JP4115066B2 - 糖質アミジン誘導体 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、グリコシダーゼ阻害剤として有用な糖質アミジン誘導体及びそれを含むグリコシダーゼ阻害剤に関する。
【0002】
【従来の技術】
配糖体の加水分解に関与するグリコシダーゼは、一般に酸触媒下、オキソカルベニウムカチオン中間体を経て反応を触媒していると考えられている。この種の酵素の阻害剤としては、例えば、各種グリコシダーゼの阻害剤として、微生物又は植物起源のものや有機合成により製造されたものなど多数が報告されている。微生物又は植物起源のものとしてはノジリマイシン(T.Niwa et al.、Agric.Biol.Chem. 34. 966(1970))、1-デオキシノジリマイシン(G.Legler et al.、Carbohydr.Res.、128 61(1984))、カスタノスペルミン(U.Fuhrann et al.、Biochem.Biophys.Acta.825、95(1985))、2,5-ジヒドロキシメチル-3,4-ジヒドロキシピロリジン(A.Welter et al.、Phytochem.15、747(1976))、バリダミン(S.Ogawa et al.、J.Chem.Soc.Chem.Commun.、1843(1987))などがある。また有機合成によるものとしてはアミノシクロペンタンポリオール(R.A.Farr et al.、Tetrahedron Lett.、31、7109(1990))、環状アミジン(G.Papandreou et al.、J.Am.Chem.Soc.、l15、l1682(1993))、環状グアニジン(J.Lehmann et al.、Leiebigs Ann.Chem.、805(1994))、オキザジン(W.M.Best et al.、Abstract of the 17th International Carbohydrates Symposium B2.80、354(1994))、ファゴミン(N.Asano et al.、Carbolydr.Res.、253、235(1994))、スワインソニン(G.P.Kaushal,A.D.Elbein、Trends Glycosci.Glycotechnol.、5、209(1993))、テトラゾール(tetrazole)誘導体及びイミダゾール(imidazole)誘導体などが挙げられる。これら阻害剤は例外なく窒素原子を含む糖質アナログである。
【0003】
これら阻害糖質は酵素反応解析試薬、アフィニティ担体、糖タンパク質糖鎖の機能・認識機構の解析試薬など、様々な生化学的研究に用いることができる有効な生理活性物質であり、更に医薬や農薬に利用する試みも活発に行われるようになった。このように広い分野で有効な利用が考えられる糖質分解酵素阻害剤は、微生物若しくは植物から抽出するか、又は有機合成法により製造されていた。しかし、微生物起源のものの場合、微生物培養液から阻害剤を精製することは、非常に困難である。又、植物起源のものは存在量も少なく植物から抽出や精製することが困難である。いずれの場合も、工業的製造法としてはコストや収量等の制約を受けるなどの問題が多い。
また従来のグリコシダーゼ阻害剤は、報告されている多くが糖骨格に窒素原子を含む含窒素糖質であり、酵素合成法あるいは有機合成法により調製することは容易ではなかった。つまり、有機合成法の場合、糖骨格に窒素原子を導入するためだけに数段階の有機合成反応を行なう必要があり、工業的製法としては問題があった。上記の理由からこれまでは生化学的応用が可能な糖質分解酵素阻害剤を工業的に製造することは困難であった。また、従来の含窒素糖質は、反応の中間体又は遷移状態を模倣した構造のものが多かったが、それらは、阻害活性は強いものの、酵素の基質選択性部位(グリコン部)に対応した選択的な阻害効果を発揮するものではなかった。従って、工業的に製造が可能な比較的簡単な構造を有し、かつ選択的な阻害効果を発揮し得る阻害剤が求められていた。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明の目的は、工業的に容易に製造可能な、選択的なグリコシダーゼ阻害効果を有し得る新規化合物及び前記新規化合物を含むグリコシダーゼ阻害剤を提供することである。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは研究を重ねた結果、基質であるグリコシドの構造を組み込んだ糖質アミジン誘導体が、優れたグリコシダーゼの阻害活性を有していることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明による糖質アミジン誘導体は、糖骨格に窒素原子を有さないため、比較的簡便に有機合成法で製造することができる。また、本発明による阻害剤は、酵素の糖部分の骨格を有し、基質と極めて近い構造であるので、酵素の基質選択性に対応した選択的な酵素阻害効果を示すことが期待できる。
【0006】
本発明は、下記一般式(1)で表される化合物に関する。
糖質アミジン誘導体
【化2】
【0007】
