JPH0564594A - 糖質又は複合糖質の製造方法 - Google Patents
糖質又は複合糖質の製造方法Info
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- JPH0564594A JPH0564594A JP3248388A JP24838891A JPH0564594A JP H0564594 A JPH0564594 A JP H0564594A JP 3248388 A JP3248388 A JP 3248388A JP 24838891 A JP24838891 A JP 24838891A JP H0564594 A JPH0564594 A JP H0564594A
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 糖鎖のリモデリング反応を利用した簡便な糖
質又は複合糖質の製造方法を提供する。 【構成】 エンドグリコシダーゼの存在下、下記式（化
１）： 【化１】Ｘ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｙ ＋ Ｚ → Ｘ−Ｇｌ
ｃＮＡｃ−Ｚ ＋ Ｙ （式中Ｘは糖質、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサ
ミン、Ｙは糖質又は複合糖質、Ｚは糖質又は複合糖質を
示す）で表される転移反応を行う糖質又は複合糖質の製
造方法。 【効果】 副生物の生成も少なく、目的の糖質を効率良
く容易に製造でき、分離精製も容易である。生理活性物
質の機能増強に有用である。
質又は複合糖質の製造方法を提供する。 【構成】 エンドグリコシダーゼの存在下、下記式（化
１）： 【化１】Ｘ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｙ ＋ Ｚ → Ｘ−Ｇｌ
ｃＮＡｃ−Ｚ ＋ Ｙ （式中Ｘは糖質、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサ
ミン、Ｙは糖質又は複合糖質、Ｚは糖質又は複合糖質を
示す）で表される転移反応を行う糖質又は複合糖質の製
造方法。 【効果】 副生物の生成も少なく、目的の糖質を効率良
く容易に製造でき、分離精製も容易である。生理活性物
質の機能増強に有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は酵素の糖質転移能を利用
した、リモデリングした糖質又は複合糖質の製造方法に
関する。
した、リモデリングした糖質又は複合糖質の製造方法に
関する。
【０００２】
【従来の技術】糖質及び複合糖質（糖タンパク質、糖脂
質、グルコサミノグリカン等）は、生物の細胞、体液、
果実、種や、微生物の細胞又はその培養液中に存在して
おり、重要な生物活性を有していることが知られてい
る。最近その生物活性を医薬品として利用しようという
試みが、遺伝子組換え技術の発展と共に盛んに行われる
ようになってきた。例えば、インターフェロン、エリス
ロポエチン、ティシュプラスミノーゲンアクチベーター
などがそれであり、培養動物細胞で生産され、薬剤とし
て使用されている。しかし、これらの複合糖質は、投与
後体内での代謝速度が早く、大量投与が必要であり、そ
の副作用も問題にされている。複合糖質中の糖鎖が体内
での代謝（例えば、レセプターへの結合、プロテアーゼ
による分解等）の速度に深く関与しており、その糖鎖の
構造を変えることにより、複合糖質の機能増強（代謝速
度や活性の調節等）に役立つと考えられている。現在広
く用いられている糖鎖のリモデリングの手法は、Ｄ．
Ｈ．ジョジアッセ（Ｄ．Ｈ．Joziasse）ら〔ヨーロピア
ン ジャーナル オブ バイオケミストリー( Eur. J.
Biochem.）、第１９１巻、第７５〜８３頁（１９９
０）〕が記載しているように、エキソグリコシダーゼ又
はグリコシルトランスフェラーゼを用いたものであり、
糖鎖の非還元末端からの逐次変換である。また、エンド
グリコシダーゼを用いた糖転移反応の報告は、Ｒ．Ｂ．
トリムブル（Ｒ．Ｂ．Trimble)ら〔ジャーナル オブ
バイオロジカル ケミストリー（Ｊ．Biol. Chem.)、第
２６１巻、第１２０００〜１２００５頁（１９８６）〕
のフラボバクテリウム メニンゴセプチカム( Flavobac
terium meningosepticum）由来のエンド−Ｆに関するも
のと、Ｒ．Ｍ．バーデールス（Ｒ．Ｍ．Bardales)ら
〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、
第２６４巻、第１９８９３〜１９８９７頁（１９８
９）〕のデイプロコッカス ニューモニエ( Diplococcu
s pneumoniae )由来のエンド−α−Ｎ−アセチルガラク
トサミニダーゼに関するものである。前者はグリセロー
ルがアクセプターとなるという報告であり、後者は、グ
リセロール、トリス、ｐ−ニトロフェノール、セリン、
スレオニンがアクセプターとなるという報告である。
質、グルコサミノグリカン等）は、生物の細胞、体液、
果実、種や、微生物の細胞又はその培養液中に存在して
おり、重要な生物活性を有していることが知られてい
る。最近その生物活性を医薬品として利用しようという
試みが、遺伝子組換え技術の発展と共に盛んに行われる
ようになってきた。例えば、インターフェロン、エリス
ロポエチン、ティシュプラスミノーゲンアクチベーター
などがそれであり、培養動物細胞で生産され、薬剤とし
て使用されている。しかし、これらの複合糖質は、投与
後体内での代謝速度が早く、大量投与が必要であり、そ
の副作用も問題にされている。複合糖質中の糖鎖が体内
での代謝（例えば、レセプターへの結合、プロテアーゼ
による分解等）の速度に深く関与しており、その糖鎖の
構造を変えることにより、複合糖質の機能増強（代謝速
度や活性の調節等）に役立つと考えられている。現在広
く用いられている糖鎖のリモデリングの手法は、Ｄ．
Ｈ．ジョジアッセ（Ｄ．Ｈ．Joziasse）ら〔ヨーロピア
ン ジャーナル オブ バイオケミストリー( Eur. J.
