pri ktorej glykozylový donor prenáša sacharidovú skupinu na akceptor za vzniku produktu, vyznačujúci sa t ý m , že sa ako akceptor použije niektorý akceptor podľa všeobecných vzorcov kde R] = R₂ = R₃ = R4 = Re = -OH, -F alebo anorganická alebo organická skupina definovaná ďalej, pričom aspoň jeden a najviac tri zo symbolov R₂, R₃, R₄ a Rs sú odlišné od hydroxyskupiny, a ak R_t predstavuje organickú alebo anorganickú skupinu, je táto organická alebo anorganická skupina zvolená zo súboru zahrnujúceho -OMe, -OA11, -OPh, -OCH₂Ph, -OEtBr, -OEtSiMe₃, -O(CH₂)₃CH=CH₂, -SMe, -SEt, -SPh, sacharidovú, lipidovú, aminokyselinovú a peptidovú skupinu, ak R₂, R₃, R, a/alebo Re predstavuje organickú alebo anorganickú skupinu, je táto organická alebo anorganická skupina zvolená zo súboru zahrnujúceho -OMe, -OA11, -OPh, -OCH₂Ph, -OEtBr, -OEtSiMe₃, -O(CH₂)₃CH=CH_2> -SMe, -SEt, -SPh, sacharidovú, lipidovú, aminokyselinovú a peptidovú skupinu, -NHAc, N-chlórmetoxyacetyl, N-fenoxyacetyl, -NHBOC, -NHOH, -N₃, p-metoxybenzyléterovú skupinu, trityl, trialkylsilyléterovú skupinu, pivaloyl, tetrahydropyranyl, (2-metoxyetoxy)metylizopropylidénketalovú skupinu, cyklohexylidénketalovú skupinu, benzylidénacetalovú skupinu, ortoesterovú skupinu, -ONO₃, tosylátovú, mesylátovú, sulfátovú, fosfátovú a karboxylátovú skupinu a že sa ako glykozidáza použije endo alebo exoglykozidáza zo skupiny E.C.3.2 a potom sa vzniknutý produkt prípadne izoluje.
2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že akceptorom je derivát glukofuranózy, prednostne 1,2-izopropylidén-a-D-glukofuranozid, najmä prednostne 3-derivát-l,2-O-izopropylidén-a-D-glukofuranózy a naj-výhodnejšie hydrochlorid l,2-O-izopropylidén-3-0-3'-(N',N’-dimetylamino-n-propyl)-D-glukofuranózy.
3. Spôsob podľa nároku 1, v y z n a č u j ú c i sa t ý m , že akceptorom je N-cetylglukozamín alebo N-acetylgalaktozamín, kde R₂ predstavuje -NHOH, -NHBOC, -N₃, -N-fenoxyacetyl alebo -N-chlórmetoxyacetyl.
4. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že organickou skupinou je acetyl, benzoyl, pivaloyl, alyl, benzyl, p-metoxybenzyl, p-izopropylidén alebo benzyl idén.
5. Spôsob podľa nároku 1, v y z n a č u j ú c i sa t ý m , že anorganickou skupinou je sulfátová, fosfátová skupina, -NHOH alebo -N₃.
6. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že akceptorom je galaktal, glukal alebo galaktal alebo glukal, kde jeden alebo viac symbolov R₃, Rq a R^ je odlišných od hydroxyskupiny.
7. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že glykozylový donor obsahuje jeden alebo viac monosacharidových zvyškov D-galaktózy, D-manózy, N-acetylneuramínovej kyseliny, N-acetyl-D-galaktozamínu, N-acetyl-D-glukozamínu alebo L-fukózy obsahujúcich glykozidicky viazanú organickú skupinu.
8. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa t ý m , že glykozidázou je D-galaktozidáza, L-fukozidáza,

SK 281488 Β6 hexozamidáza, N-acetylglukozaminidáza alebo N-acetyl-D-galaktozaminidáza.
9. Spôsob podľa nároku 1, v y z n a £ u j ú c i sa t ý m , že glykozidázou je in situ alebo izolovaná prírodná alebo rekombinantná glykozidáza.
10. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že glykozidáza je imobilizovaná pricipitáciou, adsorpciou, zapuzdrením, chelatáciou alebo kovalentnou väzbou k polymémej látke, ktorá je nerozpustná v protických alebo aprotických rozpúšťadlách.
11. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa t ý m , že polyméma látka je zvolená zo súboru zahrnujúceho polysacharid, plast, kopolymér, silikát a sklo.
12. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa t ý m , že ďalej zahrnuje chránenie hydroxyskupín v produkte a odstránenie chrániacich skupín z produktu, za vzniku jednej voľnej hydroxyskupiny a v jednej z polôh C-2, C-3, C-4, C-5 alebo C-6, počas chemickej syntézy na získanie disacharidového derivátu, trisacharidu alebo vyššieho oligosacharidu alebo jeho derivátu.
13. Spôsob podľa nároku la 12, vyznačujúci sa t ý m , že glykozidázou je a-N-acetylgalaktozaminidáza, glykozylovým donorom je N-acetylgalaktozamín alebo jeho glykozid a akceptorom je galaktóza alebo jej derivát alebo glykozid modifikovaný na hydroxyskupine v polohe C-2, alebo v polohe C-2 a jednej z polôh C-4 alebo C-6, pričom tento spôsob ďalej zahrnuje chránenie hydroxyskupín v produkte a potom odstránenie chrániacich skupín z produktu, za vzniku hydroxyskupiny v polohe C-2, počas chemickej syntézy determinantu A krvnej skupiny alebo jeho derivátu.