一般式(1)中、a1及びa2のいずれか一方は水素原子であり、他方は水酸基であり、a3及びa4のいずれか一方は水素原子であり、他方は水酸基であり、a5及びa6のいずれか一方は水素原子であり、他方は水酸基であり、b1及びb2は独立に水素原子、CH2OH基、又はCH3基を表す。Xはハロゲン原子を表す。Rはベンジル基、フェニル基、フェニルエチル基、複素環基、置換ベンジル基、置換フェニル基、置換フェニルエチル基、置換複素環基(これらの置換基は、アルキル基、アルコキシ基、カルボキシル基、ニトロ基、ハロゲン原子、水酸基、スルファニル基、アルキルスルファミル基、ホルミル基、カルボモイル基、シアノ基、アルコキシカルボニル基、アシル基、スルホニル基を示す)、直鎖状、分岐状又は環状のアルキル基又はアルケニル基を表す。
【0008】
さらに本発明は、上記一般式(1)で表される糖質アミジン誘導体の少なくとも一種を有効成分として含有するグリコシダーゼ阻害剤に関する。
【0009】
【発明の実施の形態】
糖質アミジン誘導体
一般式(1)中のピラノース環において、a1及びa2のいずれか一方、a3及びa4のいずれか一方、並びにa5及びa6のいずれか一方は水素原子であり、他方はそれぞれ水酸基である。b1及びb2は独立に水素原子、CH2OH基、又はCH3基である。前記ピラノース環の具体例を以下に示す。
グルコピラノース(a1=H,a2=OH,a3=OH,a4=H,a5=H,a6=OH,b1=CH2OH,b2=H)
マンノピラノース(a1=H,a2=OH,a3=OH,a4=H,a5=OH,a6=H,b1=CH2OH,b2=H)
ガラクトピラノース(a1=OH,a2=H,a3=OH,a4=H,a5=H,a6=OH,b1=CH2OH,b2=H)
キシロピラノース(a1=H,a2=OH,a3=OH,a4=H,a5=H,a6=OH,b1=H,b2=H)
フコピラノース(a1=H,a2=OH,a3=H,a4=OH,a5=OH,a6=H,b1=H,b2=CH3)
これら以外にも、例えば、アラビノピラノース、フルクトピラノース、リボピラノース等のピラノース環もある。
また、一般式(1)中、Xはハロゲン原子であり、具体的にはBr又はIから選ぶことができる。
【0010】
上記一般式(1)で表される本発明の誘導体は、α体又はβ体のいずれであることもでき、本発明の誘導体の例を以下に示す。
α-グルコピラノシルフェニルアセチミダミドヨウ化水素酸塩、
β-グルコピラノシルフェニルアセチミダミドヨウ化水素酸塩、
α-マンノピラノシルフェニルアセチミダミドヨウ化水素酸塩、
β-マンノピラノシルフェニルアセチミダミドヨウ化水素酸塩、
α-ガラクトピラノシルフェニルアセチミダミドヨウ化水素酸塩、
β-ガラクトピラノシルフェニルアセチミダミドヨウ化水素酸塩、
α-キシロピラノシルフェニルアセチミダミドヨウ化水素酸塩、
β-キシロピラノシルフェニルアセチミダミドヨウ化水素酸塩、
α-フコピラノシルフェニルアセチミダミドヨウ化水素酸塩、
β-フコピラノシルフェニルアセチミダミドヨウ化水素酸塩、
α-グルコピラノシルフェニルアセチミダミド臭化水素酸塩、
β-グルコピラノシルフェニルアセチミダミド臭化水素酸塩、
α-マンノピラノシルフェニルアセチミダミド臭化水素酸塩、
β-マンノピラノシルフェニルアセチミダミド臭化水素酸塩、
α-ガラクトピラノシルフェニルアセチミダミド臭化水素酸塩、
β-ガラクトピラノシルフェニルアセチミダミド臭化水素酸塩、
α-キシロピラノシルフェニルアセチミダミド臭化水素酸塩、
β-キシロピラノシルフェニルアセチミダミド臭化水素酸塩、
α-フコピラノシルフェニルアセチミダミド臭化水素酸塩、
β-フコピラノシルフェニルアセチミダミド臭化水素酸塩
【0011】
本発明のβ-グリコシルアミジン誘導体1は、有機合成法により合成することができる。具体的には、例えば、以下に反応式を示すように、無保護のアミノ糖2とチオイミデート3とを、氷冷下で反応させることにより、一段階で容易に合成することができる。
【0012】
【化3】
【0013】
上記合成に使用する無保護のアミノ糖2は、例えば、単糖とメタノール性アンモニアを反応させて生成することができる。使用する単糖は、糖アミジン誘導体中のピラノース環の種類に応じて、例えば、グルコース、マンノース、ガラクトース、キシロース又はフコース等から選ぶことができる。上記反応は、例えば、前記単糖をメタノール性アンモニアに溶解し、室温で3日間攪拌しながら行うことより無保護のアミノ糖2を得ることができる。得られた無保護のアミノ2糖は、必要により、チオイミデート3との反応の前に精製することができる。無保護のアミノ糖2の精製は、例えば、アルコールからの結晶化によって行うことができる。
【0014】
上記合成に使用するチオイミデート3は、例えば、チオイミデートのR基がベンジル基の場合には、ベンジルシアニドと硫化水素とを反応させて得たフェニルチオアセタミドを、さらにハロゲン化メチルと反応させる公知の方法によって得ることができる(A.E.S.Fairfull,J.L.Lowe,D.A.Peak,J.Chem.Soc.742-744(1952))。ベンジルシアニドと硫化水素とは、反応溶媒中で反応させることが好ましく、反応溶媒としては、ピリジンを用いることができるが、ピリジンとトリエチルアミンとの混合溶媒を用いることが、反応効率を高めるために特に好ましく、両溶媒の混合比は、ピリジン:トリエチルアミン=10:2〜10:3の範囲であることが好ましい。ベンジルシアニドと硫化水素との反応は、例えば、上記反応溶媒を用いて室温攪拌下で、18〜24時間反応させることによって行い、フェニルチオアセタミドを得ることができる。