JP3058715B2 - グリコシダーゼ触媒作用による複合糖質の合成法 - Google Patents
グリコシダーゼ触媒作用による複合糖質の合成法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】複合糖質（glyco conjugate）
（糖タンパク質、グリコスフィンゴ脂質、グリコホスホ
脂質）は腫瘍発生、細菌およびウイルス感染、細胞−細
胞認識、細胞成長および細胞分化のような生物学的認識
過程において中心的な役割を果たす。それらは血液型分
類の基準になりそして種々の巨大分子物質および医薬の
内部移行に関与している。すなわち、糖タンパク質利用
の重要な領域は例えば薬物の標的器官への選択的取り込
みおよびタンパク質加水分解による分解からの医薬保護
にある（H. Schachter, Clinical Biochemistry 17, (1
984）3；N. Sharon, Trends Biochem. Sci. 9（1984）1
98；S. Hakamori, Cancer Res. 45（1985）2405；S. Ha
kamori, Scientific American 254（1986）No. 5, 3
2）。
（糖タンパク質、グリコスフィンゴ脂質、グリコホスホ
脂質）は腫瘍発生、細菌およびウイルス感染、細胞−細
胞認識、細胞成長および細胞分化のような生物学的認識
過程において中心的な役割を果たす。それらは血液型分
類の基準になりそして種々の巨大分子物質および医薬の
内部移行に関与している。すなわち、糖タンパク質利用
の重要な領域は例えば薬物の標的器官への選択的取り込
みおよびタンパク質加水分解による分解からの医薬保護
にある（H. Schachter, Clinical Biochemistry 17, (1
984）3；N. Sharon, Trends Biochem. Sci. 9（1984）1
98；S. Hakamori, Cancer Res. 45（1985）2405；S. Ha
kamori, Scientific American 254（1986）No. 5, 3
2）。
【０００２】複合糖質の前記機能の背景を考慮すれば、
該複合糖質の合成は特に興味ある問題である。
該複合糖質の合成は特に興味ある問題である。
【０００３】
【従来の技術】糖タンパク質中のペプチドおよび炭水化
物部分は通常ともに共有結合で結合されている。多種の
構造にもかかわらず、結合部分は特徴的であって変化は
僅かであるにすぎない。性質上、結合には３つの主要な
型がある。すなわちＮ−アセチルグルコサミンとアスパ
ラギンのアミド官能基との間のグリコシド結合、Ｎ−ア
セチルガラクトサミンとセリンまたはスレオニンのヒド
ロキシル官能基との間のａ−Ｏ−グリコシド結合および
種々のヒドロキシアミノ酸へのキシロースまたはガラク
トースのｂ−Ｏ−グリコシド結合である。
物部分は通常ともに共有結合で結合されている。多種の
構造にもかかわらず、結合部分は特徴的であって変化は
僅かであるにすぎない。性質上、結合には３つの主要な
型がある。すなわちＮ−アセチルグルコサミンとアスパ
ラギンのアミド官能基との間のグリコシド結合、Ｎ−ア
セチルガラクトサミンとセリンまたはスレオニンのヒド
ロキシル官能基との間のａ−Ｏ−グリコシド結合および
種々のヒドロキシアミノ酸へのキシロースまたはガラク
トースのｂ−Ｏ−グリコシド結合である。
【０００４】さらに、セリン様セラミド部分へのグルコ
ースのｂ−Ｏ−グリコシド結合はいくつかの興味深いグ
リコスフィンゴ脂質中に見出される。セラミドはスフィ
ンゴシン〔(２Ｓ,３Ｒ,４Ｅ)−２−アミノ−４−オクタ
デセン−１,３−ジオール〕、デヒドロスフィンゴシン
（スフィンガニン）またはフィトスフィンゴシン（４−
Ｄ−ヒドロキシスフィンガニン）からなり、それらは２
−アミノ基上において長鎖脂肪酸（Ｃ14〜Ｃ26）でアシ
ル化されている（Y.-T. Li，S.-C. Li, Adv. Carbohyd
r. Chem. Biochem. 40（1982）235）。
ースのｂ−Ｏ−グリコシド結合はいくつかの興味深いグ
リコスフィンゴ脂質中に見出される。セラミドはスフィ
ンゴシン〔(２Ｓ,３Ｒ,４Ｅ)−２−アミノ−４−オクタ
デセン−１,３−ジオール〕、デヒドロスフィンゴシン
（スフィンガニン）またはフィトスフィンゴシン（４−
Ｄ−ヒドロキシスフィンガニン）からなり、それらは２
−アミノ基上において長鎖脂肪酸（Ｃ14〜Ｃ26）でアシ
ル化されている（Y.-T. Li，S.-C. Li, Adv. Carbohyd
r. Chem. Biochem. 40（1982）235）。
【０００５】すなわち、複合糖質の化学合成における主
要な問題はオリゴ糖を得るための単糖単位の立体選択的
および位置選択的連続結合、アグリコンを得るためのグ
リコシド結合の立体選択的形成およびとりわけ、アグリ
コン例えばペプチドまたはセラミドの合成である。
要な問題はオリゴ糖を得るための単糖単位の立体選択的
および位置選択的連続結合、アグリコンを得るためのグ
リコシド結合の立体選択的形成およびとりわけ、アグリ
コン例えばペプチドまたはセラミドの合成である。
【０００６】これらの問題に対する解決には、たとえ比
較的小さなグリコペプチドの場合でさえ、炭水化物およ
びペプチド化学からの好適な保護基の組合せを用いた精
巧な合成手法が必要である。例えば化学的な糖タンパク
質合成は多段、時間浪費の反応であることが多く、保護
基全てが除去された目的物質は少量だけしか得られない
ことが多い〔H. Kunz, Angew. Chem. 99（1987）297−3
11；R.R. Schmidt, “Stereochemistry of Organic and
Bioorganic Transformations", W. Bartmannand K.B.
Sharpless, ed. p. 169, Verlag Chemie Weinheim（198
7）；H.Paulsen et al. Starch／Staerke 40（1988）46
5−472〕。
較的小さなグリコペプチドの場合でさえ、炭水化物およ
びペプチド化学からの好適な保護基の組合せを用いた精
巧な合成手法が必要である。例えば化学的な糖タンパク
質合成は多段、時間浪費の反応であることが多く、保護
基全てが除去された目的物質は少量だけしか得られない
ことが多い〔H. Kunz, Angew. Chem. 99（1987）297−3
11；R.R. Schmidt, “Stereochemistry of Organic and
Bioorganic Transformations", W. Bartmannand K.B.
Sharpless, ed. p. 169, Verlag Chemie Weinheim（198
7）；H.Paulsen et al. Starch／Staerke 40（1988）46
5−472〕。
【０００７】これらの物質の合成には今日、オリゴ糖生
合成からの酵素がますます使用されている。これに関連
した高い立体−および位置選択性並びに複雑な保護基化
学の回避はしばしば多段の化学合成に比べて良好な収率
を可能にする。
合成からの酵素がますます使用されている。これに関連
した高い立体−および位置選択性並びに複雑な保護基化
学の回避はしばしば多段の化学合成に比べて良好な収率
を可能にする。
【０００８】ところで、化学酵素的な糖タンパク質合成
が最近になって初めて文献に記載された〔C. Auge, C.