Biochem.）、第１９１巻、第７５〜８３頁（１９９
０）〕が記載しているように、エキソグリコシダーゼ又
はグリコシルトランスフェラーゼを用いたものであり、
糖鎖の非還元末端からの逐次変換である。また、エンド
グリコシダーゼを用いた糖転移反応の報告は、Ｒ．Ｂ．
トリムブル（Ｒ．Ｂ．Trimble)ら〔ジャーナル オブ
バイオロジカル ケミストリー（Ｊ．Biol. Chem.)、第
２６１巻、第１２０００〜１２００５頁（１９８６）〕
のフラボバクテリウム メニンゴセプチカム( Flavobac
terium meningosepticum）由来のエンド−Ｆに関するも
のと、Ｒ．Ｍ．バーデールス（Ｒ．Ｍ．Bardales)ら
〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、
第２６４巻、第１９８９３〜１９８９７頁（１９８
９）〕のデイプロコッカス ニューモニエ( Diplococcu
s pneumoniae )由来のエンド−α−Ｎ−アセチルガラク
トサミニダーゼに関するものである。前者はグリセロー
ルがアクセプターとなるという報告であり、後者は、グ
リセロール、トリス、ｐ−ニトロフェノール、セリン、
スレオニンがアクセプターとなるという報告である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】前述のように、糖鎖を
リモデリングした複合糖質の安定性や生物活性が天然の
複合糖質に比して増強されれば、医薬品に応用した場合
非常に有用である。しかし、従来のエキソグリコシダー
ゼ又はグリコシルトランスフェラーゼを用いたリモデリ
ングの手法では糖残基１つ１つについて、酵素反応を行
わなければならず、反応ステップが多くなり大変煩雑で
ある。また、前述のエンドグリコシダーゼを用いた糖転
移反応の場合も、糖質や複合糖質がアクセプターとなる
ものではなく、これまでに糖質や複合糖質が直接アクセ
プターとなる糖鎖のリモデリングの機構は見出されてい
ない。本発明の目的は、糖質や複合糖質が直接アクセプ
ターとなる糖鎖のリモデリング反応を見出し、該反応を
利用した簡便な糖質又は複合糖質の製造方法を提供する
ことにある。
リモデリングした複合糖質の安定性や生物活性が天然の
複合糖質に比して増強されれば、医薬品に応用した場合
非常に有用である。しかし、従来のエキソグリコシダー
ゼ又はグリコシルトランスフェラーゼを用いたリモデリ
ングの手法では糖残基１つ１つについて、酵素反応を行
わなければならず、反応ステップが多くなり大変煩雑で
ある。また、前述のエンドグリコシダーゼを用いた糖転
移反応の場合も、糖質や複合糖質がアクセプターとなる
ものではなく、これまでに糖質や複合糖質が直接アクセ
プターとなる糖鎖のリモデリングの機構は見出されてい
ない。本発明の目的は、糖質や複合糖質が直接アクセプ
ターとなる糖鎖のリモデリング反応を見出し、該反応を
利用した簡便な糖質又は複合糖質の製造方法を提供する
ことにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明は糖質又は複合糖質の製造方法に関し、エンドグリ
コシダーゼの存在下、下記式（化１）：
発明は糖質又は複合糖質の製造方法に関し、エンドグリ
コシダーゼの存在下、下記式（化１）：
【０００５】
【化１】 Ｘ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｙ ＋ Ｚ → Ｘ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｚ ＋ Ｙ
【０００６】（式中Ｘは糖質、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセ
チルグルコサミン、Ｙは糖質又は複合糖質、Ｚは糖質又
は複合糖質を示す）で表される転移反応を行うことを特
徴とする。
チルグルコサミン、Ｙは糖質又は複合糖質、Ｚは糖質又
は複合糖質を示す）で表される転移反応を行うことを特
徴とする。
【０００７】本発明者らは、１段階の反応で糖鎖の転移
反応を行えることが期待できるエンドグリコシダーゼを
用いて、糖質及び複合糖質に糖鎖を転移させ、従来の安
定性及び活性が増強された新規糖質及び複合糖質の製造
をすべく、鋭意研究したところ、この目的にかなうエン
ドグリコシダーゼを見出し、その反応方法を更に研究し
た結果本発明を完成した。
反応を行えることが期待できるエンドグリコシダーゼを
用いて、糖質及び複合糖質に糖鎖を転移させ、従来の安
定性及び活性が増強された新規糖質及び複合糖質の製造
をすべく、鋭意研究したところ、この目的にかなうエン
ドグリコシダーゼを見出し、その反応方法を更に研究し
た結果本発明を完成した。
【０００８】本発明は、糖鎖の転移反応能を持つエンド
グリコシダーゼを用いて、糖質及び複合糖質の糖鎖をリ
モデリングすることを特徴とする新規糖質及び複合糖質
の製造方法である。
グリコシダーゼを用いて、糖質及び複合糖質の糖鎖をリ
モデリングすることを特徴とする新規糖質及び複合糖質
の製造方法である。
【０００９】本発明におけるエンドグリコシダーゼとし
ては、例えばＫ．タケガワ（Ｋ．Takegawa）ら〔アプラ
イド アンド エンバイロメンタルマイクロバイオロジ
ー( Appl. Environ. Microbiol.)、第５５巻、第３１０
７〜３１１２頁（１９８９）〕によって報告されてい
る、アルスロバクター プロトホルミエ( Arthrobacter
protophormiae )ＡＫＵ ０６４７によって生産される
エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（以下、
本酵素をエンドＡと称す）があり、該酵素は例えば下記
式（化２）のオリゴマンノース型の糖鎖の矢印の部分を
よく分解するという基質特異性が述べられている。
ては、例えばＫ．タケガワ（Ｋ．Takegawa）ら〔アプラ
イド アンド エンバイロメンタルマイクロバイオロジ
ー( Appl. Environ. Microbiol.)、第５５巻、第３１０
７〜３１１２頁（１９８９）〕によって報告されてい
る、アルスロバクター プロトホルミエ( Arthrobacter
protophormiae )ＡＫＵ ０６４７によって生産される
エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（以下、
本酵素をエンドＡと称す）があり、該酵素は例えば下記
式（化２）のオリゴマンノース型の糖鎖の矢印の部分を
よく分解するという基質特異性が述べられている。
【００１０】
【化２】
【００１１】しかしこの酵素が糖鎖の転移反応を行う活
