CZ283463B6

CZ283463B6 - Enzymatický způsob syntézy uhlohydrátů

Info

Publication number: CZ283463B6
Application number: CZ94238A
Authority: CZ
Inventors: Kurt Nilsson
Original assignee: Kurt Nilsson
Priority date: 1991-08-06
Filing date: 1992-08-06
Publication date: 1998-04-15
Also published as: WO1993003168A1; DE69228692T2; EP0598051A1; US5532147A; ATE177790T1; CZ23894A3; SK281488B6; SE9102292L; JPH07500494A; DE69228692D1; EP0598051B1; CA2115070A1; JP3375129B2; SK13294A3; SE9102292D0; CA2115070C

Abstract

Předmětem řešení je způsob syntézy, který zahrnuje alespoň jeden postup, při němž se používá endo- nebo exo- glykosidasy (EC 3.2) pro katalýzu syntézy produktu obecného vzorce DOA, kterým je di-, tri- nebo oligosacharid, modifikovaný v části A, z glykosylového donoru, kterým je monosacharid, disacharid, oligosacharid nebo glykosid obecného vzorce DOR, kde D představuje přenášenou uhlohydrátovou skupinu a z akceptorové látky obecného vzorce HOA, kterou je galaktosa, glukosa, N-acetylgalaktosamin, N-acetylglukosamin nebo jejich derivát nebo glykosid, přičemž tato látka je přinejmenším v jedné a maximálně ve třech skupinách v polohách C-2, C-3, C-4, C-5 nebo C-6 modifikována alespoň jednou organickou nebo anorganickou skupinou, načež se výsledného produktu použije pro další syntézu a/nebo se izoluje z produkční směsi.ŕ

Description

Způsob syntézy di-, tri- nebo vyššího oligosacharidového produktu

Oblast techniky

Vynález se týká enzymatického způsobu syntézy di-, tri- nebo vyššího oligosacharidového produktu, který se hodí pro další syntézu, například biologických receptorových struktur, jako jsou determinanty krevní skupiny nebo jiné deriváty, kterých lze přímo používat v lékařských nebo diagnostických aplikacích.

Dosavadní stav techniky

Sacharidy mají ústřední funkci v živých organismech při metabolismu, jako zdroj energie, při ochraně proti vlivu prostředí, jako biologické markéry, jako receptorové látky a jako antigenní determinanty. Oligosacharidová část glykoproteinů a glykolipidů je důležitá in vivo (Biology of Carbohydrates, sv. 2, Ginsburg a další, Wiley, New York, 1984; The Glycoconjugates, sv. I - V, Academie Press, New York; S. Hakomori, Ann, Rev. Biochem., sv. 50, str. 733 až 764; Feizi, Nátuře str. 314, 1985; S. Hakomori, Chemistry and Physics of Lipids, sv. 42, str. 209 až 233). Mimo jiné bylo zjištěno, že

- sacharidové struktury jsou důležité pro stabilitu, aktivitu, lokalizaci, imunogenicitu a degradaci glykoproteinů;

- sacharidy jsou antigenními determinanty (například antigeny krevní skupiny);

- pokud jsou navázány na povrch buňky, fungují sacharidy jako receptory pro patogeny, proteiny, hormony, toxiny a také při vzájemných interakcích mezi buňkami;

- sacharidy jsou důležité pro onkogenesi, poněvadž bylo zjištěno, že specifické oligosacharidy jsou antigenními determinanty, které vykazují spojení s rakovinou;

- pro dosažení úplné biologické aktivity (například receptorové aktivity je často nutná přítomnost pouze malé sekvence (di- nebo tri- sacharidu) sacharidové části glykokonjugátu.

Oligosacharidové deriváty obsahující jednu nebo více modifikovaných nebo derivatizovaných monosacharidových jednotek, které například obsahují deoxy-, fosfo-, sulfato-, derivatizované amino nebo thioskupiny mají velký význam při farmaceutických nebo diagnostických aplikacích sacharidů, při nichž dochází k modifikaci metabolismu určité látky a/nebo ke zvýšení biologického účinku přírodní látky.

Derivátů sacharidů se také obecně používá jako syntetických meziproduktů při selektivní organické chemické syntéze sacharidů (viz například Binkley: Modem Carbohydrate Chemistry. Marcel Dekker. New York, 1988 a citace v této publikaci uvedené). Selektivní chemická syntéza sacharidů vyžaduje v rozsáhlé míře používání chránících skupin a zahrnuje velký počet syntetických stupňů, mj. z toho důvodu, že syntéza selektivně modifikovaných sacharidových meziproduktů bývá komplikovaná. Je proto žádoucí vyvinout účinné způsoby přípravy takových sacharidových meziproduktů.

V EP-A-O 226 563 (SE-B-451849) (Svenska Sockerfabriks AB) je popsán způsob regulace regioselektivity glykosidických vazeb.

V WO 91/02806 (Procur AB) je popsán způsob výroby oligosacharidové sloučeniny za použití glykosidas z měkkýšů.

Úkolem EP-A-0 226 563 a WO 91/02806 je ovlivnit regioselektivitu reakcí katalyzovaných glykosidasou použitím vhodných akceptomích glykosidů. Jedna nebo více hydroxyskupin akceptomího glykosidů může být modifikována vodíkem nebo organickou skupinou. Jako

- 1 CZ 283463 B6 příklady jsou zde uvedeny l-nitrofenyl-2-deoxygalaktopyranosid a nahrazení kruhového kyslíku atomem síry nebo atomem dusíku. Takových akceptorů lze údajně použít pro získání oligosacharidových analogů, které jsou užitečné jako inhibitory. Všechny další příklady a příklady s praktickými podrobnostmi popsané v těchto publikacích se týkají použití akceptomích glykosidů modifikovaných výlučně v poloze C-l akceptorů.

V citovaných publikacích není popsán princip tohoto vynálezu spočívající v použití glukózových/galaktosových akceptorů modifikovaných ve specifické poloze nebo polohách C-2, C-3, C-4, C-5 a/nebo C-6 pomocí chránící skupiny nebo skupin, které lze odstranit před reakcí katalyzovanou glykosidasou, za vzniku produktů, které se výborně hodí pro další manipulace uvedené v popisu tohoto vynálezu. Není zde uvedeno ani příklady doloženo použití glykosídas pro výrobu sacharidů specificky modifikovaných v polohách C-2, C-3, C-4, C-5 a/nebo C-6 takovými odštěpitelnými skupinami.

V Tibtech 6, 1988, 256 až 264 je popsána enzymatická syntéza oligosacharidů. Zejména je zde popsána chemická metoda přípravy dimannosidů s obsahem 2,3-isopropyliden-a-mannopyranosidu. Tento vynález se naproti tomu týká způsobu výroby sacharidů, které jsou za použití glykosidas specificky modifikovány ve zbytku galaktosy, galaktosaminu, glukózy nebo glukosaminu.