さらに、得られたフェニルチオアセタミドをハロゲン化メチルと室温攪拌下で1〜12時間反応させることにより、チオイミデート3を得ることができる。使用するハロゲン化メチルは、一般式(1)中のXの種類に応じて適宜選択でき、例えば、沃化メチル又は臭化メチルであることができる。反応溶媒としてはアセトン、エタノールを用いることができるが、アセトンを用いることが、反応速度、収率及び純度の点で好ましい。得られたチオイミデート3は、必要により、無保護のアミノ糖2との反応前に精製することができる。得られたチオイミデート3は、例えば、アセトン/エーテルを1:1の割合で混合した溶媒によって再結晶を行い、精製することができる。尚、チオイミデートのR基がベンジル基以外の場合にも、原料は市販品から容易に入手可能であり、上記と同様に合成することができる。
【0015】
上記合成により得られたチオイミデート3及び無保護のアミノ糖2は、混合することで反応し、目的とするβ-グリコシルアミジン誘導体1を得ることができる。チオイミデート3と無保護のアミノ糖2との混合は、好ましくは、溶媒中で行われ、溶媒としては、例えば、DMF(ジメチルホルムアミド)、ピリジン等を使用することができる。但し、ピリジンを用いることが、反応速度、収率及び後処理の簡便さの点で好ましい。チオイミデート3とアミノ糖2との反応は、氷冷下で2時間攪拌しながら行うことが、収率向上の点で好ましい。得られたβ-グリコシルアミジン誘導体1は、必要により、例えば、分取用逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ODS)で精製することができる。
【0016】
本発明のα-グリコシルアミジン誘導体は、有機合成法で合成することができる。
具体的には、例えばピラノース環がグルコピラノースの場合、下記にスキームを示す公知の方法に従って、β-D-グルコースペンタアセテート4から、5段階反応によって合成することができる(W.J.Hickinbottom,J.Chem.Soc.,1676-1687(1929),Z.Gyorydeak,H.Paulsen,Liebigs Ann.Chem.,1987-1991(1977),Y.Ichikawa,Y.Igarashi,M.Ichikawa,Y.Suhara,J.Am.Chem.Soc.,120,3007-3018(1998))。β-D-グルコースペンタアセテート4は、市販品を入手できるほか、β-D-グルコースを、無水酢酸ナトリウム及び無水酢酸を用いて常法によりアセチル化することでも得られる。β-D-グルコースペンタアセテート4は五塩化リンで塩素化しクロル体5とし、次いでアジ化ナトリウムでアジド化し、得られたアジド体6を脱保護(脱アセテート)してアジド体7を得た後、還元によりα-1-アミン体8とし、このα-1-アミン体8とチオイミデート3とを反応させることで、目的とするN-α-D-グルコピラノシルアセチミダミド臭化水素酸塩9を得ることができる。グルコース以外の単糖であるマンノース、ガラクトース、キシロース及びフコース等を原料とする場合も同様の工程を経て目的物を得ることができる。
【0017】
【化4】
【0018】
糖質分解酵素阻害剤
本発明の糖質分解酵素阻害剤は、上記一般式(1)で表される糖質アミジン誘導体の少なくとも一種を有効成分として含む。上記一般式(1)で表される糖質アミジン誘導体及び一般式(1)中の置換基a1〜a6、b1及びb2並びにXについては、上記本発明のにおいて記載した通りである。
【0019】
本発明の糖質アミジン誘導体は、例えば、グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、ガラクトシダーゼ、キシロシダーゼ及びフコシダーゼ等のグリコシダーゼに対する阻害活性を有する。本発明の糖質分解酵素阻害剤は、糖質分解酵素であるグリコシダーゼの阻害剤として有効であり、植物及び微生物由来のグリコシダーゼのいずれをも阻害することができる。また、本発明のグリコシダーゼ阻害剤は、通常、α体はα-グリコシダーゼの阻害剤として、β-体はβ-グリコシダーゼの阻害剤として使用する場合に特に良好な阻害効果を発揮する傾向があり、また、阻害対象である酵素(グリコシダーゼ)の基質と同一のグリコシドをグリコン部として有する場合に、良好な阻害効果を発揮する傾向がある。しかし、ある阻害剤を、同一の基質特異性を有するグリコシダーゼに対してそれぞれ使用した場合でも、酵素の起源の違いによって発揮される阻害効果が異なる場合がある。例えば、β-グルコピラノシルフェニルアセチミダミド臭化水素酸塩は、酵母起源のα-D-グルコシダーゼに対しては、強い阻害効果を示すが、アスペルギルス・ニーガー(Aspergillus niger)やバチルス属(Basillus sp.)起源のものには弱い阻害しか示さない。
【0020】
また、阻害剤がβ体であってもα体の酵素に対して阻害効果を示すこともある。例えばβ-グルコピラノシルフェニルアセチミダミド臭化水素酸塩は、β-グルコシダーゼに対して顕著な阻害効果を発揮するが、α-グルコシダーゼに対しても阻害効果を発揮し得る。また、β-グルコピラノシルフェニルアセチミダミド臭化水素酸塩は、β-グルコシダーゼの中でもアスペルギルス・ニーガー(Aspergillus niger)起源のものに対して強い阻害効果を示し、トリコデルマ・ビリデ(Trichoderma viride)起源やアーモンド起源のにも阻害効果を有する。β-ガラクトピラノシルフェニルアセチミダミド臭化水素酸塩は、例えば、β-グルコシダーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ及びβ-キシロシダーゼに対する阻害効果を示す。また、β-キシロピラノシルフェニルアセチミダミド臭化水素酸塩は、β-キシロシダーゼだけでなく、β-グルコシダーゼに対しても阻害効果を示す場合がある。
