JPS62240695A - グリコシド結合のレジオセレクテイビテイの制御方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、複合糖質の糖部分からなるオリゴ糖化合物、
または、その糖部分の断片であるオリゴ糖化合物、また
は、その糖部分の類似体であるオリゴ糖化合物のいずれ
かを、逆加水分解または糖転移によって酵素的に生産す
るにあたり、グリコシル供与体とグリコシル受容体との
間に形成されるグリコシド結合のレジオセレクティビテ
ィ（ｒｃｇｉｏｓｃｌａｃｔｉｖｉｔｙ）を制御する方
法に関する。

更に、本発明はこの方法によって生産された生成物の使
用に関する。

近年、種々の複合糖質（特に、糖たんぱく質および糖脂
質）のオリゴ糖部分が、体中で多くの重要な機能を果た
すことが見出されている（　Ｂ　ｉｏｌｏｇｙ　　ｏｆ
’　　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ、　Ｖ　ｏｆ、　　
２　。

Ｇｉｎｓｂｕｒｇ　　ｅｔ　　ａｔ、　　Ｗｌｌｅｙ、
　　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ（１９８４）　　；　Ｓ、　Ｈ
ａｋｏｍｏｒｉ、　　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ。

Ｂｌｏｃｈｏｍ、、Ｖｏｌ、　、５０．　ｐｐ、　　７
３３−８４）　ｏ中でも、次のような知見が得られてい
る。

・糖たんぱく質の安定性、活性、局在化（１ｏｃａｌｌ
ｓａｔ１ｏｎ）および分解に対して、糖構造が重要であ
る。

・一定のオリゴ糖構造は植物の抗菌物質の分泌を活性化
する。

・罠合糖質はしばしば種々の細胞の表面に見出され、特
に周囲との細胞相互作用に対して重要である。というの
は、 ・複合糖質は、例えば、ペプチド、ホルモン、トキシン
、ウィルスおよび細菌などが細胞表面に結合するとき、
また、細胞−細胞相互作用の間、レセプターまたはレギ
ュレーターとして機能するからであり、かつ、 ・複合糖質が抗原決定基（例えば、血液型抗原）である
からであり、かつ、 ・複合糖質が、正常な組織発達の間、細胞分化抗原とし
て機能するからであり、かつ、 ・特定のオリゴ糖ががんに関連した抗原決定基であるこ
とが見出されているので、複合糖質が発がんに対して重
要であるからであり、かつ、・複合糖質が、精子−卵相
互作用および受精に対して重要であるからである。

今日、種々の複合糖質に包含される非常に多数のオリゴ
糖構造が確認されており、また、既知、のオリゴ糖の生
物活性に必須の最小単位（しばしば２糖または３糖であ
る）も多くの場合に決定されている。その結果、現在大
学および企業において、生物学的に活性なオリゴ糖を次
のような多数の異なる分野に応用する研究が行われてい
る。

・新規な診断法および血液型試薬の開発・アフィニティ
クロマトグラフィーのための高度に特異的な物質の合成 ・単一クローン性抗体の開発 ・細胞特異性凝集反応試薬の生産 ・薬物を内包し、その表面に特定のオリゴ糖を担う微小
球（ｔａｌｃｒｏｓｐｈｅｒｅ　）　　（１ｐ　ｍ未満
）を使用するいわゆる薬物標的（ｄｒｕｇ　　ｔａｒｇ
ｅｔｉｎｇ　）による新規な治療法の開発 ・細菌およびウィルスの細胞表面への付着を特定のオリ
ゴ糖によって阻害する、抗生物質に代わる新規な型の治
療法の開発 ・植物の成長促進および病原体に対する保護上記の分野
以外にも、生物学的に活性な糖質に基づくファインケミ
カルズに対して、将来の広範な市場が想定される。

複合糖質の糖部分にはわずかに１０種はどの単糖が含ま
れる。これらは、すなわち、Ｄ−グルコース（ＧＩＣ）
、Ｄ−ガラクトース（Ｇａｌ）、Ｄ−マンノース（Ｍａ
ｎ）　、Ｌ−フコース（Ｆｕｃ）、Ｎ−アセチル−Ｄ−
ガラクトースアミン（Ｇａ　ＩＮＡｃ）　、Ｎ−アセチ
ル−Ｄ−グルコース　アミン（Ｇ　１　ｃＮＡｃ）　、
Ｎ−アセチル−Ｄ−ノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）　、Ｄ
−アラビノース（Ａｒａ）およびＤ−キシロース（Ｘｙ
ｌ）である（かっこ中の略称は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの
単糖に対する略語に従った。

Ｊ、　　Ｂｌｏｌ、　　Ｃｈｅｗ、、　Ｖｏｌ、、　　
２５７．　ｐｐ、　３３４７−３３５４　（１９８２）
　）。しかし、アノマー配置（ｈまたはＨ）とＯ−グリ
コシド結合の位置の両方を変化させることができるので
、可能な組合せの数はほとんど無限に大きい。その結果
、通常の有機化学合成によるオリゴ糖合成には多くの困
難がある。

これらの化合物に対して用いる有機化学技術は、合成の
多くの段階において広範な保護基化学を必要とし、従っ
て、しばしば全収率が低下する。そのために、このよう
な技術を使用する工業生産は通常不利である。

酵素は、高いレジオセレクティビティおよびステレオセ
レクティビティ、並びに緩和な条件下での高い触媒効率
などの多くの優れた特性を有する天然の触媒である。そ
のために、今日、有機化学法より少ない合成段階で、従
って、より高い全収率でオリゴ糖を選択的に大量合成す
るための酵素利用に大きな期待が寄せられている。

酵素触媒によるオリゴ糖合成が多数の文献に開示されて
いる（、に、　ＮｉＮ１５ｉｚａ　　ａｔ　　ａｔ、　
　ｉｎ’　Ｔ　ｈａ　　Ｃａｒｂｏｌｌｙｄｒａｔｏｓ
、　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　ａｎｄＢｉｏｃｂｃａｌｓ
Ｌｒｙ、　　２ｎｄ　　Ｅｄ、、　Ｖｏｌ、　　ＩＩＡ
、　ｐｐ。

２４２−２９０．　　Ａ　ｃａｄａｍｉｃ　　Ｐ　ｒｅ
ｓｓ、　Ｎ　ｃｖ　　Ｙ　ｏｒｋ（１９７０）　）。加
水分解酵素（グリコシダーゼ、ＥＣＮ１３．２）と転移
酵素（ＥＣＮ１２．４）の両方が使用され、中でも特に
加水分解酵素がオリゴ糖合成に使用されてきた。この型
の酵素を用いてグリコシド合成を行うために、次の二つ
の方法が利用された。つまり、逆加水分解（縮合または
平衡技術）および糖転移（速度論的技術）である。

逆ＩＫＩ水分解： １ｌ ＤＯＨ＋　　ＨＯＡ　　ｈ　　ＤＯＡ　　＋　　Ｈ２Ｏ
（１）糖転移： ＲＯ）Ｉ ＋　　　Ｉ（ＯＡ ＤＯＲ＋　　Ｅｌｆ　　　＋　　Ｅ″Ｄ　　−ｎ　　Ｄ
ＯＡ　十　Ｅｌｌ　　　（２１ＤＯＨ＋　Ｅｆｔ （式中、ＤＯＨは供与体糖、ＤＯＲはα−よｌζはβ−
グリコシド結合アグリコン（＝Ｒ）をイｉす゛る（ハ与
体糖、）−１０Ａｔ；Ｌ受容体糖、Ｆ　１１４；Ｌ（’
ｌ’ｒ；Ｋ”ｉ’ａ＞ル）生成物が不溶性である場合、
または、水濃度を低めるために反応を有機溶媒を用いて
行うことができる場合には、逆加水分解は高収率を与え
る。

糖転移に関しては、フェニルグリコシドまたはニトロフ
ェニルグリコシド（式（２）においてＲ−フェニル、ニ
トロフェニル）などの供与体物質に対する高い酵素活性
が、高い生成物収率を得るために利用されてきた。

たとえこれらの技術が多くの場合に完全に有効であるこ
とが証明されるとしても、供与体物質が受容体物質の望
ましい位置に０−グリコシド結合するように、反応を制
御することは依然として困難である。通常、１−６結合
（つまり、受容体糖の第１の水酸基に対する結合）が形
成されてきたが、複合糖質に最もしばしば見られる１−
２，１−３および１−４結合は形成されないか、または
、わずかな程度しか形成されなかった。更に、従来技術
では、還元末端（ｒｃｄｕｃｌｎｇ　　ｅｎｄ　）がグ
リコシド化されず、生成物溶液中でα−アノマーおよび
β−アノマーの両者として存在するために、容易に精製
できない異性体生成物の混合物がしばしば形成される。

また、従来技術は、生成物をたんぱく質や脂質などに結
合させる前に、更に化学修飾する必要があった。

本発明の目的の一つは、従来の酵素技術の不利な点を取
除くまたは減少させることである。特に、供与体と受容
体との間の望ましい結合が、制御のない場合よりも高い
程度で形成されるように、糖質の酵素合成におけるレジ
オセレクティビティを制御するための手段を提供するこ
とを目的としている。本発明の他の特定の目的は、生成
物の精製を容易にし、かつオリゴ糖の興味ある配糖体の
直接合成を容易にすることである。