V Carbohydrate Research 167, 1987 str. 95 až 103 je popsána změna regioselektivity glykosidasou katalyzované tvorby disacharidů obsahujících substituent v poloze 1. Tato publikace se od tohoto vynálezu odlišuje stejným způsobem jako EP-A-0 226 563 a WO 91/02806, charakterizované výše.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je způsob syntézy di-, tri- nebo vyššího oiigosacharidového produktu reakcí

a) glykosylového donoru zahrnujícího monosacharid, disacharid, oligosacharid nebo glykosid,

b) akceptorů a

c) glykosidasy, při níž glykosylový donor přenáší sacharidovou skupinu na akceptor za vzniku produktu, jehož podstata spočívá v tom, že se jako akceptorů použije akceptorů některého z obecných vzorců

-2 CZ 283463 B6

kde R[ = R₂ = R₂ = R4 = Ró = -OH, -F nebo anorganická nebo organická skupina definovaná dále, přičemž alespoň jeden a nejvýše tři ze symbolů R₂, R₃, R4 a Ré jsou odlišné od hydroxyskupiny a představuje-li R! organickou nebo anorganickou skupinu, je tato organická nebo anorganická skupina zvolena ze souboru zahrnujícího -OMe, -OA11, -OPh, -OCH₂Ph, -OEtBr, -OEtSiMe₃, -O(CH₂)₃CH=CH₂, -SMe, -SEt, -SPh, sacharidovou, lipidovou, aminokyselinovou a peptidovou skupinu, představuje-li R₂, R₃, R4 a/nebo Rý organickou nebo anorganickou skupinu, je tato organická nebo anorganická skupina zvolena ze souboru zahrnujícího -OMe, -OA11, -OPh, -OCH₂Ph, -OEtBr, -OEtSiMe₃, -O(CH₂)₃CH=CH₂, -SMe, -SEt, -SPh, sacharidovou, lipidovou, aminokyselinovou, peptidovou skupinu, -NHAc, N-chlormethoxyacetyl, N-fenoxyacetyl, -NHBOC, -NHOH, -N₃, p-methoxybenzyletherovou skupinu, trityl, trialkylsilyletherovou skupinu, pivaloyl, tetrahydropyranyl, (2-methoxyethoxy)methylisopropylidenketalovou skupinu, cyklohexylidenketalovou skupinu, benzylidenacetalovou skupinu, orthoesterovou skupinu, -ONO₃, tosylátovou, mesylátovou, sulfátovou, fosfátovou a karboxylátovou skupinu a že se jako glykosidasy použije endo nebo exoglykosidasy ze skupiny E.C.3.2, načež se vzniklý produkt popřípadě izoluje.

Tento způsob umožňuje drasticky zjednodušit syntézu derivatizovaných nebo modifikovaných di- nebo trisacharidů a vyšších oligosacharidů. Sacharidové deriváty, které bylo nutno až dosud známými metodami syntetizovat v několika reakčních stupních, je možno způsobem podle tohoto vynálezu nyní získat pouze v jednom reakčním stupni as absolutní stereospecifičností, což také představuje rozdíl ve srovnání s chemickými metodami, při nichž bylo používáno více nebo méně jedovaných reakčních činidel, například triflátu stříbra nebo kyanidu rtuti a při nichž byl požadovaný a- nebo β- isomer získáván spolu s nežádoucím stereoisomerem.

Syntetická metoda podle tohoto vynálezu zahrnuje alespoň jeden postup, který se vyznačuje tím, že se používá glykosidasy (EC 3.2) pro katalýzu rovnovážné nebo transglykosylační reakce mezi akceptomí látkou, kterou je buď derivát galaktosy, nebo derivát glukózy a glykosylovým donorem, kterým je monosacharid, oligosacharid nebo glykosid, přičemž produktu se používá pro další syntézu a/nebo se izoluje ze směsi produktů.

Vynález tedy umožňuje provádět stereospecifickou syntézu derivátů di-, trisacharidů nebo vyšší oligosacharidů, kterých je možno používat přímo nebo po další syntéze při četných různých aplikacích, například při farmaceutických, lékařských nebo diagnostických studiích, při léčbě nebo diagnostice, jako přísad do kosmetických výrobků nebo potravin, pro modifikaci separačních látek, v afmitní chromatografii, při modifikaci aminokyselin, peptidů, proteinů, mastných kyselin, lipidů, enzymů a rekombinantních proteinů.

Při syntéze podle tohoto vynálezu lze schopnost glykosidas tvořit stereospecifické glykosidické vazby mezi glykosylovým donorem (v následující reakční rovnici je glykosylový donor znázorněn zkratkou DOR, kde D představuje přenesenou uhlohydrátovou část) a glykosylovým akceptorem (HOA) znázornit následující rovnicí:

DOR + HOA DO A + HOR (1)

Reakce podle tohoto vynálezu se může provádět podle dvou principů, buď jako syntéza, která je řízena rovnováhou (R = H), nebo jako transglykosylační reakce (R = F nebo organický zbytek); tedy kineticky řízená reakce. Tento typ reakcí je odborníkům dobře znám a konkrétní způsob jejich provádění, ani výběr glykosylových donorů a glykosidas nepředstavují pro rozsah tohoto vynálezu žádné omezení.

Jako příklady akceptomích látek, kteiých lze použít při způsobu podle tohoto vynálezu, je možno uvést D-galaktal, D-glukal a D-galaktal nebo D-glukal, které byly modifikovány jednou nebo více organickými nebo anorganickými skupinami v jedné nebo více polohách C-3, C-4, C-5 nebo C-6 a D-galaktopyranosu nebo D-glukopyranosu, které byly modifikovány jednou nebo více organickými nebo anorganickými skupinami v jedné nebo více polohách C-2, C-3, C-4 nebo C-6 nebo glykosidy takových derivátů. Při způsobu podle vynálezu je také možno použít podobných derivátů N-acetylglukopyranosy a N-acetylgalaktopyranosy.

Příklady struktur, kterých lze použít jako akceptomích látek (HOA v rovnici 1) pro tvorbu oligosacharidových derivátů podle tohoto vynálezu jsou uvedeny dále. Tyto struktury symbolizují derivatizovanou nebo modifikovanou D-galaktopyranosu a D-glukopyranosu (vDgalaktopyranose a D-glukopyranose platí, že Ri = R₂ = R₃ = R4 = R$ = OH; v N-acetylglukosaminu a N-acetyl-galaktosaminu R₂ = NHAc; přičemž Ac znamená acetylskupinu, Ph znamená fenylskupinu, Bz znamená benzoylskupinu a All znamená allylskupinu).

-4CZ 283463 B6

Deriváty glukózy

kde

Ri (i = 1 až 6) představuje hydroxyskupinu (-OH), fluoridovou skupinu nebo anorganickou nebo organickou skupinu a alespoň jeden a nejvýše 3 ze symbolů

R₂, R₃, R4 nebo Ré nepředstavuje hydroxyskupinu.

Symbol Ri může například znamenat některý ze zbytků, který je zvolen ze souboru zahrnujícího -OH, -F, -OMe, -OA11, -OPh, -OCH₂Ph, -OEtBr, -OEtSiMe₃, -O(CH₂)₃CH=CH₂, -SMe, -SEt, -EPh, uhlohydrátové zbytky, zbytky derivátů lipidů, aminokyselin nebo peptidů nebo jinou skupinu vázanou k anomemímu uhlíku.

