JP2716117B2 - グリコシド結合のレジオセレクテイビテイの制御方法 - Google Patents
グリコシド結合のレジオセレクテイビテイの制御方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、複合糖質の糖部分からなるオリゴ糖化合
物、または、その糖部分の断片であるオリゴ糖化合物、
または、その糖部分の類似体であるオリゴ糖化合物のい
ずれかを、逆加水分解または糖転移によって酵素的に生
産するにあたり、グリコシル供与体とグリコシル受容体
との間に形成されるグリコシド結合のレジオセレクティ
ビティ（regioselectivity）を制御する方法に関する。
更に、本発明はこの方法によって生産された生成物の使
用に関する。 近年、種々の複合糖質（特に、糖たんぱく質および糖
脂質）のオリゴ糖部分が、体中で多くの重要な機能を果
たすことが見出されている（Biology of Carbohydrat
es,Vol.2,Ginsburg et al,Wiley,New York（1984）;
S.Hakomori,Ann.Rev.Biochem.,Vol.50,pp.733−64）。
中でも、次のような知見が得られている。 ・糖たんぱく質の安定性、活性、局在化（localisatio
n）および分解に対して、糖構造が重要である。 ・一定のオリゴ糖構造は植物の抗菌物質の分泌を活性化
する。 ・複合糖質はしばしば種々の細胞の表面に見出され、特
に周囲との細胞相互作用に対して重要である。というの
は、 ・複合糖質は、例えば、ペプチド、ホルモン、トキシ
ン、ウイルスおよび細菌などが細胞表面に結合すると
き、また、細胞−細胞相互作用の間、レセプターまたは
レギュレーターとして機能するからであり、かつ、 ・複合糖質が抗原決定基（例えば、血液型抗原）である
からであり、かつ、 ・複合糖質が、正常な組織発達の間、細胞分化抗原とし
て機能するからであり、かつ、 ・特定のオリゴ糖ががんに関連した抗原決定基であるこ
とが見出されているので、複合糖質が発がんに対して重
要であるからであり、かつ、 ・複合糖質が、精子−卵相互作用および受精に対して重
要であるからである。 今日、種々の複合糖質に包含される非常に多数のオリ
ゴ糖構造が確認されており、また、既知のオリゴ糖の生
物活性に必須の最小単位（しばしば２糖または３糖であ
る）も多くの場合に決定されている。その結果、現在大
学および企業において、生物学的に活性なオリゴ糖を次
のような多数の異なる分野に応用する研究が行われてい
る。 ・新規な診断法および血液型試薬の開発 ・アフィニティクロマトグラフィーのための高度に特異
的な物質の合成 ・単一クローン性抗体の開発 ・細胞特異性凝集反応試薬の生産 ・薬物を内包し、その表面に特定のオリゴ糖を担う微小
球（microsphere）（１μｍ未満）を使用するいわゆる
薬物標的（drug targeting）による新規な治療法の開
発 ・細菌およびウイルスの細胞表面への付着を特定のオリ
ゴ糖によって阻害する、抗生物質に代わる新規な型の治
療法の開発 ・植物の成長促進および病原体に対する保護 上記の分野以外にも、生物学的に活性な糖質に基づく
ファインケミカルズに対して、将来の広範な市場が想定
される。 複合糖質の糖部分にはわずかに10種ほどの単糖が含ま
れる。これらは、すなわち、Ｄ−グルコース（Glc）、
Ｄ−ガラクトース（Gal）、Ｄ−マンノース（Man）、Ｌ
−フコース（Fuc）、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトース
アミン（GalNAc）、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコース
アミン（GlcNAc）、Ｎ−アセチル−Ｄ−ノイラミン酸
（NeuAc）、Ｄ−アラビノース（Ara）およびＤ−キシロ
ース（Xyl）である（かっこ中の略称は、IUPAC−IUBの
単糖に対する略語に従った。J.Biol.Chem.,Vol.257,pp.
3347−3354（1982））。しかし、アノマー配置（ｈまた
はＨ）とＯ−グリコシド結合の位置の両方を変化させる
ことができるので、可能な組合せの数はほとんど無限に
大きい。その結果、通常の有機化学合成によるオリゴ糖
合成には多くの困難がある。これらの化合物に対して用
いる有機化学技術は、合成の多くの段階において広範な
保護基化学を必要とし、従って、しばしば全収率が低下
する。そのために、このような技術を使用する工業生産
は通常不利である。 酵素は、高いレジオセレクティビティおよびステレオ
セレクティビティ、並びに緩和な条件下での高い触媒効
率などの多くの優れた特性を有する天然の触媒である。
そのために、今日、有機化学法より少ない合成段階で、
従って、より高い全収率でオリゴ糖を選択的に大量合成
するための酵素利用に大きな期待が寄せられている。 酵素触媒によるオリゴ糖合成が多数の文献に開示され
ている（K.Nisizawa et al,in“The Carbohydrates,
Chemistry and Biochemistry,2nd Ed.,Vol.II A,pp.
242−290,Academic press,New York（1970））。加水
分解酵素（グリコシダーゼ、EC No.3.2）と転移酵素
（EC No.2.4）の両方が使用され、中でも特に加水分解
酵素がオリゴ糖合成に使用されてきた。この型の酵素を
用いてグリコシド合成を行うために、次の二つの方法が
利用された。つまり、逆加水分解（縮合または平衡技
術）および糖転移（速度論的技術）である。 （式中、DOHは供与体糖、DORはα−またはβ−グリコシ
ド結合アグリコン（＝Ｒ）を有する供与体糖、HOAは受
容体糖、EHは酵素である） 生成物が不活性である場合、または、水濃度を低める
ために反応を有機溶媒を用いて行うことができる場合に
は、逆加水分解は高収率を与える。糖転移に関しては、
フェニルグリコシドまたはニトロフェニルグリコシド
（式（２）においてＲ＝フェニル、ニトロフェニル）な
どの供与体物質に対する高い酵素活性が、高い生成物収
率を得るために利用されてきた。 たとえこれらの技術が多くの場合に完全に有効である
ことが証明されるとしても、供与体物質が受容体物質の
望ましい位置にＯ−グリコシド結合するように、反応を
制御することは依然として困難である。通常、１−６結
合（つまり、受容体糖の第１の水酸基に対する結合）が
形成されてきたが、複合糖質に最もしばしば見られる１
−２、１−３および１−４結合は形成されないか、また
は、わずかな程度しか形成されなかった。更に、従来技
術では、還元末端（reducing end）がグリコシド化さ
れず、生成物溶液中でα−アノマーおよびβ−アノマー
の両者として存在するために、容易に精製できない異性
体生成物の混合物がしばしば形成される。また、従来技
術は、生成物をたんぱく質や脂質などに結合させる前
に、更に化学修飾する必要があった。 本発明の目的の一つは、従来の酵素技術の不利な点を
取除くまたは減少させることである。特に、供与体と受
容体との間の望ましい結合が、制御のない場合よりも高
い制度で形成されるように、糖質の酵素合成におけるレ
ジオセレクティビティを制御するための手段を提供する
ことを目的としている。本発明の他の特定の目的は、生
成物の精製を容易にし、かつオリゴ糖の興味ある配糖体
の直接合成を容易にすることである。 従って、本発明は、複合糖質の糖部分からなるオリゴ
糖化合物、または、その糖部分の断片であるオリゴ糖化
合物、または、その糖部分の類似体であるオリゴ糖化合
物のいずれかを、逆加水分解または糖転移によって酵素
的に生産するにあたり、グリコシル供与体とグリコシル
受容体との間に形成されるグリコシド結合のレジオセレ
クティビティを制御する方法に関する。この方法は、単
糖またはオリゴ糖、または単糖かオリゴ糖の配糖体であ
る供与体物質を、単糖またはオリゴ糖または糖類似体
と、１位でＯ−、Ｎ−、Ｃ−またはＳ−グリコシド結合
した少なくとも一つのアグリコンとからなるＯ−、Ｎ
−、Ｃ−またはＳ−配糖体である受容体物質と、グリコ
シダーゼの存在下で反応させ、かつ、ここで、受容体物
質中のグリコシル基とアグリコンとの間のグリコシド結
合に関してα−またはβ−配置が選択されることと、こ
のオリゴ糖化合物が反応混合物から分離されることとを
特徴とする。 本発明の方法に用いられる受容体物質は、式HOAR
2（式中、R2はグリコシド結合した無機物質または有機
物質である、つまり、R2はアグリコン（糖でない）であ
る）を有する単糖またはオリゴ糖の配糖体またはその類
似体である。本発明の方法による生成物はDOAR2と表さ
れる。これは、Ｄ（α１−Ｘ）Ａ（α）R2、 Ｄ（α１−Ｘ）Ａ（β）R2、 Ｄ（β１−Ｘ）Ａ（α）R2および Ｄ（β１−Ｘ）Ａ（β）R2の型の化合物を表わす（式
中、Ｄは単糖またはオリゴ糖、Ａは単糖またはオリゴ糖
またはその類似体、Ｘは２、３、４または６であり、α
およびβは、それぞれ、ＤとＡの間のＯ−グリコシド結
合の立体配置およびＡとR2の間のＯ−、Ｎ−、Ｓ−また
はＣ−グリコシド結合の立体配置である）。この型の物
質には、例えば、Gal（α１−３）Gal（α）−OMe、Gal
（α１−３）Gal（β）−OMe、GlcNAc（β１−６）Man
（α）−OMeおよびMan（α１−２）Man（α）−OMeなど
がある（略称は、IUPAC−IUBが勧める単糖に対する略語
に従った。J.Biol.Chem.,Vol.257,pp.3347−3354（198
2））。 本発明の方法では逆加水分解および糖転移のそれぞれ
の反応式は次のように表される。 従来の反応と本発明による反応との相違は、反応
（１）および（２）で使用される受容体物質がHOA型の
物質、つまり１位が誘導化されていない物質であるのに
対し、本発明では、１位が誘導化されている受容体物
質、つまりHOAR2型の受容体物質を使用することであ
る。従って、従来の生成物がDOA型であったのに対し、
本発明の方法による生成物はDOAR2型である。 一方、供与体物質は、合成されるオリゴ糖と、合成が
逆加水分解により行われるかまたは糖転移により行われ
るかとに関して選択される。従って、供与体は、還元末
端がグリコシド結合有機物質を用いて誘導化されている
かまたは誘導化されていない単糖またはオリゴ糖であっ
てもよい。有機物質は、脂肪族、芳香族、ヘテロ環など
でよく、かつα−またはβ−配置でＤ（DOR、式（２）
を参照）の１位にグリコシド結合していてよい。本発明
で使用できる誘導化された供与体物質は、例えば、メチ
ル、CH2（CH2）ｎ（ｎ＞０）、フェニル、ｐ−ニトロフ
ェニル、ｏ−ニトロフェニル、４−メチルウンベリフェ
リル（umbelliferyl）グリコシドなどである。この型の
供与体物質の多くは市販されている。市販されていない
場合にも、有機合成または酵素合成によって容易に合成
できるので、本発明の利用を制限することはない。有用
なオリゴ糖は、例えば、ラクトース、ラフィノース（ra
ffinose）、チトビオース（chitobiose）およびジマン
ノシドなどである。種々の型のアルキル配糖体またはア
リール配糖体に対して活性な種々のグリコシダーゼは文
献に完全に記述されているので、当業者はそれぞれの場
合の要求を満たす適切な官能基Ｒを困難なく選択するこ
とができる。 酵素は、それぞれの特定の場合の要求に従って、主に
どのオリゴ糖を合成するかに関して選択される。例え
ば、α−グリコシド結合の合成にはα−グリコシダーゼ
が必要であり、β−グリコシド結合の合成にはβ−グリ
コシダーゼが必要である。好ましい酵素は、EC3.2群の
エンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼであ
る。本発明で使用できる酵素は、例えば次のα−および
β−グリコシダーゼである。つまり、Ｄ−マンノシダー
ゼ、Ｄ−ガラクトシダーゼ、Ｌ−フコシダーゼ、ノイラ
ミニダーゼ、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニダーゼ、
Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニダーゼ、キシロシダ
ーゼ、ヘキサミニダーゼおよびEC3.2群の他のグリコシ
ダーゼである（Enzyme Nomenclature,Academic Pres
s,pp.1−606,New York（1979）;Enzyme,3rd Ed.,Dixo
n et al,Longman（1979））。 使用する酵素の精製の程度は重要ではない。酵素は、
そのままでまたはその天然の生物学的環境から完全にま
たは部分的に単離した後に使用できる。完全な（intac
t）細胞または凍結乾燥した細胞並びに多少精製した酵
素を使用できる。酵素は、結晶形で存在してもよく、ま
たはミセル中に内包されていてもよい。種々の型の細胞
に由来する非常に多くのグリコシダーゼが市販されてい
る。その上に、興味あるグリコシダーゼの精製と単離に
関しては、生化学文献に詳細な情報が非常に豊富に記載
されている。 酵素は可溶な形で使用でき、あるいは、沈澱、吸着、
内包、キレート化またはポリマー物質またはプロトン性
溶媒や非プロトン性溶媒に不溶なその誘導体などの固相
への共有結合によって、固定化することもできる（Meth
ods in Enzymology,Vol.44,Academic Press,（197
6））。選択された形は本発明にとっては重要ではな
い。酵素を可溶な形で使用する場合は、例えば上昇温度
または有機共溶媒（organic cosolvent）に対する安定
性を増加させるために、酵素をまず適当な方法で化学修
飾することができる。例えば、アガロース、セルロー
ス、ヒドロキシエチルアクリレート、ガラス、シリカ、
ポリアクリルアミド、ポリアクリレートに基づく可塑物
などを包含する不溶性ポリマーに固定化された酵素は、
生成混合物から容易に分離でき、従って、酵素を再使用
することができる。更に、多くの場合に上昇温度と有機
共溶媒に対する一定の安定化が得られるという利点があ
る。 受容体物質の選択は合成を希望するオリゴ糖によって
決定される。供与体物質中に含まれるものと同じ型の単
糖を、受容体中に含むことができる。これらは、好まし
くは、Glc、Gal、Man、Fuc、Xyl、Ara、GlcNAc、GalNAc
およびNeuAcのうちの一つまたはそれ以上である（略称
はIUPAC−IUBの推薦によった。前記参照）。受容体物質
は１位をＯ−、Ｎ−、Ｃ−またはＳ−グリコシド結合さ
れた少なくとも一つのアグリコンによって誘導化され
る。 本発明によれば、受容体物質は１位以外の一つまたは
それ以上の位置を誘導化された糖からなっていてもよ
い。そのような誘導化は、例えば、一つまたはそれ以上
の水酸基が水素または有機官能基によって置換されるこ
とを意味する。そのような受容体物質の一つの例は、ｐ