Gautheron and H. Pora, Carbohydr, Res. 193, 288 (1
989)；J. Thien and T. Wiemann, Angew. Chem. 102, 7
8（1990）；C. Unverzagt, H. Kunz and J.C. Paulson,
J. Am. Chem. Soc. 112，9308（1990）〕。これらは炭
水化物部分での酵素によるグリコシド化、すなわちペプ
チドもしくはアミノ酸および糖の化学的に合成された複
合体の糖−糖結合を介しての延長を伴っている。
が最近になって初めて文献に記載された〔C. Auge, C.
Gautheron and H. Pora, Carbohydr, Res. 193, 288 (1
989)；J. Thien and T. Wiemann, Angew. Chem. 102, 7
8（1990）；C. Unverzagt, H. Kunz and J.C. Paulson,
J. Am. Chem. Soc. 112，9308（1990）〕。これらは炭
水化物部分での酵素によるグリコシド化、すなわちペプ
チドもしくはアミノ酸および糖の化学的に合成された複
合体の糖−糖結合を介しての延長を伴っている。
【０００９】糖結合を形成するのに用いる酵素はグリコ
シルトランスフェラーゼである。これらはグリコシルド
ナーおよびその受容体に関して極めて特異的であるとみ
なされており、そしてグリコシド化のためには活性化糖
例えばＵＤＰ−グルコースを必要とする。しかし、グリ
コシルトランスフェラーゼおよび活性化糖を得ることが
困難であるためにインビトロでの広範な使用またはより
大規模な合成は不可能である。
シルトランスフェラーゼである。これらはグリコシルド
ナーおよびその受容体に関して極めて特異的であるとみ
なされており、そしてグリコシド化のためには活性化糖
例えばＵＤＰ−グルコースを必要とする。しかし、グリ
コシルトランスフェラーゼおよび活性化糖を得ることが
困難であるためにインビトロでの広範な使用またはより
大規模な合成は不可能である。
【００１０】単糖またはオリゴ糖とアミノ酸またはペプ
チドとの、酵素結合による糖ペプチド（複合糖質）の調
製的合成は、今日ではトランスフェラーゼまたはその他
の酵素のいずれかを用いた場合についても記載はない
〔G.M. Whitesides et al., Tetrahedron 45（1989）,
5365−5422〕。
チドとの、酵素結合による糖ペプチド（複合糖質）の調
製的合成は、今日ではトランスフェラーゼまたはその他
の酵素のいずれかを用いた場合についても記載はない
〔G.M. Whitesides et al., Tetrahedron 45（1989）,
5365−5422〕。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】グリコシダーゼは天然
系においてグリコシド結合の加水分解を触媒作用する。
最近グリコシダーゼはますます、加水分解反応の反転に
より、さらにまたグリコシドの調製的合成のために使用
されている（R. Wallenfels, R. Weil, “The Enzyme
s", ３. Ed.；Boyer, P.D. (Ed)；Academic Press, New
York 1972, Vol. VII, p. 618；J.E.G. Barnett, Int.
J. Biochem. 6（1975）321−328；G.M. Whitesides et
al., Tetrahedron 45（1989）5365−5422；Kurt G. Ni
lsson, Trends in Biotechn. 1988, 256）。ヌクレオフ
ィルとして用いられるヒドロキシル化合物は、簡単な第
１または第２アルコール、いくつかの単糖類およびある
場合にはまたステロイド類でもある。これらの合成の主
要な不利点は低収量にありそして多くの場合には副生成
物の生成にある。
系においてグリコシド結合の加水分解を触媒作用する。
最近グリコシダーゼはますます、加水分解反応の反転に
より、さらにまたグリコシドの調製的合成のために使用
されている（R. Wallenfels, R. Weil, “The Enzyme
s", ３. Ed.；Boyer, P.D. (Ed)；Academic Press, New
York 1972, Vol. VII, p. 618；J.E.G. Barnett, Int.
J. Biochem. 6（1975）321−328；G.M. Whitesides et
al., Tetrahedron 45（1989）5365−5422；Kurt G. Ni
lsson, Trends in Biotechn. 1988, 256）。ヌクレオフ
ィルとして用いられるヒドロキシル化合物は、簡単な第
１または第２アルコール、いくつかの単糖類およびある
場合にはまたステロイド類でもある。これらの合成の主
要な不利点は低収量にありそして多くの場合には副生成
物の生成にある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明によればＤ−およ
びＬ−セリン並びにＤ−およびＬ−セリン誘導体が良好
なヌクレオフィルとして同様に作用しうることが見出さ
れた。これにより初めて、本来この種の生成物用に意図
されていない酵素を用いてヒドロキシアミノ酸またはそ
れらの誘導体と単糖類とのインビトロでのグリコシド結
合を行わせることが可能になる。すなわち、複合糖質が
グリコシダーゼを用いて糖類をＤ−およびＬ−セリン、
Ｄ−およびＬ−セリン誘導体並びにＤ−およびＬ−セリ
ンペプチドと直接結合させることにより合成されうるこ
とを初めて証明することができるようになった。これ
は、グリコシダーゼがＮ−含有単糖類似体例えば１−デ
オキシノジリマイシン〔N. Peyrieras et al., Embo J.
2, 823（1983）〕、二環式Ｎ−含有化合物例えばスワ
インソニン〔８α,β−インドリジジン−１α,２α,８
β−トリオール；R.T. Schwarz, R. Datema, Trends Bi
ochem. Sci. 9, 32（1984）〕により、しかしまたＮ−
含有アルコール例えばエタノールアミン〔R. Wallenfel
s, R. Weil. “The Enzymes", 3. Ed.；Boyer, P.D.（E
d）；Academic Press, New York 1972, Vol. VII, p. 6
18〕により阻害されるので特に意外である。すなわち、
アミノ酸およびそれらの誘導体もまた阻害剤として作用
しうるかもしれなかった。
びＬ−セリン並びにＤ−およびＬ−セリン誘導体が良好
なヌクレオフィルとして同様に作用しうることが見出さ
れた。これにより初めて、本来この種の生成物用に意図
されていない酵素を用いてヒドロキシアミノ酸またはそ
れらの誘導体と単糖類とのインビトロでのグリコシド結
合を行わせることが可能になる。すなわち、複合糖質が
グリコシダーゼを用いて糖類をＤ−およびＬ−セリン、
Ｄ−およびＬ−セリン誘導体並びにＤ−およびＬ−セリ
ンペプチドと直接結合させることにより合成されうるこ
とを初めて証明することができるようになった。これ
は、グリコシダーゼがＮ−含有単糖類似体例えば１−デ
オキシノジリマイシン〔N. Peyrieras et al., Embo J.