Kterýkoliv ze zbytků R₂, R₃, R, a/nebo Rý může například představovat některou zvýše uvedených skupin nebo některou skupinu zvolenou ze souboru zahrnujícího například následující skupiny -NHAc, NHC(O)CH₂C1 (N-chlormethoxyacetyl), NHC(O)CH₂OPh (N-fenoxyacetyl), -NHBOC, -NHOH, -N₃, p-methoxybenzyletherový zbytek (-OCH₂Ph-Ome-p), tritylskupinu (-OC(Ph)₃), trialkylsilyletherovou skupinu, pivaloylskupinu, tetrahydropyranylskupinu, (2methoxyethoxy)methylisopropylidenketalovou skupinu, cyklohexylidenketalovou skupinu, benzylidenacetalovou skupinu, orthoesterovou skupinu, -ONO₃, tosylátovou, mesylátovou, sulfátovou, fosfátovou nebo karboxylátovou skupinu, derivát sulfátové, fosfátové nebo karboxylátové skupiny, esterovou skupinu, tj. skupinu typu -OC(O)R, jako je acetylová, butanoylová, oktanoylová, benzoylová a pivaloylová skupina, atd.

-5 CZ 283463 B6

Struktur, které jsou uvedeny dále a které jsou modifikovány podobným způsobem, jaký je uvedený výše, je také možno používat jako akceptomích látek při způsobu podle tohoto vynálezu.

Volba typu modifikace akceptoru se provádí podle toho, jaké jsou požadavky v určité konkrétní situaci a literatura je bohatá na informace, které se týkají používání ochraných skupin nebo modifikace uhlohydrátů a syntézy uhlohydrátů obecně (viz například Modem Carbohydrate Chemistry, Binkley, Marcel Dekker, 1988 a citace v této publikaci uvedené a dále též Paulsen. Chem. Soc. Rev. 13, str. 15 až 45). Dále je uvedeno několik příkladů kategorií akceptomích ío látek, kterých je možno používat při způsobu podle vynálezu. Na rozsah těchto látek se však vynález neomezuje. Struktury I až XI představují galaktosové deriváty a struktury XII až XVII jsou deriváty N-acetylglukosaminu. Podle vynálezu je také možno používat anhydrocukrů, které jsou představovány strukturami VII a VIII.

HO

OC(O)R

-6CZ 283463 B6

Ve strukturách I až XI, uvedených výše, představuje R₃ například alkylovou, benzylovou, 10 chlorbenzylovou nebo benzoylovou skupinu nebo chránící skupinu jiného typu, která se hodí pro tuto specifickou syntézu. Symbol R^ může představovat aromatickou skupinu, jako například skupinu Ph nebo alkylskupinu (například propylskupinu) nebo skupinu (CH₃)₃. Když například R₂ znamená atom vodíku, představuje R_t jednu ze skupin, které byly zmíněny výše, a naopak když Ri znamená atom vodíku, představuje R₂ některou z výše uvedených skupin.

Jako příklad ilustrující tento vynález, který však v žádném směru neomezuje rozsah tohoto vynálezu, je možno uvést, že když se například použije jako enzymu α-galaktosidasy, jako akceptomí látky se použije α-D-galaktopyranosy, která je chráněna v poloze C-2, například látky vzorce 1, uvedeného výše, kde R₂ například představuje skupinu vzorce HO-, MeO-, PhCHO- nebo CH₂=CH-CH₂O- a jako glykosylového donoru (při transglykosylační reakci) se použije například rafinosy, methyl-a-D-galaktopyranosidu nebo p-nitrofenyl-a-D-galaktopyranosidu, získá se a-glykosidicky vázaný digalaktosylový derivát vzorce

tj. 2-O-derivát Galal-3-Gala-R.

Jako jiný příklad, když se sloučeniny vzorce I použije jako akceptoru a a-galaktosaminidasy, například z Chamelea gallina a například GalNAca-OPh nebo GalNAca-OPhNO^p se použije jako glykosylového donoru, získá se 2-O-derivát GalNAcal-3-Gala-R.

Získaných produktů se může používat při další syntéze, například při chemické syntéze vyšších oligosacharidů. Literatura obsahuje řadu informací o tom, jak používat částečně chráněných uhlohydrátů (viz odkazy uvedené v prácích Binkleye a Paulsena), které jsou citovány výše. Jako příklad je možno uvést, že skupinu -OCH₂Ph je možno odštěpit po chránění hydroxylových skupin a vyměnit například za α-vázanou L-fukopyranosylskupinu. Tímto způsobem se syntetizuje z 2-O-chráněného derivátu GalNAcal-3Gal-R a Galal-3Gal-R determinant A a B krevní skupiny.

Když se použije β-galaktosidasy místo α-galaktosidasy, když se jako glykosylového donoru použije laktosy nebo například p-nitrofenyl-|3-D-galaktopyranosidu a když se jako akceptoru použije N-acetylglukosaminového derivátu (viz například vzorce XII až XVII, uvedené výše), získají se β-vázané deriváty Gal-GlcNac-R. Jako příklady takových zčásti chráněných derivátů Gal-GlcNAc, kterých lze například používat při chemické syntéze Lewisových-x nebo Lewisových-a trisacharidových struktur (nebo kterých lze používat při chemické syntéze disacharidových derivátů těchto látek) je možno uvést tyto struktury.

-8CZ 283463 B6

Kromě toho, jestliže se místo toho použije α-fukosidasy, například s nitrofenyl-a-L-fiikopyranosidem, jako glykosylovým donorem, mohou se způsobem podle vynálezu, syntetizovat odpovídající deriváty α-vázaného Fuc-Gal-R aa-vázaného Fuc-GlcNAc-R. Za použití Nacetyl-p-glukosaminidasy nebo N-acetyl-fJ-galaktosaminidasy se mohou připravovat deriváty β-vázaného GlcNAc-Gal a GlcNAc-GlcNAc-R nebo GalNAc-Gal-R a GalNAc-GlcNAc, za použití β-glykosidů GlcNAc nebo GalNAc, jako glykosylových donorů. Podobně se může použít α-sialidasy pro katalýzu syntézy sialylovaných derivátů galaktosy (derivátů Neu5Aca-Gal) nebo derivátů galaktosaminu (derivátů Neu5Aca-GalNAc) za použití například nitrofenylglykosidu N-acetylneuraminové kyseliny a částečně chráněného derivátu galaktosy nebo derivátu galaktosaminu, jako akceptoru.

Za použití endoglykosidasy se mohou připravovat způsobem podle tohoto vynálezu delší oligosacharidové deriváty.

Reakce uvedené výše je také možno provádět jako rovnovážné reakce, při nichž se jako glykosylových donorů používá monosacharidů.

Při způsobu podle vynálezu se také může použít různých derivátů glukofuranosy, jako 1,2isopropyliden-a-D-glukofuranosidu (struktura XVIII, uvedená dále), jako akceptoru.

Tyto oligosacharidové deriváty 1,2-isopropyliden-a-D-glukofuranosidu, například 3-deriváty 1,2-O-isopropyliden-a-D-glukofuranosy, jako hydrochloridu l,2-O-isopropyliden-3-O-3'(N',N'-dimethylamino-n-propyl)-D-glukofuranosy (dále označovaného názvem therafektin, což je látka, která je účinná při reumathoidní arthritis, psoriasis, některých typech rakoviny a asthmatu [Gordon P., Chemical Abstracts, sv. 95, abstrakt č. 54887 a Inflammation: 4. Mech. Treat. Proč. Int. Meet. (1980) , 169 až 180, University Park Press, Baltimore, USA] je tedy možno syntetizovat způsobem podle tohoto vynálezu buď tak, že se jako akceptoru použije

-9CZ 283463 B6 sloučeniny vzorce XVIII (disacharidový produkt je modifikován po enzymatické reakci v poloze

3), nebo 3-modifikovaného derivátu sloučeniny vzorce XVIII.