【0021】
本発明の糖質分解酵素阻害剤は、使用する対象によって異なるが、例えば、水溶液として使用する場合、上記本発明の糖質アミジン誘導体を0.00001〜10重量%の範囲で含有するものであることができる。
【0022】
【実施例】
以下本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
(実施例1)
N- β -D- グルコピラノシルアセチミダミドヨウ化水素酸塩の有機合成
(1) 1−アミノ糖の合成
以下にβ-グルコピラノシルアミンの合成方法を示す。
【化5】
無水メタノール100mlを耐圧ガラス瓶に入れ、ドライアイス−エタノール冷却下でアンモニアガスを通した。メタノール溶液が150mlになったところでアンモニアガスを止めて、D−グルコース10を36.2g(0.2mol)入れ、溶けるまで攪拌した。瓶を閉めて、室温で3日間放置した。次にドライアイス−エタノール冷却下で瓶を開けて、室温で1日放置しアンモニアを気化させた。できた結晶を濾過し、メタノールで洗浄し、デシケ一夕で乾燥し、β-グルコピラノシルアミン11を19.5g得た(収率54%)。
1H-NMR(400MHz,D2O)δ4.10(d,J=8.9Hz,lH,H-1),3.88(dd,J=12.2,2.2Hz,lH,H-6a),3.69(dd,J=12.2,6.lHz,lH,H-6b),3.48(dd,J=9.2,9.2Hz,lH,H-3),3.43(ddd,J=9.8,6.1,2.2Hz,lH,H-5),3.37(dd,J=9.2,9.8Hz,lH,H-4),3.16(dd,J=8.9,9.2Hz,lH,H-2).13C-NMR(100MHz,D20)δ87.9(C-l),79.8(C-5),79.5(C-3),77.1(C-2),72.7(C-4),63.8(C-6).元素分析Calcd.for C6H13NO5:C,40.22;H,7.31;N,7.82.Found:C,40.04;H,7.40;N,7.72.
【0023】
(2) チオイミデートの合成
以下にフェニルチオアセタミドの合成方法を示す。
【化6】
ベンジルシアニド12 23.43g(0.2mol)をピリジン(100ml)とトリエチルアミン(28.8ml)に溶かし、硫化水素ガス(13g,0.38mol)を通した。室温で反応24時間後、濃縮乾固し、ベンゼン150mlに溶解し、150mlのヘキサンを徐々に加えて、一晩経過後濾過し、フェニルチオアセタミド13の結晶15g得た(収率50%)。濾液を濃縮し、50mlのエーテルに溶解した後、2N塩酸(50ml)、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(50ml)及び飽和塩化ナトリウム水溶液(50ml)で洗浄後、芒硝乾燥した。濃縮後、ベンゼン/エーテルで再結晶し(1:1,50ml)、フェニルチオアセタミド13の第2結晶4.6gを得た(収率15%)。フェニルチオアセタミド13の総収量は19.6g、総収率は65%であった。
1H-NMR(200MHz,CDC13,TMS)8.1,6.8(2H,br.s,NH2),7.2-7.4(5H,m,H-4,5 and 6),4.08(2H,s,H-2).13C-NMR(50MHz,CDC13,TMS)207.4(C-1),134.9(C-3),129.4(C-5),129.3(C-4),-128.0(C-6),52.0(C-2).IR(KBr)ν3000-3400,1620,1435,1320,1220,945,780,730,690cm-1.M.p.96.3-96.9゜;元素分析Calc.H,6.00%;C,63.54%;N,9.26%.Found H,5.96%;C,63.63%;N,9.25%.
【0024】
以下にS-メチルフェニルチオアセチミデートヨウ化水素酸塩の合成方法を示す。
【化7】
フェニルチオアセタミド13 3g(0.O198mol)を無水アセトン(10ml)に溶かし、氷冷下で沃化メチルをゆっくり加え、室温で1時間反応後濾過し、生じた結晶をアセトン、エーテルで洗った後、乾燥し針状の結晶としてS-メチルフェニルチオアセチミデートヨウ化水素酸塩14を5.28g得た(収率91%)。
1H-NMR(200MHz,CDC13,TMS) 9-11(2H,br.,NH2),7.3-7.5(5H,m,H-4,5 and 6),4.46(2H,s,H-2),2.89(3H,s,H-7).13C-NMR(50MHz,CDq3,TMS)196.5(C-1),131.7(C-3),129.8(C-5,7),129,2(C-4,8),128.8(C-6),42.8(C-2),18.2(C-9).IR(KBr)ν2900-3100,1580,1500,1420,805,700cm-1.M.p.138.3-139.2゜;元素分析Calcd.H,4.13%;C,36.84%;N,4.78%.Found H,3.91%;C,36,82%;N,4.85%.