2, 823（1983）〕、二環式Ｎ−含有化合物例えばスワ
インソニン〔８α,β−インドリジジン−１α,２α,８
β−トリオール；R.T. Schwarz, R. Datema, Trends Bi
ochem. Sci. 9, 32（1984）〕により、しかしまたＮ−
含有アルコール例えばエタノールアミン〔R. Wallenfel
s, R. Weil. “The Enzymes", 3. Ed.；Boyer, P.D.（E
d）；Academic Press, New York 1972, Vol. VII, p. 6
18〕により阻害されるので特に意外である。すなわち、
アミノ酸およびそれらの誘導体もまた阻害剤として作用
しうるかもしれなかった。
【００１３】一部には、得られた化合物は部分的に保護
された天然の複合糖質に相当するか、または特に後者の
変形物を示しそしてより大きな複合体用の合成プレカー
サーとして使用されうる。
された天然の複合糖質に相当するか、または特に後者の
変形物を示しそしてより大きな複合体用の合成プレカー
サーとして使用されうる。
【００１４】
【発明の構成】すなわち、本発明は式Ｉ
【化６】 の複合糖質の製造方法に関する。その方法はグリコシダ
ーゼの存在下で式II
ーゼの存在下で式II
【００１５】
【化７】 （式中Ｒ1はフッ素、ヒドロキシル基、１〜５個の炭素
原子を有するアルコキシ基、２〜５個の炭素原子を有す
るアルケニルオキシ基、６〜１０個の炭素原子を有する
アリールオキシ基であるか、または酸素原子を介して結
合されている炭水化物残基である）の化合物を式III
原子を有するアルコキシ基、２〜５個の炭素原子を有す
るアルケニルオキシ基、６〜１０個の炭素原子を有する
アリールオキシ基であるか、または酸素原子を介して結
合されている炭水化物残基である）の化合物を式III
【００１６】
【化８】 〔式中Ｒ2はアミノ保護基でありそしてＲ3はヒドロキシ
ル基；アルコキシまたはアルキルメルカプト基またはア
ルケニルオキシ基（これらの各々は１〜１８個の炭素原
子を有しそしてハロゲンまたはシアノにより置換されう
る）；アリールオキシ基（これは６〜１０個の炭素原子
を有しそしてそれぞれ１〜５個の炭素原子を有するアル
キル、アルコキシ、アルキルメルカプト、およびニトロ
基により置換されうる）；または −ＮＨＲ4（ここでＲ
4は１〜５個の炭素原子を有するアルキル基であるかま
たは式IV
ル基；アルコキシまたはアルキルメルカプト基またはア
ルケニルオキシ基（これらの各々は１〜１８個の炭素原
子を有しそしてハロゲンまたはシアノにより置換されう
る）；アリールオキシ基（これは６〜１０個の炭素原子
を有しそしてそれぞれ１〜５個の炭素原子を有するアル
キル、アルコキシ、アルキルメルカプト、およびニトロ
基により置換されうる）；または −ＮＨＲ4（ここでＲ
4は１〜５個の炭素原子を有するアルキル基であるかま
たは式IV
【００１７】
【化９】 の基または式ＶまたはVI
【００１８】
【化１０】 のジ−またはトリペプチド残基であって、ここでＲ5は
ヒドロキシル基、各場合１〜５個の炭素原子を有しそし
てハロゲンまたはシアノにより置換されうるアルコキ
シ、アルキルメルカプトまたはアルケニルオキシ基、ま
たは６〜１０個の炭素原子を有しそして各場合に１〜５
個の炭素原子を有するアルキル、アルコキシ、アルキル
メルカプト、およびニトロ基により置換されうるアリー
ルオキシ基であり、そしてＲ6、Ｒ7およびＲ8は同一で
あるかまたは相異なっていて水素であるか、または１〜
１０個の炭素原子を有しそしてハロゲン、ヒドロキシ
ル、アルコキシ、メルカプト、アルキルメルカプト、ア
リールまたはヘテロアリールにより置換されうる直鎖
状、分枝鎖状または環状のアルキルまたはアルケニル基
である）である〕の化合物とインキュベートすることか
らなる。
ヒドロキシル基、各場合１〜５個の炭素原子を有しそし
てハロゲンまたはシアノにより置換されうるアルコキ
シ、アルキルメルカプトまたはアルケニルオキシ基、ま
たは６〜１０個の炭素原子を有しそして各場合に１〜５
個の炭素原子を有するアルキル、アルコキシ、アルキル
メルカプト、およびニトロ基により置換されうるアリー
ルオキシ基であり、そしてＲ6、Ｒ7およびＲ8は同一で
あるかまたは相異なっていて水素であるか、または１〜
１０個の炭素原子を有しそしてハロゲン、ヒドロキシ
ル、アルコキシ、メルカプト、アルキルメルカプト、ア
リールまたはヘテロアリールにより置換されうる直鎖
状、分枝鎖状または環状のアルキルまたはアルケニル基
である）である〕の化合物とインキュベートすることか
らなる。
【００１９】グルコース、ガラクトースおよびマンノー
スが式IIの化合物として可能でありかつ好ましい。式II
のＲ1位のアルコキシ基としてはメトキシ基を用いるの
が好ましいし、アルケニルオキシ基としてはアリルオキ
シまたはビニルオキシ基を用いるのが好ましい。アリー
ルオキシ基は電子求引性置換基例えばニトロまたはシア
ノ基、またはハロゲンにより置換されうる。フェノキ
シ、ｏ−またはｐ−ニトロフェノキシまたはジニトロフ
ェノキシ基を用いるのが好ましい。Ｒ1位の炭水化物残
基により形成される糖はマルトースまたはラクトースで
あるのが好ましい。Ｒ1は特に好ましくはフッ素または
ｐ−またはｏ−ニトロフェノキシ基である。
スが式IIの化合物として可能でありかつ好ましい。式II
のＲ1位のアルコキシ基としてはメトキシ基を用いるの
が好ましいし、アルケニルオキシ基としてはアリルオキ
シまたはビニルオキシ基を用いるのが好ましい。アリー
ルオキシ基は電子求引性置換基例えばニトロまたはシア
ノ基、またはハロゲンにより置換されうる。フェノキ
シ、ｏ−またはｐ−ニトロフェノキシまたはジニトロフ
ェノキシ基を用いるのが好ましい。Ｒ1位の炭水化物残
基により形成される糖はマルトースまたはラクトースで
あるのが好ましい。Ｒ1は特に好ましくはフッ素または
ｐ−またはｏ−ニトロフェノキシ基である。
【００２０】式IIIのＲ2位中の保護基としてはペプチド
および糖ペプチド化学で慣用のアミノ保護基例えばアシ
ル基例えば長鎖脂肪酸のアシル基およびアルキル−また
はアリールオキシカルボニル基を用いることが本質的に
可能である。使用できる保護基は例えばH. Hubbuch, Ko
ntakte 3/79, page 14, T.W. Greene, Protective Grou
ps in Organic Synthesis, John Wiley & Sons 1981, p
223ffまたはHouben-Weyl, Vol. 15/1 p. 46の論文中に
記載されている。用いるのに好ましいのはベンジルオキ
シカルボニル（Ｚ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｏ
ｃ）および第三ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）並び
にトリクロロエトキシカルボニル、ホルミル、アセチ
ル、クロロアセチル、トリフルオロアセチル、フェナセ
チル、ベンゾイルまたは６〜２４個の炭素原子を有する
長鎖脂肪酸のアシル基である。
および糖ペプチド化学で慣用のアミノ保護基例えばアシ
ル基例えば長鎖脂肪酸のアシル基およびアルキル−また