Neomezující příklady jak toho lze dosáhnout způsobem podle vynálezu jsou uvedeny dále:

- Therafektin nebo jeho analogy se nechají reagovat s například laktosou nebo nitrofenyl-βgalaktosidem ve vhodném rozpouštědle za použití β-galaktosidasy (například zE.coli nebo Aspergillus niger) jako katalyzátoru. Tímto způsobem se získá therafektin, modifikovaný βglykosidicky vázanou galaktopyranosylskupinou. Této látky se potom může použít při farmaceutických nebo kosmetických aplikacích nebo pro další chemickou nebo enzymatickou syntézu. Tak například se mohou do produktu, který se získá při první reakci, zavést další sacharidové skupiny opakovanou syntézou, katalyzovanou glykosidasou, za použití stejné nebo jiné glykosidasy, nebo se může použít například sialyltransferasy a CMP-Neu5Ac pro syntézu Neu5Aca2-3Ga^l-O-therafektinu nebo jeho odpovídajícího 2,6-derivátu. Galaktosylový derivát se popřípadě může před těmito posledními reakcemi chemicky modifikovat.

- Podobným způsobem se může therafektin nebo jeho analog nechat reagovat např. s GlcNAcfTOR, GalNAcp-OR, Mana-OR, Gala-OR, Glc[3-OR (R=F, H, alkyl, aryl nebo uhlohydrátový zbytek) za použití glukosaminidasy, galaktosaminidasy, mannosidasy, galaktosidasy nebo glukosidasy, jako katalyzátoru.

- Podobným způsobem se může použít endoglykosidasy jako katalyzátoru a oligosacharidu nebo jeho derivátu, jako glykosylového donoru a therafektinu nebo jeho analogu, jako akceptoru.

Výše uvedené reakce je také možno provádět jako rovnovážné reakce s jednoduchým monosacharidem, jako glykosylovým donorem.

Benzylovou nebo allylovou skupinu (nebo jiné skupiny, které byly zmíněny v souvislosti s výše uvedenými vzorci) ve výše uvedených produktech je možno snadno chemicky převést na celou řadu jiných skupin než je zbytek L-fukosy a tímto způsobem je možno způsobem podle vynálezu selektivně syntetizovat několik různých disacharidových derivátů (například O-fosfát, O-sulfát, atd.) nebo vyšších oligosacharidů.

Kromě toho je možno získaných produktů používat pro další enzymatickou syntézu za použití galaktosidas nebo glykosyltransferas. Tak například α-sialyltransferasy se může použít pro katalýzu tvorby sialylovaných Gal-GlcNAc-derivátů a β-galaktosyltransferasy se může použít pro tvorbu oligosacharidových derivátů typu Gal-GcNAc-Gal-R, které lze nakonec sialylovat a/nebo kterých lze použít pro další chemickou syntézu atd.

Když se jako akceptoru použije modifikovaného galaktosidu nebo glukosidu, volí se aglykon s ohledem na aplikaci produktu. Z aglykonů je speciální zájem zaměřen na aminokyseliny (serin, threonin, hydroxyprolin, hydroxylysin, asparagin, atd.), peptidy, lipidy a deriváty nebo analogy látek z těchto tří skupin. Aminokyselinové nebo peptidové glykosidy mohou být chráněny na svých aminových a/nebo karboxylových funkčních skupinách obvyklými skupinami, kterých se používá při syntéze peptidů (FMOC, CBZ, BOC, atd.).

Produktů, které se získají za použití modifikovaných alkylglykosidů (například modifikovaného methyl-, oktyl- a dodecylglykosidu), jako akceptorových látek, se může používat jako inhibitorů v afinitní chromatografii nebo při aglutinačních testech, inhibiční terapii nebo pro zacílení léčiv a dále též jako strukturních jednotek pro další enzymatickou syntézu. Nitrofenylglykosidy je možno redukovat na aminofenylglykosidy. Může se též použít glykosidů s polymerovatelným aglykonem, jako například 2-hydroxyethylmethakrylátem. Jako příklad N-glykosidicky vázaného aglykonů je možno uvést skupinu -NHCO(CH₂)₅NH₂. Jinými použitelnými typy

- 10CZ 283463 B6 aglykonů jsou aglykony, kterých se například používá při syntéze glykolipidů nebo jejich analogů pro konverzi na ceramidy nebo jejich analogy. Příklady aglykonů tohoto typu jsou popsány v práci Magnusson a další. J. Org. Chem., (1990). Thioglykosidů (například -SEt nebo -SPh) je možno používat způsobem podle vynálezu pro výrobu produktů, které se hodí pro další chemickou syntézu. Volby chránící skupiny nebo derivátu, aglykonů a polohy derivatizovaných hydroxylových skupin se při způsobu podle vynálezu může použít k ovlivnění výtěžku a regioselektivity reakcí. Tak například použití hydrofobnějších aglykonů (například p-methoxybenzyl a benzylskupiny, ve srovnání s například allylskupinou) může vést k vyššímu výtěžku při stejné koncentraci akceptoru.

Jako donomích substrátů se může používat při způsobu podle vynálezu stejných látek, jakých se používalo dříve spolu s glykosidasami při syntéze, prováděné rovnovážnými nebo transglykosylačními reakcemi.

Jako příklady donomích látek, kterých lze používat při způsobu podle vynálezu, je možno uvést monosacharidy, monosacharidové glykosidy a di- nebo oligosacharidy (nebo jejich glykosidy), v nichž sacharidová část obsahuje jeden nebo více monosacharidů, zvolených ze souboru zahrnujícího D-galaktosu, D-mannosu, N-acetylneuraminovou kyselinu, N-acetyl-D-galaktosamin, N-acetyl-D-glukosamin a L-fukosu. Jako příklady vhodných glykosylových donorů je možno uvést nitrofenyl-α- nebo β-glykosidy výše uvedených monosacharidů, laktosy, dimannosy a rafinosy. Vhodnými donomími látkami pro endoglykosidasy jsou například nitrofenylglykosidy bilogicky účinných sacharidových sekvencí (například Galpl-3-GlcNAc|3-OPhN02-p), biologicky aktivní oligosacharidy nebo struktury typu Glc(pl-3Glc)_npl-3Glc (n > 1).

Koncentrace glykosylového donoru v reakční směsi se volí s ohledem na syntetizovaný oligosacharid a také na vlastnosti enzymu. Z toho důvodu nepředstavuje koncentrace omezující faktor pro tento vynález. Obecně může být výhodné přidávat donor po malých dávkách do transglykosylační reakční směsi, aby se minimalizovalo riziko, že bude donor působit také jako akceptor. Při rovnovážných reakcích se často dává přednost tomu, aby byla počáteční koncentrace donoru vysoká.