性を保存していることは知られていない。確かに前述の
ごとくエンドＦやディプロコッカス由来のエンド−α−
Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの糖鎖転移反応の報
告はあるが、糖又は糖鎖又は糖ペプチド又は糖タンパク
質への糖鎖転移反応は、本発明者らが始めて見出したも
のである。
性を保存していることは知られていない。確かに前述の
ごとくエンドＦやディプロコッカス由来のエンド−α−
Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの糖鎖転移反応の報
告はあるが、糖又は糖鎖又は糖ペプチド又は糖タンパク
質への糖鎖転移反応は、本発明者らが始めて見出したも
のである。
【００１２】前述の本発明の転移反応において、Ｘは糖
質を示し、酵素としてエンドＡを用いる場合、Ｘとして
はマンノース、グルコース等より構成されるホモオリゴ
マー、マンノース、グリコース、Ｎ−アセチルグルコサ
ミン等の２成分以上より成るヘテロオリゴマーによく作
用する。
質を示し、酵素としてエンドＡを用いる場合、Ｘとして
はマンノース、グルコース等より構成されるホモオリゴ
マー、マンノース、グリコース、Ｎ−アセチルグルコサ
ミン等の２成分以上より成るヘテロオリゴマーによく作
用する。
【００１３】Ｙは糖質又は複合糖質であり、本発明のエ
ンドＡを用いる場合、グリコース、マンノース、Ｎ−ア
セチルグルコサミン等の単糖、これらの２単糖以上のホ
モオリゴマー、これらの２成分以上より成るヘテロオリ
ゴマー等の糖質によく作用し、またその末端にＡｓｎ
や、Ａｓｎを介しポリペプチドが結合した複合糖質、そ
の末端にＴｈｒ又はＳｅｒや、Ｔｈｒ又はＳｅｒを介し
ポリペプチドが結合した複合糖質等でもよい。
ンドＡを用いる場合、グリコース、マンノース、Ｎ−ア
セチルグルコサミン等の単糖、これらの２単糖以上のホ
モオリゴマー、これらの２成分以上より成るヘテロオリ
ゴマー等の糖質によく作用し、またその末端にＡｓｎ
や、Ａｓｎを介しポリペプチドが結合した複合糖質、そ
の末端にＴｈｒ又はＳｅｒや、Ｔｈｒ又はＳｅｒを介し
ポリペプチドが結合した複合糖質等でもよい。
【００１４】また、エンドＡを用いた転移反応のアクセ
プターのＺとしては、その非還元末端にＣ−４位が遊離
の糖を有する糖質又は複合糖質をアクセプターとする場
合よく反応する。該アクセプターのＣ−４位が遊離の糖
の中でもそのＣ−４位及びＣ−６位がグルコースと同じ
立体配座をもつものが特によく、グルコース、グルコサ
ミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノース、マンノ
サミン、Ｎ−アセチルマンノサミン、アロース等の単
糖、又はこれらの糖を非還元末端とする糖質、又は複合
糖質によく作用する。またこれらの糖質のα−及びβ−
メチルグリコシド、又はα−及びβ−ｐ−ニトロフェニ
ルグリコシド、グルコース−１−リン酸、マンノース−
１−リン酸等の糖質にも作用する。
プターのＺとしては、その非還元末端にＣ−４位が遊離
の糖を有する糖質又は複合糖質をアクセプターとする場
合よく反応する。該アクセプターのＣ−４位が遊離の糖
の中でもそのＣ−４位及びＣ−６位がグルコースと同じ
立体配座をもつものが特によく、グルコース、グルコサ
ミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノース、マンノ
サミン、Ｎ−アセチルマンノサミン、アロース等の単
糖、又はこれらの糖を非還元末端とする糖質、又は複合
糖質によく作用する。またこれらの糖質のα−及びβ−
メチルグリコシド、又はα−及びβ−ｐ−ニトロフェニ
ルグリコシド、グルコース−１−リン酸、マンノース−
１−リン酸等の糖質にも作用する。
【００１５】本発明の転移反応は、通常、原料の糖質又
は複合糖質、エンドグリコシダーゼ、及び緩衝液を含む
出発溶液に、アクセプターの糖質又は複合糖質を加えて
行われる。原料及びアクセプターの使用量は特に制限さ
れず、その飽和量まで使用できるが、アクセプターが過
剰に存在する状態が好ましい。エンドグリコシダーゼの
使用量も特に制限されず広い範囲から適宜選択できる
が、出発溶液１ml当り、通常１ｍＵ以上、より好ましく
は１０ｍＵ〜１０Ｕ程度使用すれば良い。緩衝液として
は、ｐＨが５〜１１程度の好適な緩衝液を用いれば良
く、通常はｐＨ６付近で酢酸緩衝液中で反応を行う。
は複合糖質、エンドグリコシダーゼ、及び緩衝液を含む
出発溶液に、アクセプターの糖質又は複合糖質を加えて
行われる。原料及びアクセプターの使用量は特に制限さ
れず、その飽和量まで使用できるが、アクセプターが過
剰に存在する状態が好ましい。エンドグリコシダーゼの
使用量も特に制限されず広い範囲から適宜選択できる
が、出発溶液１ml当り、通常１ｍＵ以上、より好ましく
は１０ｍＵ〜１０Ｕ程度使用すれば良い。緩衝液として
は、ｐＨが５〜１１程度の好適な緩衝液を用いれば良
く、通常はｐＨ６付近で酢酸緩衝液中で反応を行う。
【００１６】本発明の転移反応は、出発溶液に有機溶
媒、無機塩等を加えて疎水性状態としてもよく反応し、
有機溶媒として、例えばメタノールを用いれば、水難溶
性の糖質又は複合糖質を使用することができる。エンド
Ａの場合、４０％メタノールの存在下でもよく反応し、
５０％メタノールの存在下でも約８０％の相対活性を示
す。また、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）やＤＭＦ
（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）なども用いることが
できる。
媒、無機塩等を加えて疎水性状態としてもよく反応し、
有機溶媒として、例えばメタノールを用いれば、水難溶
性の糖質又は複合糖質を使用することができる。エンド
Ａの場合、４０％メタノールの存在下でもよく反応し、
５０％メタノールの存在下でも約８０％の相対活性を示
す。また、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）やＤＭＦ
（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）なども用いることが
できる。
【００１７】本発明の転移反応は、エンドＡを用いる場
合、通常室温〜６０℃程度、好ましくは３０〜４０℃程
度の温度下及びｐＨ５〜１１程度のｐＨ条件下に行わ
れ、その反応条件にもよるが、転移反応は通常５分〜３
０分程度、好ましくは１０〜２０分程度で終了する。
合、通常室温〜６０℃程度、好ましくは３０〜４０℃程
度の温度下及びｐＨ５〜１１程度のｐＨ条件下に行わ