【0025】
(3) グリコシルアミジン沃化水素酸塩の合成
以下にN-β-D-グルコピラノシルフェニルアセチミダミドヨウ化水素酸塩の合成方法を示す。
【化8】
β-グルコピラノシルアミン11の結晶0.90g(5mmol)をDMF(10ml)に溶かし、氷冷下でS-メチルフェニルチオアセチミデートヨウ化水素酸塩14 1.54g(5.2mmol)を入れ、氷冷下で2時間反応させた。反応混合物を減圧濃縮し、残査をエーテル、クロロホルムで順次洗浄した。油状残査を水(2ml)に溶かして中圧分取用逆相ODSカラム(ODS-S-50D;山善製)に供し、水で溶出し(6ml/min)、生成物の画分を凍結乾燥して、N-β-D-グルコピラノシルフェニルアセチミダミドヨウ化水素酸塩15を1.69g得た(収率80%)。
1H-NMR(200MHz,CD3OD,TMS)δ7.35-7.45(m,5H,H-4〜6),4.74(d,J=8.6Hz,1H,H-1'),3.88(dd,J=12.0,2.0Hz,1H,H-6'b),3.88(s,2H,H-2),3.68(dd,J=12.0,5.2Hz,1H,H-6'a),3.29-3.55(m,4H,H-2'〜5').13C-NMR(50MHz,CD3OD,TMS) δ169.6(C-1),134.0(C-3),130.2(C-5),129.8(C-4),129.1(C-6),83.3(C-1'),79.8(C-5'),78.5(C-3'),73.5(C-2'),70.7(C-4'),62.2(C-6'),39.8(C-2).IR(KBr)ν3000-3500,1670,1615,1070,690cm-1.FABMS〔M+H〕+=297.1442,-0.8 mmu for C14H21N205.
【0026】
(実施例2)
N- β -D- ガラクトピラノシルフェニルアセチミダミドヨウ化水素酸塩及び N- β -D- キシロピラノシルフェニルアセチミダミドヨウ化水素酸塩の有機合成
実施例1において、β−D-グルコピラノシルアミンをβ−D−ガラクトピラノシルアミン又はβ−D−キシロピラノシルアミンに変更したのみで、その他の手順は実施例1の記載と同様に行い、N-β-D-ガラクトピラノシルフェニルアセチミダミドヨウ化水素酸塩16及びN-β-D-キシロピラノシルフェニルアセチミダミドヨウ化水素酸塩17を得た。
化合物16
1H-NMR(200MHz,CD3OD,TMS)δ7.30-7.40(m,5H,H-4〜6),4.64(d,J=8.7Hz,1H,H-1'),3.90(d,J=3.2Hz,1H,H-6'b),3.86(s,2H,H-2),3.66-3.81(m,4H,H-2'〜4',6'a),3.54(dd,J=9.4,3.2Hz,1H,H-5').13C-NMR(50MHz,CD3OD,TMS) δ169.5(C-1),134.1(C-3),130.2(C-5),129.8(C-4),129.1(C-6),83.9(C-1'),87.6(C-5'),75.2(C-3'),70.6(C-2'),70.1(C-4'),62.4(C-6'),39.8(C-2).IR(KBr)ν3000-3500,1670,1615,1070,700cm-1.FABMS〔M+H〕+=297.1440,-1.0 mmu for C14H21N205.
化合物17
1H-NMR(400MHz,CD3OD,TMS)δ7.33-7.39(m,5H,H-4〜6),4.66(d,J=8.2Hz,1H,H-1'),3.88(dd,J=11.2,5.1Hz,1H,H-5'b),3.87(s,2H,H-2),3.53(ddd,J=10.4,8.7,5.1Hz,1H,H-4'),3.42(dd,J=9.0,8.7Hz,1H,H-3'),3.39(dd,J=11.2,10.4Hz,1H,H-5'),3.37(dd,J=8.7,8.2Hz,1H,H-2').13C-NMR(50MHz,CD3OD,TMS)δ169.6(C-1),134.2(C-3),130.2(C-5),129.6(C-4),129.1(C-6),83.7(C-1'),78.4(C-3'),73.4(C-2'),70.4(C-4'),68.7(C-5'),39.8(C-2).IR(KBr)ν3000-3500,1670,1615,1050,690cm-1.FABMS〔M+H〕+=267.1338,-0.7 mmu for C13H19N204.