はアリールオキシカルボニル基を用いることが本質的に
可能である。使用できる保護基は例えばH. Hubbuch, Ko
ntakte 3/79, page 14, T.W. Greene, Protective Grou
ps in Organic Synthesis, John Wiley & Sons 1981, p
223ffまたはHouben-Weyl, Vol. 15/1 p. 46の論文中に
記載されている。用いるのに好ましいのはベンジルオキ
シカルボニル（Ｚ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｏ
ｃ）および第三ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）並び
にトリクロロエトキシカルボニル、ホルミル、アセチ
ル、クロロアセチル、トリフルオロアセチル、フェナセ
チル、ベンゾイルまたは６〜２４個の炭素原子を有する
長鎖脂肪酸のアシル基である。
【００２１】Ｒ3位の基および式IV−VI中のＲ5はメトキ
シ、メトキシメチル、ベンジルオキシメチル、メチルメ
ルカプトメチル、エトキシ、クロロエトキシ、ブロモエ
トキシもしくはシアノエトキシ、およびビニルオキシ基
およびペプチド化学での慣用カルボキシル保護基（Houb
en-Weyl. Vol. 15/1, p. 315ff）例えばベンジルオキ
シ、トリクロロエトキシ、ｐ−ニトロベンジルオキシ、
ｐ−メトキシベンジルオキシ、ピペロニルオキシ、アリ
ルオキシまたは第三ブチルオキシおよび第三ブチルジメ
チルシリルオキシ基であるのが好ましい。
シ、メトキシメチル、ベンジルオキシメチル、メチルメ
ルカプトメチル、エトキシ、クロロエトキシ、ブロモエ
トキシもしくはシアノエトキシ、およびビニルオキシ基
およびペプチド化学での慣用カルボキシル保護基（Houb
en-Weyl. Vol. 15/1, p. 315ff）例えばベンジルオキ
シ、トリクロロエトキシ、ｐ−ニトロベンジルオキシ、
ｐ−メトキシベンジルオキシ、ピペロニルオキシ、アリ
ルオキシまたは第三ブチルオキシおよび第三ブチルジメ
チルシリルオキシ基であるのが好ましい。
【００２２】Ｒ3がアミノ基ＮＨＲ4である場合には、Ｒ
4は式IVおよびＶの基であるのが好ましい。式中Ｒ6およ
びＲ7は同一であるかまたは相異なっていて、水素であ
るかまたは１〜１０個の炭素原子を有しそしてハロゲ
ン、ヒドロキシル、メルカプト、アルコキシ、アルキル
メルカプト、アリールまたはヘテロアリールにより置換
されうる直鎖、分枝鎖状または環状のアルキルまたはア
ルケニル基である。Ｒ6およびＲ7の置換基は本質的には
中性、脂肪族、芳香族または環状α−アミノ酸の側鎖で
ある。式IIIの化合物として使用されるのが特に好まし
いのはＺ−Ｓｅｒ−Ｏアリル、Ｚ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｏ
Ｍｅ、Ｚ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−ＯＭｅ、Ａｌｏｃ−Ｓｅｒ
−Ｇｌｙ−ＯＥｔＣｌ、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ−Ｏアリルおよ
びＡｌｏｃ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−ＯＭｅである。式IIIの
化合物中のＲ2が６〜２４個の炭素原子を有する長鎖脂
肪酸のアシル基でありそしてＲ3が６〜１８個の炭素原
子を有するアルコキシ基である場合には、式IIIの化合
物はスフィンゴシンまたはスフィンガニンと構造上類似
している化合物であって、それはグリコシダーゼの触媒
作用による、グリコスフィンゴ脂質合成のためのモデル
物質として興味深い。
4は式IVおよびＶの基であるのが好ましい。式中Ｒ6およ
びＲ7は同一であるかまたは相異なっていて、水素であ
るかまたは１〜１０個の炭素原子を有しそしてハロゲ
ン、ヒドロキシル、メルカプト、アルコキシ、アルキル
メルカプト、アリールまたはヘテロアリールにより置換
されうる直鎖、分枝鎖状または環状のアルキルまたはア
ルケニル基である。Ｒ6およびＲ7の置換基は本質的には
中性、脂肪族、芳香族または環状α−アミノ酸の側鎖で
ある。式IIIの化合物として使用されるのが特に好まし
いのはＺ−Ｓｅｒ−Ｏアリル、Ｚ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｏ
Ｍｅ、Ｚ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−ＯＭｅ、Ａｌｏｃ−Ｓｅｒ
−Ｇｌｙ−ＯＥｔＣｌ、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ−Ｏアリルおよ
びＡｌｏｃ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−ＯＭｅである。式IIIの
化合物中のＲ2が６〜２４個の炭素原子を有する長鎖脂
肪酸のアシル基でありそしてＲ3が６〜１８個の炭素原
子を有するアルコキシ基である場合には、式IIIの化合
物はスフィンゴシンまたはスフィンガニンと構造上類似
している化合物であって、それはグリコシダーゼの触媒
作用による、グリコスフィンゴ脂質合成のためのモデル
物質として興味深い。
【００２３】式IIおよびIIIの各基質は購入されうる
（例えばニトロフェニルグリコシド類）かまたはそれ自
体知られた手法によって容易に製造されうる（F. Miche
el, A.Klimer, Adv. Carbohydr. Chem. 16, 85（196
1）；ドイツ国特許出願公開公報第3040805号および第34
32565号各明細書によるグリコシルフルオライド類；Hou
ben-Weyl, Volumes 15／Ｉおよび15／IIに記載の各手法
によるアミノ酸およびペプチド並びに保護された誘導
体）かのいずれかである。
（例えばニトロフェニルグリコシド類）かまたはそれ自
体知られた手法によって容易に製造されうる（F. Miche
el, A.Klimer, Adv. Carbohydr. Chem. 16, 85（196
1）；ドイツ国特許出願公開公報第3040805号および第34
32565号各明細書によるグリコシルフルオライド類；Hou
ben-Weyl, Volumes 15／Ｉおよび15／IIに記載の各手法
によるアミノ酸およびペプチド並びに保護された誘導
体）かのいずれかである。
【００２４】式IIの化合物および式IIIの化合物は４：
１〜１：１０、好ましくは３：２〜１：４の割合で用い
ることができる。グリコシルドナーIIIのミリモル当た
り４〜４０単位の酵素を用いるのが好都合である。
１〜１：１０、好ましくは３：２〜１：４の割合で用い
ることができる。グリコシルドナーIIIのミリモル当た
り４〜４０単位の酵素を用いるのが好都合である。
【００２５】反応はpH５.０〜８.０、有利にはpH６.０
〜７.５で行うことができる。使用しうる緩衝液はＨＥ
ＰＥＳ、ＴＲＩＣＩＮ、ＴＡＰＳ、ＭＥＳ、ＴＥＳおよ
びＭＯＰＳ、ＣＨＥＳ、ＴＲＩＳ並びにりん酸カリウム
およびりん酸ナトリウム緩衝液である。モル濃度は０.