14. Spôsob podľa nároku la 12, vyznačujúci sa t ý m , že glykozidázou je α-galaktozidáza, glykozylovým donorom je galaktóza alebo jej glykozid a akceptorom je galaktóza alebo jej derivát alebo glykozid modifikovaný na hydroxyskupine v polohe C-2, alebo v polohe C-2 a jednej z polôh C-4 alebo C-6, pričom tento spôsob ďalej zahrnuje chránenie hydroxyskupín v produkte a potom odstránenie chrániacich skupín z produktu, za vzniku hydroxyskupiny v polohe C-2, počas chemickej syntézy determinantu B krvnej skupiny alebo jeho derivátu.
15. Spôsob podľa nároku la 12, vyznačujúci sa t ý m , že glykozidázou je β-galaktozidáza, glykozylovým donorom je galaktóza, laktóza alebo β-galaktozid a akceptorom 3-0-chránený N-acetylglukozamín alebo jeho 3-0-chránený derivát, pričom tento spôsob ďalej zahrnuje chránenie hydroxyskupín tohto 3-0-chráneného produktu a odstránenie chrániacich skupín z tohto produktu, za vzniku hydroxyskupiny v polohe C-3, počas chemickej syntézy Lewis-x alebo jeho derivátu.
16. Spôsob podľa nároku la 12, vyznačujúci sa t ý m , že glykozidázou je α-flukozidáza, glykozylovým donorom je α-fukozid a akceptorom 3-0-chránený N-acetylglukozamín alebo jeho 3-0-chránený derivát, pričom tento spôsob ďalej zahrnuje chránenie hydroxyskupín tohto 3-0-chráneného produktu a odstránenie chrániacich skupín z tohto produktu, za vzniku hydroxyskupiny v polohe C-3, počas chemickej syntézy Lewis-a alebo jeho derivátu.
17. Spôsob podľa nároku 1, v y z n a č u j ú c i sa t ý m , že glykozidázou je α-sialidáza, glykozylovým donorom je N-acetylneuramínová kyselina alebo je glykozid a akceptorom je galaktóza alebo jej derivát alebo glykozid modifikovaný v aspoň jednej a najviac v troch hydroxyskupinách v polohách C-2, C-4 alebo C-6 a produkt sa používa pri chemickej syntéze sialylovanej látky Lewis-a, sialylovanej látky Lewis-x alebo jeho derivátu alebo sialylo vaného di-, tri- alebo vyššieho oligosacharidu alebo jeho derivátu.
18. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa t ý m , že polysachridom je celulóza alebo agaróza a plastom je polyakrylamid, polyvinylalkohol alebo polysterén.
19. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa t ý m , že glykozylovým donorom je Gala-OPhNO₂-p, akceptorom je 2-O-alyl-Gala-OMe, glykozidázou je a-D-galaktozidáza a ako produkt sa získa Galal-3-(2-0alyl)Gala-OMe.
20. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa t ý m , že glykozylovým donorom je Gala-OPhNO₂-p, akceptorom je 2-O-benzyl-Gala-OMe, glyozidázou je a-D-galaktozidáza a ako produkt sa získa Gala 1-3-(2-0-benzyl)Gala-OMe.
21. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že glykozylovým donorom je Gala-OPhNO₂-p, akceptorom je 2-O-alyl-6-0-alyl-Gala-OMe, glykozidázou je α-D-galaktozidáza a ako produkt sa získa Galal-3-(2-0-alyl-6-0-alyl)Gala-OMe.
22. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa t ý m , že glykozylovým donorom je Galp-OPhNO₂-o, akceptorom je 2-0-benzyl-Galp-OBn, glykozidázou je β-galaktozidáza a ako produkt sa získa Gaipi-3-(2-0-benzyl)Ga^-OBn.
23. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa t ý m , že glykozylovým donorom je Neu5Aca-OPhNO₂-p, akceptorom je 2-0-alyl-6-0-alyl-Ga^-OMe, glykozidázou je α-sialidáza a ako produkt sa získa Neu5Aca2-3-(2-0-alyl-6-O-alyl)Ga^-OMe.
24. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci s a t ý m , že glykozylovým donorom je GlcNAc3-OPhNO₂-p, akceptorom je 2-0-alyl-6-0-alyl-Ga$-OMe, glykozidázou je β-D-N-acetylglukozaminidáza a ako produkt sa získa Glcl^l-3-(2-0-alyl-6-0-alyl)Ga^-OMe.
25. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa t ý m , že glykozylovým donorom je Gaip-OPhNO2-o, akceptorom je 1,2-anhydro-a-D-glukofuranozid, glykozidázou je β-gaiaktozidáza a ako produkt sa získa β-galaktozyl-1,2-anyhdro-a-D-glukofuranozid.
26. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa t ý m , že akceptorom je D-galaktal, D-glukal alebo D-galaktal alebo D-glukal, kde aspoň jeden zo symbolov R₃, R! a R₆ je odlišný od hydroxyskupiny.
27. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa t ý m , že akceptorom je D-galaktopyranóza alebo D-glukopyranóza, kde aspoň jeden zo symbolov R₂, R₃, R₄ a ÍL, je odlišný od hydroxyskupiny.
28. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa t ý m , že akceptorom je niektorá zo zlúčenín so vzorcom (1) až (XVII).