−ニトロフェニル−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピ
ラノシドである。糖誘導体のもう一つの重要な型は、環
の酸素（即ち、ヘキソースではＣ−５酸素）が窒素、イ
オウなどで置換された物質である。そのような誘導体の
一つの例は、Ｃ−５酸素が窒素によって置換されたグリ
コース類似モラノリン（moranolin）である。酵素また
は糖質結合たんぱく質に対する有効な阻害剤であるオリ
ゴ糖類似体は、この方法で本発明によって合成される。 HOAR2のアグリコンR2は種々の型のものでよく、その
選択は、それぞれの特定の場合に何を要求し望むかによ
って決定される。R2は無機物質でもよいが、上記のすべ
てのR2が種々の型の有機物質であってもよい（脂肪族、
芳香族、ヘテロ環、ヘテロ芳香族またはその変形）。R2
は、受容体糖に対してＯ−、Ｎ−、Ｓ−またはＣ−グリ
コシド結合されていることができる。適当な有機アグリ
コンの例として、メチル基またはエチル基などのCH3（C
H2）ｎ基；フェニル基、ｐ−ニトロフェニル基およびｏ
−ニトロフェニル基;2−ブロモエチル基、トリメチルシ
リルエチル基またはCH2＝Ｃ（CH3）−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−CH
2CH2基などを挙げることができる。また、アグリコンは
アミノ基、ニトリル基またはアミド基、または、発蛍光
（fluorogenic）物質でもよく、あるいは、フォスフェ
ート、サルフェートまたはカルボキシル基、またはその
誘導体を含むこともできる。 受容体物質としてアルキル配糖体（メチルグリコシ
ド、オクチルグリコシド、ドデシルグリコシドなど）を
用いて得られた生成物は、凝集試験またはアフィニティ
ークロマトグラフィーにおいて阻害剤として使用でき
る。また、阻害に基づいた治療や薬物標的に対しても使
用でき、更に、連続酵素合成または連続有機合成の構造
単位などとしても使用できる。ニトロフェニルグリコシ
ドは、例えばPd/Cを用いて簡単にアミノフェニルグリコ
シドに還元でき、このアミノフェニルグリコシドは、直
接にまたは化学修飾の後、種々のポリマー（デキストラ
ン、ポリエチレングリコール、アガロース、セルロー
ス、シリカなど）並びにペプチド、たんぱく質、酵素、
脂質またはその類似体などに対して共有結合させること
ができる（Methods in Enzymology,Academic Press,
Vols.34,44,50 and 104）。更に、アミノ基は、イソ
チオシアネート、ジアゾ、Ｎ−ブロモアセテートなどの
幾つかの他の反応性の官能基に容易に変換できる。直接
にまたは化学修飾の後、アミノフェニル基について上に
述べた方法においていわゆるスペーサーアーム（Method
s in Enzymology,Vol.34,Academic Press）として使
用でき、かつ本発明によるアグリコン（R2基）として有
用な他の基は、例えば、２−ブロモエチル基、２−（２
−カルボメトキシエチルチオ）エチル基、２−アミノエ
チル基および６−アミノヘキシル基、またはそれらの誘
導体などである。また、２−ヒドロキシエチルメタクリ
レートなどの重合可能なアグリコンを有する配糖体も受
容体物質として使用できる。Ｎ−グリコシド結合したア
グリコンの例として、６−アミノカプロン酸アミド（−
NHCO（CH2）NH2）を挙げることができる。 他の型の配糖体にトリメチルシリルエチル配糖体があ
る。この配糖体は、アノマー配置を保持したままトリメ
チルシリル基をアセチル基によって置換できるので興味
深い（K.Jansson et al,Tetrahedron Lett.,27（198
6）,753−756）。従って、一つの酵素工程によって、同
じオリゴ糖配列の多数の配糖体を合成することができ
る。アリルグリコシドおよびベンジルグリコシドは容易
に遊離の糖へ変換することができる。アリル基は、例え
ば、70℃でKotBu/DMSO処理した後、HgCl2・HgO/アセト
ン処理することによって容易に除去できる。ベンジル基
はPd/C処理によって容易に除去できる。アリルグリコシ
ドは対応する2,3−エポキシプロピルグリコシドに変換
できる（E.Falent−Kwast et al,Carbohydrate Re
s.,145（1986）,pp.332−340）。遊離の還元末端を有す
るオリゴ糖配列はこのように合成できる。 特別に興味ある他のアグリコンには、アミノ酸（セリ
ン、トレオニン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジ
ン、アスパラギンなど）、ペプチド脂質および、これら
の３群に属する物質の誘導体または類似体がある。アミ
ノ酸配糖体およびペプチド配糖体は、ペプチド合成に通
常利用される官能基（FMOC、CBZ、BOCなど）によって、
アミノ基および／またはカルボキシル基を保護できる。
本発明によれば、複合糖質の断片または類似体をこれら
のアグリコンを用いて合成することができる。 上述のように、受容体物質の望ましい位置をグリコシ
ド置換するように合成を制御できることは、本発明によ
る合成方法の重要な利点である。その結果として、従来
の方法を用いるより高い割合で望ましいオリゴ糖異性体
を形成できる。更に、アグリコンの選択と、受容体物質
の糖部分へのグリコシド結合の立体配置とに応じて、同
じ酵素が異なる異性体の合成を異なる程度に触媒すると
いう利点がある。 本発明による方法では、生成物の還元末端のアノマー
炭素における異性化の問題が除かれるので、生成物の精
製も多くの場合に非常に容易となる。 更に他の利点は、興味あるファインケミカルズが本発
明の方法を用いて合成できることである。直接にまたは
化学修飾の後、例えば、重合、固体担体への固定化、酵
素やたんぱく質に対する結合などに対して使用できる物
質を得ることができる。アミノ酸、ペプチドまたは脂質
誘導体をアグリコンとして使用できるので、糖ペプチド
や糖脂質およびその類似体の合成も本発明の方法によっ
て非常に容易となる。 本発明による合成方法は、例えば、温度、pH、緩衝液
および反応体濃度などに関して、高度に多様な条件下で
行うことができる。種々の共溶媒（N,N−ジメチルホル
ムアミド、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジ
オキサン、ピリジン、メタノール、エタノール、エチレ
ングリコールなど）が使用でき、種々の濃度の水溶液と
しても使用できる。加えて、反応は２相系、水−有機溶
媒（シクロヘキサン、クロロホルム、塩化メチレンな
ど）中で行うことができる。更に、酵素を逆ミセルに内
包することもできる（P.Luisi,Angew.Chem.,Vol.97,pp.
449−60（1985））。反応は沈澱させた酵素を用いて純
粋な有機溶媒中で行うこともできる（Kazandjian et
al,J.Amer.Chem.Soc.,Vol.107,（1985））。反応条件は
重要でないが、主にその合成に含まれる反応体の性質に
基づいて、更に実際的な理由を考慮して選択する。例え
ば、酵素に関しては、室温で、しかも水性の媒質の場合
には４〜11の範囲のpHで、作用させることがしばしば適
切であることが挙げられる。酵素の最適pHよりいくらか
高いpHを用いることによって、しばしばより高い生成物
収率が得られることが見出されている。コーヒーマメ由
来のα−ガラクトシダーゼおよびタチナタマメ由来のα
−マンノシダーゼに対してはpH6.5〜7.5が使用された。
一方、大腸菌（E.coli）のβ−ガラクトシダーゼに対し
てはわずかに高いpHが好ましい。適切な緩衝塩は、例え
ば、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、リン酸カリウムま
たはリン酸ナトリウムなどである。 有機共溶媒は加水分解反応を最小化するために使用さ
れる。同じ理由で、２相系を使用できる。しかし、ある
場合には水を唯一の溶媒として用いる場合に、かなり高
い収率が得られることが知られている。これは、例え
ば、コーヒーマメ由来のα−ガラクトシダーゼを用いる
Gal（α１−３）Gal（α）−OMeおよびGal（α１−３）
Gal（α）−OC6H4−NO2−ｐの合成の場合などである。 生成物収率と酵素安定性を変えるために温度を変化さ
せることもできる。最もしばしば用いられる温度は５〜
55℃の範囲であるが、熱安定性グリコシダーゼに対し
て、あるいは、例えば高基質濃度を用いて熱変性に対し
て安定化された酵素（E.Johansson et al,Biotechno
l.Lett.,8（1986）pp.421−424）に対しては、より高い
温度を使用できる。高温の利点の一つは、高基質濃度を
利用でき、それによって水活性が減少され高い生成物収
率が得られることである。その上に、高温では酵素活性
が増加し、そのために反応時間が短縮されるという利点
があり、これが更に、メチルグリコシドまたはエチルグ
リコシドなどの室温で比較的遅く加水分解される配糖体
が高温（50〜60℃）ではグリコシル供与体として有利に
使用できるという利点をもたらす。上限温度は反応媒質
中の酵素の熱安定性によって決定される。ある糖転移に
関しては、より低い温度がより高い収率の生成配糖体を
与えることが見出された。コーヒーマメ由来のα−ガラ
クトシダーゼを用い、供与体の初濃度を0.15M、受容体
の初濃度を0.45Mとし、それぞれ20、40、50℃で反応を
行った場合、20℃でGal（α１−３）Gal（α）−OMeの
最大収率が得られた。 通常は、生成配糖体の収率を最大にするために、供与
体および受容体基質の飽和溶液が使用される。これは、
室温で水を溶媒として、ｐ−ニトロフェニルグリコシド
の0.05〜0.2モル溶液、メチルグリコシドの0.3〜0.6モ
ル溶液を意味する。メタノール、N,N−ジメチルホルム
アミドなどの共溶媒を、例えばｐ−ニトロフェニルグリ
コシドなどの疎水性アグリコンを有する配糖体の溶解度
を増加させるために使用できる。反応はTLC、HPLCによ
って、または放出されたアグリコンの分光測定によって
（例えばｐ−ニトロフェノールでは400nm）追跡でき
る。生成配糖体の最大収率が達成されたときには、pH変
化、温度上昇および／または有機共溶液（エタノールな
ど）の添加により酵素を変性させることによって反応を
中断させる。通常は、80〜85℃で３〜５分間加熱し、そ
の後、約80％の濃度までエタノールを添加することで十
分である。 生成物の精製には種々の技術が使用できる。例えば、
溶出液として塩化メチレン：メタノール：水（例えば6:
4:1 v/v/v）を用い、固相としてシリカを用い、そこ
で、低圧での乾燥後の部分的に精製した生成配糖体を無
水酢酸とピリジン（例えば1:1 v/v）を用いてアセチル
化するカラムクロマトグラフィーが有効である。更にカ
ラムクロマトグラフィーの工程（シリカ、溶出液は例え
ば酢酸エチル：イソオクタン）を行うことによって、通
常は純粋なアセチル化生成物が得られる。触媒量のナト
リウム メトキシドを用いる乾燥MeOH中の脱アセチル化
によって、しばしば結晶形の生成配糖体が得られる。顕
著に疎水性のアグリコン（例えば、Gal（α１−３）Gal
（α）−OC6H4−NO2−ｐ）を有する生成物の精製は、製
造的な（preparative）HPLC装置とC18シリカを用いてし
ばしば１工程で行うことができる。本発明による合成方
法は、糖たんぱく質または糖脂質に含まれるオリゴ糖配
列の合成に一般に適用できる（Biology of Carbohydr
ates,Vol.2（1984）,V.Ginsburg and P.W.Robbins,ed
s.Wiley ＆ Sons,New York;The Glycoconjugates,V
ol.I−V,Academic Press,New York;S.Hakomori,Ann.R
ev.Biochem.,Vol.50,pp.733−64（1981））。 特に興味深いのは、生物学的情報を転移するためには
十分であるこれらの構造の最小断片である。このような
構造の重要性の例として、血液型決定基、微生物に対す
る特異的レセプター（Gal（α１−３）Galα−、大腸菌
K88;ClcNac（β１−３）Galβ−、肺炎双球菌（S.pne
umoniae）;Gal（α１−４）Galβ−、ｐ−線毛大腸菌
（ｐ−fimbriated E.coli）など）、分化抗原ｉ、Ｉ、
CO514、38.13などを挙げることができる（Nature,Vol.3
14,pp.53−57（1985）のT.Feiziによる総説中の第１表
および第２表を参照）。 例えば、「成熟」アスパラギン結合オリゴ糖の３つの
クラス、即ち、（ａ）高マンノース型、（ｂ）複合型、
（ｃ）雑種型を代表する次のＮ−結合オリゴ糖中に含ま
れるオリゴ糖配列を生産できる（Biology of Carbohy
drates,Vol.2,（1984）,V.Ginsburg and P.W.Robbin
s,eds.Wiley ＆ Sons,New Yorkを参照）。 次のＯ−結合オリゴ糖構造中に含まれるオリゴ糖配列
を生産できる（Biology of Carbohydrates,Vol.2（19
84）,Wiley ＆ Sons.New Yorkを参照）。 更に、次の構造またはその断片が本発明によって製造
できる（S.Hakomori,Ann.Rev.Biochem.,Vol.5,p.739（1
981）を参照）。 次の表に，本発明によって全体または部分を生産でき
ることが示唆される微生物およびトキシンに対する幾つ
かのレセプター構造を示す。表中の参照文献 〔ａ）N.Firon,I.Ofek and W.Sharon,Infect.Immun.,4
3,1984,p.1088;E.H.Beachey（ed）Bact.Adherence,Rece
ptors and Recognition,Vol.8,Chapman and Hall,N.Y.,
1980. ｂ）H.Leffler and C.Svanborg−Ed′en,FEMS Microbio
l.Letters 8,1980,p.127;G.Kallenius,R.Mllby,S.B.S
vensson,J.Winberg,A.Lundblad,S.Svensson,and B.Cede
rgren,FEMS Microbiol.Letters 7,1980,p.297. ｃ）I.Parkkinen,J.Finne,M.Achtman,V.Vaisnen,and
T.K.Korhonen,Biochem.Biophys.Res.Commun.111,1983,
p.456. ｄ）V.Vaisnen−Rhen,T.K.Korhonen,and J.Finne,FEB
D Lett.159,1983,p.233. ｅ）M.J.Anderson,J.S.Whitehead,and Y.S.Kim,Infect.