Enzym se volí především s ohledem na oligosacharidový derivát, který má být syntetizován. Enzymu se může používat in šitu nebo po částečné nebo úplné purifikaci z jeho přírodního prostředí. Enzymu se může používat v rozpustné formě nebo imobilizované formě na pevném nosiči, na němž je enzym zakotven adsorpcí, zapouzdřením, chelatací, vysrážením nebo kovalentní vazbou.

Jako příklady a- a β-glykosidas, kterých je možno používat při způsobu podle vynálezu, je možno uvést D-mannosidasy, D-galaktosisasy, L-fukosidasy, N-acetyl-D-galaktosaminidasy, hexosaminidasy a jiné glykosidasy zEC skupiny 3.2 [Enzyme Nomenclature (nomenklatura enzymů), Academie Press, 1984]. Při způsobu podle vynálezu se může používat jak endotak exoglykosidas.

Stupeň čistoty použitého enzymu není kritický. Enzymu se může používat in sítu nebo po úplné nebo částečné izolaci z jeho přírodního biologického prostředí. Také se může používat surového extraktu organismu nebo jeho tkáně. Použitý enzym lze také předem vysrážet, například síranem amonným. Enzym může být přítomen v krystalické formě nebo může být obklopen micellami. Biochemická literatura je bohatá na podrobné informace, které se vztahují k purifikaci a izolaci glykosidas. Enzym může být produkován rekombinantními technikami. Potom se popřípadě může jedna nebo více aminokyselin v aminokyselinové sekvenci enzymu vyměnit, za účelem optimalizace vlastností enzymu, například jeho tepelné stálosti, katalytické účinnosti a/nebo regioselektivity.

- 11 CZ 283463 B6

Enzymu se může používat v rozpustné formě nebo může být imobilizován, například adsorpcí, zapouzdřením, chelatací, vysrážením nebo kovalentní vazbou, k pevnému nosiči, jako například polymemí látce nebo jejímu derivátu, které jsou nerozpustné v protických nebo aprotických rozpouštědlech (Methods in Enzymology, sv. 44, Academie Press, 1976). Zvolená forma není pro vynález kritická. Pokud se enzymu používá v rozpustné formě, může se předem vhodným způsobem chemicky modifikovat, aby se například zvýšila jeho tepelná stálost nebo stabilita v organických ko-rozpouštědlech. Enzym, který je imobilizován na nerozpustném polymeru, například agarose, celulóze, hydroxyethylakrylátu, skle, oxidu křemičitém, polyakrylamidu, plastech typu polyakrylátů, atd., se snadno oddělí z produkční směsi a může se ho znovu použít. Přídavnou výhodou je, že se v mnoha případech imobilizací dosáhne určité stabilizace proti zvýšeným teplotám a organickým ko-rozpouštědlům.

Syntetický postup podle tohoto vynálezu se může provádět za velmi rozmanitých podmínek, pokud se například týče pH, typu pufru, teploty a koncentrace reakčních složek. Spolu s vodou se může používat různých ko-rozpouštědel (jako například Ν,Ν-dimethylformamidu, acetonitrilu, dimethylsulfoxidu, dioxanu, pyridinu, methanolu, ethanolu, ethylenglykolu, atd.), jejichž koncentrace se také může měnit. Kromě toho, reakce je také možno provádět ve dvoufázovém systému, zahrnujícím vodu a organické rozpouštědlo.

Reakční podmínky nejsou kritické, ale volí se především podle vlastností reakčních složek, kterých se používá při konkrétní syntéze a také se uplatňuje hledisko praktičnosti. Tak například je obvykle účelné pracovat s enzymy při teplotě místnosti a v případě, že se používá média bohatého na vodu, bývá obvykle pH v rozmezí od 4 do 11.

Organických ko-rozpouštědel se může používat za účelem minimalizace hydrolytické vedlejší reakce. Ze stejného důvodu se může používat dvoufázových systémů. Jako příklady ko-rozpouštědel je možno uvést tetrahydrofuran, acetonitril a dimethylformamid. Volba rozpouštědla a jeho koncentrace neomezuje rozsah tohoto vynálezu a odborník v tomto oboru ji může snadno provést. Používání vysokých koncentrací organických rozpouštědel (přibližně 50 % a až téměř 100 %, vztaženo na celkový objem rozpouštědla) může být zvláště výhodné v tom případě, že se používá hydrofobních akceptorových derivátů, které vykazují dobrou rozpustnost v organických rozpouštědlech, například akceptorů modifikovaných esterovými skupinami (například acetyl-, benzoyl-, butanoyl-, pivaloyl-, oktanoylskupinou, atd.) a/nebo například allylovými, benzylovými, tritylovými nebo jinými skupinami. Tímto způsobem je možno v organických rozpouštědlech dosáhnout poměrně vysoké koncentrace akceptorů a rozsah hydrolytické vedlejší reakce se může díky nízkému obsahu vody snížit. Tento způsob podle vynálezu umožňuje syntetizovat v organickém rozpouštědle například trisacharidové deriváty a vyšší oligosacharidové deriváty pomocí exoglykosidas za použití hydrofobně chráněných derivátů dinebo oligosacharidů, které obsahují pouze jednu nebo několik málo volných hydroxylových skupin, jako akceptorů.

Pro zvýšení rozpustnosti nebo dostupnosti a pro usnadnění reakce s donomí látkou se například může používat fenylboronátu, který vytváří komplex se sacharidy s vicinálními dioly, přičemž výsledný donor-boronátový komplex má díky přítomnosti fenylskupiny vyšší rozpustnost v organických rozpouštědlech.

Také reakční teplotu je možno měnit za účelem ovlivnění výtěžku produktu a stability enzymu, aniž by to představovalo pro rozsah vynálezu nějaké omezení. Nejčastěji používaná teplota leží v rozmezí od 4 do 55 °C, ale může se používat i nižších teplot. Teplot pod 0 °C se může používat, pokud jsou přítomna organická ko-rozpouštědla. S tepelně stálými glykosidasami a substráty je možno používat vyšších teplot, což také platí o enzymech, které jsou stabilizovány proti tepelné denaturaci například tím, že se používá vysokých koncentrací substrátu (Johansson a další. Biotechnol. Lett. , 8 (1986, 421 až 424)). Výhodou použití vysokých teplot například je,

- 12CZ 283463 B6 že se může používat substrátu ve vysoké koncentraci, což má za následek snížení aktivity vody a tedy i zvýšení výtěžku produktu. Další výhodou je, že se zvyšuje aktivita enzymu, což se projeví zkrácením reakční doby při zvýšených teplotách. Jednou přídavnou výhodou je, že se jako vhodných glykosylových donorů může při zvýšených teplotách (50 až 60 °C) používat glykosidů, například methyl, nebo ethylglykosidu, které se pomalu hydrolyzují při teplotě místnosti. Horní hranice teploty je dána tepelnou stálostí enzymu v reakčním prostředí. Při některých transglykosylacích se zjistilo, že práce při nízké teplotě vede k vyššímu výtěžku glykosidového produktu.