れ、その反応条件にもよるが、転移反応は通常５分〜３
０分程度、好ましくは１０〜２０分程度で終了する。
【００１８】生成するリモデリングした糖質又は複合糖
質は、公知の手段に従って反応終了液から容易に分離・
精製することができる。例えば、ゲルろ過カラムクロマ
トグラフィー、イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィ
ー等により反応終了液から、リモデリングした糖質又は
複合糖質を分離し、更に濃縮、脱塩、凍結乾燥等を行え
ばよい。
質は、公知の手段に従って反応終了液から容易に分離・
精製することができる。例えば、ゲルろ過カラムクロマ
トグラフィー、イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィ
ー等により反応終了液から、リモデリングした糖質又は
複合糖質を分離し、更に濃縮、脱塩、凍結乾燥等を行え
ばよい。
【００１９】また、本発明の方法で製造した糖質又は複
合糖質は各種糖質分解酵素の基質ともなり、各種有用酵
素の検索にも用いることができる。例えば、エンドＡの
存在下、（Ｍａｎ）6 （ＧｌｃＮＡｃ）2 Ａｓｎにα−
ｐ−ニトロフェニルグルコース（ｐ−ＮＰ−α−Ｇｌ
ｃ）を作用させ、得られる（Ｍａｎ）6 （ＧｌｃＮＡ
ｃ）1 （Ｇｌｃ）1 −α−ＰＮＰは試料中のエンド−β
−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの検出及び測定に用
いることができる。すなわち試料中の目的の酵素が存在
すれば、ｐ−ＮＰ−α−Ｇｌｃが遊離し、次にα−グリ
コシダーゼを作用させれば遊離のｐ−ニトロフェノール
が黄色を示し、ラジオアイソトープや蛍光計などを必要
とせず、試料中の酵素活性を測定することができる。試
料としては例えば、微生物の培養液、培養液からの精製
物、動物、植物等からの調製物等を用いることができ
る。またｐ−ＮＰ−α−Ｇｌｃの替りに例えば、Ｘ−Ｇ
ｌｃ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｄ−
グルコシド）を用いることができ、この場合は最終的に
は青色の呈色が示される。
合糖質は各種糖質分解酵素の基質ともなり、各種有用酵
素の検索にも用いることができる。例えば、エンドＡの
存在下、（Ｍａｎ）6 （ＧｌｃＮＡｃ）2 Ａｓｎにα−
ｐ−ニトロフェニルグルコース（ｐ−ＮＰ−α−Ｇｌ
ｃ）を作用させ、得られる（Ｍａｎ）6 （ＧｌｃＮＡ
ｃ）1 （Ｇｌｃ）1 −α−ＰＮＰは試料中のエンド−β
−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの検出及び測定に用
いることができる。すなわち試料中の目的の酵素が存在
すれば、ｐ−ＮＰ−α−Ｇｌｃが遊離し、次にα−グリ
コシダーゼを作用させれば遊離のｐ−ニトロフェノール
が黄色を示し、ラジオアイソトープや蛍光計などを必要
とせず、試料中の酵素活性を測定することができる。試
料としては例えば、微生物の培養液、培養液からの精製
物、動物、植物等からの調製物等を用いることができ
る。またｐ−ＮＰ−α−Ｇｌｃの替りに例えば、Ｘ−Ｇ
ｌｃ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｄ−
グルコシド）を用いることができ、この場合は最終的に
は青色の呈色が示される。
【００２０】また、例えば本発明のＰＮＰ化糖質を還元
し、ｐ−アミノフェニル糖質を調製し、次に、例えば活
性化カルボキシルアガロースや臭化シアン活性化アガロ
ース等に結合させることにより、糖質が結合した担体を
容易に調製することができる。この糖質結合担体は各種
レクチンの精製や、グリコシダーゼ、グリコシルトラン
スフェラーゼのアフィニティー担体として有用である。
また、例えば本発明のメチルグリコシド化糖質を用いて
も、該糖質はエポキシ活性化アガロース等に容易に固定
化することができ、調製した糖質結合担体は上記と同様
の目的で使用することができる。
し、ｐ−アミノフェニル糖質を調製し、次に、例えば活
性化カルボキシルアガロースや臭化シアン活性化アガロ
ース等に結合させることにより、糖質が結合した担体を
容易に調製することができる。この糖質結合担体は各種
レクチンの精製や、グリコシダーゼ、グリコシルトラン
スフェラーゼのアフィニティー担体として有用である。
また、例えば本発明のメチルグリコシド化糖質を用いて
も、該糖質はエポキシ活性化アガロース等に容易に固定
化することができ、調製した糖質結合担体は上記と同様
の目的で使用することができる。
【００２１】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。
【００２２】実施例１ ＧｌｃＮＡｃへの糖鎖の転移反
応 （１）前出、アプライド アンド エンバイロメンタル
マイクロバイオロジーに記載の方法に従って、アルス
ロバクター プロトホルミエ ＡＫＵ ０６４７を培養
し、エンドＡを調製し、以下実施例に使用した。該菌株
は、Arthrobacterprotophormiae ＡＫＵ ０６４７と表
示し、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第
１２４３０号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２４３０）として寄託
されている。１．３ＭのＧｌｃＮＡｃ（和光純薬社製）
の水溶液１００μｌに、１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）
を２０μｌと、エンドＡを１０ｍＵ含む酵素溶液５０μ
ｌを加え、３７℃にて１０分間予備インキュベーション
した。次いで（Ｍａｎ）6 （ＧｌｃＮＡｃ）2 −Ａｓｎ
（バイオカーブケミカルズ社製）（１３mg／ml）を１０
０μｌ添加し、３７℃で２０分間反応させた後、１００
℃にて３分間加熱処理し、反応を止めた。反応液を凍結
乾燥後、特開平１−１０１７７号公報に記載の方法に準
じ２−ピリジルアミノ化（以下ＰＡ化と略記する）を行
い、ＨＰＬＣにて精製し、ＰＡ化された転移生成物であ
る（Ｍａｎ）6 （ＧｌｃＮＡｃ）2−ＰＡを得た。次に
このＰＡ化物の組成分析、ＮＭＲ及びＭＳ分析を行い、
その糖鎖構造を確認した。 （２）上記と同様の条件で転移反応を行い、反応開始
後、５分、１０分、２０分、３０分、及び６０分後にサ
ンプリングを行い、上記と同様にＰＡ化生成物を調製
し、その収率を求めた。図１は反応時間（分、横軸）と
収率（％、縦軸）との関係を示す図であり、２０分後で
約５０％の収率を示した。