従って、本発明は、複合糖質の糖部分からなるオリゴ糖
化合物、または、その糖部分の断片であるオリゴ糖化合
物、または、その糖部分の類似体であるオリゴ糖化合物
のいずれかを、逆加水分解または糖転移によって酵素的
に生産するにあたり、グリコシル供与体とグリコシル受
容体との間に形成されるグリコシド結合のレジオセレク
ティビティを制御する方法に関する。この方法は、単糖
またはオリゴ糖、または単糖かオリゴ糖の配糖体である
供与体物質を、単糖またはオリゴ糖または糖類似体と、
１位で０−１Ｎ−１Ｃ−またはＳ−グリコシド結合した
少なくとも一つのアグリコンとからなる０−１Ｎ−１Ｃ
−またはＳ−配糖体である受容体物質と、グリコシダー
ゼの存在下で反応させ、かつ、ここで、受容体物質中の
グリコシル基とアグリコンとの間のグリコシド結合に関
してα−またはβ−配置が選択されることと、このオリ
ゴ糖化合物が反応混合物から分離されることとを特徴と
する。

本発明の方法に用いられる受容体物質は、式ＨＯＡＲ２
（式中、Ｒ２はグリコシド結合した無機物質または有機
物質である、つまり、Ｒ２はアグリコン（糖でない）で
ある）を有する単糖またはオリゴ糖の配糖体またはその
類似体である。本発明の方法による生成物はＤＯＡＲ２
と表される。

これは、Ｄ（Ｃ１−Ｘ）Ａ　（α）Ｒ２、Ｄ（Ｃ１−Ｘ
）Ａ　（β）Ｒ２、 Ｄ（β１−Ｘ）Ａ（α）Ｒ２および Ｄ（β１−Ｘ）Ａ（β）Ｒ２の型の化合物を表わす（式
中、Ｄは単糖またはオリゴ糖、Ａは単糖またはオリゴ糖
またはその類似体、Ｘは２．３．４または６であり、α
およびβは、それぞれ、ＤとＡの間のＯ−グリコシド結
合の立体配置およびＡとＲ２の間の０−１Ｎ−１Ｓ−ま
たはＣ−グリコシド結合の立体配置である）。この型の
物質には、例えば、Ｇａ　１　（（！１−３）　Ｇａ　
ｌ　（（Ｚ）　−ＯＭｅ％Ｇａ　ｌ　（αｌ−３）Ｇａ
　ｌ　　（β）−ＯＭｅ、ＧｌｃＮＡｃ　（β１−６１
−６）　（ａ）−ＯＭｅおよびＭａｎ　（αｌ−２１−
２）　（α）−ＯＭｅなどがある（略称は、Ｉ　ＵＰＡ
Ｃ−ＩＵＢが勧める単糖に対する略語に従った。

Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、　　ＣＣ１１ｏ、、　Ｖｏｌ、　　
２５７．　ｐｐ、　３３４７−３３５４　（１９８２）
　）。

本発明の方法では逆加水分解および糖転移のそれぞれの
反応式は次のように表される。

逆１１１１水分解： ＥＨ Ｄｏｌ！　＋　１１０ΔＲ２Ｆ＝士ＤＯＡＲ２＋　Ｈ２
Ｏ（３）糖転移： ｏｌｌ 従来の反応と本発明による反応との相違は、反応（１）
および（２）で使用される受容体物質がＨＯＡ型の物質
、つまり１位が誘導化されていない物質であるのに対し
、本発明では、１位が誘導化されている受容体物質、つ
まりＨＯＡ　Ｒｚ型の受容体物質を使用することである
。従って、従来の生成物がＤＯＡ型であったのに対し、
本発明の方法による生成物はＤＯＡＲ２型である。

一方、供与体物質は、合成されるオリゴ糖と、合成が逆
加水分解により行われるかまたは糖転移により行われる
かとに関して選択される。従って、供与体は、還元末端
がグリコシド結合有機物質を用いて誘導化されているか
または誘導化されていない単糖またはオリゴ糖であって
よい。有機物質は、脂肪族、芳香族、ペテロ環などでよ
く、かつα−またはβ−配置でＤ　（ＤＯＲ，式（２）
を参照）の１位にグリコシド結合していてよい。本発明
で使用できる誘導化された供与体物質は、例えば、メチ
ル、ＣＨ２（ＣＨ２）ｎ　　（ｎ　＞Ｏ）　、フェニル
、ｐ−ニトロフェニル、Ｏ−ニトロフェニル、４−メチ
ルウンベリフェリル（ｕａｂｃｌｌｉｒｃｒｙｌ）グリ
コシドなどである。この型の供与体物質の多くは市販さ
れている。市販されていない場合にも、有機合成または
酵素合成によって容易に合成できるので、本発明の利用
を制限することはない。有用なオリゴ糖は、例えば、ラ
クトース、ラフィノース（ｒａｆ’ｆ’１ｎｏｓｏ　）
　、チトビオース（ｃｈＩｔｏｂｉｏｓｏ）およびジマ
ンノシドなどである。種々の型のアルキル配糖体または
アリール配糖体に対して活性な種々のグリコシダーゼは
文献に完全に記述されているので、当業者はそれぞれの
場合の要求を満たす適切な官能基Ｒを困難なく選択する
ことができる。

酵素は、それぞれの特定の場合の要求に従って、主にど
のオリゴ糖を合成するかに関して選択される。例えば、
α−グリコシド結合の合成にはα−グリコシダーゼが必
要であり、β−グリコシド結合の合成にはβ−グリコシ
ダーゼが必要である。

好ましい酵素は、ＥＣ３，２群のエンドグリコシダーゼ
およびエキソグリコシダーゼである。本発明で使用でき
る酵素は、例えば次のα−およびβ−グリコシダーゼで
ある。つまり、Ｄ−マンノシダーゼ、Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ、Ｌ−フコシダーゼ、ノイラミニダーゼ、Ｎ−アセ
チル−Ｄ−グルコサミニダーゼ、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガ
ラクトサミニダーゼ、キシロシダーゼ、ヘキソサミニダ
ーゼおよびＥＣ３，２群の他のグリコシダーゼである（
　Ｅ　ｎｚｙｍｏ　　Ｎ　ｏ＋ｅａｎｃｌａｔｕｒｅ　
、　Ａ　ｃａｄａｍｌｅＰｒｅｓｓ、　ｐｐ、　　１−
６０６．　　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　（１９７９）　　
；Ｅｎｚｙｍｏ、　　３ｒｄ　　Ｅｄ、、　Ｄｉｘｏｎ
　　ａｔ　　ａｌ。

Ｌ　ｏｎｇｍａｎ　（１９７９）　）。

使用する酵素の精製の程度は重要ではない。酵素は、そ
のままでまたはその天然の生物学的環境から完全にまた
は部分的に単離した後に使用できる。完全な（ｉｎｔａ
ｃｔ）　ｔＡｎ胞または凍結乾燥した細胞並びに多少精
製した酵素を使用できる。酵素は、結晶形で存在しても
よく、またはミセル中に内包されていてもよい。種々の
型の細胞に由来する非常に多くのグリコシダーゼが市販
されている。その上に、興味あるグリコシダーゼの精製
と単離に関しては、生化学文献に詳細な情報が非常に豊
富に記載されている。

酵素は可溶な形で使用でき、あるいは、沈澱、吸着、内
包、キレート化またはポリマー物質またはプロトン性溶
媒や非プロトン性溶媒に不溶なその誘導体などの固相へ
の共存結合によって、固定化することもできる（　Ｍ　
ｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎＥ　ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　　Ｖ
　ｏｆ、　４４．　Ａ　ｃａｄｅｍｉｃ　　Ｐ　ｒｅｓ
ｓ。

（１９７［ｉ）　）。選択された形は本発明にとっては
重要ではない。酵素を可溶な形で使用する場合は、例え
ば上昇温度または有機共溶媒（ｏｒｇａｎｉｃｃｏｓｏ
ｌｖｅｎｔ　）に対する安定性を増加させるために、酵
素をまず適当な方法で化学修飾することができる。例え
ば、アガロース、セルロース、ヒドロキシエチルアクリ
レート、ガラス、シリカ、ポリアクリルアミド、ポリア
クリレートに基づく可預物などを包含する不溶性ポリマ
ーに固定化さ〜れた酵素は、生成混合物から容易に分離
でき、従って、酵素を再使用することができる。更に、
多くの場合に上昇温度と有機共溶媒に対する一定の安定
化が得られるという利点がある。

受容体物質の選択は合成を希望するオリゴ糖によって決
定される。供与体物質中に含まれるものと同じ型の単糖
を、受容体中に含むことができる。

これらは、好ましくは、Ｇ　Ｉ　Ｃ％　Ｇ　ａ　１　ｓ
Ｍａｎ、ＦｕｃＳＸｙ　１．Ａｒａ、ＧＩＣＮＡＣ％Ｇ
ａ１ＮＡｃおよびＮｅ　ｕＡｃのうちの一つまたはそれ
以上である（略称はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの推薦によった
。前記参照）。受容体物質は１位を０−１Ｎ−１Ｃ−ま
たはＳ−グリコシド結合された少なくとも一つのアグリ
コンによって誘導化される。