Koncentrace akceptoru představuje parametr, kterého je možno používat pro ovlivnění výtěžku reakcí podle tohoto vynálezu. Vysokým koncentracím akceptoru se dává přednost jak při rovnovážných, tak při transglykosylačních reakcích, za účelem minimalizace hydrolytických vedlejších reakcí. To obvykle znamená, že v závislosti na rozpustnosti se akceptoru používá přibližně v 0,2 až 7M koncentraci. Při rovnovážných reakcích se často používá vysoké koncentrace donoru. Obvykle se vysokých koncentrací substrátů dosahuje několikaminutovým zahříváním reakční směsi na teplotu blízkou teplotě varu, po němž se nechá roztok zchladnout na 37 až 75 °C (v závislosti na tepelné stálosti enzymu a substrátu) a potom se přidá enzym. Pro zvýšení rozpustnosti substrátů s hydrofobními skupinami se používá ko-rozpouštědel.

Reakci je možno monitorovat pomocí TLC (chromatografie na tenké vrstvě), HPLC (vysoce účinná kapalinová chromatografie) nebo spektrofotometrickým stanovením uvolněného aglykonu (například p-nitrofenolu při 400 nm). Při dosažení maximálního výtěžku glykosidového produktu se reakce ukončí denaturací enzymu změnou hodnoty pH, zvýšením teploty a/nebo přídavkem organického ko-rozpouštědla (například ethanolu). Tří až pětiminutové zahřívání na 80 až 85 °C, po němž se přidá ethanol až do přibližně 80 % koncentrace, je obvykle postačující.

Pro izolaci produktu se může používat různých technologií. Užitečné je srážení, například organickým rozpouštědlem, jako je ethanol, zejména v tom případě, když se používá jedné zreakčních složek v nadbytku nebo když mají donor, akceptor nebo produkty různou rozpustnost. Po provedení syntézy rovnovážnou nebo transglykosylační reakcí a po například tepelném zpracování, popsaném výše a zředění reakční směsi, může být užitečné přidat druhou glykosidasu, která má odlišnou regioselektivitu než glykosidasa použitá při syntéze. Tímto způsobem je možno nežádoucí regioisomery (například s 1-6-vazbami) více nebo méně selektivně hydrolyzovat, což usnadňuje izolaci požadovaného produktu. Srážení a hydrolýza vedlejších produktů představují doplňkové metody k chromatografii (adsorpční chromatografii; gelové filtraci, například za použití sloupce Sephadex G10-G25; HPLC, například za použití aminomodifikovaného oxidu křemičitého, oxidu křemičitého s reversní fází nebo novější náplně Dionex).

Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu, pro který jsou určující pouze připojené nároky, v žádném ohledu neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Syntéza peracetylovaného Galal-3(2-O-allyl)Gala-OMe; methyl(2-O-allyl-3-O-a-Dgalaktopyranosyl)-a-D-galaktopyranosidu

2-O-allyl-Gala-OMe (methyl-2-O-allyl-a-D-galaktopyranosid; 0,4 g) se rozpustí v pufru na bázi fosforečnanu sodného (pH 6,5, 18 ml, 0,05M) a přidá se p-nitrofenyl-a-D-galakto

- 13 CZ 283463 B6 pyranosid (Gala-OPhNOr-p; 50 mg), spolu se 400 μΐ a-D-galaktosidasy (Sigma; 20 U) při teplotě místnosti. Další donor (Gala-OPhNOr-p) se přidává po dávkách (50 mg; 10 dávek) v průběhu reakce, podle toho, jak se donor spotřebovává. Po asi 20 hodinách reakce se roztok přibližně 5 minut zahřívá, za účelem inaktivace enzymu a produkt se přečistí sloupcovou chromatografií (nejprve na sloupci Sephadex G10, potom na sloupci silikagelu a po acetylaci znovu na silikagelu, jakožto pevné fázi). Pro potvrzení struktuiy se použije NMR acetylovaného produktu.

Příklad 2

Syntéza peracetylovaného Galal-3(2-O-benzyl)Gala-0Me; methyl(2-O-benzyl-3-0-a-Dgalaktopyranosyl)-a-D-galaktopyranosidu

2-O-benzyl-Gala-OMe (methyl)-2-0-benzyl-a-D-galaktopyranosid; 0,4 g) se rozpustí v pufru na bázi fosforečnanu sodného (pH 6,5, 18 ml, 0,05M) a přidá se p-nitrofenyl-a-Dgalaktopyranosid (Gala-OPhNOr-p; 50 mg), spolu se 400 μΐ a-D-galaktosidasy (Sigma; 20 U) při teplotě místnosti. Další donor (Gala-OPhNOr-p) se přidává po dávkách (50 mg; 10 dávek) v průběhu reakce, podle toho, jak se donor spotřebovává. Po asi 20 hodinách reakce se roztok přibližně 5 minut zahřívá, za účelem inaktivace enzymu a produkt se přečistí sloupcovou chromatografií za použití stejných technik, jaké byly popsány v příkladu 1. Pro potvrzení struktury se použije NMR acetylovaného produktu.

Příklad 3

Syntéza peracetylovaného Galal-3(2-O-allyl-6-O-allyl)Gala-OMe; methyl(2-O-allyl-6-Oallyl-3-0-a-D-galaktopyranosyl)-a-D-galaktopyranosidu

2-O-allyl-6-O-allyl-Gala-OMe (methyl-2-0-allyl-6-0-allyl-a-D-galaktopyranosid; 0,4 g) se rozpustí v pufru na bázi fosforečnanu sodného (pH 6,5, 18 ml, 0,05M) a přidá se pnitrofenyl-a-D-galaktopyranosid (Gala-OPhNO₂-p; 50 mg), spolu se 400 μΐ a-Dgalaktosidasy (Sigma; 20 U) při teplotě místnosti. Další donor (Gala-OPhNO₂-p) se přidává po dávkách (50 mg; 10 dávek) v průběhu reakce, podle toho, jak se donor spotřebovává. Po asi 20 hodinách reakce se roztok přibližně 5 minut zahřívá, za účelem inaktivace enzymu a produkt se přečistí sloupcovou chromatografií za použití stejných technik, jaké byly popsány v příkladu 1. Pro potvrzení struktury se použije NMR acetylovaného produktu.

Příklad 4

Syntéza peracetylovaného Gaip~3(2-O-benzyl)Gal[3-OBn; benzyl(2-O-benzyl-3-0-[3-Dgalaktopyranosyl)-[3-D-galaktopyranosidu

2-O-benzyl-Gal(3-OBn (methyl-2-0-benzyl-P~D-galaktopyranosid; 0,4 g) se rozpustí v pufru na bázi fosforečnanu sodného (pH 5,5, 18 ml, 0,05M) a přidává se při teplotě místnosti onitrofenyl-[3-D-galaktopyranosid (Galp-OPhNO₂-o) po dávkách (50 mg; 10 dávek) v průběhu reakce, podle toho, jak se donor spotřebovává. Reakce a purifikace se provádí v podstatě stejným způsobem, jak je to popsáno v příkladech uvedených výše, pouze s tím rozdílem, že se používá β-galaktosidasy (z Aspergillus niger; Sigma; St. Louis; USA), jako katalyzátoru. Pro potvrzení struktury se použije NMR acetylovaného produktu.