【0027】
(実施例3)
N- β -D- グルコピラノシルフェニルアセチミダミド臭化水素酸塩の有機合成
(1) チオイミデートの合成
実施例1と同様の方法により合成したフェニルチオアセタミド13 3.02gを臭化メチルを氷冷下で吹き込んだ無水アセトン(28ml)に溶かした。室温で12時間反応後濾過し、生じた結晶をアセトン、エーテルで洗った後、乾燥し針状の結晶としてS-メチルフェニルチオアセチミデート臭化水素酸塩20 4.76gを得た(収率97%)。
1H-NMR(200MHz,CDC13,TMS) 12.50,11.75(2H,br.,NH2),7.3-7.5(5H,m,H-4,5 and 6),4.38(2H,s,H-2),2.86(3H,s,H-7).13C-NMR(50MHz,CDCl3,TMS)195.4(C-1),132.1(C-3),129.7(C-5,7),129,2(C-4,8),128.6(C-6),43.0(C-2),17.0(C-9).IR(KBr)ν2900-3100,1580,1500,1420,805,700cm-1.M.p.147.9-148.4゜;元素分析Calcd.H,4.91%;C,43.91%;N,5.69%.Found H,4.97%;C,43.86%;N,5.55%.
(2) グリコシルアミジン臭化水素酸塩の合成
実施例1と同様の方法で合成したβ-グルコピラノシルアミン11 0.90mg(5mmol)の結晶をピリジン(20ml)に溶かし、氷冷下でS-メチルフェニルチオアセチミデート臭化水素酸塩20 1.27g(5.15mmol)を入れ、氷冷下で2時間反応させた。反応混合物を減圧濃縮し、残査を水(3ml)に溶かして、中圧分取用逆相ODSカラム(ODS-S-50D;山善製)に供し、水で溶出し(5ml/min)、生成物の画分を凍結乾燥して、N-β-D-グルコピラノシルフェニルアセチミダミド臭化水素酸塩21を1.8g得た(収率96%)。
1H-NMR(400MHz,D2O,TSP)δ7.39-7.49(m,5H,H-4〜6),4.87(d,J=8.5Hz,1H,H-1'),3.97(s,2H,H-2),3.89(dd,J=12.4,2.2Hz,1H,H-6'b),3.75(dd,J=12.4,5.2Hz,1H,H-6'a),3.60(ddd,J=9.7,5.2,2.2Hz,1H,H-5'),3.45-3.58(m,3H,H-2'〜4').13C-NMR(50MHz,D2O,TSP)δ171.4(C-1),134.5(C-3),131.8(C-5),131.5(C-4),130.9(C-6),83.8(C-1'),80.1(C-5'),78.6(C-3'),74.0(C-2'),71.2(C-4'),62.8(C-6'),41.0(C-2).IR(KBr)ν3200(br),1670,1610,1030cm-1.FABMS〔M+H〕+=297.1450,-0.1 mmu for C14H21N205.元素分析Calcd.for C14H21BrN2O5・0.4H2O:C,43.74%;H,5.72%;N,7.29%.Found H,5.77%;C,43.68%;N,7.31%.
【0028】
(実施例4)
N- β -D- ガラクトピラノシルフェニルアセチミダミド臭化水素酸塩及び N- β -D- キシロピラノシルフェニルアセチミダミド臭化水素酸塩の有機合成
実施例3において、β-グルコピラノシルアミン11をβ-ガラクトピラノシルアミン又はβ-キシロピラノシルアミンに変更したのみで、その他の手順は実施例3の記載と同様に行い、N-β-D-ガラクトピラノシルフェニルアセチミダミド臭化水素酸塩22及びN-β-D-キシロピラノシルフェニルアセチミダミド臭化水素酸塩23を得た。
化合物22
1H-NMR(200MHz,D2O,TSP)δ7.40-7.50(m,5H,H-4〜6),4.81(d,J=8.4Hz,1H,H-1'),4.01(d,J=3.0Hz,1H,H-6'b),3.98(s,2H,H-2),3.84(d,J=5.6Hz,1H,H-6'a),3.70-3.80(m,4H,H-2'〜5').13C-NMR(50MHz,D2O,TSP)δ171.4(C-1),134.5(C-3),131.8(C-5),131.6(C-4),130.9(C-6),84.4(C-1'),79.5(C-5'),75.5(C-3'),71.4(C-2'),70.9(C-4'),63.3(C-6'),41.0(C-2).IR(KBr)ν3200(br),1670,1610,1060cm-1.FABMS〔M+H〕+=297.1460,+1.0 mmu for C14H21N205. 元素分析Calcd. for C14H21BrN2O5・0.6H2O:H,5.77%;C,43.33%;N,7.22%.Found H,5.74%;C,43.25%;N,7.19%.
化合物23
1H-NMR(200MHz,D2O,TSP)δ7.40-7.50(m,5H,H-4〜6), 4.82(d,J=8.4Hz,1H,H-1'),3.99(dd,J=11.6,5.3Hz,1H,H-5'b),3.96(s,2H,H-2),3.41-3.80(m,4H,H-2'〜5').13C-NMR(50MHz,D2O,TSP)δ171.5(C-1),134.5(C-3),131.8(C-5),131.5(C-4),130.9(C-6),84.4(C-1'),78.6(C-3'),73.9(C-2'),71.0(C-4'),69.4(C-5'),40.9(C-2).IR(KBr)ν3200(br),1670,1610,1040cm-1.FABMS〔M+H〕+=267.1359,+1.4 mmu for C13H19N204.元素分析Calcd. for C13H19BrN2O4・0.55H2O:H,5.67%;C,43.72%;N,7.84%.Found H,5.59%;C,43.56%;N,7.93%.