本発明によれば、受容体物質は１位以外の一つまたはそ
れ以上の位置を誘導化された糖からなっていてもよい。

そのような誘導化は、例えば、一つまたはそれ以上の水
酸基が水素または有機官能基によって置換されることを
意味する。そのようす受容体物質の一つの例は、ｐ−ニ
トロフェニル−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノ
シドである。糖誘導体のもう一つの重要な型は、環の酸
素（即ち、ヘキソースではＣ−５酸素）が窒素、イオウ
などで置換された物質である。そのような誘導体の一つ
の例は、Ｃ−５酸素が窒素によって置換されたグリコー
ス類似モラノリン （ｍａｒａｎｏｌｌｎ　）である。酵素または糖質結合
たんぱく質に対する有効な阻害剤であるオリゴ糖類似体
は、この方法で本発明によって合成される。

ＨＯＡＲ２のアグリコンＲ２は種々の型のものでよく、
その選択は、それぞれの特定の場合に何を要求し望むか
によって決定される。Ｒ２は無機物質でもよいが、上記
のすべてのＲ２が種々の型の有機物質であってもよい（
脂肪族、芳香族、ヘテロ環、ヘテロ芳香族またはその変
形）。Ｒ２は、受容体糖に対して０−１Ｎ−１Ｓ−また
はＣ−グリコシド結合されていることができる。適当な
有機アグリコンの例として、メチル基またはエチル基な
どのＣＨ３（ＣＨ２）ｎ基；フェニル基、ｐ−ニトロフ
ェニル基およびＯ−ニトロフェニル基２−ブロモエチル
基、トリメチルシリルエチル基またはＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ
３）＝Ｃ（Ｏ）−０＝ＣＨ２ＣＨ２基などを挙げること
ができる。また、アグリコンはアミノ基、ニトリル基ま
たはアミド基、または、発蛍光（ｆ’ｌｕｏｒｏｇｅｎ
ｌｃ　）物質でもよく、あるいは、フォスフェート、サ
ルフェートまたはカルボキシル基、またはその誘導体を
含むこともできる。

受容体物質としてアルキル配糖体（メチルグリコシド、
オクチルグリコシド、ドデシルグリコシドなど）を用い
て得られた生成物は、凝集試験またはアフィニティーク
ロマトグラフィーにおいて阻害剤として使用できる。ま
た、阻害に基づいた治療や薬物標的に対しても使用でき
、更に、連続酵素合成または連続有機合成の構造単位な
どとしても使用できる。ニトロフェニルグリコシドは、
例えばＰｄ／Ｃを用いて簡単にアミノフェニルグリコシ
ドに還元でき、このアミノフェニルグリコシドは、直接
にまたは化学修飾の後、種々のポリマー（デキストラン
、ポリエチレングリコール、アガロース、セルロース、
シリカなど）並びにペプチド、たんぱく質、酵素、脂質
またはその類似体などに対して共有結合させることがで
きる（　Ｍ　ｅＬｂｏｄｓ　　Ｉｎ　　Ｅ　ｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ、　　Ａ　ｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、　　Ｖ
ｏｌｓ、　　３４．４４．５０　　ａｎｄ　　１０４）
　ｏ更に、アミノ基は、イソチオシアネート、ジアゾ、
Ｎ−ブロモアセテートなどの幾つかの他の反応性の官能
基に容易に変換できる。直接にまたは化学修飾の後、ア
ミノフェニル基について上に述べた方法においていわゆ
るスペーサーアーム（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　　Ｅ　ｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ、　　Ｖ　ｏｆ、　　３４．　Ａ　ｃａ
ｄｅｍｌｃＰ　ｒｃｓｓ）として使用でき、かつ本発明
によるアグリコン（Ｒ２基）としてを用な他の基は、例
えば、２−ブロモエチル基、２−（２−カルボメトキシ
エチルチオ）エチル基、２−アミノエチル基および６−
アミノヘキシル基、またはそれらの誘導体などである。

また、２−ヒドロキシエチルメタクリレートなどの重合
可能なアグリコンを有する配糖体も受容体物質として使
用できる。Ｎ−グリコシド結合したアグリコンの例とし
て、６−アミノカプロン酸アミド（ＮＨＣＯ（ＣＨ２）
ＮＨ２）を挙げることができる。

他の型の配糖体にトリメチルシリルエチル配糖体がある
。この配糖体は、アノマー配置を保持したままトリメチ
ルシリル基をアセチル基によって置換できるので興味深
い（Ｋ、　　Ｊ　ａｎｓｓｏｎ　　Ｏｔ　　ａｌ。

Ｔ　ｃｔｒａｈｃｄｒｏｎ　　Ｌ　ｃｔｔ、、　　２７
　（１９８Ｂ）　、　　７５３−７５６）。従って、一
つの酵素工程によって、同じオリゴ糖配列の多数の配糖
体を合成することができる。アリルグリコシドおよびベ
ンジルグリコシドは容易に遊離の糖へ変換することがで
きる。アリル基は、例えば、７０℃でＫ　ｏ　ｔ　Ｂ　
ｕ　／ＤＭＳＯ処理した後、ＨｇＣｌ！２　・ＨｇＯ／
アセトン処理することによって容易に除去できる。ベン
ジル基はＰｄ／Ｃ処理によって容易に除去できる。アリ
ルグリコシドは対応する２、３−エポキシプロピルグリ
コシドに変換できる （Ｅ、　　Ｆａｌｅｎｔ　−Ｋｗａｓｔ　　ｅｔ　　ａ
ｌ。

Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　　Ｒｅｓ、、　１４５（１
９８Ｂ）　、　Ｉ）り、　　３３２−３４０）。遊離の
還元末端を有するオリゴ糖配列はこのようにして合成で
きる。

特別に興味ある他のアグリコンには、アミノ酸（セリン
、トレオニン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン
、アスパラギンなど）、ペプチド脂質および、これらの
３群に属する物質の誘導体または類似体がある。アミノ
酸配糖体およびペプチド配糖体は、ペプチド合成に通常
利用される官能基（ＦＭＯＣ％ＣＢＺ、ＢＯＣなど）に
よって、アミノ基および／またはカルボキシル基を保護
できる。本発明によれば、複合糖質の断片または類似体
をこれらのアグリコンを用いて合成することができる。

上述のように、受容体物質の望ましい位置をグリコシド
置換するように合成を制御できることは、本発明による
合成方法の重要な利点である。その結果として、従来の
方法を用いるより高い割合で望ましいオリゴ糖異性体を
形成できる。更に、アグリコンの選択と、受容体物質の
糖部分へのグリコシド結合の立体配置とに応じて、同じ
酵素が異なる異性体の合成を異なる程度に触媒するとい
う利点がある。

本発明による方法では、生成物の還元末端のアノマー炭
素における異性化の問題が除かれるので、生成物の精製
も多くの場合に非常に容易となる。

更に他の利点は、興味あるファインケミカルズが本発明
の方法を用いて合成できることである。

直接にまたは化学修飾の後、例えば、重合、固体担体へ
の固定化、酵素やたんぱく質に対する結合などに対して
使用できる物質を得ることができる。

アミノ酸、ペプチドまたは脂質誘導体をアグリコンとし
て使用できるので、糖ペプチドや糖脂質およびその類似
体の合成も本発明の方法によって非常に容易となる。

本発明による合成方法は、例えば、温度、ｐＨ。

緩衝液および反応体濃度などに関して、高度に多様な条
件下で行うことができる。種々の共溶媒（Ｎ、Ｎ−ジメ
チルホルムアミド、アセトニトリル、ジメチルスルホキ
シド、ジオキサン、ピリジン、メタノール、エタノール
、エチレングリコールなど）が使用でき、種々の濃度の
水溶液としても使用できる。加えて、反応は２相系、水
−有機溶媒（シクロヘキサン、クロロホルム、塩化メチ
レンなど）中で行うことができる。更に、酵素を逆ミセ
ルに内包することもできる（　Ｐ　、　　Ｌ　ｕｌｓＩ
。

Ａｎｇｅｖ、　　Ｃｈｅｍ、、　Ｖｏｌ、　９７．　ｐ
ｐ、　　４４９−Ｇ。

（１９８５）　）。反応は沈澱させた酵素を用いて純粋
な有機溶媒中で行うこともできる（　Ｋ　ａｚａｎｄｊ
ｌａｎｅｔ　　ａｌ、　　Ｊ、　Ａｍｅｒ、　　Ｃｈｅ
ｓ＋、　　Ｓｏｃ、、Ｖｏｌ。

１０７、　（１９８５）　）。反応条件は重要でないが
、主にその合成に含まれる反応体の性質に基づいて、更
に実際的な理由を考慮して選択する。例えば、酵素に関
しては、室温で、しかも水性の媒質の場合には４〜１１
の範囲のｐＨで、作用させることがしばしば適切である
ことが挙げられる。酵素の最適ｐＨよりいくらか高いｐ
Ｈを用いることによって、しばしばより高い生成物収率
が得られることが見出されている。コーヒーマメ由来の
α−ガラクトシダーゼおよびタチナタマメ由来のα−マ
ンノシダーゼに対してはｐＨ６，５〜７．５が使用され
た。一方、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｔ）のβ−ガラクトシ
ダーゼに対してはわずかに高いｐＨが好ましい。適切な
緩衝塩は、例えば、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、リ
ン酸カリウムまたはリン酸ナトリウムなどである°。