- 14 CZ 283463 B6

Příklad 5

Syntéza Neu5 Aca2-3 (2-O-ally 1-6-O-ally l)Gal β-OMe

2-O-allyl-6-O-allyl-Gal[3-OMe (methyl-2-0-allyl-6-0-allyl-[3-D-galaktopyranosid; 0,4 g) se rozpustí v pufru na bázi octanu sodného (pH 5, 0,18 ml, 0,05M) a ke vzniklému roztoku se při teplotě místnosti po dávkách přidává (každá dávka 50 mg, celkem 10 dávek) p-nitrofenyl—5acetamido-3,5-dideoxy-a-D-glycero-D-galakto-2-nonulopyranosylonové kyseliny (Neu5Aca -OPhNOr-p) takovou rychlostí, jakou se spotřebovává. Reakce a izolace produktu se provádějí způsobem popsaným výše, pouze s tím rozdílem, že se jako katalyzátoru použije a-sialidasy (Vibrio cholerae; Sigma) a produkt se purifikuje sloupcovou chromatografíí bez předchozí acetylace.

Příklad 6

Syntéza peracetylovaného GlcNAcpi-3(2-O-allyl-6-O-allyl)-Gaip-OMe

2-O-allyl-6-O-allyl-Gaip-OMe (methyl-2-0-allyl6-0-allyl-(3-D-galaktopyranosid; 0,4 g) se rozpustí v pufru na bázi octanu sodného (pH 6,5, 18 ml, 0,05M) a při teplotě místnosti se přidává GlcNAc[3-OPhNO₂-p (50 mg) takovou rychlostí, jakou se spotřebovává. Reakce a purifikace produktu se v podstatě provádějí způsoby popsanými v předcházejících příkladech, pouze stím rozdílem, že se jako katalyzátoru použije β-D-N-acetylglukosaminidasy. Struktura produktu se potvrdí NMR.

Příklad 7

Syntéza derivátů Gaipi-3GlcNAc a Gaipi—4GlcNAc (složky látek Lewisovy krevní skupiny, jako jsou Lewis-a, Lewis-x a sialylované struktury)

Produkty, jejichž struktura odpovídá dále uvedeným obecným vzorcům, se získají za použití například derivatizovaného glykosidu N-acetylglukosaminu, například vzorce XIII nebo XIV, jako akceptoru, rozpuštěného například ve směsi tetrahydrofuranu a pufru na bázi octanu sodného (pH 5,5, 0,05M) v objemovém poměru 1:1, Gaip-OPhNOr-o, jako donoru a βgalaktosidasy, jako katalyzátoru.

- 15 CZ 283463 B6

Těchto sloučenin je možno přímo používat při různých aplikacích nebo je lze podrobit další chemické nebo enzymatické syntéze. Galaktosylový zbytek je například možno modifikovat chemickými nebo enzymatickými metodami (za použití lipasy nebo galaktosaoxidasy, po němž následuje chemická modifikace), přičemž v glukosaminylovém zbytku zůstane pouze jedna volná hydroxylová skupina, kterou lze potom modifikovat například fukosylskupinou.

Podobně se může za použití akceptorů dále uvedeného obecného vzorce získat odpovídající βvázaný 3-O-chráněný Gal-GlcNAc-derivát.

OH

Po chránění volných hydroxylových skupin v produktu a deprotekci 3-O-polohy se například může zavést α-vázaná L-fukosylová skupina, za vzniku struktury typu Lewis-x, kterou lze například sialylovat, za vzniku například NeuAca2-3Gaipi-4(Fucal-3)GlcNAc-R. Podobným způsobem se mohou vyrábět regioisomery, jako Gaipi-3(Fucal—4)GlcNAc-R a analogy nebo deriváty látek Lewis-x. Lewis-a a sialylovaných Lewisových látek.

Když se použije glukalu, který je modifikován v poloze 6, jako akceptorové látky, β-galaktosidasy, jako katalyzátoru a Galp-OPhNO₂-o, jako donoru, získá se β-vázaný galaktosyl-(6-OR)glukal.

Příklad 8

Syntéza β-galaktosyl-l ,2-anhydro-a-D-glukofuranosidu

1,2-anhydro-a-D-glukofuranosid se rozpustí ve směsi tetrahydrofuranu a pufru na bázi octanu sodného (pH 5,0, 0,05M) v objemovém poměru 1:1 a ke vzniklému roztoku se při teplotě místnosti po dávkách přidává Gal[3-OPhNO₂~o takovou rychlostí, jakou se spotřebovává. Reakce se provádí za použití β-galaktosidasy, jako katalyzátoru a produkt se izoluje sloupcovou chromatografii.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob syntézy di-, tri- nebo vyššího oligosacharidového produktu reakcí

a) glykosylového donoru zahrnujícího monosacharid, disacharid, oiigosacharid nebo glykosid,

b) akceptoru a

c) glykosidasy, při níž glykosylový donor přenáší sacharidovou skupinu na akceptor za vzniku produktu, vyznačující se tím, že se jako akceptoru použije akceptoru některého z obecných vzorců kde Ri = R₂ = R3 = R4 = R$ = -OH, -F nebo anorganická nebo organická skupina definovaná dále, přičemž alespoň jeden a nejvýše tři ze symbolů R₂, R₃, R4 a R$ jsou odlišné od hydroxyskupiny a představuje-li Ri organickou nebo anorganickou skupinu, je tato organická nebo anorganická skupina zvolena ze souboru zahrnujícího -OMe, -OA11, -OPh, -OCH₂Ph, -OEtBr, -OEtSiMe₃, -O(CH₂)₃CH=CH₂, -SMe, -SEt, -SPh, sacharidovou, lipidovou, aminokyselinovou a peptidovou skupinu, představuje-li R₂, R₃, R4 a/nebo organickou nebo anorganickou skupinu, je tato organická nebo anorganická skupina zvolena ze souboru zahrnujícího -OMe, -OA11, -OPh, -OCH₂Ph, -OEtBr, -OEtSiMe₃, -O(CH₂)₃CH=CH₂, -SMe, -SEt, -SPh, sacharidovou, lipidovou, aminokyselinovou, peptidovou skupinu, -NHAc, N-chlormethoxyacetyl, N-fenoxyacetyl,