０１〜１.０好ましくは０.０１〜０.１であるべきであ
る。さらに、温度は約−３０℃〜５０℃好ましくは２０
℃〜３５℃で保持されるべきである。酵素は温度が５０
℃以上に増加するにつれ、ますます不可逆的に不活化す
る。培養時間は１〜３０時間であることができる。
〜７.５で行うことができる。使用しうる緩衝液はＨＥ
ＰＥＳ、ＴＲＩＣＩＮ、ＴＡＰＳ、ＭＥＳ、ＴＥＳおよ
びＭＯＰＳ、ＣＨＥＳ、ＴＲＩＳ並びにりん酸カリウム
およびりん酸ナトリウム緩衝液である。モル濃度は０.
０１〜１.０好ましくは０.０１〜０.１であるべきであ
る。さらに、温度は約−３０℃〜５０℃好ましくは２０
℃〜３５℃で保持されるべきである。酵素は温度が５０
℃以上に増加するにつれ、ますます不可逆的に不活化す
る。培養時間は１〜３０時間であることができる。
【００２６】使用するのに有利な酵素は酵母および甘扁
桃からのグルコシダーゼ、大腸菌、コーヒー豆、ウシの
精巣およびアスペルギルスニガー（Aspergillus nige
r）からのガラクトシダーゼ、アーモンド、タチナタマ
メおよびカタツムリアセトン粉末からのマンノシダー
ゼ、アスペルギルスオリゼ（Aspergillus oryzae）、バ
チルスズブチリス（Bacillus subtilis）およびブタの
膵臓からのアミラーゼ、アスペルギルスニガー（Asperg
illus niger）からのアミログルコシダーゼおよびトラ
ンスグルコシダーゼである。
桃からのグルコシダーゼ、大腸菌、コーヒー豆、ウシの
精巣およびアスペルギルスニガー（Aspergillus nige
r）からのガラクトシダーゼ、アーモンド、タチナタマ
メおよびカタツムリアセトン粉末からのマンノシダー
ゼ、アスペルギルスオリゼ（Aspergillus oryzae）、バ
チルスズブチリス（Bacillus subtilis）およびブタの
膵臓からのアミラーゼ、アスペルギルスニガー（Asperg
illus niger）からのアミログルコシダーゼおよびトラ
ンスグルコシダーゼである。
【００２７】グルコシルドナーがグルコースまたは１−
グルコ−ヘキソピラノシドである場合には、グルコシダ
ーゼを酵素として使用することが特に好ましい。しか
し、ガラクトースもしくは１−ガラクト−ヘキソピラノ
シド、またはマンノースもしくは１−マンノ−ヘキソピ
ラノシドが用いられる場合には、使用するのが有利な酵
素はガラクトシダーゼまたはマンノシダーゼである。す
なわちグルコシルドナーIIの場合には比較的広範な基質
特異性があるので、式IIIの化合物の選択に融通性があ
る。すなわち、多数の相異なるＮ−およびカルボキシル
−保護基を自由に併用することができる。
グルコ−ヘキソピラノシドである場合には、グルコシダ
ーゼを酵素として使用することが特に好ましい。しか
し、ガラクトースもしくは１−ガラクト−ヘキソピラノ
シド、またはマンノースもしくは１−マンノ−ヘキソピ
ラノシドが用いられる場合には、使用するのが有利な酵
素はガラクトシダーゼまたはマンノシダーゼである。す
なわちグルコシルドナーIIの場合には比較的広範な基質
特異性があるので、式IIIの化合物の選択に融通性があ
る。すなわち、多数の相異なるＮ−およびカルボキシル
−保護基を自由に併用することができる。
【００２８】基質IIおよびIIIの溶解を改善するには、
酵素活性への悪影響が全くないかまたはほんの僅かであ
る溶媒を用いることが可能である。これらの例にはアセ
トン、ジメトキシエタン、ジグライムがあるが、特にジ
イソプロピルエーテルおよび第三ブチルメチルエーテ
ル、トルエンおよびキシレンがある。また、使用する酵
素と生理学的に融和性である塩を加えることにより反応
速度を増大させることも可能である。このような塩の例
としてはＭｎＳＯ4、ＣａＣｌ2、ＫＣｌ、ＮａＢｒ、Ｌ
ｉＣｌ、ＬｉＢｒおよびＫＭｎＯ4があるが、ＮｉＳＯ4
およびＭｇＣｌ2がより好ましい。
酵素活性への悪影響が全くないかまたはほんの僅かであ
る溶媒を用いることが可能である。これらの例にはアセ
トン、ジメトキシエタン、ジグライムがあるが、特にジ
イソプロピルエーテルおよび第三ブチルメチルエーテ
ル、トルエンおよびキシレンがある。また、使用する酵
素と生理学的に融和性である塩を加えることにより反応
速度を増大させることも可能である。このような塩の例
としてはＭｎＳＯ4、ＣａＣｌ2、ＫＣｌ、ＮａＢｒ、Ｌ
ｉＣｌ、ＬｉＢｒおよびＫＭｎＯ4があるが、ＮｉＳＯ4
およびＭｇＣｌ2がより好ましい。
【００２９】本発明により用いられるグリコシダーゼ
は、水溶液中において遊離の水溶性酵素としてまたは慣
用法により担体に結合された水に不溶性形態で（ドイツ
国特許出願公開公報第2732301号参照）用いることがで
きる。酵素が固定化形態で用いられる場合には、これは
バッチ法および連続法の両手法で実施されうる。
は、水溶液中において遊離の水溶性酵素としてまたは慣
用法により担体に結合された水に不溶性形態で（ドイツ
国特許出願公開公報第2732301号参照）用いることがで
きる。酵素が固定化形態で用いられる場合には、これは
バッチ法および連続法の両手法で実施されうる。
【００３０】反応の進行はＨＰＬＣ〔ODS-Hypersil ５
μm4.6×250mm、MeOH-H2O、Bioselect 100／10-8 250×
4.6mm、CH3CN-H2O〕によりまたはＴＬＣ〔CHCl3／Hex／
MeOH＝３：１：１〕により追跡されうる。
μm4.6×250mm、MeOH-H2O、Bioselect 100／10-8 250×
4.6mm、CH3CN-H2O〕によりまたはＴＬＣ〔CHCl3／Hex／
MeOH＝３：１：１〕により追跡されうる。
【００３１】その後の後処理は例えば、トルエンまたは
ジイソプロピルエーテルでの抽出、ＸＡＤ吸着剤（例え
ばＸＡＤ−２）での処理によるニトロフェノールの除
去、水性相の凍結乾燥およびクロマトグラフィー例えば
調製用薄層クロマトグラフィー、シリカゲルでのクロマ
トグラフィー（フラッシュまたは慣用の）、フラッシュ
クロマトグラフィーまたはEurosil Bioselect 100-30 C
l8（Knauer社製）もしくはLiChroPrep RP 18（Merck社
製）でのＭＰＬＣおよびSephadex LH20（Pharmacia社
製）もしくはBiogel P2 100-200メッシュ（BioRad社
製）でのクロマトグラフィーによる精製によって実施さ
れる。また、最初に反応溶液を凍結乾燥し次に固形残留
物をメタノールで抽出することも可能である。その場合
メタノール溶液の濾過および濃縮の次にはさらに精製す
るために前記のクロマトグラフィー手法を使用すること
ができる。
ジイソプロピルエーテルでの抽出、ＸＡＤ吸着剤（例え
ばＸＡＤ−２）での処理によるニトロフェノールの除
去、水性相の凍結乾燥およびクロマトグラフィー例えば
調製用薄層クロマトグラフィー、シリカゲルでのクロマ
トグラフィー（フラッシュまたは慣用の）、フラッシュ
クロマトグラフィーまたはEurosil Bioselect 100-30 C