応 （１）前出、アプライド アンド エンバイロメンタル
マイクロバイオロジーに記載の方法に従って、アルス
ロバクター プロトホルミエ ＡＫＵ ０６４７を培養
し、エンドＡを調製し、以下実施例に使用した。該菌株
は、Arthrobacterprotophormiae ＡＫＵ ０６４７と表
示し、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第
１２４３０号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２４３０）として寄託
されている。１．３ＭのＧｌｃＮＡｃ（和光純薬社製）
の水溶液１００μｌに、１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）
を２０μｌと、エンドＡを１０ｍＵ含む酵素溶液５０μ
ｌを加え、３７℃にて１０分間予備インキュベーション
した。次いで（Ｍａｎ）6 （ＧｌｃＮＡｃ）2 −Ａｓｎ
（バイオカーブケミカルズ社製）（１３mg／ml）を１０
０μｌ添加し、３７℃で２０分間反応させた後、１００
℃にて３分間加熱処理し、反応を止めた。反応液を凍結
乾燥後、特開平１−１０１７７号公報に記載の方法に準
じ２−ピリジルアミノ化（以下ＰＡ化と略記する）を行
い、ＨＰＬＣにて精製し、ＰＡ化された転移生成物であ
る（Ｍａｎ）6 （ＧｌｃＮＡｃ）2−ＰＡを得た。次に
このＰＡ化物の組成分析、ＮＭＲ及びＭＳ分析を行い、
その糖鎖構造を確認した。 （２）上記と同様の条件で転移反応を行い、反応開始
後、５分、１０分、２０分、３０分、及び６０分後にサ
ンプリングを行い、上記と同様にＰＡ化生成物を調製
し、その収率を求めた。図１は反応時間（分、横軸）と
収率（％、縦軸）との関係を示す図であり、２０分後で
約５０％の収率を示した。
【００２３】実施例２ （ＧｌｃＮＡｃ）2 への糖鎖の
転移反応 １．３Ｍの（ＧｌｃＮＡｃ）2 （生化学工業社製）の水
溶液１００μｌに、１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を２
０μｌと、実施例１に記載のエンドＡを１０ｍＵ含む酵
素溶液５０μｌを加え、３７℃にて１０分間予備インキ
ュベーションした。次いで（Ｍａｎ）6 （ＧｌｃＮＡ
ｃ）2 −Ａｓｎ（１３mg／ml）を１００μｌ添加し、３
７℃で２０分間反応させた後、１００℃にて３分間加熱
処理し、反応を止めた。反応液を凍結乾燥後、実施例１
に準じＰＡ化した。ＨＰＬＣを用いて精製し、ＰＡ化さ
れた転移生成物である（Ｍａｎ）6 （ＧｌｃＮＡｃ）3
−ＰＡを得た。次にこのＰＡ化物の組成分析、ＮＭＲ及
びＭＳ分析を行い、その糖鎖構造を確認した。
転移反応 １．３Ｍの（ＧｌｃＮＡｃ）2 （生化学工業社製）の水
溶液１００μｌに、１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を２
０μｌと、実施例１に記載のエンドＡを１０ｍＵ含む酵
素溶液５０μｌを加え、３７℃にて１０分間予備インキ
ュベーションした。次いで（Ｍａｎ）6 （ＧｌｃＮＡ
ｃ）2 −Ａｓｎ（１３mg／ml）を１００μｌ添加し、３
７℃で２０分間反応させた後、１００℃にて３分間加熱
処理し、反応を止めた。反応液を凍結乾燥後、実施例１
に準じＰＡ化した。ＨＰＬＣを用いて精製し、ＰＡ化さ
れた転移生成物である（Ｍａｎ）6 （ＧｌｃＮＡｃ）3
−ＰＡを得た。次にこのＰＡ化物の組成分析、ＮＭＲ及
びＭＳ分析を行い、その糖鎖構造を確認した。
【００２４】実施例３ （ＧｌｃＮＡｃ）3 への糖鎖の
転移反応 １．３Ｍの（ＧｌｃＮＡｃ）3 （生化学工業社製）の水
溶液１００μｌに、１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を２
０μｌと、実施例１に記載のエンドＡを１０ｍＵ含む酵
素溶液５０μｌを加え、３７℃にて１０分間予備インキ
ュベーションした。次いで（Ｍａｎ）6 （ＧｌｃＮＡ
ｃ）2 −Ａｓｎ（１３mg／ml）を１００μｌ添加し、３
７℃で２０分間反応させた後、１００℃にて３分間加熱
処理し、反応を止めた。反応液を凍結乾燥後、実施例１
に準じＰＡ化した。ＨＰＬＣを用いて精製し、ＰＡ化さ
れた転移生成物である（Ｍａｎ）6 （ＧｌｃＮＡｃ）4
−ＰＡを得た。次にこのＰＡ化物の組成分析、ＮＭＲ及
びＭＳ分析を行い、その糖鎖構造を確認した。
転移反応 １．３Ｍの（ＧｌｃＮＡｃ）3 （生化学工業社製）の水
溶液１００μｌに、１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を２
０μｌと、実施例１に記載のエンドＡを１０ｍＵ含む酵
素溶液５０μｌを加え、３７℃にて１０分間予備インキ
ュベーションした。次いで（Ｍａｎ）6 （ＧｌｃＮＡ
ｃ）2 −Ａｓｎ（１３mg／ml）を１００μｌ添加し、３
７℃で２０分間反応させた後、１００℃にて３分間加熱
処理し、反応を止めた。反応液を凍結乾燥後、実施例１
に準じＰＡ化した。ＨＰＬＣを用いて精製し、ＰＡ化さ
れた転移生成物である（Ｍａｎ）6 （ＧｌｃＮＡｃ）4
−ＰＡを得た。次にこのＰＡ化物の組成分析、ＮＭＲ及
びＭＳ分析を行い、その糖鎖構造を確認した。
【００２５】実施例４ Ｇｌｃへの糖鎖の転移反応 １．３ＭのＧｌｃ（和光純薬社製）の水溶液１００μｌ
に、１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を２０μｌと、実施
例１に記載のエンドＡを１０ｍＵ含む酵素溶液５０μｌ
を加え、３７℃にて１０分間予備インキュベーションし
た。次いで（Ｍａｎ）6 （ＧｌｃＮＡｃ）2 −Ａｓｎ
（１３mg／ml）を１００μｌ添加し、３７℃で２０分間
反応させた後、１００℃にて３分間加熱処理し、反応を
止めた。反応液を凍結乾燥後、実施例１に準じＰＡ化し
た。ＨＰＬＣを用いて精製し、ＰＡ化された転移生成物
である（Ｍａｎ）6 （ＧｌｃＮＡｃ）1 −（Ｇｌｃ）1
−ＰＡを得た。次にこのＰＡ化物の組成分析、ＮＭＲ及
びＭＳ分析を行い、その糖鎖構造を確認した。
に、１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を２０μｌと、実施
例１に記載のエンドＡを１０ｍＵ含む酵素溶液５０μｌ
を加え、３７℃にて１０分間予備インキュベーションし
た。次いで（Ｍａｎ）6 （ＧｌｃＮＡｃ）2 −Ａｓｎ
（１３mg／ml）を１００μｌ添加し、３７℃で２０分間
反応させた後、１００℃にて３分間加熱処理し、反応を
止めた。反応液を凍結乾燥後、実施例１に準じＰＡ化し
た。ＨＰＬＣを用いて精製し、ＰＡ化された転移生成物
である（Ｍａｎ）6 （ＧｌｃＮＡｃ）1 −（Ｇｌｃ）1