有機共溶媒は加水分解反応を最小化するために使用され
る。同じ理由で、２相系を使用できる。

しかし、ある場合には水を唯一の溶媒として用いる場合
に、かなり高い収率が得られることが知られている。こ
れは、例えば、コーヒーマメ由来のα−ガラクトシダー
ゼを用いるＧａ１（α１−３）Ｇａ　１　（ａ）−０Ｍ
ｅおよびＧａｌ　（（Ｚｌ−３）Ｇａ　ｌ　　（ａ）−
０Ｃ６Ｈ４−ＮＯ２−ｐの合成の場合などである。

生成物収率と酵素安定性を変えるために温度を変化させ
ることもできる。最もしばしば用いられる温度は５〜５
５℃の範囲であるが、熱安定性グリコシダーゼに対して
、あるいは、例えば高基質濃度を用いて熱変性に対して
安定化された酵素（Ｅ　、　　Ｊ　ｏｈａｎｓｓｏｎ　
　ｅｔ　　ａｌ、　　Ｂ　１ｏｔｅｃｈｎｏｌ。

Ｌｃｔｔ、、　８　　（１９８１３）　　ｐｐ、　４２
１−４２４　）に対しては、より高い温度を使用できる
。高温の利点の一つは、高基質濃度を利用でき、それに
よって水活性が減少され高い生成物収率が得られること
である。その上に、高温では酵素活性が増加し、そのた
めに反応時間が短縮されるという利点があり、これが更
に、メチルグリコシドまたはエチルグリコシドなどの室
温で比較的遅く加水分解される配糖体が高温（５０〜６
０℃）ではグリコシル供与体として有利に使用できると
いう利点をもたらす。上限温度は反応媒質中の酵素の熱
安定性によって決定される。ある糖転移に関しては、よ
り低い温度がより高い収率の生成配糖体を与えることが
見出された。コーヒーマメ由来のα−ガラクトシダーゼ
を用い、供与体の初濃度を０．１５Ｍ、受容体の初濃度
を０．４５Ｍとし、それぞれ２０．４０．５０℃で反応
を行った場合、２０℃で Ｇａ　Ｉ　Ｃａ　１−３）Ｇａ　１　（（り−０Ｍｅの
最大収率が得られた。

通常は、生成配糖体の収率を最大にするために、供与体
および受容体基質の飽和溶液が使用される。

これは、室温で水を溶媒として、ｐ−ニトロフェニルグ
リコシドの０．０５〜０．２モル溶液、メチルグリコシ
ドの０．３〜０．６゛モル溶液を意味する。メタノール
、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミドなどの共溶媒を、例え
ばｐ−ニトロフェニルグリコシドなどの疎水性アグリコ
ンを有する配糖体の溶解度を増加させるために使用でき
る。反応はＴＬＣ％ＨＰＬＣによって、または放出され
たアグリコンの分光測定によって（例えばｐ−ニトロフ
ェノールでは４００ｎｍ）追跡できる。生成配糖体の最
大収率が達成されたときには、ｐＨ変化、温度上昇およ
び／または有機共溶媒（エタノールなど）の添加により
酵素を変性させることによって反応を中断させる。通常
は、８０〜８５℃で３〜５分間加熱し、その後、約８０
％の濃度までエタノールを添加することで十分である。

生成物の精製には種々の技術が使用できる。例えば、溶
出液として塩化メチレン：メタノール：水（例えば６：
４：１　　ｖ／ｖ／ｖ）を用い、固相としてシリカを用
い、そこで、低圧での乾燥後の部分的に精製した生成配
糖体を無水酢酸とピリジン（例えば１　：　１　　ｖ／
ｖ）を用いてアセチル化するカラムクロマトグラフィー
が有効である。

更に、カラムクロマトグラフィーの工程（シリカ、溶出
液は例えば酢酸エチル：イソオクタン）を行うことによ
って、通常は純粋なアセチル化生成物が得られる。触媒
量のナトリウム　メトキシドを用いる乾燥ＭｅＯＨ中の
脱アセチル化によって、しばしば結晶形の生成配糖体が
得られる。顕著に疎水性のアグリコン（例えば、Ｇａ１
（α１−３）Ｇａ　１　　（（Ｚ）−０Ｃ６Ｈ４Ｎ０２
−ｐ）を有する生成物の精製は、製造的な（ｐｒａｐａ
ｒａｔｌｖｏ　）ＨＰＬＣ装置とＣ□８シリカを用いて
しばしば１工程で行うことができる。本発明による合成
方法は、糖たんぱく質または糖脂質に含まれるオリゴ、
　　糖配列の合成に一般に適用できる（　Ｂ　１ｏ１ｏ
ｇｙ　　ｏｆ’Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ、　Ｖ　ｏ
ｆ、　２　（１９８４）　。

Ｖ、　Ｇｉｎｓｂｕｒｇ　　ａｎｄ　　Ｐ、　Ｗ、　Ｒ
ｏｂｂｉｎｓ、　ｃｄｓ。

Ｗｌｌｅｙ　　＆　　５ｏｎｓ、　　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒ
ｋ　；ＴｈｅＧｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ、　Ｖｏ
ｌ、　　Ｉ　−Ｖ、　Ａｃａｄｅ＋＋＋１ｃＰｒｅｓｓ
、　　　Ｎｅｗ　　　Ｙｏｒｋ　　　；　　Ｓ、　　　
Ｈａｋｏ＊ｏｒ１．　　　Ａｎｎ。

Ｒｅｖ、　Ｂ　ｉｏｅｈｅｍ、　、　Ｖ　ｏｌ、　５０
．　ｐｐ、　　７３３−６４（１９８１）　　）　　。

特に興味深いのは、生物学的情報を転移するためには十
分であるこれらの構造の最小断片である。

このような構造の重要性の例として、血液型決定基、微
生物に対する特異的レセプター（Ｇａｌ（α１−３）　
Ｇａ　１ａ−１大腸菌　Ｎ８８；Ｃ１ｃＮａｃ　（β１
−３）Ｇａｌβ−１肺炎双球菌（Ｓ、　ｐｎｅｕａ＋ｏ
ｎｉａｅ）　；　Ｇ　ａ　Ｉ　Ｃａ　１−４）Ｇａｌβ
−１ｐ−線毛大腸菌（ｐ　−ｒ１ｗ＋ｂｒｊａｔｅｄＥ
、　ｅｏｌｌ）など）、分化抗原ｉ、Ｉ、ＣＯ５１４，
３８，１３などを挙げることができる（　Ｎ　ａｔｕｒ
ｅ。

Ｖ　ｏｆ、　　３１４．　　ｐｐ、　　５３−５７　（
１９８５）のＴ　、　　Ｆ　ｃｉｚｉによる総説中の第
１表および第２表を参照）。

例えば、「成熟」アスパラギン結合オリゴ糖の３つのク
ラス、即ち、（ａ）高マンノース型、（ｂ）　腹合型、
（ｃ）雑種型を代表する次のＮ−結合オリゴ糖中に含ま
れるオリゴ糖配列を生産できる（　Ｂ　ｉｏｌｏｇｙ　
　ｏｆ’　　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｏｓ、　Ｖ　ｏｆ
、　　２　。

（１９８４）　、　Ｖ、　　Ｇｉｎｓｂｕｒｇ　　ａｎ
ｄ　　Ｐ、　Ｗ。

Ｒｏｂｂｌｎｓ、　ｅｄｓ、　　Ｗｉｌｏｙ　　＆　　
５ｏｎｓ、　　ＮｅｗＹ　ｏｒｋを参照）。

ゴ　８ 次のＯ−れ〜合Ａリゴ糖ｔｉ＋ｔｉΔ中に、１まれるＡ
リニ「糖配列を（［＋１’（−さ゛る（ｌｌｉｏｌｏｇ
ｙ　　ｏｒ　　Ｃａｒ市ｏ１＋＋７＋ＩｒａＬｃｓ。

Ｖｏｌ、　２　（１０８４）　、　５ＡｆｉｌＯｙ　　
＆　　５ｏｎｓ、　　Ｎ（！ＩＶＹ　Ｏｒｋをぞ；照）
。

■、　而、１＋Ｊｌり之スー’ｒ１１　ｓ、ｔ＋（Ｆｕ
ｃａｌ−２−Ｇａｌ ＩＩ・他の糖 ）ｆ”；ｒり’ｔ−−スＧａ１８１−３ＧａｌＮ−１１
？’ｆルグルー１リミン　　　ＧｌｃＮｃａｌ−４Ｇａ
ｌＧｌｃＮＡｃα１−４ＧｌｃＮＡｃ Ｎ−アピチルガラク１−リミン　　Ｇａ１ＮＡｃａｌ−
３ＧａｌＮＡｃシｉＮＬ／Ｍ　　　　　　　　　　　５
ｉａａ２−６ＧａｌＮＡｃＳｉａａ２−６Ｇａｌ Ｓｉａａ２−４Ｇ１ｃＮＡｃ Ｓｉａａ２−８Ｓｉａ 更に、次の構造またはその断片が本発明によって製造で
きる（　Ｓ　、　Ｈａｋｏｏ＋ｏｒｌ、　　Ａ　ｎｎ、
　Ｒａｙ。

Ｂｉｏｃｈｅａ＋、、Ｖｏｌ、　　５．　ｐ、　７３９
　（１９８１）を参照）。

次の表に、本発明によって全体または部分を生産できる
ことが示唆される微生物およびトキシンに対する幾つか
のレセプター構造を芥子。

赤痢菌トキシン　　　　　Ｇａ　ｌ（！１−４Ｇａ　ｌ
−末端位　　　　　　ｇ）裏申のｔＪ町文献 Ｒ＠Ｃ＠ｐ七ｏｒｓ　　ａｎｄ　　Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉ
ｏｎ、　　Ｖｏｌ、　　８．　　Ｃｈａｐｍａｎ　　ａ
ｎｄ　　１ｌａｌｌ。