l8（Knauer社製）もしくはLiChroPrep RP 18（Merck社
製）でのＭＰＬＣおよびSephadex LH20（Pharmacia社
製）もしくはBiogel P2 100-200メッシュ（BioRad社
製）でのクロマトグラフィーによる精製によって実施さ
れる。また、最初に反応溶液を凍結乾燥し次に固形残留
物をメタノールで抽出することも可能である。その場合
メタノール溶液の濾過および濃縮の次にはさらに精製す
るために前記のクロマトグラフィー手法を使用すること
ができる。
【００３２】
【実施例】以下に本発明を説明するために実施例を記載
する。
する。
【００３３】実施例 １ 大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ（５０μlの(ＮＨ4)
2ＳＯ4懸濁液、Boehringer Mannheim社製）７５Ｕを、
りん酸カリウム緩衝液（０.１Ｍ、pH＝７；１０mM Ｍｇ
Ｃｌ2）１００ml中のｏ−ニトロフェニルβ−ガラクト
シド １.２４ｇ（４.１ミリモル）および(Ｌ)−Ｚ−セ
リンエチルエステル２.０ｇ（７.５ミリモル）に加え、
その混合物を室温で５時間撹拌した。凍結乾燥し、残留
物をメタノールで抽出し次いでシリカゲルでのフラッシ
ュクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2／ヘキサ
ン＝１：６：６）に付しそして最後に調製用薄層クロマ
トグラフィー（ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ3／ヘキサン＝２：
６：６）により精製して目的の複合糖質３００mg（１７
％）を得た。これは1Ｈ／13Ｃ−ＮＭＲによれば純粋な
化合物であった。13 Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6、７５ＭＨｚ、δ ppm表
示）： Ｃｌ（Ｇａｌ）：１０４.０３（β） ＦＡＢ−ＭＳ：ＭＨ+＝４３０
2ＳＯ4懸濁液、Boehringer Mannheim社製）７５Ｕを、
りん酸カリウム緩衝液（０.１Ｍ、pH＝７；１０mM Ｍｇ
Ｃｌ2）１００ml中のｏ−ニトロフェニルβ−ガラクト
シド １.２４ｇ（４.１ミリモル）および(Ｌ)−Ｚ−セ
リンエチルエステル２.０ｇ（７.５ミリモル）に加え、
その混合物を室温で５時間撹拌した。凍結乾燥し、残留
物をメタノールで抽出し次いでシリカゲルでのフラッシ
ュクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2／ヘキサ
ン＝１：６：６）に付しそして最後に調製用薄層クロマ
トグラフィー（ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ3／ヘキサン＝２：
６：６）により精製して目的の複合糖質３００mg（１７
％）を得た。これは1Ｈ／13Ｃ−ＮＭＲによれば純粋な
化合物であった。13 Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6、７５ＭＨｚ、δ ppm表
示）： Ｃｌ（Ｇａｌ）：１０４.０３（β） ＦＡＢ−ＭＳ：ＭＨ+＝４３０
【００３４】実施例 ２ 大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ（１００μlの(ＮＨ
4)2ＳＯ4懸濁液、Boehringer Mannheim）１５０Ｕを、
りん酸カリウム緩衝液（０.０７Ｍ、pH＝７；１０mM Ｍ
ｇＣｌ2）２００ml中のｏ−ニトロフェニルβ−ガラク
トシド ２.５ｇ（８.３ミリモル）および(Ｌ)−Ｚ−セ
リンアリルエステル８.０ｇ（２８.７ミリモル）に加
え、その混合物を室温で２４時間撹拌した。凍結乾燥、
メタノールでの残留物の抽出およびシリカゲルでのカラ
ムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2／ヘキサ
ン＝１：６：２）による後処理を行って目的の複合糖質
４３５mg（１２％）を得た。13 Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6、７５ＭＨｚ、δ ppm表
示）： Ｃｌ（Ｇａｌ）：１０４.０６（β） ＦＡＢ−ＭＳ：ＭＨ+＝４４２
4)2ＳＯ4懸濁液、Boehringer Mannheim）１５０Ｕを、
りん酸カリウム緩衝液（０.０７Ｍ、pH＝７；１０mM Ｍ
ｇＣｌ2）２００ml中のｏ−ニトロフェニルβ−ガラク
トシド ２.５ｇ（８.３ミリモル）および(Ｌ)−Ｚ−セ
リンアリルエステル８.０ｇ（２８.７ミリモル）に加
え、その混合物を室温で２４時間撹拌した。凍結乾燥、
メタノールでの残留物の抽出およびシリカゲルでのカラ
ムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2／ヘキサ
ン＝１：６：２）による後処理を行って目的の複合糖質
４３５mg（１２％）を得た。13 Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6、７５ＭＨｚ、δ ppm表
示）： Ｃｌ（Ｇａｌ）：１０４.０６（β） ＦＡＢ−ＭＳ：ＭＨ+＝４４２
【００３５】実施例 ３ ｏ−ニトロフェニルβ−ガラクトシド１２４mg（０.４
１ミリモル）および(Ｌ)−Ｚ−セリンアリルエステル２
００mg（０.７２ミリモル）をりん酸カリウム緩衝液
（０.０７Ｍ、pH＝７.０；１０mM ＭｇＣｌ2）１０ml中
において大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ（５μlの
(ＮＨ4)2ＳＯ4懸濁液、Boehringer Mannheim社製）７.
５Ｕとともに５０℃で2 1/4時間撹拌した。凍結乾燥し
ついで調製用薄層クロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＣＨ
Ｃｌ3／ヘキサン＝２：２：６）に付して予想されたグ
リコシド２２mg（１２％）を得た。分光学上のデータは
実施例２に相当した。
１ミリモル）および(Ｌ)−Ｚ−セリンアリルエステル２
００mg（０.７２ミリモル）をりん酸カリウム緩衝液
（０.０７Ｍ、pH＝７.０；１０mM ＭｇＣｌ2）１０ml中
において大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ（５μlの
(ＮＨ4)2ＳＯ4懸濁液、Boehringer Mannheim社製）７.
５Ｕとともに５０℃で2 1/4時間撹拌した。凍結乾燥し
ついで調製用薄層クロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＣＨ
Ｃｌ3／ヘキサン＝２：２：６）に付して予想されたグ
リコシド２２mg（１２％）を得た。分光学上のデータは
実施例２に相当した。
【００３６】実施例 ４ ｏ−ニトロフェニルβ−ガラクトシド２２５mg（０.８
５ミリモル）および(Ｌ)−Ｚ−セリンアリルエステル５
００mg（１.８ミリモル）をりん酸カリウム緩衝液（０.