- 17CZ 283463 B6

-NHBOC, -NHOH, -N3, p-methoxybenzyletherovou skupinu, trityl, trialkylsilyletherovou skupinu, pivaloyl, tetrahydropyranyl, (2-methoxyethoxy)methylisopropylidenketalovou skupinu, cyklohexylidenketalovou skupinu, benzylidenacetalovou skupinu, orthoesterovou skupinu, -ONO3, tosylátovou, mesylátovou, sulfátovou, fosfátovou a karboxylátovou skupinu, a že se jako glykosidasy použije endo- nebo exoglykosidasy ze skupiny E.C.3.2, načež se vzniklý produkt popřípadě izoluje.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že akceptorem je derivát glukofuranosy, přednostně I,2-isopropyliden-a-D-glukofuranosid, zvláště přednostně 3-derivát 1,2-O-isopropyliden-a-D-glukofuranosy a nej výhodněji hydrochlorid 1,2-0-isopropyliden-3O-3'-(N',N'-dimethylamino-n-propyl)-D-glukofuranosy.
3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že akceptorem je Nacetylglukosamin nebo N-acetylgalaktosamin, kde R₂ představuje -NHOH, -NHBOC, -N3, -Nfenoxyacetyl nebo -N-chlormethoxyacetyl.
4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že organickou skupinou je acetyl, benzoyl, pivaloyl, allyl, benzyl, p-methoxybenzyl, p-isopropyliden nebo benzyliden.
5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že anorganickou skupinou je sulfátová, fosfátová skupina, -NHOH nebo -N3.
6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že akceptorem je galaktal, glukal nebo galaktal nebo glukal, kde jeden nebo více symbolů R3, R» a R5 je odlišných od hydroxyskupiny.
7. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že glykosylový donor obsahuje jeden nebo více monosacharidových zbytků D-galaktosy, D-mannosy, N-acetylneuraminové kyseliny, N-acetyl-D-galaktosaminu, N-acetyl-D-glukosaminu nebo L-fukosy obsahujících glykosidicky vázanou organickou skupinu.
8. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že glykosidasou je D-galaktosidasa, L-fukosidasa, hexosaminidasa, N-acetylglukosaminidasa nebo N-acetyl-D-galaktosaminidasa.
9. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že glykosidasou je in šitu nebo izolovaná přírodní nebo rekombinantní glykosidasa.
10. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že glykosidasa je imobilizována precipitací, adsorpcí, zapouzdřením, chelatací nebo kovalentní vazbou k polymemí látce, která je nerozpustná v protických nebo aprotických rozpouštědlech.
11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se t í m , že polymemí látka je zvolena ze souboru zahrnujícího polysacharid, plast, kopolymer, silikát a sklo.
12. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že dále zahrnuje chránění hydroxyskupin v produktu a odstranění chránících skupin z produktu, za vzniku jedné volné hydroxyskupiny v jedné z poloh C-2, C-3, C-4, C-5 nebo C-6, v průběhu chemické syntézy pro získání disacharidového derivátu, trisacharidu nebo vyššího oligosacharidu nebo jeho derivátu.
13. Způsob podle nároků 1 a 12, vyznačující se tím, že glykosidasou je a-Nacetylgalaktosaminidasa, glykosylovým donorem je N-acetylgalaktosamin nebo jeho glykosid

- 18CZ 283463 B6 aakceptorem je galaktosa nebo její derivát nebo glykosid modifikovaný na hydroxyskupině v poloze C-2, nebo v poloze C-2 a jedné z poloh C-4 nebo C-6, přičemž tento způsob dále zahrnuje chránění hydroxyskupin v produktu a potom odstranění chránících skupin z produktu, za vzniku hydroxyskupiny v poloze C-2, v průběhu chemické syntézy determinantu A krevní skupiny nebo jeho derivátu.
14. Způsob podle nároků 1 a 12, vyznačující se tím, že glykosidasou je α-galaktosidasa, glykosylovým donorem je galaktosa nebo její glykosid aakceptorem je galaktosa nebo její derivát nebo glykosid modifikovaný na hydroxyskupině v poloze C-2, nebo v poloze C-2 a jedné z poloh C-4 nebo C-6, přičemž tento způsob dále zahrnuje chránění hydroxyskupin v produktu a potom odstranění chránících skupin z produktu, za vzniku hydroxyskupiny v poloze C-2, v průběhu chemické syntézy determinantu B krevní skupiny nebo jeho derivátu.
15. Způsob podle nároků 1 a 12, vyznačující se tím, že glykosidasou je βgalaktosidasa, glykosylovým donorem je galaktosa, laktosa nebo β-galaktosid a akceptorem je 3— O-chráněný N-acetylglukosamin nebo jeho 3-O-chráněný derivát, přičemž tento způsob dále zahrnuje chránění hydroxyskupin tohoto 3-O-chráněného produktu a odstranění chránících skupin z tohoto produktu, za vzniku hydroxyskupiny v poloze C-3, v průběhu chemické syntézy Lewis-x nebo jeho derivátu.
16. Způsob podle nároku lal2, vyznačující se tím, že glykosidasou je a-fiikosidasa, glykosylovým donorem je α-fukosid a akceptorem je 3-O-chráněný N-acetylglukosamin nebo jeho 3-O-chráněný derivát, přičemž tento způsob dále zahrnuje chránění hydroxyskupin tohoto 3-O-chráněného produktu a odstranění chránících skupin z tohoto produktu, za vzniku hydroxyskupiny v poloze C-3, v průběhu chemické syntézy Lewis-a nebo jeho derivátu.
17. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že glykosidasou je a-sialidasa, glykosylovým donorem je N-acetylneuraminová kyselina nebo její glykosid aakceptorem je galaktosa nebo její derivát nebo glykosid modifikovaný v alespoň jedné a nejvýše ve třech hydroxyskupinách v polohách C-2, C-4 nebo C-6 a produktu se používá při chemické syntéze sialylované látky Lewis-a, sialylované látky Lewis-x nebo jejího derivátu nebo sialylovaného di-, tri- nebo vyššího oligosacharidu nebo jeho derivátu.
18. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že polysacharidem je celulosa nebo agarosa a plastem je polyakrylamid, polyvinylalkohol nebo polystyren.
19. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že glykosylovým donorem je Gala-OPhNO₂-p, akceptorem je 2-O-allyl-Gala-OMe, glykosidasou je a-D-galaktosidasa a jako produkt se získá Galal-3(2-O-allyl)Gala- OMe.
20. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že glykosylovým donorem je Gala-OPhNO₂-p, akceptorem je 2-O-benzyl-Gala-OMe, glykosidasou je a-D-galaktosidasa a jako produkt se získá Galal-3(2-O-benzyl)Gala- OMe.
21. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že glykosylovým donorem je Gala-OPhNO₂-p, akceptorem je 2-0-allyl-6-0-allyl-Gala-OMe, glykosidasou je a-D-galaktosidasa a jako produkt se získá Galal-3(2-O-allyl-6-O-allyl)Gala-OMe.
22. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že glykosylovým donorem je Gal[3-OPhNO₂-o, akceptorem je 2-O-benzyl-Galp-OBn, glykosidasou je β-galaktosidasa a jako produkt se získá Gaipi-3(2-O-benzyl)Galp-OBn.

- 19CZ 283463 B6
23. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že glykosylovým donorem je Neu5Aca-OPhN0₂-p, akceptorem je 2-0-allyl-6-0-allyl-Gaip-OMe, glykosidasou je α-sialidasa a jako produkt se získá Neu5Aca2-3(2-O-allyl-6-O-allyl)Gal|3-OMe.
24. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že glykosylovým donorem je GlcNAcp-OPhNOr-p, akceptorem je 2-O-allyl-6-O-allyl-Gal[3-OMe, glykosidasou je β-DN-acetylglukosaminidasa a jako produkt se získá GlcNAcpl-3(2-O-allyl-6-O-allyl)GaipOMe.
25. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že glykosylovým donorem je Galp-OPhNCL-o, akceptorem je 1,2-anhydro-a-D-glukofuranosid, glykosidasou je β-galaktosidasa a jako produkt se získá β-galaktosyl- 1,2-anhydro-a-D-glukofuranosid.
26. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že akceptorem je D-galaktal, Dglukal nebo D-galaktal nebo D-glukal, kde alespoň jeden ze symbolů R₃, Ri a R$ je odlišný od hydroxyskupiny.
27. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že akceptorem je Dgalaktopyranosa nebo D-glukopyranosa, kde alespoň jeden ze symbolů R₂, R₃, R4 a R$ je odlišný od hydroxyskupiny.
28. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že akceptorem je některá ze sloučenin vzorce I až XVII