−ＰＡを得た。次にこのＰＡ化物の組成分析、ＮＭＲ及
びＭＳ分析を行い、その糖鎖構造を確認した。
【００２６】実施例５ ゲンチオビオース〔（Ｇｌｃ）
2 〕への糖鎖の転移反応 １．３Ｍの（Ｇｌｃ）2 （生化学工業社製）の水溶液１
００μｌに、１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を２０μｌ
と、実施例１に記載のエンドＡを１０ｍＵ含む酵素溶液
５０μｌを加え、３７℃にて１０分間予備インキュベー
ションした。次いで（Ｍａｎ）6 （ＧｌｃＮＡｃ）2 −
Ａｓｎ（１３mg／ml）を１００μｌ添加し、３７℃で２
０分間反応させた後、１００℃にて３分間加熱処理し、
反応を止めた。反応液を凍結乾燥後、実施例１に準じＰ
Ａ化した。ＨＰＬＣを用いて精製し、ＰＡ化された転移
生成物である（Ｍａｎ）6 （ＧｌｃＮＡｃ）1 −（Ｇｌ
ｃ）2 −ＰＡを得た。次にこのＰＡ化物の組成分析、Ｎ
ＭＲ及びＭＳ分析を行い、その糖鎖構造を確認した。
2 〕への糖鎖の転移反応 １．３Ｍの（Ｇｌｃ）2 （生化学工業社製）の水溶液１
００μｌに、１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を２０μｌ
と、実施例１に記載のエンドＡを１０ｍＵ含む酵素溶液
５０μｌを加え、３７℃にて１０分間予備インキュベー
ションした。次いで（Ｍａｎ）6 （ＧｌｃＮＡｃ）2 −
Ａｓｎ（１３mg／ml）を１００μｌ添加し、３７℃で２
０分間反応させた後、１００℃にて３分間加熱処理し、
反応を止めた。反応液を凍結乾燥後、実施例１に準じＰ
Ａ化した。ＨＰＬＣを用いて精製し、ＰＡ化された転移
生成物である（Ｍａｎ）6 （ＧｌｃＮＡｃ）1 −（Ｇｌ
ｃ）2 −ＰＡを得た。次にこのＰＡ化物の組成分析、Ｎ
ＭＲ及びＭＳ分析を行い、その糖鎖構造を確認した。
【００２７】実施例６ Ｍａｎへの糖鎖の転移反応 １．３ＭのＭａｎ（和光純薬社製）の水溶液１００μｌ
に、１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を２０μｌと、実施
例１に記載のエンドＡを１０ｍＵ含む酵素溶液５０μｌ
を加え、３７℃にて１０分間予備インキュベーションし
た。次いで（Ｍａｎ）6 （ＧｌｃＮＡｃ）2 −Ａｓｎ
（１３mg／ml）を１００μｌ添加し、３７℃で２０分間
反応させた後、１００℃にて３分間加熱処理し、反応を
止めた。反応液を凍結乾燥後、実施例１に準じＰＡ化し
た。ＨＰＬＣを用いて精製し、ＰＡ化された転移生成物
である（Ｍａｎ）6 （ＧｌｃＮＡｃ）1 （Ｍａｎ）1 −
ＰＡを得た。次にこのＰＡ化物の組成分析、ＮＭＲ及び
ＭＳ分析を行い、その糖鎖構造を確認した。
に、１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を２０μｌと、実施
例１に記載のエンドＡを１０ｍＵ含む酵素溶液５０μｌ
を加え、３７℃にて１０分間予備インキュベーションし
た。次いで（Ｍａｎ）6 （ＧｌｃＮＡｃ）2 −Ａｓｎ
（１３mg／ml）を１００μｌ添加し、３７℃で２０分間
反応させた後、１００℃にて３分間加熱処理し、反応を
止めた。反応液を凍結乾燥後、実施例１に準じＰＡ化し
た。ＨＰＬＣを用いて精製し、ＰＡ化された転移生成物
である（Ｍａｎ）6 （ＧｌｃＮＡｃ）1 （Ｍａｎ）1 −
ＰＡを得た。次にこのＰＡ化物の組成分析、ＮＭＲ及び
ＭＳ分析を行い、その糖鎖構造を確認した。
【００２８】実施例７ ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎへの糖鎖
の転移反応 １．３ＭのＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ（バイオカーブケミカ
ルズ社製）の水溶液１００μｌに、１Ｍ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．０）を２０μｌと、実施例１に記載のエンドＡを
１０ｍＵ含む酵素溶液５０μｌを加え、３７℃にて１０
分間予備インキュベーションした。次いで（Ｍａｎ）6
（ＧｌｃＮＡｃ）2 （１３mg／ml）を１００μｌ添加
し、３７℃で２０分間反応させた後、１００℃にて３分
間加熱処理し、反応を止めた。反応液をダンシル化（以
下Ｄｎｓ化と略記する）した後、ＨＰＬＣを用いて精製
し、Ｄｎｓ化された転移生成物である（Ｍａｎ）6 （Ｇ
ｌｃＮＡｃ）2 −Ａｓｎ−Ｄｎｓを得た。次にこのＤｎ
ｓ化物の組成分析、ＮＭＲ及びＭＳ分析を行い、その糖
鎖構造を確認した。
の転移反応 １．３ＭのＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ（バイオカーブケミカ
ルズ社製）の水溶液１００μｌに、１Ｍ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．０）を２０μｌと、実施例１に記載のエンドＡを
１０ｍＵ含む酵素溶液５０μｌを加え、３７℃にて１０
分間予備インキュベーションした。次いで（Ｍａｎ）6
（ＧｌｃＮＡｃ）2 （１３mg／ml）を１００μｌ添加
し、３７℃で２０分間反応させた後、１００℃にて３分
間加熱処理し、反応を止めた。反応液をダンシル化（以
下Ｄｎｓ化と略記する）した後、ＨＰＬＣを用いて精製
し、Ｄｎｓ化された転移生成物である（Ｍａｎ）6 （Ｇ
ｌｃＮＡｃ）2 −Ａｓｎ−Ｄｎｓを得た。次にこのＤｎ
ｓ化物の組成分析、ＮＭＲ及びＭＳ分析を行い、その糖
鎖構造を確認した。
【００２９】実施例８ ＰＮＰ−α−Ｇｌｃへの糖鎖の
転移反応 １．３ＭのＰＮＰ−α−Ｇｌｃ（生化学工業社製）の水
溶液１００μｌに、１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を２
０μｌと、実施例１に記載のエンドＡを１０ｍＵ含む酵
素溶液５０μｌを加え、３７℃にて１０分間予備インキ
ュベーションした。次いで（Ｍａｎ）6 （ＧｌｃＮＡ
ｃ）2 −Ａｓｎ（１３mg／ml）を１００μｌ添加し、３
７℃で２０分間反応させた後、１００℃にて３分間加熱
処理し、反応を止めた。反応液を凍結乾燥後、ＨＰＬＣ
を用いて精製し、転移生成物である（Ｍａｎ）6 （Ｇｌ
ｃＮＡｃ）1 （Ｇｌｃ）1 −ＰＮＰを得た。次にこの生
成物の組成分析、ＮＭＲ及びＭＳ分析を行い、その糖鎖
構造を確認した。
転移反応 １．３ＭのＰＮＰ−α−Ｇｌｃ（生化学工業社製）の水
溶液１００μｌに、１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を２
０μｌと、実施例１に記載のエンドＡを１０ｍＵ含む酵