Ｎ、Ｙ、、　　１９８０゜ ｂｌ　Ｉｔ、Ｌａｆｆ１ｅｒ　ａｎｄ　Ｃ，５ｖａｎｂ
ｏｒｑ−Ｅｄ”ｅｎｅ　ＦＥＭｊ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
。

Ｌｅ七ｔａｒｓ　　Ｌ　　１９８０＋　　ｐ、　　１２
７１　Ｇ、　　Ｋａｌｌｓｎｉｕｓ、　　Ｉｔ、　　Ｍ
８１１ｂｙ。

Ｓ、Ｂ、ＳＶ＠ｎ１ｍ１！Ｏｎ、Ｊ、Ｗｉｎｂｅｒｇ、
　　八−ｆ、ｕｎｄｂｌａｄ、Ｓ、ＳＶ＠ｎ８１１０ｎ
ｙａｎｄ　Ｂ、　Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ、　ＦＥＭＳ　Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｌｅｔｔｅｒｓ　７＃　１９１１
（Ｌ２、２９）。

ｃｌ　　Ｘ、　Ｐａｒｋｋｌｎｌｌ！ｎｓ　Ｊ、　Ｆｉ
ｎｎｓ、　Ｍ、　Ａｃｈｔｍａｎ、　Ｖ、　ＶａｉｓＭ
ｎｓｎｓａｎｄ　Ｔ、に＋　Ｋｏｒｈｏｎｅｎ、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｓｓ、Ｃｏｎｗｎｕｎ。

ｉｌｌ、　　１９１１３．　ｐ、　　４５６゜ｄｌ　Ｖ
、ＶＢＬＪＭＩ４ｎ＠ｎ−Ｒｈ＠ｎｒ　Ｔ、に、Ｋｏｒ
ｈｏｎｅｎ、ａｎｄ　Ｊ、Ｆｉｎｎｅ＃ＦＥＢＤ　Ｌａ
ｔｔ、１５９，１９８３．ｐ−２Ｄ。

ｓ）Ｍ、Ｊ、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、ＪＪ、Ｗｈｌ七ｅｈｅ
ａｄｔ　ａｎｄ　ＹＪ、　に１ｍ、Ｉｎｆｅｃｔ。

ａｎｄ　　Ｘｍｍｕｎ、　　２Ｌ　　１９８（Ｌ　　ｐ
、　　８９７゜ｆ）　Ｍ、　ＢｅｒＬｏｌｉｎｉ　ａｎ
ｄ　Ｗ、Ｐｉｇｍａｎ、　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、　Ｒｅ
ｓ、、　Ｌ４ｔ１９７Ｅｌ、　　ｐ、　　５３゜ ９１　　Ｊ、Ｅ、Ｂｒｏｗｎ、に＋−Ａ、Ｋａｒｌｓｓ
ｏｎ、　　八＋　Ｌｉｎｄｂｅｒｇ＃　Ｎ、Ｂ七ｒｉ５
ｍｂ＠ｒ：ｑｒａｎｄ　Ｊ、Ｔｈｕｒｉｎ　　ｉｎ　Ｍ
、八、Ｃｈａｓｔｅｒ、ｏ、ＩｌｅｉｎｅｇＡｒｄｔ　
　八、ｆａｕｎｄｂｌａｄ。

ａｎｄ　Ｓ、５ｖｅｎｓｓｏｎ　　（ｅｄｓｌｒ　Ｐｒ
ｏｃ、７七ｈ　Ｘｎ七、Ｓｙｍｐ、Ｇｌｙｃｏ−ｃｏｎ
ｊｕｇａｔｓｓ＋　　Ｌｕｎｄｇ　　１９８３．　ｐ、
　　６）８゜ｈ）　八、Ｇｕｎｎａｒ！１Ｉｉｏｎｙ　
　Ｐ、−八、ＭＡｒｄｈ、　　八、Ｌｕｎｄｂｌａｄ、
Ｓ、５ｖｅｎｓｓｏｎ。

Ｘｎｆｅｃ七、　　Ｉｍｍｕｎ、、　　４５＃　　１９
８Ｌ　　ｐ、　　４１゜ｉ）Ｃ，Ｓｖａｎｂｏｒｇ−Ｅ
ｄｅｎ、Ｂ＋Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ、Ｌ、ｌｌａｇｂｗｇ
、Ｉｌ、Ｌａｆｆ１ｅｒ＋Ｇ、Ｐ憧ａｑｎｕｍＢ０ｎｒ
Ｇ９ＭｏｏｒｉｐＪ、Ｄａｌｔｍｅｎ、ａｎｄ丁、５８
ｄｔ！１”！Ｉｔｒ８ｆｆｂＡｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ
−Ｓｃｉ、、４Ｇ９，１９８３．ｐ　５６０゜ｊ）　Ｔ
、　Ｆｅ１ｚｉ　ａｎｄ　１１．Ａ、　Ｃｈｉｌｄｓ、
　Ｔｒｅｎｄｌｌ、　Ｂｌｏｃｈｅｍ、　Ｓｃｉ、。

ｔｏ、　　１９８５．　ｐ、　　２４゜ｋ）Ｇ、Ｐ、　
　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　　ａｎｄ　　Ｒ，Ｒ，Ｄｅｓｓａ
ｉ、　八ｎｎ、　　Ｃｌ１ｎ、　　Ｌａｂ、　　ＳｃＬ
、ｔ１９８５、ｐ、２９４゜ １）　　Ｊ−）１ｏ１ｍｇｒｅｎ、　　Ｎａｔｕｒｅ＋
　　２９２．　１９８１＃　　ｐ、　　４３１．　　）
更に、種々のヒト腫瘍中に現われ、腫瘍関連抗原として
作用する複合糖質（特に、Ｆ　ｃｉｚｉ、　Ｎ　ａｔｕ
ｒｃ、　３１４　（１９８５）を参照）中の多数の異な
るオリゴ糖の配列も非常に興味深い。これには次の構造
がある。

横γシ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　刹１１
１泡介合胃腺がん、分泌者 亙２グＪ土丞 単糖のフルオロ類似体、ホスホ類似体、アミン類似体ま
たはチオ類似体などを含むオリゴ糖配列は、複合糖質代
謝の研究の点から、および可能性としてはがんの化学療
法の点から非常に興味深い（Ｔｈｏ　　Ｇｌｙｅｏｃｏ
ｎｊｕｇａｔｅｓ、　Ｖｏｌ、　ＩＶ　（１９８２）Ａ
　ｃａｄｃｍｉｃ　　Ｐ　ｒｃｓｓ）　ｏあるオリゴ糖
類似体は、天然のレセプターよりもレクチンに対してよ
り高い会合定数を持つことが示された。これについては
、糖構造に基づく感受性の高い診断法および効果的な治
療法の開発の点から非常に興味が持たれる。

上に述べたように非常に多数のアグリコンを使用できる
。例えば、受容体としてアリルグリコシド、ベンジルグ
リコシドまたはトリメチルシリルグリコシドを選ぶこと
によって、生成配糖体から容易に高収率で遊離の糖を得
ることができる。このように、依然にはグリコシダーゼ
を用いて合成することができなかった遊離のオリゴ糖構
造の酵素合成を、本発明の方法によって行うことができ
る。

簡単な配糖体（メチルグリコシドなど）を、抗体（Ｓｌ
ａｍａ　ａｔ　ａｔ、　Ｂｌｏｃｈｅ＋５ｌｓｔｒｙ、
　　（１９８０）　。

１９　（２０）　、　４５９５−４（ｔｏｏ）およびレ
クチン（Ｓｈａｒｏｎ　　ａｎｄ　　　Ｌｉｓ、　　５
ｃｉｏｎｃｏ（１９７２）、　　１７７゜９４９−９５
９　）を用いる阻害研究に使用することができる。発色
団または蛍光性のアグリコン（例えば、ｐ−ニトロフェ
ニル、４−メチルウンベリフェリル）を存する配糖体を
酵素分析に使用することができる（Ｄ、　　Ｅ、　　５
ｙｋｅｓ　　ａｔ　　ａｌ。