and Immun,29,1980,p.897. ｆ）M.Bertolini and W.Pigman,Carbohydr.Res.,14,197
8,p.53. ｇ）J.E.Brown,K.−A.Karlsson,A.Lindberg,N.Strmbe
rg,and J.Thurin in M.A.Chester,D.Heingrd,A.Lundb
lad,and S.Svensson（eds）,Proc.7th Int.Symp.Glycoc
onjugates,Lund,1983,p.678. ｈ）A.Gunnarsson,P.−A.Mrdh,A.Lundblad,S.Svensso
n,Infect.Immun.,45,1984,p.41. ｉ）C.Svanborg−Edn,B.Andersson,L.Hagberg,H.Leff
ler,G.Magnusson,G.Moori,J.Dahmn,and T.Sderstr
m,Ann.N.Y.Acad.Sci.,409,1983,p 560. ｊ）T.Feizi and R.A.Childs,Trends.Biochem.Sci.,10,
1985,p.24. ｋ）G.F.Springer and R.R.Desai,Ann.Clin.Lab.Sci.,1
985,p.294. ｌ）J.Holmgren,Nature,292,1981,p.431.〕 更に、種々のヒト腫瘍中に現われ、腫瘍関連抗原とし
て作用する複合糖質（特に、Feizi,Nature,314（1985）
を参照）中に多数の異なるオリゴ糖の配列も非常に興味
深い。これには次の構造がある。 単糖のフルオロ類似体、ホスホ類似体、アミノ類似体
またはチオ類似体などを含むオリゴ糖配列は、複合糖質
代謝の研究の点から、および可能性としてはがんの化学
療法の点から非常に興味深い（The Glycoconjugates,V
ol.IV（1982）Academic Press）。あるオリゴ糖類似体
は、天然のレセプターよりもレクチンに対してより高い
会合定数を持つことが示された。これについては、糖構
造に基づく感受性の高い診断法および効果的な治療法の
開発の点から非常に興味が持たれる。 上に述べたように非常に多数のアグリコンを使用でき
る。例えば、受容体としてアリルグリコシド、ベンジル
グリコシドまたはトリメチルシリルグリコシドを選ぶこ
とによって、生成配糖体から容易に高収率で遊離の糖を
得ることができる。このように、依然にはグリコシダー
ゼを用いて合成することができなかった遊離のオリゴ糖
構造の酵素合成を、本発明の方法によって行うことがで
きる。 簡単な配糖体（メチルグリコシドなど）を、抗体（Sl
ama et al,Biochemistry,（1980）,19（20）,4595−4
600）およびレクチン（Sharon and Lis,Science（197
2）,177,949−959）を用いる阻害研究に使用することが
できる。発色団または蛍光性のアグリコン（例えば、ｐ
−ニトロフェニル、４−メチルウンベリフェニル）を有
する配糖体を酵素分析に使用することができる（D.E.Sy
kes et al,Carbohydrate Res.,116（1983）127−13
8）。更に、ペプチド、たんぱく質、脂質、クロマトグ
ラフィーの担体などに対する共有結合させるのに適した
配糖体を、本発明の方法によって合成することができ
る。 本発明の実際の具体例を次に示す。しかし、これらは
本発明の技術的範囲を制限するものではない（略称は、
IUPAC−IUBの推薦によった。J.Biol.Chem.Vol.257,pp.3
347−3354（1982））。 例１ Gal（α１−３）Gal（α）−OMe（メチル−３−Ｏ−α
−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド）の合成 A. 1.8gのｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラ
ノシド（Gal（α）−OPhNO2−ｐと18gの１−Ｏ−メチル
−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（Gal（α）−OMe）と
を、110mlの0.05Mリン酸ナトリウム水溶液（pH6.5）と4
0mlのN,N−ジメチルホルムアミド中に溶解した。コーヒ
ーマメ由来のα−ガラクトシダーゼ（α−Ｄ−ガラクト
シド ガラクトヒドロラーゼ;EC3.2.1.22;0.2ml;10単
位、Boehringer）を添加した。室温で７日間放置した
後、反応混合物を80℃で５分間加熱し、生成物をカラム
クロマトグラフィー（シリカ、Kieselgel 60、230〜40
0メッシュ、Merck、クロロホルム:MeOH:H2O、6:4:0.5
v/v/v）によって精製し、無水酢酸とピリジンを用いて
パーアセチル化した。更にカラムクロマトグラフィーの
工程（シリカ、イソオクタン：酢酸エチル、1:1 v/v）
を行い、触媒量のナトリウムメトキシドを用いてMeOH中
で脱アセチル化した後、純粋な結晶Gal（α１−３）Gal
（α）−OMeを得た。生成物をNMR、HPLCを用いて分析し
（純度は99％を超える）、更にメチル化分析を行った。 B. 0.31gのGal（α）−OPhNO2−ｐと0.91gのGal（α）
−OMeとを、10mlの緩衝液（例1Aを参照）に溶解した。
α−ガラクトシダーゼコーヒーマメ、Boehringer,EC3.
2.1.22、５単位）を添加し、反応を室温で72時間継続さ
せた。反応混合物を80℃で５分間加熱し、生成物を例1A
に従って単離した。Gal（α１−３）Gal（α）−OMeの
収量は180mg、つまりGal（α）−OPhNO2−ｐの39％が付
加された。 例２ Gal（α１−３）Gal（β）−OMeとGal（h1−６）Gal
（β）−OMeの合成 0.6gのGal（α）−OPhNO2−ｐと4gのGal（β）−OMe
とを、22mlの0.05Mリン酸ナトリウム水溶液（pH6.5）と
9mlのN,N−ジメチルホルムアミド中に溶解した。コーヒ
ーマメ由来のα−ガラクトシダーゼ（EC3.2.1.22;0.2m
l;10単位）を添加し、反応を室温で90時間継続させた。
生成物を例１に従ってカラムクロマトグラフィーによっ
て精製した。アセチル化した生成物を200MHz NMR
（1H、13C）を用いて分析した。Gal（α１−６）Gal
（β）−OMeの収量は125mg、Gal（α１−３）Gal（β）
−OMeでは65mgであり、つまりそれぞれ16％と８％のGal
（α）−OPhNO2−ｐが付加された。 例３ Gal（α１−２）Gal（α）−OPhNO2−ｐとGal（α１−
３）Gal（α）−OPhNO2−ｐの合成 A. 0.9gのGal（α）−OPhNO2−ｐを、24mlの0.05Mリン
酸ナトリウム水溶液（pH6.5）と8mlのN,N−ジメチルホ
ルムアミド中に溶解した。コーヒーマメ由来のα−ガラ
クトシダーゼ（EC3.2.1.22;0.2ml;10単位）を添加し、
反応を室温で38時間継続させた。生成物をカラムクロマ
トグラフィー（シリカ、セファデックス（Sephadex）
G10）によって分離し、UV（305nm）と200MHz NMR
（1H、13C）を用いて分析し、更にメチル化分析を行っ
た。Gal（α１−３）Gal（α）−OPhNO2−ｐの収量は15
0mg、Gal（α１−２）Gal（α）−OPhNO2−ｐでは25mg
であり、つまりそれぞれ13％と1.7％のGal（α）−OPhN
O2−ｐが付加された。 B. 1.35gのGal（α）−OPhNO2−ｐを、10mlの緩衝液
（例3Aを参照）中に溶解し、コーヒーマメ由来のα−ガ
ラクトシダーゼ（例3Aを参照）を５単位添加した。反応
を50℃で76時間継続させた。反応混合物を80℃で５分間
加熱することによって反応を中断させた。生成物を例3A
に従いカラムクロマトグラフィー（セファデックス G1
0、Pharmacia、および、シリカ、Merck、Kieselgel 6
0、23〜400メッシュ、酢酸エチル：イソプロパノール：
水 6:2:1 v/v/v）によって単離した。Gal（α１−
３）Gal（α）−OPhNO2−ｐとGal（α１−２）Gal
（α）−OPhNO2−ｐの収率はそれぞれ23％（236mg）と
3.5％（36mg）であった。 C. この試験は、トレシル（tresyl）クロリド活性化ア
ガロース（Pharmacia）に固定化したコーヒーマメ由来
のα−ガラクトシダーゼ（K.Nilsson et al,Biochem.