【0029】
(比較例)
N- β -D- グルコピラノシルフェニルアセトアミドの有機合成
【化9】
N-ヒドロキシサクシニアミド31 2.53g(22mmol)をジクロロメタン30mlに溶解し、トリエチルアミン3.0mlを加え、次いでフェニルアセチルクロライド3 0 3.1g(20mmol)を加えて室温で6時間反応させた。反応混合物を濃縮後、酢酸エチル100mlに溶解し、氷冷下した0.5N塩酸(70ml)、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(50ml×2)、飽和塩化ナトリウム水溶液(30ml)の順で洗浄した。芒硝乾燥後濃縮し、フェニル酢酸N-ヒドロキシサクシニアミドエステル32の結晶3.73gを得た(収率80%)。β-グルコシルアミン33 0.18g(1mmol)をピリジン2mlとトリエチルアミン0.3gの混合物に溶解し、フェニル酢酸N-ヒドロキシサクシニアミドエステル32 0.25g(1.05mmol)を加えて、室温で24時間反応させた。反応混合物を濃縮後、50%メタノール水溶液2mlに溶解し、中圧分取用逆相ODSカラム(ODS-S-50シリーズ;山善製)に供し、メタノールのグラジエント(50〜100%)で溶出し(4ml/min)、100%メタノール画分でN-β-D-グルコピラノシルフェニルアセトアミド34を溶出し、凍結乾燥後、N-β-D-グルコピラノシルフェニルアセトアミド34 0.25gを得た(収率82%)。
m.p.200℃,1H-NMR(400MHz,D2O,TSP)δ7.31-7.42(m,5H,H-4〜6),4.97(d,J=9.2Hz,1H,H-1'),3.85(dd,J=12.4,1.8Hz,1H,H-6'b),3.70(dd,J=12.4,5.1Hz,1H,H-6'a),3.67(s,2H,H-2),3.54(dd,J=9.2,9.2Hz,1H,H-3')3.50(ddd,J=9.2,5.1,1.8Hz,1H,H-5'),3.42(dd,J=9.2,9.2Hz,1H,H-4'),3.41(dd,J=9.2,9.2Hz,1H,H-2').13C-NMR(50MHz,D2O,TSP)δ178.3(c-1),136.9(c-3),131.8(c-5),131.4(c-4,8),129.9(c-6),81.9(c-1')80.0(c-5'),79.0(c-3'),74.3(c-2'),71.7(c-4'),63.0(c-6'),44.7(c-2).IR(KBr)νmax 3300(br),1650,1530,1350,1250,1030,700cm-1. FABMS〔M+H〕+=298.1298,+0.7 mmu for C14H20N06. 元素分析Calcd.H,6.44%;C,56.56%;N,4.71%.Found H,6.60%;C,56.68%;N,4.44%.
【0030】
(実施例5)
実施例1〜4で合成した糖質アミジン誘導体の各種グリコシダーゼに対する阻害効果を測定した。
<試料>
1.アミジン及びアミド誘導体
▲1▼N-β-D-グルコピラノシルフェニルアセチミダミド臭化水素酸塩
(0.4水和物);化合物21、以下、Glc-β-amidineと記載。
▲2▼N-β-D-ガラクトピラノシルフェニルアセチミダミド臭化水素酸塩16
(0.6水和物);化合物22、以下、Gal-β-amidineと記載。
▲3▼N-β-D-キシロピラノシルフェニルアセチミダミド臭化水素酸塩
(0.55水和物);化合物23、以下、Xyl-β-amidineと記載。
▲4▼N-β-D-グルコピラノシルフェニルアセトアミド(比較例)
;以下、Glc-β-amideと記載。
2.酵素
▲1▼β-D-グルコシダーゼ(アスペルギルス・ニーガー(Aspergillus niger)起源),クロマトグラフィー精製品,(基質;pNP-β-Glc,pH5.0,30℃)
▲2▼β-D-グルコシダーゼ(トリコデルマ・ビリデ(Trichoderma viride)起源 ), クトマトグラフィー精製品(基質;pNP-β-Glc,pH5.0,30℃)
▲3▼β-D-グルコシダーゼ(アーモンド起源), クロマトグラフィー精製品, SIGM A社製,(基質;pNP-β-Glc,pH5.0,37℃)
▲4▼α-D-グルコシダーゼ(アスペルギルス・ニーガー(Aspergillus niger)起源),クロマトグラフィー精製品(基質;pNP-α-Glc,pH4.2,37℃)
▲5▼α-D-グルコシダーゼ(基質;バチルス属(Bacillus sp.)起源), 東洋紡(株)製,製品名AGH-211 (pNP-α-Glc,pH7.0,37℃)
▲6▼α-D-グルコシダーゼ(酵母起源),オリエンタル酵母(株)(基質;pNP-α-Glc,pH 6.0,25℃)
▲7▼β-D-ガラクトシダーゼ(アスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae )起源), SIGMA社製 (基質;oNP-β-Gal, pH 4.5, 30℃)