Ｃａｒｂｏｂｙｄｒａｔｅ　　Ｒａｓ、、　ＩＩＧ　（
１９Ｈ）　　１２７−　ＩＨ）。

更に、ペプチド、たんぱく質、脂質、クロマトグラフィ
ーの担体などに対する共有結合させるのに適した配糖体
を、本発明の方法によって合成することができる。

本発明の実際の具体例を次に示す。しかし、これらは本
発明の技術的範囲を制限するものではない（略称は、Ｉ
ＵＰＡＣ−ＩＵＢの推薦によった。

Ｊ、　　Ｂｌｏｔ、　　Ｃｂｃｍ、　　Ｖｏｌ、　２５
７．　ｐｐ、（３４７−３３５４（１９８２）　”）。

例Ｉ Ａ、　　　１．８ｇのｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガ
ラクトピラノシド（Ｇａｌ（α）− ＯＰｈＮＯ２−ｐと１８ｇの１−０−メチル−α−Ｄ−
ガラクトピラノシド（Ｇａｌ（α）−〇Ｍｅ）とを、１
１０１１１の０．０５Ｍリン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ
６，５）と４０１１１！のＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド中に溶解した。コーヒーマメ由来のα−ガラクトシダ
ーゼ（α−Ｄ−ガラクトシド　ガラクトヒドロラーゼ；
ＥＣ３，２，１゜２２；０．２１１ｉ；１０単位、Ｂ　
ｏｏｈｒｉｎｇｏｒ　）を添加した。室温で７日間放置
した後、反応混合物を８０℃で５分間加熱し、生成物を
カラムクロマトグラフィー（シリカ、Ｋ　Ｉｃｓｃｌｇ
ｃｌ　　６０．２３０〜４００メツシユ、Ｍ　ｅｒｃＬ
クロロホルム：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ，６：４：０．５　　
ｖ／ｖ／ｖ）によって精製し、無水酢酸とピリジンを用
いてパ−アセチル化した。更にカラムクロマトグラフィ
ーの工程（シリカ、イソオクタン：酢酸エチル、１：１
ｖ／ｖ）を行い、触媒量のナトリウムメトキシドを用い
てＭｅＯＨ中で脱アセチル化した後、純粋な結晶Ｇａ　
１　　（Ｃ１−３）　Ｇａ　１　（ａ）−〇Ｍｅを得た
。生成物をＮＭＲ，ＨＰＬＣを用いて分析しく純度は９
９％を超える）、更にメチル化分析を行った。

Ｂ、　　０．３１ｇのＧａ　１　（α）−０ＰｈＮＯ２
−ｐとＯｙ９１ｇのＧａ　１　（（り−０Ｍｅとを、１
０ｒＩＪ！の緩衝液（例ＩＡを参照）に溶解した。α−
ガラクトシダーゼ（コーヒーマメ、 Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、　　Ｅ　Ｃ３，２，１、２２，
５単位）を添加し、反応を室温で７２時間継続させた。

反応混合物を８０℃で５分間加熱し、生成物を例ＩＡに
従って単離した。Ｇａ１（Ｃ１−３）Ｇａ　１　　（α
）−０Ｍｅの収量は１８０ｍｇ、つまりＧａ　１　（α
）−０ＰｈＮＯ２９の３９％が付加された。

例２ ０．６ｇのＧａ　１　（α）−０ＰｈＮＯ２−ｐと４ｇ
のＧａ１（β）−０Ｍｅとを、２２Ｍの０．０５Ｍリン
酸ナトリウム水溶液（ｐＨ６，５）と９ｄのＮ、Ｎ−ジ
メチルホルムアミド中に溶解した。コーヒーマメ由来の
α−ガラクトシダーゼ（ＥＣ３，２，１，２２；０．２
ｔｌ；１０単位）を添加し、反応を室温で９０時間継続
させた。生成物を例１に従ってカラムクロマトグラフィ
ーによって精製した。アセチル化した生成物を２００Ｍ
Ｈｚ　　ＮＭＲ（’　Ｈｓ　１３Ｃ）を用いて分析した
。Ｇａ　１　　（ｃｒｌ−６）　Ｇａ　１　　（β）−
０Ｍｅの収量は１２５ｍｇ、Ｇａ　１　（（！１−３）
Ｇａ　１（β）−０Ｍｅでは６５ｍｇであり、つまりそ
れぞれ１６％と８％のＧａ　ｌ　　（α）−０ＰｈＮＯ
２−ｐが付加された。

例３ Ａ、　　０．９ｇのＧａ　１　（ａ）−０ＰｈＮＯ２−
ｐを、２４Ｍの０．０５Ｍリン酸ナトリウム水溶液（ｐ
Ｈ６，５）と８１１Ｊ！のＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド中に溶解した。コーヒーマメ由来のα−ガラクトシダ
ーゼ（ＥＣ３，２，１，２２；０．２１ＬＩ！；１０単
位）を添加し、反応を室温で３８時間継続させた。生成
物をカラムクロマトグラフィー（シリカ、セファデック
ス（Ｓ　ｃｐｈａｄｃｘ　）Ｇ１０）によって分離し、
ＵＶ　（３０５ｎｍ）と２００ＭＨｚ　　ＮＭＲ（”　
Ｈ，１３Ｃ）を用いて分析し、更にメチル化分析を行っ
た。Ｇａ１（（！１−３）Ｇａ　１　（ａ）−０ＰｈＮ
Ｏ２−ｐの収量は１５０ｍｇ、Ｇａ　１　　（（Ｅｌ−
２）Ｇａ　１（ａ）　　０ＰｈＮＯ２ｐでは２５ｍｇで
あり、つまりそれぞれ１３％と１．７％のＧａ１（α）
−ＯＰｈＮＯ２−ｐが付加された。

Ｂ、　　１．３５ｇのＧａ　ｌ　（ａ）　−０ＰｈＮＯ
２−ｐを、１０ｔｔ’の緩衝液（例３Ａを参照）中に溶
解し、コーヒーマメ由来のα−ガラクトシダーゼ（例３
Ａを参照）を５単位添加した。反応を５０℃で７６時間
継続させた。反応混合物を８０℃で５分間加熱すること
によって反応を中断させた。

生成物を例３Ａに従いカラムクロマトグラフィー（セフ
ァデックス　ＧＩＯｌＰ　ｂａｒｍａｃｉａｘおよび、
シリカ、Ｍ　０ｒＣｋｓ　Ｋ　ｉｏｓｃｌｇｏｌ　　６
０．２３〜４００メツシユ、酢酸エチル：イソプロパノ
ール：水　６：２：１　　ｖ／ｖ／ｖ）によって単離し
た。

Ｇａ　ｌ　　（ａｌ−３）Ｇａ　ｌ　（ａ）−０ＰｈＮ
Ｏ２−ｐとＧａ　ｌ　（ａｌ−２）　Ｇａ　ｌ　（ａ）
　−ＯＰ　ｈ　Ｎ　Ｏ２９の収率はそれぞれ２３％（２
３６ｍｇ）と３．５％（３６ｍｇ）であった。

Ｃ１この試験は、トレシル（ｔｒｃｓｙｌ）クロリド活
性化アガロース（Ｐ　ｂａｒｓａｃｌａ）に固定化した
コーヒーマメ由来のα−ガラクトシダーゼ（Ｋ、　　Ｎ
ｉ１ｓｓｏｎ　　ｅｔ　　ａｔ、　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、
　　Ｂｉｏｐｂｙｓ＋Ｒａｓ、　　Ｃｏ１１．、１０２
　　（１９８１）　　４４９−４５７　）を用いて、例
３Ａに従って行った。０．５ｇ、１１単位のα−ガラク
トシダーゼ−アガロースを、１．５ｇのＧａ　１　（α
）　−０ＰｈＮＯ２−ｐを２３Ｒ１の緩衝液と１０ｍ１
！のＤＭＦとに溶解した溶液に添加した。緩やかに撹拌
しながら反応を室温で１２０間継続させた。上記に従っ
て反応を終結させ生成物を単離して、１６０ｍｇのＧａ
ｌ　（αｌ−３）Ｇａ　１　（（Ｚ）−０ＰｈＮＯ２−
ｐを得た。ツまり理論値の１４％である。触媒活性がわ
ずかに数パーセント減少するが、固定化したα−ガラク
トシダーゼを繰返して使用することができた。

例４ Ｇａ　ｌ　（αｌ−２）Ｇａ　１　（（Ｚ）−０ＰｈＮ
Ｏ２−〇の合成 ２ｇのＧａ　１　（α）−０ＰｈＮＯ２−ｏを、３０ｍ
１！の緩衝液（例ＩＡを参照）と１４１１１！のＤＭＦ
とに溶解した。α−ガラクトシダーゼ（例ＩＡを参照、
２０単位）を添加し、反応を室温で５３時間継続させた
。反応を終結させ、生成物を例ＩＡに従って単離し分析
した。純粋な結晶Ｇａ　　１　　（（Ｚｌ−２）　　Ｇ
ａ　　１　　（（Ｚ）　　−０ＰｈＮＯ２−０の収量は
６０ｍｇであり、つまり理論収率の４％であった。

例５ アスペルギルス　ニゲル（Ａ　ｓｐｅｒｇｌｌｌｕｓｎ
ｌｇｃｒ　）由来のα−ガラクトシダーゼ（ＥＣ３゜２
．１．２２）を用いる以外は例３に従って、合成を行っ
た。この場合、４０ｍｇのＧａ１（ａｌ−３）Ｇａ　１
　（ａ）−０ＰｈＮ０２−ｐと４ｍｇの異性体生成物（
多分（Ｇ１−２）異性体）と痕跡程度（約１ｍｇ）の他
の異性体生成物が得られた。これらの異性体は、例３Ａ
に従ってセファデックス　Ｇ１０工程中で分離した。