素溶液５０μｌを加え、３７℃にて１０分間予備インキ
ュベーションした。次いで（Ｍａｎ）6 （ＧｌｃＮＡ
ｃ）2 −Ａｓｎ（１３mg／ml）を１００μｌ添加し、３
７℃で２０分間反応させた後、１００℃にて３分間加熱
処理し、反応を止めた。反応液を凍結乾燥後、ＨＰＬＣ
を用いて精製し、転移生成物である（Ｍａｎ）6 （Ｇｌ
ｃＮＡｃ）1 （Ｇｌｃ）1 −ＰＮＰを得た。次にこの生
成物の組成分析、ＮＭＲ及びＭＳ分析を行い、その糖鎖
構造を確認した。
【００３０】参考例１ （Ｍａｎ）6 （ＧｌｃＮＡｃ）
1 （Ｇｌｃ）1 −ＰＮＰを用いたエンド−β−Ｎ−アセ
チルグルコサミニダーゼのスクリーニング ９６穴プレートに、基質として飽和の（Ｍａｎ）6 （Ｇ
ｌｃＮＡｃ）1 （Ｇｌｃ）1 −ＰＮＰを含む１００ｍＭ
酢酸ナトリウム緩衝液５０μｌを入れ、土壌分離細菌の
３３株を各ウエルに植菌し、８時間、３７℃にてインキ
ュベーション後、酵母由来のα−グルコシダーゼ（シグ
マ社製）５Ｕ／mlを２０μｌ加え、３時間、３７℃にて
インキュベーションした後、０．１ＭのＮａ2 ＣＯ3 溶
液を５０μｌ添加した。供試した３３菌株中、４菌株を
植菌したウエルの反応液が黄色を呈し、これらの菌株が
エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性を有
することが明確となった。上記方法を用いれば、該酵素
を持った試料の場合、反応溶液が遊離したｐ−ニトロフ
ェノールにより黄色に着色するため、容易に多数検体の
スクリーニングを行うことができる。
1 （Ｇｌｃ）1 −ＰＮＰを用いたエンド−β−Ｎ−アセ
チルグルコサミニダーゼのスクリーニング ９６穴プレートに、基質として飽和の（Ｍａｎ）6 （Ｇ
ｌｃＮＡｃ）1 （Ｇｌｃ）1 −ＰＮＰを含む１００ｍＭ
酢酸ナトリウム緩衝液５０μｌを入れ、土壌分離細菌の
３３株を各ウエルに植菌し、８時間、３７℃にてインキ
ュベーション後、酵母由来のα−グルコシダーゼ（シグ
マ社製）５Ｕ／mlを２０μｌ加え、３時間、３７℃にて
インキュベーションした後、０．１ＭのＮａ2 ＣＯ3 溶
液を５０μｌ添加した。供試した３３菌株中、４菌株を
植菌したウエルの反応液が黄色を呈し、これらの菌株が
エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性を有
することが明確となった。上記方法を用いれば、該酵素
を持った試料の場合、反応溶液が遊離したｐ−ニトロフ
ェノールにより黄色に着色するため、容易に多数検体の
スクリーニングを行うことができる。
【００３１】実施例９ Ｇｌｃ−ＯＭｅへの糖鎖の転移
反応 １．３ＭのＧｌｃ−ＯＭｅ（生化学工業社製）の水溶液
１００μｌに、１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を２０μ
ｌと、実施例１に記載のエンドＡを１０ｍＵ含む酵素溶
液５０μｌを加え、３７℃にて１０分間予備インキュベ
ーションした。次いで（Ｍａｎ）6 （ＧｌｃＮＡｃ）2
−Ａｓｎ（１３mg／ml）を１００μｌ添加し、３７℃で
２０分間反応させた後、１００℃にて３分間加熱処理
し、反応を止めた。反応液を凍結乾燥後、ＨＰＬＣを用
いて精製し、転移生成物である（Ｍａｎ）6 （ＧｌｃＮ
Ａｃ）1 （Ｇｌｃ）1 −ＯＭｅを得た。次にこの生成物
の組成分析、ＮＭＲ及びＭＳ分析を行い、その糖鎖構造
を確認した。
反応 １．３ＭのＧｌｃ−ＯＭｅ（生化学工業社製）の水溶液
１００μｌに、１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を２０μ
ｌと、実施例１に記載のエンドＡを１０ｍＵ含む酵素溶
液５０μｌを加え、３７℃にて１０分間予備インキュベ
ーションした。次いで（Ｍａｎ）6 （ＧｌｃＮＡｃ）2
−Ａｓｎ（１３mg／ml）を１００μｌ添加し、３７℃で
２０分間反応させた後、１００℃にて３分間加熱処理
し、反応を止めた。反応液を凍結乾燥後、ＨＰＬＣを用
いて精製し、転移生成物である（Ｍａｎ）6 （ＧｌｃＮ
Ａｃ）1 （Ｇｌｃ）1 −ＯＭｅを得た。次にこの生成物
の組成分析、ＮＭＲ及びＭＳ分析を行い、その糖鎖構造
を確認した。
【００３２】実施例１０ 糖タンパク質への糖鎖の転移
反応 糖タンパク質としてはリボヌクレアーゼＢ（シグマ社
製）を用い、酵素はエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサ
ミダーゼ（生化学工業社製）を使用し、Ｋ．ヤマモト
（Ｋ．Yamamoto）ら〔ジャーナル オブ ファーメンテ
ーションテクノロジー（Ｊ．Ferment. Technol.)、第６
４巻、第３９７〜４０３頁（１９８６）〕の方法に従い
ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ−（タンパク質）の状態の糖タン
パク質を調製した。次に該タンパク質を３mg含む１０μ
ｌの１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に実施例１に記載の
エンドＡを３ｍＵ含む酵素液１５μｌを加え、１０分間
インキュベーションした後、（Ｍａｎ）6 （ＧｌｃＮＡ
ｃ）2 −Ａｓｎを３７５μｇ加え、３７℃で１０分間反
応を行った。次にＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動を行い、糖鎖が転移した（Ｍａｎ）6 （ＧｌｃＮＡ
ｃ）2 Ａｓｎ−（タンパク質）の生成を確認し、ＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲルより抽出した生成物の糖組成
分析によっても確認した。
反応 糖タンパク質としてはリボヌクレアーゼＢ（シグマ社
製）を用い、酵素はエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサ
ミダーゼ（生化学工業社製）を使用し、Ｋ．ヤマモト
（Ｋ．Yamamoto）ら〔ジャーナル オブ ファーメンテ
ーションテクノロジー（Ｊ．Ferment. Technol.)、第６
４巻、第３９７〜４０３頁（１９８６）〕の方法に従い
ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ−（タンパク質）の状態の糖タン
パク質を調製した。次に該タンパク質を３mg含む１０μ
ｌの１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に実施例１に記載の
エンドＡを３ｍＵ含む酵素液１５μｌを加え、１０分間
インキュベーションした後、（Ｍａｎ）6 （ＧｌｃＮＡ