Biophys.Res.Comm.,102（1981）449−457）を用いて、
例3Aに従って行った。0.5g、11単位のα−ガラクトシダ
ーゼ−アガロースを、1.5gのGal（α）−OPhNO2−ｐを2
3mlの緩衝液と10mlのDMFとに溶解した溶液に添加した。
緩やかに攪拌しながら反応を室温で12日間継続させた。
上記に従って反応を終結させ生成物を単離して、160mg
のGal（α１−３）Gal（α）−OPhNO2−ｐを得た。つま
り理論値の14％である。触媒活性がわずかに数パーセン
ト減少するが、固定化したα−ガラクトシダーゼを繰返
して使用することができた。 例４ Gal（α１−２）Gal（α）−OPhNO2−ｏの合成 2gのGal（α）−OPhNO2−ｏを、30mlの緩衝液（例1A
を参照）と14mlのDMFとに溶解した。α−ガラクトシダ
ーゼ（例1Aを参照、20単位）を添加し、反応を室温で53
時間継続させた。反応を終結させ、生成物を例1Aに従っ
て単離し分析した。純粋な結晶Gal（α１−２）Gal
（α）−OPhNO2−ｏの収量は60mgであり、つまり理論収
率の４％であった。 例５ アスペルギルス ニゲル由来のα−ガラクトシダーゼを
用いるGal（α１−３）Gal（α）−OPhNO2−ｐの合成 アスペルギルス ニゲル（Aspergillus niger）由来
のα−ガラクトシダーゼ（EC3.2.1.22）を用いる以外は
例３に従って、合成を行った。この場合、40mgのGal
（α１−３）Gal（α）−OPhNO2−ｐと4mgの異性体生成
物（多分（α１−２）異性体）と痕跡程度（約1mg）の
他の異性体生成物が得られた。これらの異性体は、例3A
に従ってセファデックス G10工程中で分離した。 例６ Man（α１−２）Man（α）−OPhNO2−ｐ（ｐ−ニトロフ
ェニル−２−Ｏ−α−Ｄ−マンノピラノシル−α−Ｄ−
マンノピラノシド）の合成 0.63gのMan（α）−OPhNO2−ｐを、10μＭ ZnCl2で
ある0.05Mリン酸ナトリウム（pH6.5）の33mlに溶解し
た。10mgのN,N−ジメチルホルムアミドを添加した。タ
チナタマメ（Canavalia ensiformis）由来のα−マン
ノシダーゼ（α−Ｄ−マンノシドマンノヒドロラーゼ;E
C3.2.1.24;0.3ml;10単位、Boehringer−Mannheim）を添
加し、反応を室温で６時間、それから冷却室（４℃）で
36時間継続させた。生成物をカラムクロマトグラフィー
（シリカゲル）によって単離し、NMRを用いて分析し更
にメチル化分析を行った。Man（α１−２）Man（α）−
OPhNO2−ｐの収量は36mgであった。NMRによれば生成物
の純度は95％を超えており、残りの異性体の形成は無視
できる程度であった。 例7A Man（α１−２）Man（α）−OMe（メチル−２−Ｏ−α
−Ｄ−マンノピラノシル−α−Ｄ−マンノピラノシド）
とMan（α１−６）Man（α）−OMe（メチル−６−Ｏ−
α−Ｄ−マンノピラノシル−α−Ｄ−マンノピラノシ
ド）の合成 0.6gのｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノピラノシ
ド（Man（α）−OPhNO2−ｐ）と6gの１−Ｏ−メチル−
α−Ｄ−マンノピラノシド（Man（α）−OMe）とを、10
μＭ ZnCl2である0.05Mリン酸ナトリウム水溶液（pH6.
5）の38mlに溶解した。N,N−ジメチルホルムアミドを添
加した。タチナタマメ由来のα−マンノシダーゼ（EC3.
2.1.24;0.3ml;15単位）を添加し、反応を室温で14時間
継続させた。生成物を例１および例２の合成と類似の方
法でシリカカラムによって精製した。生成物をNMR、メ
チル化分析、HPLCを用いて分析した。180mgのMan（α１
−２）Man（α）−OMeと28mgのMan（α１−６）Man
（α）−OMeを得た。つまり、それぞれMan（α）−OPhN
O2pの20％と３％が付加された。 例7B Man（α１−２）Man（α）−OMeとMan（α１−６）Man
（α）−OMeの合成 20gのMan（α）−OMeを、45mlの緩衝液（例7Aを参
照）と5mlのMeOHとに溶解した。α−マンノシダーゼ
（例7Aを参照、50単位）を添加し、反応を55℃で３日間
継続させた。反応を終結させ、生成物を例7Aに従って単
離した。 例８ Man（α１−２）Man（α）−OEtBr（２−ブロモエチル
−２−Ｏ−α−マンノピラノシル−α−Ｄ−マンノピラ
ノシド）の合成 0.9gのMan（α）−OPhNO2−ｐと2.7gの２−ブロモエ
チル−α−Ｄ−マンノピラノシド（Man（α）−OEtBr）
とを、20mlの0.05Mリン酸ナトリウム水溶液（pH6.5）に
溶解した。7mlのN,N−ジメチルホルムアミドを添加し
た。タチナタマメ由来のα−マンノシダーゼ（EC3.2.1.
24;0.3ml;15単位）を添加し、反応を室温で72時間継続
させた。生成物を例7Aに従って精製した。生成物をNMR
（200MHz;1H、13C）によって分析した。200mgのMan（α
１−２）Man（α）−OEtBrと約30mgの未帰属異性体生成
物（多分（α１−６）異性体）とを得た。 例９ Man（α１−２）Man（α１−２）Man（α）−OMeの合成 この物質は、20gのMan（α）−OPhNO2−ｐと45gのMan
（α）−OMeとから、1ml（50単位）のタチナタマメ由来
のα−マンノシダーゼ（EC3.2.1.24）を用い、他は例7A
による条件下でのMan（α１−２）Man（α）−OMeとMan
（α１−６）Man（α）−OMeの大量合成の副生成物とし
て形成された。生成物は、カラムクロマトグラフィー
（セファデックス G10、シリカ）によって２糖分画か
ら分離した。アセチル化した生成物を、カラムクロマト
グラフィー（シリカ）によって異性体生成物（全量の約
35％）から分離した。250mgのアセチル化Man（α１−
２）Man（α１−２）Man（α）−OMeを得た。生成物をN
MR（200MHz;1H、13C）によって分析し、更にメチル化分
析を行った。 例10 Gal（β１−３）Gal（β）−OMe（メチル−３−Ｏ−β
−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−Ｄ−マンノピラノシ
ド）の合成 A. 2.7gのｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシド（Gal（β）−OPhNO2−ｏ）と5gのGal（β）−OM
eとを、1mM MgCl2および10mMメルカプトエタノールで
ある0.05Mリン酸ナトリウム水溶液（pH6.8）の35mlに溶
解した。15mlのN,N−ジメチルホルムアミドを添加し
た。大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−ガラ
クトシド ガラクトヒドロラーゼ;EC3.2.1.23;100単位;
Sigma Laboratories）を添加し、反応を室温で24時間
継続させた。生成物をカラムクロマトグラフィー（シリ
カおよびセファデックス G10）によって分離した。ア
セチル化とシリカカラムでのクロマトグラフィーの後、
1.3gのアセチル化Gal（β１−３）Gal（β）−OMeと160
mgのGal（β１−６）Gal（β）−OMe（アセチル化）を
得た。分析は200MHz NMR（1H、13C）を用いて行った。 B. この試験は例10Aと類似しているが、9.0gのGal
（β）−OPhNO2−ｏと、15gのGal（β）−OMeと、トレ
シルアガロース（例3Cを参照）に固定化した大腸菌由来
のβ−ガラクトシダーゼとを用いた。このグリコシダー
ゼを、105mlの緩衝液（例10Aを参照）と45mlのDMFに溶
解した。β−ガラクトシダーゼ−アガロース（0.2g、30
0単位）を添加し、緩やかに攪拌しながら反応を室温で
４日間継続させた。生成物を例10Aに従って単離し、分
析した。MeOHから再結晶させたGal（β１−３）Gal
（β）−OMeの収量は4g（29％）であり、Gal（β１−
６）Gal（β）−OMeでは400mg（３％）であった。 例11 Gal（β１−６）Gal（α）−OMeの製造 この試験は例10Aと類似しているが、2.7gのGal（β）
−OPhNO2−ｏと、5gのGal（α）−OMeと、大腸菌由来の
1.0gのβ−ガラクトシダーゼ（例10Aを参照）を35mlの
緩衝液（例10Aを参照）と15mlのDMFとに溶解した溶液と
を用いた。室温で５時間反応させた後、生成物を例10に
従って単離し分析した。結晶Gal（β１−６）Gal（β）
−OMeの収量は450mgであった。他の異性体の形成は無視
できる程度であった。 例12 Gal（β１−３）Gal−OCH2CH2OC（Ｏ）Ｃ（CH3）＝CH2
とGal（β）−OCH2CH2OC（Ｏ）Ｃ（CH3）＝CH2の１容器
合成 この例は受容体配糖体自身の製造の説明である。18g
のラクトースを、160mlの緩衝液（例10を参照）と75ml
のDMFと15mlのヒドロキシエチルメタクリレートとの混
合物中に溶解した。β−ガラクトシダーゼ−アガロース
（1.5g、2250単位、例10Bを参照）を添加し、緩やかに
攪拌しながら反応を室温で継続させた。６日後、固定化
酵素をろ別し、生成物をカラムクロマトグラフィーによ
って単離した。2.6gのGal（β）−OCH2CH2OC（Ｏ）Ｃ
（CH3）＝CH2と160mgのGal（β１−３）Gal−OCH2CH2OC
（Ｏ）Ｃ（CH3）＝CH2を得た。 例13 Gal（β１−３）GlcNAc（β）−OCH2CH2Si（Me）３の合
成 6gのGal（β）−OPhNO2−ｏと1gのGlcNAc（β）−Ｏ
（CH2）2Si（CH3）３とを、10gのウシ精巣から得た抽出
物の上清を含む30mlの0.1Mリン酸ナトリウム（pH7.0）
中に懸濁した。反応を40℃で２日間継続させた。反応を
終結させ、生成物を例10Aに従ってカラムクロマトグラ
フィーによって単離した。脱アセチル化後のGal（β１
−３）GlcNAc（β）−Ｏ（CH2）2Si（CH3）３の収量は2
00mgであった。 例14 GlcNAc（β１−６）Man（α）−OMeの合成 3gのGlcNAc（β）−OPhNO2−ｐ（ｐ−ニトロフェニル
−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド）と16gのMan
（α）−OMeとを、88mlの緩衝液（例1Aを参照）と12ml
のDMFに溶解した。Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミ
ニダーゼ（タチナタマメ;EC3.2.1.30;20単位、0.3ml、S
igma Laboratories）を添加し、反応を室温で３日間継
続させた。反応を終結させ、生成物を例1Aに従って単離
し分析した。純粋な結晶GlcNAc（β１−６）Man（α）
−OMeの収量は350mgであった。 例15 Fuc（α１−３）Gal（α）−OMeの合成 0.31gのｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコピラノシ
ド（Fuc（α）−OPhNO2）と3gのGal（α）−OMeとを、2
5mlの緩衝液（0.05Mリン酸ナトリウム、pH6.2）に溶解
した。α−Ｌ−フコシダーゼ（ウシ腎臓;EC3.2.1.51;0.
3ml、１単位、Sigma Laboratories）を添加し、反応を
37℃で２日間継続させた。反応を中断させ、生成物を例
1Aに従って単離し分析した。パーアセチル化Fuc（α１
−３）Gal（α）−OMeの収量は35mgであった。
物、または、その糖部分の断片であるオリゴ糖化合物、
または、その糖部分の類似体であるオリゴ糖化合物のい
ずれかを、逆加水分解または糖転移によって酵素的に生
産するにあたり、グリコシル供与体とグリコシル受容体
との間に形成されるグリコシド結合のレジオセレクティ
ビティ（regioselectivity）を制御する方法に関する。
更に、本発明はこの方法によって生産された生成物の使
用に関する。 近年、種々の複合糖質（特に、糖たんぱく質および糖
脂質）のオリゴ糖部分が、体中で多くの重要な機能を果
たすことが見出されている（Biology of Carbohydrat
es,Vol.2,Ginsburg et al,Wiley,New York（1984）;
S.Hakomori,Ann.Rev.Biochem.,Vol.50,pp.733−64）。
中でも、次のような知見が得られている。 ・糖たんぱく質の安定性、活性、局在化（localisatio
n）および分解に対して、糖構造が重要である。 ・一定のオリゴ糖構造は植物の抗菌物質の分泌を活性化
する。 ・複合糖質はしばしば種々の細胞の表面に見出され、特
に周囲との細胞相互作用に対して重要である。というの
は、 ・複合糖質は、例えば、ペプチド、ホルモン、トキシ
ン、ウイルスおよび細菌などが細胞表面に結合すると
き、また、細胞−細胞相互作用の間、レセプターまたは
レギュレーターとして機能するからであり、かつ、 ・複合糖質が抗原決定基（例えば、血液型抗原）である
からであり、かつ、 ・複合糖質が、正常な組織発達の間、細胞分化抗原とし
て機能するからであり、かつ、 ・特定のオリゴ糖ががんに関連した抗原決定基であるこ
とが見出されているので、複合糖質が発がんに対して重
要であるからであり、かつ、 ・複合糖質が、精子−卵相互作用および受精に対して重
要であるからである。 今日、種々の複合糖質に包含される非常に多数のオリ
ゴ糖構造が確認されており、また、既知のオリゴ糖の生
物活性に必須の最小単位（しばしば２糖または３糖であ
る）も多くの場合に決定されている。その結果、現在大
学および企業において、生物学的に活性なオリゴ糖を次
のような多数の異なる分野に応用する研究が行われてい
る。 ・新規な診断法および血液型試薬の開発 ・アフィニティクロマトグラフィーのための高度に特異
的な物質の合成 ・単一クローン性抗体の開発 ・細胞特異性凝集反応試薬の生産 ・薬物を内包し、その表面に特定のオリゴ糖を担う微小
球（microsphere）（１μｍ未満）を使用するいわゆる
薬物標的（drug targeting）による新規な治療法の開
発 ・細菌およびウイルスの細胞表面への付着を特定のオリ
ゴ糖によって阻害する、抗生物質に代わる新規な型の治
療法の開発 ・植物の成長促進および病原体に対する保護 上記の分野以外にも、生物学的に活性な糖質に基づく
ファインケミカルズに対して、将来の広範な市場が想定
される。 複合糖質の糖部分にはわずかに10種ほどの単糖が含ま
れる。これらは、すなわち、Ｄ−グルコース（Glc）、
Ｄ−ガラクトース（Gal）、Ｄ−マンノース（Man）、Ｌ
−フコース（Fuc）、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトース
アミン（GalNAc）、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコース
アミン（GlcNAc）、Ｎ−アセチル−Ｄ−ノイラミン酸
（NeuAc）、Ｄ−アラビノース（Ara）およびＤ−キシロ
ース（Xyl）である（かっこ中の略称は、IUPAC−IUBの
単糖に対する略語に従った。J.Biol.Chem.,Vol.257,pp.