例６ 合成 ０．６３ｇのＭａｎ　（（Ｚ）−０ＰｈＮＯｚ　−ｐを
、１０ｇＭ　　ＺｎＣｌ２である０、０５Ｍリン酸ナト
リウム（ｐＨ６，５）の３３ｍに溶解した。

１０１ｔのＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドを添加した０
タチナタマメ（Ｃａｎａｖａｌｉａ　　ｅｎｓｉｒｏｒ
ｍｉｓ）由来のα−マンノシダーゼ（α−Ｄ−マンノシ
ドマンノヒドロラーゼ；ＥＣ３，２，１，２４；０．３
ｍ；１０単位、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｏｒ　−Ｍａｎｎｈｅ
ｉｓ＋　）を添加し、反応を室温で６時間、それから冷
却室（４℃）で３６時間継続させた。生成物をカラムク
ロマトグラフィー（シリカゲル）によって単離し、ＮＭ
Ｒを用いて分析し更にメチル化分析を行った。Ｍａｎ　
（（Ｚｌ−２）Ｍａｎ　Ｃａ）−ＯＰｈＮＯ２−ｐの収
量は３６ｍｇであった。

ＮＭＲによれば生成物の純度は９５％を超えており、残
りの異性体の形成は無視できる程度であった。

例７Ａ の合成 ０．６ｇのｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノピラノ
シド（Ｍａｎ　（α）−０ＰｈＮＯ２−ｐ）と６ｇの１
−０−メチル−α−Ｄ−マンノピラノシド（Ｍａｎ　（
（Ｚ）−０Ｍｅ）とを、１０ｇＭＺｎＣノ２である０、
０５Ｍリン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ６，５）の３８ピ
に溶解した。Ｎ、　Ｎ−ジメチルホルムアミドを添加し
た。タチナタマメ由来のα−マンノシダーゼ（ＥＣ３，
２，１゜２４；０．３１１Ｉｌ；１５単位）を添加し、
反応を室温で１４時間継続させた。生成物を例１および
例２の合成と類似の方法でシリカカラムによって精製し
た。生成物をＮＭＲ、メチル化分析、ＨＰＬＣを用いて
分析した。　１８０ｍｇのＭａｎ（αｌ−２１−２）　
（ａ）−ＯＭｅと２８ｍｇのＭａｎ　（αｌ−６１−６
）　（（Ｚ）　−ＯＭｅを得た。

つまり、それぞれＭａｎ　（（Ｚ）−０ＰｈＮＯ２ｐの
２０％と３％が付加された。

例７Ｂ ２０ｇのＭａ　ｎ　（α）−ＯＭｅを、４５１１ｉの緩
衝液（例７Ａを参照）と５ｄのＭｅＯＨとに溶解した。

α−マンノシダーゼ（例７Ａを参照、５０単位）を添加
し、反応を５５℃で３０間継続させた。反応を終結させ
、生成物を例７Ａに従って単離した。

例８ ０．９ｇのＭａｎ　（ａ）−０ＰｈＮＯ２−ｐと２．７
ｇの２−ブロモエチル−α−Ｄ−マンノピラノシド（Ｍ
ａ　ｎ　（（Ｚ）　−０Ｅ　ｔ　Ｂ　ｒ）とを、２０Ｉ
ＩＬ！！の０．０５Ｍリン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ６
，５）に溶解した。７ＪのＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミ
ドを添加した。タチナタマメ由来のα−マンノシダーゼ
（ＥＣ３，２，１，２４；０．３ＩＩＬＩ！；１５単位
）を添加し、反応を室温で７２時間継続させた。生成物
を例７Ａに従って精製した。生成物をＮ　Ｍ　Ｒ（２０
０Ｍ　Ｈｚ　；ＩＨ，１３Ｃ）によって分析した。２０
０ｍｇのＭａｎ　（（２１−２）Ｍａｎ　（ａ）−０Ｅ
ｔＢｒと約３０ｍｇの未帰属異性体生成物（多分（Ｇ１
−６）異性体）とを得た。

例９ この物質は、２０ｇのＭａｎ（α）− ＯＰｈＮＯ２−ｐと４５ｇのＭａｎ（ａ）−ＯＭｅとか
ら、ＩＭ（５０単位）のタチナタマメ由来のα−マンノ
シダーゼ（ＥＣ３，２，１゜２４）を用い、他は例７Ａ
による条件下でのＭａｎ　（αｌ−２１−２）　（α）
−ＯＭｅとＭａｎ　（（Ｚｌ−６）Ｍａｎ　（ａ）−Ｏ
Ｍｅの大量合成の副生成物として形成された。生成物は
、カラムクロマトグラフィー（セファデックスＧＩＯ、
シリカ）によって２糖分画から分離した。

アセチル化した生成物を、カラムクロマトグラフィー（
シリカ）によって異性体生成物（全量の約３５％）から
分離し、た。２５０ｍｇのアセチル化Ｍ　ａ　ｎ　（ａ
　１−２　）　Ｍ　ａ　ｎ　（ａ　１−２　）　Ｍ　ａ
　ｎ（α）−ＯＭｅを得た。生成物をＮＭＲ（２００Ｍ
Ｈｚ　；”　Ｈ，”　３Ｃ）によって分析し、更にメチ
ル化分析を行った゛。

例１Ｏ Ａ、　　２．７ｇの０−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラ
クトピラノシド（Ｇａｌ（β）− ＯＰｈＮＯ２−ｏ）と５ｇのＧａ１（β）−ＯＭｅとを
、１ｍＭ　　ＭｇＣｌ２および１０ｍＭメルカプトエタ
ノールである０、０５Ｍリン酸ナトリウム水溶液（ｐ　
Ｈ６，８）の３５１１１に溶解した。１５Ｍ１のＮ、Ｎ
−ジメチルホルムアミドを添加した。大腸菌由来のβ−
ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−ガラクトシド　ガラクトヒ
ドロラーゼ；ＥＣ３，２，１，２３，１００単位；　Ｓ
　ｉｇｍａＬ　ａｂｏｒａｉｏｒｌｏｓ　）を添加し、
反応を室温で２４時間継続させた。生成物をカラムクロ
マトグラフィー（シリカおよびセファデックス　Ｇ１０
）によって分離した。アセチル化とシリカカラムでのク
ロマトグラフィーの後、１．３ｇのアセチル化Ｇａ１（
β１−３）Ｇａｌ（β）−ＯＭｅと１６０　ｍ　ｇのＣ
ａ１（β１−６）Ｇａｌ（β）−ＯＭｅ（アセチル化）
を得た。分析は２００Ｍ　Ｈｚ　　Ｎ　Ｍ　Ｒ（”　Ｈ
％　”　３Ｃ）を用いて行った。

Ｂ、　　この試験は例１０Ａと類似しているが、９６０
ｇのＧａ１（β）−０ＰｈＮＯ２−ｏと、１５ｇのＣａ
１（β）　−ＯＭｅと、トレシルアガロース（例３Ｃを
参照）に固定化した大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ
とを用いた。このグリコシダーゼを、１０５ａＩｉ７の
緩衝液（例１０Ａを参照）と４５１ｎｉのＤＭＦ’に溶
解した。β−ガラクトシダーゼ−アガロース（Ｏ，２ｇ
、３００単位）を添加し、緩やかに撹拌しながら反応を
室温で４日間継続させた。生成物を例１ＯＡに従って単
離し、分析した。ＭｅＯＨから再結晶させたＧａ１（β
１−３）Ｇａｌ（β）−ＯＭｅの収量は４ｇ（２９９６
）であり、Ｇａ１（β１−６）Ｇａｌ（β）−ＯＭｅで
は４００ｍｇ　（３％）であった。

例１１ Ｇａｌ（β１−６）Ｇａ　１　（ａ）−ＯＭｅの製造こ
の試験は例１０Ａと類似しているが、２．７ｇのＧａ１
（β）　　０ＰｈＮＯ２ｏと、５ｇのＧａ　１　　（ａ
）−ＯＭｅと、大腸菌由来の１．０ｇのβ−ガラクトシ
ダーゼ（例１０Ａを参照）を３５ｇの緩衝液（例１０Ａ
を参照）と１５ｍのＤＭＦとに溶解した溶液とを用いた
。室温で５時間反応させた後、生成物を例１Ｏに従って
単離し分析した。

結晶Ｇａ１（β１−６）Ｇａｌ（β）−ＯＭｅの収量は
４５０ｍｇであった。他の異性体の形成は無視できる程
度であった。

例１２ この例は受容体配糖体自身の製造の説明である。

１８ｇのラクトースを、１６０Ｉ！ＩＩ！の緩衝液（例
１Ｏを参照）と７５１ＬＩ！のＤＭＦと１５ピのヒドロ
キシエチルメタクリレートとの混合物中に溶解した。

β−ガラクトシダーゼ−アガロース（１，５ｇ。

２２５０単位、例１０Ｂを参照）を添加し、緩やかに撹
拌しながら反応を室温で継続させた。６日後、固定化酵
素をろ別し、生成物をカラムクロマトグラフィーによっ
て単離した。２．６ｇのＧａ１（β）　　０ＣＨ２ＣＨ
２ＱＣ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ２と１６０ｍｇのＧａ
１（β１−３）Ｇａ　１−ＯＣＨ２ＣＨ２ＱＣ（Ｏ）Ｃ
（ＣＨ３）＝ＣＨ２を得た。

廻」Ｊ ６ｇのＧａ１（β）−０ＰｈＮＯ２−ｏと１ｇのＣ；１
ｃＮＡｃ（β）　−〇　（ＣＨ２）　２　Ｓ　１（ＣＨ
３）３とを、１０ｇのウシ精巣から得た抽出物の上清を
含む３０Ｍ１の０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７，０
）中に懸濁した。反応を４０℃で２日間継続させた。反
応を終結させ、生成物を例１０Ａに従ってカラムクロマ
トグラフィーによって単離した。脱アセチル化後のＧａ
１（β１−３）ＧｌｃＮＡｃ（β）　　０（ＣＨ２）２
ｓｉ（ＣＨ３）３の収量は２００ｍｇであった。