▲8▼β-D-ガラクトシダーゼ(大腸菌起源), SIGMA社製(基質;oNP-β-Gal, pH 7.3, 37℃)
▲9▼β-D-ガラクトシダーゼ(アスペルギルス・ニーガー(Aspergillus niger)起源),SIGMA社製 (基質;oNP-α-Gal,pH 4.0,25℃)
(株)β-D-キシロシダーゼ(アスペルギルス・プルベルレンタス(Aspergillus pulverulentus)起源),天野製薬(株)製ペクチナーゼGの部分精製品(基質;pNP-β-Xyl,pH4.0,40℃)
【0031】
1.Km値
各種pNP(p-ニトロフェニル)又はoNP(o-ニトロフェニル)-グリコピラノシドを基質として終濃度1/2〜2 Km となるように、50 mM各種緩衝液に溶解し、適当濃度に希釈した酵素液を50μl添加し、総液量1000μlとした。30℃で10min反応させた後、1M 炭酸ナトリウム500μlを添加し405nmの吸光度を測定した(pNP;ε=17.8125 cm2/μmol,oNP;ε=4.5 cm2/μmol)。最小二乗法により各種基質濃度でのp-あるいはo-ニトロフェノールの生成速度v0を算出しミカエリスの速度式からKmを求めた。その測定条件及び結果を表1に示した。
【0032】
【表1】
【0033】
2.50%阻害濃度(IC50)
IC50は、各種pNP-あるいはoNP-グリコピラノシドを基質とし(測定時の基質濃度は表1. IC50測定濃度参照)、表1と同様に50 mM各種緩衝液に溶解し、4種類のアミジン誘導体を0〜2.5mMの範囲で6点の濃度になるよう添加した後、適当濃度に希釈した酵素液を50μl添加し、総液量1000μlとした。30℃で10min反応させた後、1M 炭酸ナトリウム500μlを添加し405nmの吸光度を測定した(pNP;ε=17.8125 cm2/μmol,oNP;ε=4.5 cm2/μmol)。最小二乗法により各種基質濃度でのp-あるいはo-ニトロフェノールの生成速度v0を算出し、阻害剤濃度と1/v0のプロットからIC50(mM)を求めた。測定結果を表2に示す。
【0034】
【表2】
【0035】
3.阻害定数(Ki)と阻害形式
阻害定数(Ki)と阻害形式は、基質濃度をIC50測定条件と同様及び2倍にして後は同様の操作を行った。2種の基質濃度においてそれぞれ1/v0と阻害剤濃度をプロットし、その交点からKiと阻害形式を求めた。その結果を表3に示した。
【0036】
【表3】
【0037】
表2及び3の結果から、Glc-β-amidine21は、Glc-β-amideと比較して103〜104倍強くβ-D-グルコシダーゼを阻害した。またGal-β-amidine22、Xyl-β-amidine23もそれぞれ対応するβ-D-ガラクトシダーゼ、β-D-キシロシダーゼを最も強く阻害した(Ki =10-5〜10-6(M)オーダー)。
【0038】
さらに、表2及び3の結果から、各阻害剤の、アスペルギルス・ニーガー(Aspergillus niger)起源のβ-D-グルコシダーゼに対する阻害効果を比較すると、Glc-β-amidine21は、Gal-β-amidine22の約104倍、、Xyl-β-amidine23の約103倍強い阻害効果を示した。即ち、本発明による阻害剤は、酵素を選択的に阻害し得ることが確認された。
【0039】
Glc-β-amidine21は、α-D-グルコシダーゼの中で、酵母起源のものについでは弱い阻害活性を有するが、アスペルギルシ・ニーガー(Aspergillus niger)や、バチルス属(Basillus sp.)起源のものには、阻害活性を有さなかった。しかし、Gal-β-amidine22は、アスペルギルス・ニーガー(Aspergillus niger)起源のα-D-ガラクトシダーゼに対しても阻害活性を有した。即ち、アミジンがβ-結合していても、対応するα-グリコシダーゼの起源によっては阻害活性を有することが判明した。尚、本発明による阻害剤の阻害形式はすべて拮抗型阻害であった。
【0040】
【発明の効果】
一般式(1)で表される糖質アミジン誘導体は、基質であるグリコシドの構造を組み込んだ新規化合物であって、グリコシダーゼに対して非常に強力な阻害効果を発揮するものである。さらに、本発明による糖質アミジン誘導体は、糖骨格に窒素原子を有さないため、比較的簡便に有機合成法で製造することができる。
Claims (4)
- 下記一般式(1)で表される糖質アミジン誘導体。
- 請求項1に記載の一般式(1)で表される糖質アミジン誘導体のβ体を含有する糖質分解酵素阻害剤。
- 糖質分解酵素がβ - グリコシダーゼである請求項2に記載の阻害剤。
- 糖質分解酵素がβ−グルコシダーゼ、β−マンノシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−キシロシダーゼ、又はβ - フコシダーゼである請求項2に記載の阻害剤。
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