3347−3354（1982））。しかし、アノマー配置（ｈまた
はＨ）とＯ−グリコシド結合の位置の両方を変化させる
ことができるので、可能な組合せの数はほとんど無限に
大きい。その結果、通常の有機化学合成によるオリゴ糖
合成には多くの困難がある。これらの化合物に対して用
いる有機化学技術は、合成の多くの段階において広範な
保護基化学を必要とし、従って、しばしば全収率が低下
する。そのために、このような技術を使用する工業生産
は通常不利である。 酵素は、高いレジオセレクティビティおよびステレオ
セレクティビティ、並びに緩和な条件下での高い触媒効
率などの多くの優れた特性を有する天然の触媒である。
そのために、今日、有機化学法より少ない合成段階で、
従って、より高い全収率でオリゴ糖を選択的に大量合成
するための酵素利用に大きな期待が寄せられている。 酵素触媒によるオリゴ糖合成が多数の文献に開示され
ている（K.Nisizawa et al,in“The Carbohydrates,
Chemistry and Biochemistry,2nd Ed.,Vol.II A,pp.
242−290,Academic press,New York（1970））。加水
分解酵素（グリコシダーゼ、EC No.3.2）と転移酵素
（EC No.2.4）の両方が使用され、中でも特に加水分解
酵素がオリゴ糖合成に使用されてきた。この型の酵素を
用いてグリコシド合成を行うために、次の二つの方法が
利用された。つまり、逆加水分解（縮合または平衡技
術）および糖転移（速度論的技術）である。 （式中、DOHは供与体糖、DORはα−またはβ−グリコシ
ド結合アグリコン（＝Ｒ）を有する供与体糖、HOAは受
容体糖、EHは酵素である） 生成物が不活性である場合、または、水濃度を低める
ために反応を有機溶媒を用いて行うことができる場合に
は、逆加水分解は高収率を与える。糖転移に関しては、
フェニルグリコシドまたはニトロフェニルグリコシド
（式（２）においてＲ＝フェニル、ニトロフェニル）な
どの供与体物質に対する高い酵素活性が、高い生成物収
率を得るために利用されてきた。 たとえこれらの技術が多くの場合に完全に有効である
ことが証明されるとしても、供与体物質が受容体物質の
望ましい位置にＯ−グリコシド結合するように、反応を
制御することは依然として困難である。通常、１−６結
合（つまり、受容体糖の第１の水酸基に対する結合）が
形成されてきたが、複合糖質に最もしばしば見られる１
−２、１−３および１−４結合は形成されないか、また
は、わずかな程度しか形成されなかった。更に、従来技
術では、還元末端（reducing end）がグリコシド化さ
れず、生成物溶液中でα−アノマーおよびβ−アノマー
の両者として存在するために、容易に精製できない異性
体生成物の混合物がしばしば形成される。また、従来技
術は、生成物をたんぱく質や脂質などに結合させる前
に、更に化学修飾する必要があった。 本発明の目的の一つは、従来の酵素技術の不利な点を
取除くまたは減少させることである。特に、供与体と受
容体との間の望ましい結合が、制御のない場合よりも高
い制度で形成されるように、糖質の酵素合成におけるレ
ジオセレクティビティを制御するための手段を提供する
ことを目的としている。本発明の他の特定の目的は、生
成物の精製を容易にし、かつオリゴ糖の興味ある配糖体
の直接合成を容易にすることである。 従って、本発明は、複合糖質の糖部分からなるオリゴ
糖化合物、または、その糖部分の断片であるオリゴ糖化
合物、または、その糖部分の類似体であるオリゴ糖化合
物のいずれかを、逆加水分解または糖転移によって酵素
的に生産するにあたり、グリコシル供与体とグリコシル
受容体との間に形成されるグリコシド結合のレジオセレ
クティビティを制御する方法に関する。この方法は、単
糖またはオリゴ糖、または単糖かオリゴ糖の配糖体であ
る供与体物質を、単糖またはオリゴ糖または糖類似体
と、１位でＯ−、Ｎ−、Ｃ−またはＳ−グリコシド結合
した少なくとも一つのアグリコンとからなるＯ−、Ｎ
−、Ｃ−またはＳ−配糖体である受容体物質と、グリコ
シダーゼの存在下で反応させ、かつ、ここで、受容体物
質中のグリコシル基とアグリコンとの間のグリコシド結
合に関してα−またはβ−配置が選択されることと、こ
のオリゴ糖化合物が反応混合物から分離されることとを
特徴とする。 本発明の方法に用いられる受容体物質は、式HOAR
2（式中、R2はグリコシド結合した無機物質または有機
物質である、つまり、R2はアグリコン（糖でない）であ
る）を有する単糖またはオリゴ糖の配糖体またはその類
似体である。本発明の方法による生成物はDOAR2と表さ
れる。これは、Ｄ（α１−Ｘ）Ａ（α）R2、 Ｄ（α１−Ｘ）Ａ（β）R2、 Ｄ（β１−Ｘ）Ａ（α）R2および Ｄ（β１−Ｘ）Ａ（β）R2の型の化合物を表わす（式
中、Ｄは単糖またはオリゴ糖、Ａは単糖またはオリゴ糖
またはその類似体、Ｘは２、３、４または６であり、α
およびβは、それぞれ、ＤとＡの間のＯ−グリコシド結
合の立体配置およびＡとR2の間のＯ−、Ｎ−、Ｓ−また
はＣ−グリコシド結合の立体配置である）。この型の物
質には、例えば、Gal（α１−３）Gal（α）−OMe、Gal
（α１−３）Gal（β）−OMe、GlcNAc（β１−６）Man
（α）−OMeおよびMan（α１−２）Man（α）−OMeなど
がある（略称は、IUPAC−IUBが勧める単糖に対する略語
に従った。J.Biol.Chem.,Vol.257,pp.3347−3354（198
2））。 本発明の方法では逆加水分解および糖転移のそれぞれ
の反応式は次のように表される。 従来の反応と本発明による反応との相違は、反応
（１）および（２）で使用される受容体物質がHOA型の
物質、つまり１位が誘導化されていない物質であるのに
対し、本発明では、１位が誘導化されている受容体物
質、つまりHOAR2型の受容体物質を使用することであ
る。従って、従来の生成物がDOA型であったのに対し、
本発明の方法による生成物はDOAR2型である。 一方、供与体物質は、合成されるオリゴ糖と、合成が
逆加水分解により行われるかまたは糖転移により行われ
るかとに関して選択される。従って、供与体は、還元末
端がグリコシド結合有機物質を用いて誘導化されている
かまたは誘導化されていない単糖またはオリゴ糖であっ
てもよい。有機物質は、脂肪族、芳香族、ヘテロ環など
でよく、かつα−またはβ−配置でＤ（DOR、式（２）
を参照）の１位にグリコシド結合していてよい。本発明
で使用できる誘導化された供与体物質は、例えば、メチ
ル、CH2（CH2）ｎ（ｎ＞０）、フェニル、ｐ−ニトロフ
ェニル、ｏ−ニトロフェニル、４−メチルウンベリフェ
リル（umbelliferyl）グリコシドなどである。この型の
供与体物質の多くは市販されている。市販されていない
場合にも、有機合成または酵素合成によって容易に合成
できるので、本発明の利用を制限することはない。有用
なオリゴ糖は、例えば、ラクトース、ラフィノース（ra
ffinose）、チトビオース（chitobiose）およびジマン
ノシドなどである。種々の型のアルキル配糖体またはア
リール配糖体に対して活性な種々のグリコシダーゼは文
献に完全に記述されているので、当業者はそれぞれの場
合の要求を満たす適切な官能基Ｒを困難なく選択するこ
とができる。 酵素は、それぞれの特定の場合の要求に従って、主に
どのオリゴ糖を合成するかに関して選択される。例え
ば、α−グリコシド結合の合成にはα−グリコシダーゼ
が必要であり、β−グリコシド結合の合成にはβ−グリ
コシダーゼが必要である。好ましい酵素は、EC3.2群の
エンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼであ
る。本発明で使用できる酵素は、例えば次のα−および
β−グリコシダーゼである。つまり、Ｄ−マンノシダー
ゼ、Ｄ−ガラクトシダーゼ、Ｌ−フコシダーゼ、ノイラ
ミニダーゼ、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニダーゼ、
Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニダーゼ、キシロシダ
ーゼ、ヘキサミニダーゼおよびEC3.2群の他のグリコシ
ダーゼである（Enzyme Nomenclature,Academic Pres
s,pp.1−606,New York（1979）;Enzyme,3rd Ed.,Dixo
n et al,Longman（1979））。 使用する酵素の精製の程度は重要ではない。酵素は、
そのままでまたはその天然の生物学的環境から完全にま
たは部分的に単離した後に使用できる。完全な（intac
t）細胞または凍結乾燥した細胞並びに多少精製した酵
素を使用できる。酵素は、結晶形で存在してもよく、ま
たはミセル中に内包されていてもよい。種々の型の細胞
に由来する非常に多くのグリコシダーゼが市販されてい
る。その上に、興味あるグリコシダーゼの精製と単離に
関しては、生化学文献に詳細な情報が非常に豊富に記載
されている。 酵素は可溶な形で使用でき、あるいは、沈澱、吸着、
内包、キレート化またはポリマー物質またはプロトン性
溶媒や非プロトン性溶媒に不溶なその誘導体などの固相
への共有結合によって、固定化することもできる（Meth
ods in Enzymology,Vol.44,Academic Press,（197
6））。選択された形は本発明にとっては重要ではな
い。酵素を可溶な形で使用する場合は、例えば上昇温度
または有機共溶媒（organic cosolvent）に対する安定
性を増加させるために、酵素をまず適当な方法で化学修
飾することができる。例えば、アガロース、セルロー
ス、ヒドロキシエチルアクリレート、ガラス、シリカ、
ポリアクリルアミド、ポリアクリレートに基づく可塑物
などを包含する不溶性ポリマーに固定化された酵素は、
生成混合物から容易に分離でき、従って、酵素を再使用
することができる。更に、多くの場合に上昇温度と有機
共溶媒に対する一定の安定化が得られるという利点があ
る。 受容体物質の選択は合成を希望するオリゴ糖によって
決定される。供与体物質中に含まれるものと同じ型の単
糖を、受容体中に含むことができる。これらは、好まし
くは、Glc、Gal、Man、Fuc、Xyl、Ara、GlcNAc、GalNAc
およびNeuAcのうちの一つまたはそれ以上である（略称
はIUPAC−IUBの推薦によった。前記参照）。受容体物質
は１位をＯ−、Ｎ−、Ｃ−またはＳ−グリコシド結合さ
れた少なくとも一つのアグリコンによって誘導化され
る。 本発明によれば、受容体物質は１位以外の一つまたは
それ以上の位置を誘導化された糖からなっていてもよ
い。そのような誘導化は、例えば、一つまたはそれ以上
の水酸基が水素または有機官能基によって置換されるこ
とを意味する。そのような受容体物質の一つの例は、ｐ
−ニトロフェニル−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピ
ラノシドである。糖誘導体のもう一つの重要な型は、環
の酸素（即ち、ヘキソースではＣ−５酸素）が窒素、イ
オウなどで置換された物質である。そのような誘導体の
一つの例は、Ｃ−５酸素が窒素によって置換されたグリ
コース類似モラノリン（moranolin）である。酵素また
は糖質結合たんぱく質に対する有効な阻害剤であるオリ
ゴ糖類似体は、この方法で本発明によって合成される。 HOAR2のアグリコンR2は種々の型のものでよく、その
選択は、それぞれの特定の場合に何を要求し望むかによ
って決定される。R2は無機物質でもよいが、上記のすべ
てのR2が種々の型の有機物質であってもよい（脂肪族、
芳香族、ヘテロ環、ヘテロ芳香族またはその変形）。R2
は、受容体糖に対してＯ−、Ｎ−、Ｓ−またはＣ−グリ
コシド結合されていることができる。適当な有機アグリ
コンの例として、メチル基またはエチル基などのCH3（C
H2）ｎ基；フェニル基、ｐ−ニトロフェニル基およびｏ
−ニトロフェニル基;2−ブロモエチル基、トリメチルシ
リルエチル基またはCH2＝Ｃ（CH3）−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−CH
2CH2基などを挙げることができる。また、アグリコンは
アミノ基、ニトリル基またはアミド基、または、発蛍光
（fluorogenic）物質でもよく、あるいは、フォスフェ
ート、サルフェートまたはカルボキシル基、またはその
誘導体を含むこともできる。 受容体物質としてアルキル配糖体（メチルグリコシ
ド、オクチルグリコシド、ドデシルグリコシドなど）を
用いて得られた生成物は、凝集試験またはアフィニティ
ークロマトグラフィーにおいて阻害剤として使用でき
る。また、阻害に基づいた治療や薬物標的に対しても使
用でき、更に、連続酵素合成または連続有機合成の構造
単位などとしても使用できる。ニトロフェニルグリコシ