ｃ）2 −Ａｓｎを３７５μｇ加え、３７℃で１０分間反
応を行った。次にＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動を行い、糖鎖が転移した（Ｍａｎ）6 （ＧｌｃＮＡ
ｃ）2 Ａｓｎ−（タンパク質）の生成を確認し、ＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲルより抽出した生成物の糖組成
分析によっても確認した。
【００３３】
【発明の効果】本発明により、糖質又は複合糖質を直接
アクセプターとする簡便な糖質又は複合糖質のリモデリ
ング方法が提供される。該方法は目的の糖質又は複合糖
質を効率良く容易に製造できる。また、副生物の生成も
少なく、目的の糖質又は複合糖質の分離精製も容易であ
り、生体内で重要な働きを示す生理活性物質の糖鎖をリ
モデリングした物質の製造において特に有用である。
アクセプターとする簡便な糖質又は複合糖質のリモデリ
ング方法が提供される。該方法は目的の糖質又は複合糖
質を効率良く容易に製造できる。また、副生物の生成も
少なく、目的の糖質又は複合糖質の分離精製も容易であ
り、生体内で重要な働きを示す生理活性物質の糖鎖をリ
モデリングした物質の製造において特に有用である。
【図１】本発明における転移反応時間と収率との関係の
１例を示す図である。
１例を示す図である。
Claims (1)
- 【請求項１】 エンドグリコシダーゼの存在下、下記式
（化１）： 【化１】 Ｘ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｙ ＋ Ｚ → Ｘ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｚ ＋ Ｙ （式中Ｘは糖質、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサ
ミン、Ｙは糖質又は複合糖質、Ｚは糖質又は複合糖質を
示す）で表される転移反応を行うことを特徴とする糖質
又は複合糖質の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03248388A JP3105306B2 (ja) | 1991-09-03 | 1991-09-03 | 糖質又は複合糖質の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03248388A JP3105306B2 (ja) | 1991-09-03 | 1991-09-03 | 糖質又は複合糖質の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0564594A true JPH0564594A (ja) | 1993-03-19 |
| JP3105306B2 JP3105306B2 (ja) | 2000-10-30 |
Family
ID=17177369
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03248388A Expired - Fee Related JP3105306B2 (ja) | 1991-09-03 | 1991-09-03 | 糖質又は複合糖質の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3105306B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0769550A2 (en) | 1995-10-27 | 1997-04-23 | Takara Shuzo Co. Ltd. | Gene encoding endo-beta-n-acetyl glucosaminidase A |
| US5645918A (en) * | 1994-09-14 | 1997-07-08 | Toray Industries, Inc. | Magnetic recording medium having an aromatic polyamide substrate |
| US5955324A (en) * | 1994-03-30 | 1999-09-21 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Process for producing carbohydrate or glycoconjugate |
| US6962809B1 (en) | 2001-07-02 | 2005-11-08 | Hitachi, Ltd. | Sugar chain synthesizer |
-
1991
- 1991-09-03 JP JP03248388A patent/JP3105306B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5955324A (en) * | 1994-03-30 | 1999-09-21 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Process for producing carbohydrate or glycoconjugate |
| US5645918A (en) * | 1994-09-14 | 1997-07-08 | Toray Industries, Inc. | Magnetic recording medium having an aromatic polyamide substrate |
| EP0769550A2 (en) | 1995-10-27 | 1997-04-23 | Takara Shuzo Co. Ltd. | Gene encoding endo-beta-n-acetyl glucosaminidase A |
| US5985637A (en) * | 1995-10-27 | 1999-11-16 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Gene encoding endo-β-N-acetylglucosaminidase A |
| US6962809B1 (en) | 2001-07-02 | 2005-11-08 | Hitachi, Ltd. | Sugar chain synthesizer |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3105306B2 (ja) | 2000-10-30 |
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