０７Ｍ、pH＝７.０；１０mM ＭｇＣｌ2）２０ml中にお
いて大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ（１０μlの(Ｎ
Ｈ4)2ＳＯ4懸濁液、Boehringer Mannheim社製）１５Ｕ
とともに室温で2 1/4時間撹拌した。凍結乾燥し、残留
物をメタノールで抽出しついでメタノールを用いてSeph
adex LH20（カラム ６０×２.５cm）でクロマトグラフ
ィーに付した。目的生成物３４mg（９％）が得られた。
分光学上のデータは実施例２に相当した。
５ミリモル）および(Ｌ)−Ｚ−セリンアリルエステル５
００mg（１.８ミリモル）をりん酸カリウム緩衝液（０.
０７Ｍ、pH＝７.０；１０mM ＭｇＣｌ2）２０ml中にお
いて大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ（１０μlの(Ｎ
Ｈ4)2ＳＯ4懸濁液、Boehringer Mannheim社製）１５Ｕ
とともに室温で2 1/4時間撹拌した。凍結乾燥し、残留
物をメタノールで抽出しついでメタノールを用いてSeph
adex LH20（カラム ６０×２.５cm）でクロマトグラフ
ィーに付した。目的生成物３４mg（９％）が得られた。
分光学上のデータは実施例２に相当した。
【００３７】実施例 ５ 大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ（５０μlの(ＮＨ4)
2ＳＯ4懸濁液、Boehringer Mannheim社製）７５ＵをＴ
ＲＩＳ緩衝液（０.１Ｍ、pH＝７.２）５０ml中において
ｏ−ニトロフェニルβ−ガラクトシド ５３８mg（１.７
８ミリモル）および(Ｄ)−Ｚ−セリンアリルエステル
１.０７ｇ（３.８４ミリモル）に加え、その混合物を室
温で６.５時間撹拌した。凍結乾燥し、次いで水を用い
たBiogel P2（１００〜２００メッシュ、カラム５０×
３cm）でのクロマトグラフィーそしてＭｅＯＨ／ＣＨＣ
ｌ3／ヘキサン＝１：３：１を用いたシリカゲルでのク
ロマトグラフィーに付した。目的の複合糖質が９５mg
（１２％）の収量で得られた。13 Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6、７５ＭＨｚ、δ ppm表
示）： ＦＡＢ−ＭＳ：ＭＨ+＝４４２
2ＳＯ4懸濁液、Boehringer Mannheim社製）７５ＵをＴ
ＲＩＳ緩衝液（０.１Ｍ、pH＝７.２）５０ml中において
ｏ−ニトロフェニルβ−ガラクトシド ５３８mg（１.７
８ミリモル）および(Ｄ)−Ｚ−セリンアリルエステル
１.０７ｇ（３.８４ミリモル）に加え、その混合物を室
温で６.５時間撹拌した。凍結乾燥し、次いで水を用い
たBiogel P2（１００〜２００メッシュ、カラム５０×
３cm）でのクロマトグラフィーそしてＭｅＯＨ／ＣＨＣ
ｌ3／ヘキサン＝１：３：１を用いたシリカゲルでのク
ロマトグラフィーに付した。目的の複合糖質が９５mg
（１２％）の収量で得られた。13 Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6、７５ＭＨｚ、δ ppm表
示）： ＦＡＢ−ＭＳ：ＭＨ+＝４４２
【００３８】実施例 ６ 大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ（５０μlの(ＮＨ4)
2ＳＯ4懸濁液、Boehringer Mannheim社製）７５ＵをＴ
ＲＩＳ緩衝液（０.０１Ｍ、pH＝７.２）５０ml中におい
てｏ−ニトロフェニルβ−ガラクトシド ５４２mg（１.
８ミリモル）および(Ｌ)−Ｚ−セリンエチルエステル
１.０６ｇ（３.８ミリモル）に加え、その混合物を室温
で５.５時間撹拌した。次に凍結乾燥、水によるBiogel
P2（１００〜２００メッシュ、カラム５０×３cm）およ
びＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ／ヘキサン(３：１：１）による
シリカゲルでのクロマトグラフィーにより精製を実施し
た。目的グリコシド７８mg（１０％収率）が得られた。
分光学上のデータは実施例１に相当した。
2ＳＯ4懸濁液、Boehringer Mannheim社製）７５ＵをＴ
ＲＩＳ緩衝液（０.０１Ｍ、pH＝７.２）５０ml中におい
てｏ−ニトロフェニルβ−ガラクトシド ５４２mg（１.
８ミリモル）および(Ｌ)−Ｚ−セリンエチルエステル
１.０６ｇ（３.８ミリモル）に加え、その混合物を室温
で５.５時間撹拌した。次に凍結乾燥、水によるBiogel
P2（１００〜２００メッシュ、カラム５０×３cm）およ
びＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ／ヘキサン(３：１：１）による
シリカゲルでのクロマトグラフィーにより精製を実施し
た。目的グリコシド７８mg（１０％収率）が得られた。
分光学上のデータは実施例１に相当した。
【００３９】実施例 ７ ｏ−ニトロフェニルβ−ガラクトシド５３２mg（１.７
７ミリモル）および(Ｌ)−Ｂｏｃ−セリンアリルエステ
ル１.０２ｇ（４.１６ミリモル）をＴＲＩＳ緩衝液
（０.０１Ｍ、pH＝７.２）５０ml中において大腸菌由来
のβ−ガラクトシダーゼ（５０μlの(ＮＨ4)2ＳＯ4懸濁
液、Boehringer Mannheim社製）７５Ｕとともに室温で
５.５時間撹拌した。凍結乾燥し、水を用いたBiogel P2
（１００〜２００メッシュ、カラム５０×３cm）でのク
ロマトグラフィーおよびＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ／ヘキサ
ン（３：１：１）を用いたシリカゲルでのクロマトグラ
フィーに付して目的の複合糖質１３０mg（１８％）を得
た。
７ミリモル）および(Ｌ)−Ｂｏｃ−セリンアリルエステ
ル１.０２ｇ（４.１６ミリモル）をＴＲＩＳ緩衝液
（０.０１Ｍ、pH＝７.２）５０ml中において大腸菌由来
のβ−ガラクトシダーゼ（５０μlの(ＮＨ4)2ＳＯ4懸濁
液、Boehringer Mannheim社製）７５Ｕとともに室温で
５.５時間撹拌した。凍結乾燥し、水を用いたBiogel P2
（１００〜２００メッシュ、カラム５０×３cm）でのク
ロマトグラフィーおよびＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ／ヘキサ
ン（３：１：１）を用いたシリカゲルでのクロマトグラ
フィーに付して目的の複合糖質１３０mg（１８％）を得
た。
【００４０】この化合物はＴＬＣ、1Ｈ／13Ｃ−ＮＭＲ
およびＦＡＢ−ＭＳによれば純粋であった。13 Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6、７５ＭＨｚ、δ ppm表
示）： Ｃｌ（Ｇａｌ）：１０４.０１（β） ＦＡＢ−ＭＳ：ＭＨ+＝４０８
およびＦＡＢ−ＭＳによれば純粋であった。13 Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6、７５ＭＨｚ、δ ppm表