ドは、例えばPd/Cを用いて簡単にアミノフェニルグリコ
シドに還元でき、このアミノフェニルグリコシドは、直
接にまたは化学修飾の後、種々のポリマー（デキストラ
ン、ポリエチレングリコール、アガロース、セルロー
ス、シリカなど）並びにペプチド、たんぱく質、酵素、
脂質またはその類似体などに対して共有結合させること
ができる（Methods in Enzymology,Academic Press,
Vols.34,44,50 and 104）。更に、アミノ基は、イソ
チオシアネート、ジアゾ、Ｎ−ブロモアセテートなどの
幾つかの他の反応性の官能基に容易に変換できる。直接
にまたは化学修飾の後、アミノフェニル基について上に
述べた方法においていわゆるスペーサーアーム（Method
s in Enzymology,Vol.34,Academic Press）として使
用でき、かつ本発明によるアグリコン（R2基）として有
用な他の基は、例えば、２−ブロモエチル基、２−（２
−カルボメトキシエチルチオ）エチル基、２−アミノエ
チル基および６−アミノヘキシル基、またはそれらの誘
導体などである。また、２−ヒドロキシエチルメタクリ
レートなどの重合可能なアグリコンを有する配糖体も受
容体物質として使用できる。Ｎ−グリコシド結合したア
グリコンの例として、６−アミノカプロン酸アミド（−
NHCO（CH2）NH2）を挙げることができる。 他の型の配糖体にトリメチルシリルエチル配糖体があ
る。この配糖体は、アノマー配置を保持したままトリメ
チルシリル基をアセチル基によって置換できるので興味
深い（K.Jansson et al,Tetrahedron Lett.,27（198
6）,753−756）。従って、一つの酵素工程によって、同
じオリゴ糖配列の多数の配糖体を合成することができ
る。アリルグリコシドおよびベンジルグリコシドは容易
に遊離の糖へ変換することができる。アリル基は、例え
ば、70℃でKotBu/DMSO処理した後、HgCl2・HgO/アセト
ン処理することによって容易に除去できる。ベンジル基
はPd/C処理によって容易に除去できる。アリルグリコシ
ドは対応する2,3−エポキシプロピルグリコシドに変換
できる（E.Falent−Kwast et al,Carbohydrate Re
s.,145（1986）,pp.332−340）。遊離の還元末端を有す
るオリゴ糖配列はこのように合成できる。 特別に興味ある他のアグリコンには、アミノ酸（セリ
ン、トレオニン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジ
ン、アスパラギンなど）、ペプチド脂質および、これら
の３群に属する物質の誘導体または類似体がある。アミ
ノ酸配糖体およびペプチド配糖体は、ペプチド合成に通
常利用される官能基（FMOC、CBZ、BOCなど）によって、
アミノ基および／またはカルボキシル基を保護できる。
本発明によれば、複合糖質の断片または類似体をこれら
のアグリコンを用いて合成することができる。 上述のように、受容体物質の望ましい位置をグリコシ
ド置換するように合成を制御できることは、本発明によ
る合成方法の重要な利点である。その結果として、従来
の方法を用いるより高い割合で望ましいオリゴ糖異性体
を形成できる。更に、アグリコンの選択と、受容体物質
の糖部分へのグリコシド結合の立体配置とに応じて、同
じ酵素が異なる異性体の合成を異なる程度に触媒すると
いう利点がある。 本発明による方法では、生成物の還元末端のアノマー
炭素における異性化の問題が除かれるので、生成物の精
製も多くの場合に非常に容易となる。 更に他の利点は、興味あるファインケミカルズが本発
明の方法を用いて合成できることである。直接にまたは
化学修飾の後、例えば、重合、固体担体への固定化、酵
素やたんぱく質に対する結合などに対して使用できる物
質を得ることができる。アミノ酸、ペプチドまたは脂質
誘導体をアグリコンとして使用できるので、糖ペプチド
や糖脂質およびその類似体の合成も本発明の方法によっ
て非常に容易となる。 本発明による合成方法は、例えば、温度、pH、緩衝液
および反応体濃度などに関して、高度に多様な条件下で
行うことができる。種々の共溶媒（N,N−ジメチルホル
ムアミド、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジ
オキサン、ピリジン、メタノール、エタノール、エチレ
ングリコールなど）が使用でき、種々の濃度の水溶液と
しても使用できる。加えて、反応は２相系、水−有機溶
媒（シクロヘキサン、クロロホルム、塩化メチレンな
ど）中で行うことができる。更に、酵素を逆ミセルに内
包することもできる（P.Luisi,Angew.Chem.,Vol.97,pp.
449−60（1985））。反応は沈澱させた酵素を用いて純
粋な有機溶媒中で行うこともできる（Kazandjian et
al,J.Amer.Chem.Soc.,Vol.107,（1985））。反応条件は
重要でないが、主にその合成に含まれる反応体の性質に
基づいて、更に実際的な理由を考慮して選択する。例え
ば、酵素に関しては、室温で、しかも水性の媒質の場合
には４〜11の範囲のpHで、作用させることがしばしば適
切であることが挙げられる。酵素の最適pHよりいくらか
高いpHを用いることによって、しばしばより高い生成物
収率が得られることが見出されている。コーヒーマメ由
来のα−ガラクトシダーゼおよびタチナタマメ由来のα
−マンノシダーゼに対してはpH6.5〜7.5が使用された。
一方、大腸菌（E.coli）のβ−ガラクトシダーゼに対し
てはわずかに高いpHが好ましい。適切な緩衝塩は、例え
ば、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、リン酸カリウムま
たはリン酸ナトリウムなどである。 有機共溶媒は加水分解反応を最小化するために使用さ
れる。同じ理由で、２相系を使用できる。しかし、ある
場合には水を唯一の溶媒として用いる場合に、かなり高
い収率が得られることが知られている。これは、例え
ば、コーヒーマメ由来のα−ガラクトシダーゼを用いる
Gal（α１−３）Gal（α）−OMeおよびGal（α１−３）
Gal（α）−OC6H4−NO2−ｐの合成の場合などである。 生成物収率と酵素安定性を変えるために温度を変化さ
せることもできる。最もしばしば用いられる温度は５〜
55℃の範囲であるが、熱安定性グリコシダーゼに対し
て、あるいは、例えば高基質濃度を用いて熱変性に対し
て安定化された酵素（E.Johansson et al,Biotechno
l.Lett.,8（1986）pp.421−424）に対しては、より高い
温度を使用できる。高温の利点の一つは、高基質濃度を
利用でき、それによって水活性が減少され高い生成物収
率が得られることである。その上に、高温では酵素活性
が増加し、そのために反応時間が短縮されるという利点
があり、これが更に、メチルグリコシドまたはエチルグ
リコシドなどの室温で比較的遅く加水分解される配糖体
が高温（50〜60℃）ではグリコシル供与体として有利に
使用できるという利点をもたらす。上限温度は反応媒質
中の酵素の熱安定性によって決定される。ある糖転移に
関しては、より低い温度がより高い収率の生成配糖体を
与えることが見出された。コーヒーマメ由来のα−ガラ
クトシダーゼを用い、供与体の初濃度を0.15M、受容体
の初濃度を0.45Mとし、それぞれ20、40、50℃で反応を
行った場合、20℃でGal（α１−３）Gal（α）−OMeの
最大収率が得られた。 通常は、生成配糖体の収率を最大にするために、供与
体および受容体基質の飽和溶液が使用される。これは、
室温で水を溶媒として、ｐ−ニトロフェニルグリコシド
の0.05〜0.2モル溶液、メチルグリコシドの0.3〜0.6モ
ル溶液を意味する。メタノール、N,N−ジメチルホルム
アミドなどの共溶媒を、例えばｐ−ニトロフェニルグリ
コシドなどの疎水性アグリコンを有する配糖体の溶解度
を増加させるために使用できる。反応はTLC、HPLCによ
って、または放出されたアグリコンの分光測定によって
（例えばｐ−ニトロフェノールでは400nm）追跡でき
る。生成配糖体の最大収率が達成されたときには、pH変
化、温度上昇および／または有機共溶液（エタノールな
ど）の添加により酵素を変性させることによって反応を
中断させる。通常は、80〜85℃で３〜５分間加熱し、そ
の後、約80％の濃度までエタノールを添加することで十
分である。 生成物の精製には種々の技術が使用できる。例えば、
溶出液として塩化メチレン：メタノール：水（例えば6:
4:1 v/v/v）を用い、固相としてシリカを用い、そこ
で、低圧での乾燥後の部分的に精製した生成配糖体を無
水酢酸とピリジン（例えば1:1 v/v）を用いてアセチル
化するカラムクロマトグラフィーが有効である。更にカ
ラムクロマトグラフィーの工程（シリカ、溶出液は例え
ば酢酸エチル：イソオクタン）を行うことによって、通
常は純粋なアセチル化生成物が得られる。触媒量のナト
リウム メトキシドを用いる乾燥MeOH中の脱アセチル化
によって、しばしば結晶形の生成配糖体が得られる。顕
著に疎水性のアグリコン（例えば、Gal（α１−３）Gal
（α）−OC6H4−NO2−ｐ）を有する生成物の精製は、製
造的な（preparative）HPLC装置とC18シリカを用いてし
ばしば１工程で行うことができる。本発明による合成方
法は、糖たんぱく質または糖脂質に含まれるオリゴ糖配
列の合成に一般に適用できる（Biology of Carbohydr
ates,Vol.2（1984）,V.Ginsburg and P.W.Robbins,ed
s.Wiley ＆ Sons,New York;The Glycoconjugates,V
ol.I−V,Academic Press,New York;S.Hakomori,Ann.R
ev.Biochem.,Vol.50,pp.733−64（1981））。 特に興味深いのは、生物学的情報を転移するためには
十分であるこれらの構造の最小断片である。このような
構造の重要性の例として、血液型決定基、微生物に対す
る特異的レセプター（Gal（α１−３）Galα−、大腸菌
K88;ClcNac（β１−３）Galβ−、肺炎双球菌（S.pne
umoniae）;Gal（α１−４）Galβ−、ｐ−線毛大腸菌
（ｐ−fimbriated E.coli）など）、分化抗原ｉ、Ｉ、
CO514、38.13などを挙げることができる（Nature,Vol.3
14,pp.53−57（1985）のT.Feiziによる総説中の第１表
および第２表を参照）。 例えば、「成熟」アスパラギン結合オリゴ糖の３つの
クラス、即ち、（ａ）高マンノース型、（ｂ）複合型、
（ｃ）雑種型を代表する次のＮ−結合オリゴ糖中に含ま
れるオリゴ糖配列を生産できる（Biology of Carbohy
drates,Vol.2,（1984）,V.Ginsburg and P.W.Robbin
s,eds.Wiley ＆ Sons,New Yorkを参照）。 次のＯ−結合オリゴ糖構造中に含まれるオリゴ糖配列
を生産できる（Biology of Carbohydrates,Vol.2（19
84）,Wiley ＆ Sons.New Yorkを参照）。 更に、次の構造またはその断片が本発明によって製造
できる（S.Hakomori,Ann.Rev.Biochem.,Vol.5,p.739（1
981）を参照）。 次の表に，本発明によって全体または部分を生産でき
ることが示唆される微生物およびトキシンに対する幾つ
かのレセプター構造を示す。表中の参照文献 〔ａ）N.Firon,I.Ofek and W.Sharon,Infect.Immun.,4
3,1984,p.1088;E.H.Beachey（ed）Bact.Adherence,Rece
ptors and Recognition,Vol.8,Chapman and Hall,N.Y.,
1980. ｂ）H.Leffler and C.Svanborg−Ed′en,FEMS Microbio
l.Letters 8,1980,p.127;G.Kallenius,R.Mllby,S.B.S
vensson,J.Winberg,A.Lundblad,S.Svensson,and B.Cede
rgren,FEMS Microbiol.Letters 7,1980,p.297. ｃ）I.Parkkinen,J.Finne,M.Achtman,V.Vaisnen,and
T.K.Korhonen,Biochem.Biophys.Res.Commun.111,1983,
p.456. ｄ）V.Vaisnen−Rhen,T.K.Korhonen,and J.Finne,FEB
D Lett.159,1983,p.233. ｅ）M.J.Anderson,J.S.Whitehead,and Y.S.Kim,Infect.