１旦 ＧｌｃＮＡｃ（β１−１−６）　ｎ　（（Ｚ）　−ＯＭ
ｅの合成 ３ｇのＧｌｃＮＡｃ（β）−０ＰｈＮＯ２−ｐ　　’（
ｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサ
ミニド）と１６ｇのＭａｎ（α）−〇　Ｍ　ｅとを、８
８ａａ？の緩衝液（例ＩＡを参照）と１２ＭＪ！のＤＭ
Ｆに溶解した。Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダ
ーゼ（タチナタマメ、ＥＣ３゜２．１．３０．２０単位
、０．３ＪＩＪＦ、　ＳｌｇｍａＬ　ａｂｏｒａＬｏｒ
ｉａｓ　）を添加し、反応を室温で３０間継続させた。

反応を終結させ、生成物を例ＩＡに従って単離し分析し
た。純粋な結晶Ｇ’１ｃＮＡｃ（β１−６　）　Ｍ　ａ
　ｎ　（ａ　）　−０Ｍ　ｅの収量は３５０ｍｇであっ
た。

例１５ Ｆｕｃ　（ａｌ−３）Ｇａ　１　（（り−０Ｍｅの合成
０．３１ｇのｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコピラノ
シド（Ｆｕｃ　（ａ）−０ＰｈＮＯ２）と３ｇのＧａ　
１　　（ａ）−ＯＭｅとを、２５１Ｒ１の緩衝液（Ｏ，
０５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６，２）に溶解した。α
−Ｌ−フコシダーゼ（ウシ腎臓；ＥＣ３，２，１，５１
；ｏ、３ｍ／、１単位、Ｓ　ｉｇｍａ　　Ｌ　ａｂｏｒ
ａｔｏｒｔｃｓ　）を添加し、反応を３７℃で２０間継
続させた。反応を中断させ、生成物を例ＩＡに従って単
離し分析した。パーアセチル化Ｆｕｃ　（αｌ−３）Ｇ
ａ　ｌ　（（Ｚ）−ＯＭｅの収量は３５ｍｇであった。

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. （１）複合糖質の糖部分からなるオリゴ糖化合物、また
   は、その糖部分の断片であるオリゴ糖化合物、または、
   その糖部分の類似体であるオリゴ糖のいずれかを、逆加
   水分解または糖転移によって酵素的に生産するにあたり
   、グリコシル供与体とグリコシル受容体との間に形成さ
   れるグリコシド結合のレジオセレクティビティを制御す
   る方法であって、 単糖またはオリゴ糖、または単糖かオリゴ糖の配糖体で
   ある供与体物質を、単糖またはオリゴ糖または糖類似体
   と、１位でＯ−、Ｎ−、Ｃ−またはＳ−グリコシド結合
   した少なくとも一つのアグリコンとからなるＯ−、Ｎ−
   、Ｃ−またはＳ−配糖体である受容体物質と、グリコシ
   ダーゼの存在下で反応させ、かつ、ここで、受容体物質
   中のグリコシル基とアグリコンの間のグリコシド結合に
   関してα−またはβ−配置が選択されることと、このオ
   リゴ糖化合物が反応混合物から分離されることとを特徴
   とする、 グリコシド結合のレジオセレクティビティの制御方法。
2. （２）供与体物質と受容体物質の糖部分が、Ｌ−フコー
   ス、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｎ−アセチル
   ノイラミン酸、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンおよ
   びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンといった単糖の一つ
   またはそれ以上を含むことを特徴とする特許請求の範囲
   第１項記載の方法。
3. （３）受容体物質が、Ｌ−フコース、Ｄ−ガラクトース
   、Ｄ−マンノース、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン
   およびＮ−アセチルＤ−グルコサミンといった単糖の類
   似体を含むことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
   の方法。
4. （４）アグリコンが脂肪族物質または芳香族物質である
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項から第３項まで
   のいずれか１項に記載する方法。
5. （５）アグリコンが、グリコシド結合したメチル基、Ｃ
   Ｈ＿３（ＣＨ＿２）ｎ基、フェニル基、ｐ−ニトロフェ
   ニル基、ｏ−ニトロフェニル基、２−ブロモエチル基、
   トリメチルシリルエチル基またはＣＨ＿２＝Ｃ（ＣＨ＿
   ３）−Ｃ（Ｏ）− ＯＣＨ＿２ＣＨ＿２基であることを特徴とする特許請求
   の範囲第４項記載の方法。
6. （６）アグリコンが発蛍光物質であることを特徴とする
   特許請求の範囲第１項から第４項までのいずれか１項に
   記載する方法。
7. （７）アグリコンがアミノ基、ニトリル基またはアミド
   基であるか、またはこれらの基を含むことを特徴とする
   特許請求の範囲第１項から第４項までのいずれか１項に
   記載する方法。
8. （８）アグリコンが、フォスフェート、サルフェートま
   たはカルボキシル基、またはそれらの誘導体を含むこと
   を特徴とする特許請求の範囲第１項から第４項までのい
   ずれか１項に記載する方法。
9. （９）アグリコンが、直接にまたは化学修飾の後、脂質
   、ペプチド、たんぱく質、酵素、または、アフィニティ
   分配系、アフィニティクロマトグラフィー、診断または
   治療において使用される担体物質に、共有結合できるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項から第４項までの
   いずれか１項に記載する方法。
10. （１０）アグリコンが重合可能であることを特徴とする
    特許請求の範囲第１項から第９項までのいずれか１項に
    記載する方法。
11. （１１）アグリコンが、アミノ酸、ペプチド、脂質また
    はその誘導体またはその類似体であることを特徴とする
    特許請求の範囲第１項から第６項までのいずれか１項に
    記載する方法。
12. （１２）供与体が、ラクトース、ラフィノース、チトビ
    オースまたはジマンノシドであることを特徴とする特許
    請求の範囲第１項から第１１項までのいずれか１項に記
    載する方法。
13. （１３）供与体物質が、α−またはβ−グリコシド結合
    した有機物質を有する単糖またはオリゴ糖であることを
    特徴とする特許請求の範囲第１項から第１１項までのい
    ずれか１項に記載する方法。
14. （１４）有機物質が、メチル基、 ＣＨ＿３（ＣＨ＿２）ｎ基、フェニル基、ｐ−ニトロフ
    ェニル基、ｏ−ニトロフェニル基または４−メチルウン
    ベリフェリル基であることを特徴とする特許請求の範囲
    第１３項記載の方法。
15. （１５）酵素がＥＣ３．２群のエンドグリコシダーゼお
    よび／またはエキソグリコシダーゼであることを特徴と
    する特許請求の範囲第１項から第１４項までのいずれか
    １項に記載する方法。
16. （１６）酵素が、ガラクトシダーゼ、マンノシダーゼ、
    Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ、Ｎ−アセチルガラク
    トース　アミニダーゼ、Ｎ−アセチルグリコースアミニ
    ダーゼまたはフコシダーゼであることを特徴とする特許
    請求の範囲第１項から第１５項までのいずれか１項に記
    載する方法。
17. （１７）使用する酵素が熱安定性であることを特徴とす
    る特許請求の範囲第１項から第１６項までのいずれか１
    項に記載する方法。
18. （１８）酵素が、そのままでまたはその天然の生物学的
    環境から完全にまたは部分的に単離された後に使用され
    ることを特徴とする特許請求の範囲第１項から第１７項
    までのいずれか１項に記載する方法。
19. （１９）酵素が結晶形であることを特徴とする特許請求
    の範囲第１項から第１８項までのいずれか１項に記載す
    る方法。
20. （２０）酵素がミセルに内包されていることを特徴とす
    る特許請求の範囲第１項から第１９項までのいずれか１
    項に記載する方法。
21. （２１）酵素が有機物質によって共有結合的に修飾され
    ていることを特徴とする特許請求の範囲第１項から第２
    ０項までのいずれか１項に記載する方法。
22. （２２）酵素が、沈澱、吸着、内包、キレート化、また
    は、プロトン性溶媒または非プロトン性溶媒に不溶であ
    るポリマー物質またはその誘導体への共有結合によって
    固定化されていることを特徴とする特許請求の範囲第１
    項から第２１項までのいずれか１項に記載する方法。
23. （２３）ポリマー物質が、アガロース、セルロース、シ
    リカ、ポリアクリルアミド、または、ポリアクリレート
    に基づく可塑物からなることを特徴とする特許請求の範
    囲第２２項記載の方法。
24. （２４）他の物質に対する生物特異的な親和力を有する
    オリゴ糖化合物が合成され単離されることを特徴とする
    特許請求の範囲第１項から第２３項までのいずれか１項
    に記載する方法。
25. （２５）特許請求の範囲第１項に記載する方法によって
    得られた生成物を、直接にまたは化学修飾の後、アフィ
    ニティクロマトグラフィー、２相系でのアフィニティ分
    配、診断、治療、免疫化、免疫学的特徴づけ、酵素／た
    んぱく質の性質の変化、酵素活性の測定、性細胞への影
    響、または、植物防御／成長機構の修飾のために使用す
    る、 特許請求の範囲第１項記載の方法によって得られた生成
    物の使用。