示）： Ｃｌ（Ｇａｌ）：１０４.０１（β） ＦＡＢ−ＭＳ：ＭＨ+＝４０８
【００４１】実施例 ８ ｐ−ニトロフェニルα−マンノシド３９１mg（１.３ミ
リモル）および(Ｌ)−Ｚ−セリンアリルエステル７１４
mg（２.９ミリモル）をＴＲＩＳ緩衝液（pH６、０.０１
Ｍ）３５ml中においてα−マンノシダーゼ（タチナタマ
メから、Sigma社製）２２Ｕ（２２０μlの(ＮＨ4)2ＳＯ
4懸濁液）とともに室温で３.５時間撹拌した。凍結乾燥
し、Emosil-Bioselect（アセトニトリル／水 ４０：６
０中の１００−３０ Ｃ１８）９０ｇでのクロマトグラ
フィーおよびシリカゲル（ＣＨＣｌ3／メタノール／ヘ
キサン ３：１：１）でのクロマトグラフィーに付して
目的の生成物２２ｇ（４％）を得た。これは1Ｈ／13Ｃ
−ＮＭＲおよびＦＡＢ−ＭＳによれば純粋であった。13 Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6、７５ＭＨｚ、δ ppm表
示）： Ｃｌ（Ｍａｎ）：１００.６１（α） ＦＡＢ−ＭＳ：ＭＨ+＝４４２
リモル）および(Ｌ)−Ｚ−セリンアリルエステル７１４
mg（２.９ミリモル）をＴＲＩＳ緩衝液（pH６、０.０１
Ｍ）３５ml中においてα−マンノシダーゼ（タチナタマ
メから、Sigma社製）２２Ｕ（２２０μlの(ＮＨ4)2ＳＯ
4懸濁液）とともに室温で３.５時間撹拌した。凍結乾燥
し、Emosil-Bioselect（アセトニトリル／水 ４０：６
０中の１００−３０ Ｃ１８）９０ｇでのクロマトグラ
フィーおよびシリカゲル（ＣＨＣｌ3／メタノール／ヘ
キサン ３：１：１）でのクロマトグラフィーに付して
目的の生成物２２ｇ（４％）を得た。これは1Ｈ／13Ｃ
−ＮＭＲおよびＦＡＢ−ＭＳによれば純粋であった。13 Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6、７５ＭＨｚ、δ ppm表
示）： Ｃｌ（Ｍａｎ）：１００.６１（α） ＦＡＢ−ＭＳ：ＭＨ+＝４４２
【００４２】
【表１】
【００４３】
【表２】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07H 15/04 C12P 19/44 - 19/62 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (8)
- 【請求項１】 グリコシダーゼの存在下で式II 【化１】 （式中Ｒ1はフッ素、ヒドロキシル基、１〜５個の炭素
原子を有するアルコキシ基、２〜５個の炭素原子を有す
るアルケニルオキシ基、６〜１０個の炭素原子を有する
アリールオキシ基であるか、または酸素原子を介して結
合されている炭水化物残基である）の化合物を式III 【化２】 〔式中Ｒ2はアミノ保護基でありそしてＲ3はヒドロキシ
ル基；アルコキシまたはアルキルメルカプト基またはア
ルケニルオキシ基（これらの各々は１〜１８個の炭素原
子を有しそしてハロゲンまたはシアノにより置換されう
る）；アリールオキシ基（これは６〜１０個の炭素原子
を有しそしてそれぞれ１〜５個の炭素原子を有するアル
キル、アルコキシ、アルキルメルカプト、およびニトロ
基により置換されうる）；または −ＮＨＲ4（ここでＲ
4は１〜５個の炭素原子を有するアルキル基であるかま
たは式IV 【化３】 の基または式ＶまたはVI 【化４】 のジ−またはトリペプチド残基であって、ここでＲ5は
ヒドロキシル基、各場合１〜５個の炭素原子を有しそし
てハロゲンまたはシアノにより置換されうるアルコキ
シ、アルキルメルカプトまたはアルケニルオキシ基、ま
たは６〜１０個の炭素原子を有しそして各場合に１〜５
個の炭素原子を有するアルキル、アルコキシ、アルキル
メルカプト、およびニトロ基により置換されうるアリー
ルオキシ基であり、そしてＲ6、Ｒ7およびＲ8は同一で
あるかまたは相異なっていて水素であるか、または１〜
１０個の炭素原子を有しそしてハロゲン、ヒドロキシ
ル、アルコキシ、メルカプト、アルキルメルカプト、ア
リールまたはヘテロアリールにより置換されうる直鎖
状、分枝鎖状または環状のアルキルまたはアルケニル基
である）である〕の化合物とインキュベートすることか
らなる式Ｉ 【化５】 の複合糖質の製造方法。 - 【請求項２】 式IIにおいてＲ1がフッ素、メトキシ
基、アリルオキシ基、ビニルオキシ基、フェノキシ基、
ｏ−またはｐ−ニトロフェノキシ基またはジニトロフェ
ノキシ基である化合物を用いる請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 式IIIにおいてＲ2がベンジルオキシカル
ボニル、アリルオキシカルボニル、第三ブチルオキシカ
ルボニル、ホルミル、アセチル、クロロアセチル、トリ
フルオロアセチル、フェナセチル、ベンゾイルまたは６
〜２４個の炭素原子を有する長鎖脂肪酸のアシル基であ
る化合物を用いる請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 式IIIにおいてＲ3がメトキシ、メトキシ
メチル、ベンジルオキシメチル、メチルメルカプトメチ
ル、エトキシ、クロロエトキシ、ブロモエトキシもしく
はシアノエトキシ、ベンジルオキシ、ｐ−ニトロベンジ
ルオキシ、ｐ−メトキシベンジルオキシ、ピペロニルオ
キシ、アリルオキシもしくはビニルオキシおよび第三ブ
チルオキシもしくは第三ブチルジメチルシリルオキシで
あるか、またはＲ3が基ＮＨＲ4である場合にはＲ4が式I
VまたはＶ（式中Ｒ5はＲ3で定義した意味を有する）の
基であり、Ｒ3およびＲ5は同一であるかまたは相異なる
ことができる化合物を用いる請求項１または３記載の方
法。 - 【請求項５】 式IIおよび式IIIの各化合物が４：１〜
１：１０の比で用いられる請求項１〜４のいずれか１項
に記載の方法。 - 【請求項６】 反応を５.０〜８.０のpH範囲で行う請求
項１〜５のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項７】 反応を−３０〜５０℃の温度で行う請求
項１〜６のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項８】 酵母および甘扁桃からのグルコシダー
ゼ、大腸菌、アスペルギルスニガー（Aspergillus nige
r）、コーヒー豆またはウシの精巣からのガラクトシダ
ーゼ、カタツムリアセトン粉末形態でのβ−マンノシダ
ーゼまたはタチナタマメまたはアーモンドからのα−マ
ンノシダーゼ、アスペルギルスオリゼ（Aspergillus or
yzae）、バチルスズブチリス（Bacillus subtilis）ま
たはブタの膵臓からのアミラーゼまたはアスペルギルス
ニガーからのアミログルコシダーゼをグリコシダーゼと
して用いる請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
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