and Immun,29,1980,p.897. ｆ）M.Bertolini and W.Pigman,Carbohydr.Res.,14,197
8,p.53. ｇ）J.E.Brown,K.−A.Karlsson,A.Lindberg,N.Strmbe
rg,and J.Thurin in M.A.Chester,D.Heingrd,A.Lundb
lad,and S.Svensson（eds）,Proc.7th Int.Symp.Glycoc
onjugates,Lund,1983,p.678. ｈ）A.Gunnarsson,P.−A.Mrdh,A.Lundblad,S.Svensso
n,Infect.Immun.,45,1984,p.41. ｉ）C.Svanborg−Edn,B.Andersson,L.Hagberg,H.Leff
ler,G.Magnusson,G.Moori,J.Dahmn,and T.Sderstr
m,Ann.N.Y.Acad.Sci.,409,1983,p 560. ｊ）T.Feizi and R.A.Childs,Trends.Biochem.Sci.,10,
1985,p.24. ｋ）G.F.Springer and R.R.Desai,Ann.Clin.Lab.Sci.,1
985,p.294. ｌ）J.Holmgren,Nature,292,1981,p.431.〕 更に、種々のヒト腫瘍中に現われ、腫瘍関連抗原とし
て作用する複合糖質（特に、Feizi,Nature,314（1985）
を参照）中に多数の異なるオリゴ糖の配列も非常に興味
深い。これには次の構造がある。 単糖のフルオロ類似体、ホスホ類似体、アミノ類似体
またはチオ類似体などを含むオリゴ糖配列は、複合糖質
代謝の研究の点から、および可能性としてはがんの化学
療法の点から非常に興味深い（The Glycoconjugates,V
ol.IV（1982）Academic Press）。あるオリゴ糖類似体
は、天然のレセプターよりもレクチンに対してより高い
会合定数を持つことが示された。これについては、糖構
造に基づく感受性の高い診断法および効果的な治療法の
開発の点から非常に興味が持たれる。 上に述べたように非常に多数のアグリコンを使用でき
る。例えば、受容体としてアリルグリコシド、ベンジル
グリコシドまたはトリメチルシリルグリコシドを選ぶこ
とによって、生成配糖体から容易に高収率で遊離の糖を
得ることができる。このように、依然にはグリコシダー
ゼを用いて合成することができなかった遊離のオリゴ糖
構造の酵素合成を、本発明の方法によって行うことがで
きる。 簡単な配糖体（メチルグリコシドなど）を、抗体（Sl
ama et al,Biochemistry,（1980）,19（20）,4595−4
600）およびレクチン（Sharon and Lis,Science（197
2）,177,949−959）を用いる阻害研究に使用することが
できる。発色団または蛍光性のアグリコン（例えば、ｐ
−ニトロフェニル、４−メチルウンベリフェニル）を有
する配糖体を酵素分析に使用することができる（D.E.Sy
kes et al,Carbohydrate Res.,116（1983）127−13
8）。更に、ペプチド、たんぱく質、脂質、クロマトグ
ラフィーの担体などに対する共有結合させるのに適した
配糖体を、本発明の方法によって合成することができ
る。 本発明の実際の具体例を次に示す。しかし、これらは
本発明の技術的範囲を制限するものではない（略称は、
IUPAC−IUBの推薦によった。J.Biol.Chem.Vol.257,pp.3
347−3354（1982））。 例１ Gal（α１−３）Gal（α）−OMe（メチル−３−Ｏ−α
−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド）の合成 A. 1.8gのｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラ
ノシド（Gal（α）−OPhNO2−ｐと18gの１−Ｏ−メチル
−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（Gal（α）−OMe）と
を、110mlの0.05Mリン酸ナトリウム水溶液（pH6.5）と4
0mlのN,N−ジメチルホルムアミド中に溶解した。コーヒ
ーマメ由来のα−ガラクトシダーゼ（α−Ｄ−ガラクト
シド ガラクトヒドロラーゼ;EC3.2.1.22;0.2ml;10単
位、Boehringer）を添加した。室温で７日間放置した
後、反応混合物を80℃で５分間加熱し、生成物をカラム
クロマトグラフィー（シリカ、Kieselgel 60、230〜40
0メッシュ、Merck、クロロホルム:MeOH:H2O、6:4:0.5
v/v/v）によって精製し、無水酢酸とピリジンを用いて
パーアセチル化した。更にカラムクロマトグラフィーの
工程（シリカ、イソオクタン：酢酸エチル、1:1 v/v）
を行い、触媒量のナトリウムメトキシドを用いてMeOH中
で脱アセチル化した後、純粋な結晶Gal（α１−３）Gal
（α）−OMeを得た。生成物をNMR、HPLCを用いて分析し
（純度は99％を超える）、更にメチル化分析を行った。 B. 0.31gのGal（α）−OPhNO2−ｐと0.91gのGal（α）
−OMeとを、10mlの緩衝液（例1Aを参照）に溶解した。
α−ガラクトシダーゼコーヒーマメ、Boehringer,EC3.
2.1.22、５単位）を添加し、反応を室温で72時間継続さ
せた。反応混合物を80℃で５分間加熱し、生成物を例1A
に従って単離した。Gal（α１−３）Gal（α）−OMeの
収量は180mg、つまりGal（α）−OPhNO2−ｐの39％が付
加された。 例２ Gal（α１−３）Gal（β）−OMeとGal（h1−６）Gal
（β）−OMeの合成 0.6gのGal（α）−OPhNO2−ｐと4gのGal（β）−OMe
とを、22mlの0.05Mリン酸ナトリウム水溶液（pH6.5）と
9mlのN,N−ジメチルホルムアミド中に溶解した。コーヒ
ーマメ由来のα−ガラクトシダーゼ（EC3.2.1.22;0.2m
l;10単位）を添加し、反応を室温で90時間継続させた。
生成物を例１に従ってカラムクロマトグラフィーによっ
て精製した。アセチル化した生成物を200MHz NMR
（1H、13C）を用いて分析した。Gal（α１−６）Gal
（β）−OMeの収量は125mg、Gal（α１−３）Gal（β）
−OMeでは65mgであり、つまりそれぞれ16％と８％のGal
（α）−OPhNO2−ｐが付加された。 例３ Gal（α１−２）Gal（α）−OPhNO2−ｐとGal（α１−
３）Gal（α）−OPhNO2−ｐの合成 A. 0.9gのGal（α）−OPhNO2−ｐを、24mlの0.05Mリン
酸ナトリウム水溶液（pH6.5）と8mlのN,N−ジメチルホ
ルムアミド中に溶解した。コーヒーマメ由来のα−ガラ
クトシダーゼ（EC3.2.1.22;0.2ml;10単位）を添加し、
反応を室温で38時間継続させた。生成物をカラムクロマ
トグラフィー（シリカ、セファデックス（Sephadex）
G10）によって分離し、UV（305nm）と200MHz NMR
（1H、13C）を用いて分析し、更にメチル化分析を行っ
た。Gal（α１−３）Gal（α）−OPhNO2−ｐの収量は15
0mg、Gal（α１−２）Gal（α）−OPhNO2−ｐでは25mg
であり、つまりそれぞれ13％と1.7％のGal（α）−OPhN
O2−ｐが付加された。 B. 1.35gのGal（α）−OPhNO2−ｐを、10mlの緩衝液
（例3Aを参照）中に溶解し、コーヒーマメ由来のα−ガ
ラクトシダーゼ（例3Aを参照）を５単位添加した。反応
を50℃で76時間継続させた。反応混合物を80℃で５分間
加熱することによって反応を中断させた。生成物を例3A
に従いカラムクロマトグラフィー（セファデックス G1
0、Pharmacia、および、シリカ、Merck、Kieselgel 6
0、23〜400メッシュ、酢酸エチル：イソプロパノール：
水 6:2:1 v/v/v）によって単離した。Gal（α１−
３）Gal（α）−OPhNO2−ｐとGal（α１−２）Gal
（α）−OPhNO2−ｐの収率はそれぞれ23％（236mg）と
3.5％（36mg）であった。 C. この試験は、トレシル（tresyl）クロリド活性化ア
ガロース（Pharmacia）に固定化したコーヒーマメ由来
のα−ガラクトシダーゼ（K.Nilsson et al,Biochem.
Biophys.Res.Comm.,102（1981）449−457）を用いて、
例3Aに従って行った。0.5g、11単位のα−ガラクトシダ
ーゼ−アガロースを、1.5gのGal（α）−OPhNO2−ｐを2
3mlの緩衝液と10mlのDMFとに溶解した溶液に添加した。
緩やかに攪拌しながら反応を室温で12日間継続させた。
上記に従って反応を終結させ生成物を単離して、160mg
のGal（α１−３）Gal（α）−OPhNO2−ｐを得た。つま
り理論値の14％である。触媒活性がわずかに数パーセン
ト減少するが、固定化したα−ガラクトシダーゼを繰返
して使用することができた。 例４ Gal（α１−２）Gal（α）−OPhNO2−ｏの合成 2gのGal（α）−OPhNO2−ｏを、30mlの緩衝液（例1A
を参照）と14mlのDMFとに溶解した。α−ガラクトシダ
ーゼ（例1Aを参照、20単位）を添加し、反応を室温で53
時間継続させた。反応を終結させ、生成物を例1Aに従っ
て単離し分析した。純粋な結晶Gal（α１−２）Gal
（α）−OPhNO2−ｏの収量は60mgであり、つまり理論収
率の４％であった。 例５ アスペルギルス ニゲル由来のα−ガラクトシダーゼを
用いるGal（α１−３）Gal（α）−OPhNO2−ｐの合成 アスペルギルス ニゲル（Aspergillus niger）由来
のα−ガラクトシダーゼ（EC3.2.1.22）を用いる以外は
例３に従って、合成を行った。この場合、40mgのGal
（α１−３）Gal（α）−OPhNO2−ｐと4mgの異性体生成
物（多分（α１−２）異性体）と痕跡程度（約1mg）の
他の異性体生成物が得られた。これらの異性体は、例3A
に従ってセファデックス G10工程中で分離した。 例６ Man（α１−２）Man（α）−OPhNO2−ｐ（ｐ−ニトロフ
ェニル−２−Ｏ−α−Ｄ−マンノピラノシル−α−Ｄ−
マンノピラノシド）の合成 0.63gのMan（α）−OPhNO2−ｐを、10μＭ ZnCl2で
ある0.05Mリン酸ナトリウム（pH6.5）の33mlに溶解し
た。10mgのN,N−ジメチルホルムアミドを添加した。タ
チナタマメ（Canavalia ensiformis）由来のα−マン
ノシダーゼ（α−Ｄ−マンノシドマンノヒドロラーゼ;E
C3.2.1.24;0.3ml;10単位、Boehringer−Mannheim）を添
加し、反応を室温で６時間、それから冷却室（４℃）で
36時間継続させた。生成物をカラムクロマトグラフィー
（シリカゲル）によって単離し、NMRを用いて分析し更
にメチル化分析を行った。Man（α１−２）Man（α）−
OPhNO2−ｐの収量は36mgであった。NMRによれば生成物
の純度は95％を超えており、残りの異性体の形成は無視
できる程度であった。 例7A Man（α１−２）Man（α）−OMe（メチル−２−Ｏ−α
−Ｄ−マンノピラノシル−α−Ｄ−マンノピラノシド）
とMan（α１−６）Man（α）−OMe（メチル−６−Ｏ−
α−Ｄ−マンノピラノシル−α−Ｄ−マンノピラノシ
ド）の合成 0.6gのｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノピラノシ
ド（Man（α）−OPhNO2−ｐ）と6gの１−Ｏ−メチル−
α−Ｄ−マンノピラノシド（Man（α）−OMe）とを、10
μＭ ZnCl2である0.05Mリン酸ナトリウム水溶液（pH6.
5）の38mlに溶解した。N,N−ジメチルホルムアミドを添
加した。タチナタマメ由来のα−マンノシダーゼ（EC3.
2.1.24;0.3ml;15単位）を添加し、反応を室温で14時間
継続させた。生成物を例１および例２の合成と類似の方
法でシリカカラムによって精製した。生成物をNMR、メ
チル化分析、HPLCを用いて分析した。180mgのMan（α１
−２）Man（α）−OMeと28mgのMan（α１−６）Man
（α）−OMeを得た。つまり、それぞれMan（α）−OPhN
O2pの20％と３％が付加された。 例7B Man（α１−２）Man（α）−OMeとMan（α１−６）Man
（α）−OMeの合成 20gのMan（α）−OMeを、45mlの緩衝液（例7Aを参
照）と5mlのMeOHとに溶解した。α−マンノシダーゼ
（例7Aを参照、50単位）を添加し、反応を55℃で３日間
継続させた。反応を終結させ、生成物を例7Aに従って単
離した。 例８ Man（α１−２）Man（α）−OEtBr（２−ブロモエチル
−２−Ｏ−α−マンノピラノシル−α−Ｄ−マンノピラ
ノシド）の合成 0.9gのMan（α）−OPhNO2−ｐと2.7gの２−ブロモエ
チル−α−Ｄ−マンノピラノシド（Man（α）−OEtBr）
とを、20mlの0.05Mリン酸ナトリウム水溶液（pH6.5）に
溶解した。7mlのN,N−ジメチルホルムアミドを添加し
た。タチナタマメ由来のα−マンノシダーゼ（EC3.2.1.
24;0.3ml;15単位）を添加し、反応を室温で72時間継続
させた。生成物を例7Aに従って精製した。生成物をNMR
（200MHz;1H、13C）によって分析した。200mgのMan（α
１−２）Man（α）−OEtBrと約30mgの未帰属異性体生成
物（多分（α１−６）異性体）とを得た。 例９ Man（α１−２）Man（α１−２）Man（α）−OMeの合成 この物質は、20gのMan（α）−OPhNO2−ｐと45gのMan
（α）−OMeとから、1ml（50単位）のタチナタマメ由来
のα−マンノシダーゼ（EC3.2.1.24）を用い、他は例7A
による条件下でのMan（α１−２）Man（α）−OMeとMan
（α１−６）Man（α）−OMeの大量合成の副生成物とし
て形成された。生成物は、カラムクロマトグラフィー
（セファデックス G10、シリカ）によって２糖分画か
ら分離した。アセチル化した生成物を、カラムクロマト
グラフィー（シリカ）によって異性体生成物（全量の約
35％）から分離した。250mgのアセチル化Man（α１−
２）Man（α１−２）Man（α）−OMeを得た。生成物をN
MR（200MHz;1H、13C）によって分析し、更にメチル化分
析を行った。 例10 Gal（β１−３）Gal（β）−OMe（メチル−３−Ｏ−β
−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−Ｄ−マンノピラノシ
ド）の合成 A. 2.7gのｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシド（Gal（β）−OPhNO2−ｏ）と5gのGal（β）−OM
eとを、1mM MgCl2および10mMメルカプトエタノールで
ある0.05Mリン酸ナトリウム水溶液（pH6.8）の35mlに溶
解した。15mlのN,N−ジメチルホルムアミドを添加し
た。大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−ガラ
クトシド ガラクトヒドロラーゼ;EC3.2.1.23;100単位;
Sigma Laboratories）を添加し、反応を室温で24時間
継続させた。生成物をカラムクロマトグラフィー（シリ
カおよびセファデックス G10）によって分離した。ア
セチル化とシリカカラムでのクロマトグラフィーの後、
1.3gのアセチル化Gal（β１−３）Gal（β）−OMeと160
mgのGal（β１−６）Gal（β）−OMe（アセチル化）を
得た。分析は200MHz NMR（1H、13C）を用いて行った。 B. この試験は例10Aと類似しているが、9.0gのGal
（β）−OPhNO2−ｏと、15gのGal（β）−OMeと、トレ
シルアガロース（例3Cを参照）に固定化した大腸菌由来
のβ−ガラクトシダーゼとを用いた。このグリコシダー
ゼを、105mlの緩衝液（例10Aを参照）と45mlのDMFに溶
解した。β−ガラクトシダーゼ−アガロース（0.2g、30
0単位）を添加し、緩やかに攪拌しながら反応を室温で
４日間継続させた。生成物を例10Aに従って単離し、分
析した。MeOHから再結晶させたGal（β１−３）Gal
（β）−OMeの収量は4g（29％）であり、Gal（β１−
６）Gal（β）−OMeでは400mg（３％）であった。 例11 Gal（β１−６）Gal（α）−OMeの製造 この試験は例10Aと類似しているが、2.7gのGal（β）
−OPhNO2−ｏと、5gのGal（α）−OMeと、大腸菌由来の
1.0gのβ−ガラクトシダーゼ（例10Aを参照）を35mlの
緩衝液（例10Aを参照）と15mlのDMFとに溶解した溶液と
を用いた。室温で５時間反応させた後、生成物を例10に
従って単離し分析した。結晶Gal（β１−６）Gal（β）
−OMeの収量は450mgであった。他の異性体の形成は無視
できる程度であった。 例12 Gal（β１−３）Gal−OCH2CH2OC（Ｏ）Ｃ（CH3）＝CH2
とGal（β）−OCH2CH2OC（Ｏ）Ｃ（CH3）＝CH2の１容器
合成 この例は受容体配糖体自身の製造の説明である。18g
のラクトースを、160mlの緩衝液（例10を参照）と75ml
のDMFと15mlのヒドロキシエチルメタクリレートとの混
合物中に溶解した。β−ガラクトシダーゼ−アガロース
（1.5g、2250単位、例10Bを参照）を添加し、緩やかに
攪拌しながら反応を室温で継続させた。６日後、固定化
酵素をろ別し、生成物をカラムクロマトグラフィーによ
って単離した。2.6gのGal（β）−OCH2CH2OC（Ｏ）Ｃ
（CH3）＝CH2と160mgのGal（β１−３）Gal−OCH2CH2OC
（Ｏ）Ｃ（CH3）＝CH2を得た。 例13 Gal（β１−３）GlcNAc（β）−OCH2CH2Si（Me）３の合
成 6gのGal（β）−OPhNO2−ｏと1gのGlcNAc（β）−Ｏ
（CH2）2Si（CH3）３とを、10gのウシ精巣から得た抽出
物の上清を含む30mlの0.1Mリン酸ナトリウム（pH7.0）
中に懸濁した。反応を40℃で２日間継続させた。反応を
終結させ、生成物を例10Aに従ってカラムクロマトグラ
フィーによって単離した。脱アセチル化後のGal（β１
−３）GlcNAc（β）−Ｏ（CH2）2Si（CH3）３の収量は2
00mgであった。 例14 GlcNAc（β１−６）Man（α）−OMeの合成 3gのGlcNAc（β）−OPhNO2−ｐ（ｐ−ニトロフェニル
−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド）と16gのMan
（α）−OMeとを、88mlの緩衝液（例1Aを参照）と12ml
のDMFに溶解した。Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミ
ニダーゼ（タチナタマメ;EC3.2.1.30;20単位、0.3ml、S
igma Laboratories）を添加し、反応を室温で３日間継
続させた。反応を終結させ、生成物を例1Aに従って単離
し分析した。純粋な結晶GlcNAc（β１−６）Man（α）
−OMeの収量は350mgであった。 例15 Fuc（α１−３）Gal（α）−OMeの合成 0.31gのｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコピラノシ
ド（Fuc（α）−OPhNO2）と3gのGal（α）−OMeとを、2
5mlの緩衝液（0.05Mリン酸ナトリウム、pH6.2）に溶解
した。α−Ｌ−フコシダーゼ（ウシ腎臓;EC3.2.1.51;0.
3ml、１単位、Sigma Laboratories）を添加し、反応を
37℃で２日間継続させた。反応を中断させ、生成物を例
1Aに従って単離し分析した。パーアセチル化Fuc（α１
−３）Gal（α）−OMeの収量は35mgであった。
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．複合糖質の糖部分からなるオリゴ糖化合物、又はそ
の糖部分の断片であるオリゴ糖化合物、又はその糖部分
の類似体であるオリゴ糖化合物のいずれかを、逆加水分
解又は糖転移によって酵素的に生産するにあたり、 単糖又はオリゴ糖、又は単糖又はオリゴ糖の配糖体であ
る供与体物質を、単糖又はオリゴ糖又は糖類似体と、１
位でＯ−、Ｎ−、Ｃ−又はＳ−グリコシド結合し少なく
とも１個のアグリコンとからなるＯ−、Ｎ−、Ｃ−又は
Ｓ−配糖体である受容体物質に、受容体物質中のグリコ
シル基とアグリコンとの間のグリコシド結合に関してα
−又はβ−配置を選定して、グリコシダーゼの存在下で
反応させること、及びこのオリゴ糖化合物を反応混合物
から分離することを特徴とするグリコシル供与体とグリ
コシル受容体との間に形成されるグリコシド結合のレジ
オセレクティビティを制御して、オリゴ糖化合物を製造
する方法。 ２．供与体物質と受容体物質の糖部分が、単糖であるＬ
−フコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｎ−
アセチルノイラミン酸、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサ
ミン及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの１又はそれ
以上を含むことを特徴とする特許請求の範囲第１項に記
載の方法。 ３．受容体物質が、単糖であるＬ−フコース、Ｄ−ガラ
クトース、Ｄ−マンノース、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラク
トサミン及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの類似体
を含むことを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の
方法。 ４．アグリコンが脂肪族物質又は芳香族物質であること
を特徴する特許請求の範囲第１項から第３項のいずれか
に記載の方法。 ５．アグリコンが、グリコシド結合したメチル基、CH3
（CH2）ｎ基、フェニル基、ｐ−ニトロフェニル基、ｏ
−ニトロフェニル基、２−ブロモエチル基、トリメチル
シリルエチル基又はCH2＝Ｃ（CH3）−Ｃ（Ｏ）−OCH2CH
2基であることを特徴とする特許請求の範囲第４項に記
載の方法。 ６．アグリコンが、発蛍光物質であることを特徴とする
特許請求の範囲第１項から第４項のいずれかに記載の方
法。 ７．アグリコンが、アミノ基、ニトリル基又はアミド基
であるか、又はこれらの基を含むことを特徴とする特許
請求の範囲第１項から第４項のいずれかに記載の方法。 ８．アグリコンが、フォスフェート、サルフェート又は
カルボキシル基、又はそれらの誘導体を含むことを特徴
とする特許請求の範囲第１項から第４項のいずれかに記
載の方法。 ９．アグリコンが、直接に又は化学修飾の後、脂質、ペ
プチド、たんぱく質、酵素、又はアフィニティ分配系、
アフィニティクロマトグラフィー、診断又は治療におい
て使用される担体物質に共有結合できる有機物質である
ことを特徴とする特許請求の範囲第１項から第４項のい
ずれかに記載の方法。 １０．アグリコンが重合可能であることを特徴とする特
許請求の範囲第１項から第９項のいずれかに記載の方
法。 １１．アグリコンが、アミノ酸、ペプチド、脂質又はそ
の誘導体又はその類似体であることを特徴とする特許請
求の範囲第１項から第６項のいずれかに記載の方法。 １２．供与体が、ラクトース、ラフィノース、チトビオ
ース又はジマンノシドであることを特徴とする特許請求
の範囲第１項から第11項のいずれかに記載の方法。 １３．供与体物質が、α−又はβ−グリコシド結合した
有機物質を有する単糖又はオリゴ糖であることを特徴と
する特許請求の範囲第１項から第11項のいずれかに記載
の方法。 １４．有機物質が、メチル基、CH3（CH2）ｎ基、フェニ
ル基、ｐ−ニトロフェニル基、ｏ−ニトロフェニル基又
は４−メチルウンベリフェリル基であることを特徴とす
る特許請求の範囲第13項に記載の方法。 １５．酵素が、EC3.2群のエンドグリコシダーゼ及び／
又はエキソグリコシダーゼであることを特徴とする特許
請求の範囲第１項から第14項のいずれかに記載の方法。 １６．酵素が、ガラクトシダーゼ、マンノシダーゼ、Ｎ
−アセチルヘキソサミニダーゼ、Ｎ−アセチルガラクト
ース アミニダーゼ、Ｎ−アセチルグリコース アミニ
ダーゼ又はフコシダーゼであることを特徴とする特許請
求の範囲第１項から第15項のいずれかに記載の方法。 １７．使用する酵素が熱安定性であることを特徴とする
特許請求の範囲第１項から第16項のいずれかに記載の方
法。 １８．酵素が、その場で又はその天然の生物学的環境か
ら完全に又は部分的に単離された後に使用されることを
特徴とする特許請求の範囲第１項から第17項のいずれか
に記載の方法。 １９．酵素が、結晶形であることを特徴とする特許請求
の範囲第１項から第18項のいずれかに記載の方法。 ２０．酵素が、ミセルに内包されていることを特徴とす
る特許請求の範囲第１項から第19項のいずれかに記載の
方法。 ２１．酵素が、有機物質によって共有結合的に修飾され
ていることを特徴とする特許請求の範囲第１項から第20
項のいずれかに記載の方法。 ２２．酵素が、沈殿、吸着、内包、キレート化、又は共
有結合によって、プロトン性溶媒又は非プロトン性溶媒
に不溶であるポリマー物質又はその誘導体へ固定化され
ていることを特徴とする特許請求の範囲第１項から第21
項のいずれかに記載の方法。 ２３．ポリマー物質が、アガロース、セルロース、シリ
カ、ポリアクリルアミド又はポリアクリレートに基づく
可塑物からなることを特徴とする特許請求の範囲第22項
に記載の方法。 ２４．他の物質に対する生物特異的な親和力を有するオ
リゴ糖化合物が合成され、単離されることを特徴とする
特許請求の範囲第１項から第23項のいずれかに記載の方
法。
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