JPH04225996A - グリコシダーゼ触媒作用による複合糖質の合成法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】複合糖質（ｇｌｙｃｏ　ｃｏｎｊ
ｕｇａｔｅ）（糖タンパク質、グリコスフィンゴ脂質、
グリコホスホ脂質）は腫瘍発生、細菌およびウイルス感
染、細胞−細胞認識、細胞成長および細胞分化のような
生物学的認識過程において中心的な役割を果たす。それ
らは血液型分類の基準になりそして種々の巨大分子物質
および医薬の内部移行に関与している。すなわち、糖タ
ンパク質利用の重要な領域は例えば薬物の標的器官への
選択的取り込みおよびタンパク質加水分解による分解か
らの医薬保護にある（Ｈ．　Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ，　Ｃ
ｌｉｎｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１７，　
（１９８４）３；Ｎ．　Ｓｈａｒｏｎ，　Ｔｒｅｎｄｓ
　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｓｃｉ．　９（１９８４）１９８
；Ｓ．　Ｈａｋａｍｏｒｉ，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．
　４５（１９８５）２４０５；Ｓ．　Ｈａｋａｍｏｒｉ
，　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　２５４
（１９８６）Ｎｏ．　５，　３２）。

【０００２】複合糖質の前記機能の背景を考慮すれば、
該複合糖質の合成は特に興味ある問題である。

【０００３】

【従来の技術】糖タンパク質中のペプチドおよび炭水化
物部分は通常ともに共有結合で結合されている。多種の
構造にもかかわらず、結合部分は特徴的であって変化は
僅かであるにすぎない。性質上、結合には３つの主要な
型がある。すなわちＮ−アセチルグルコサミンとアスパ
ラギンのアミド官能基との間のグリコシド結合、Ｎ−ア
セチルガラクトサミンとセリンまたはスレオニンのヒド
ロキシル官能基との間のａ−Ｏ−グリコシド結合および
種々のヒドロキシアミノ酸へのキシロースまたはガラク
トースのｂ−Ｏ−グリコシド結合である。

【０００４】さらに、セリン様セラミド部分へのグルコ
ースのｂ−Ｏ−グリコシド結合はいくつかの興味深いグ
リコスフィンゴ脂質中に見出される。セラミドはスフィ
ンゴシン〔（２Ｓ，３Ｒ，４Ｅ）−２−アミノ−４−オ
クタデセン−１，３−ジオール〕、デヒドロスフィンゴ
シン（スフィンガニン）またはフィトスフィンゴシン（
４−Ｄ−ヒドロキシスフィンガニン）からなり、それら
は２−アミノ基上において長鎖脂肪酸（Ｃ１４〜Ｃ２６
）でアシル化されている（Ｙ．−Ｔ．　Ｌｉ，Ｓ．−Ｃ
．　Ｌｉ，　Ａｄｖ．　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．　Ｃｈｅ
ｍ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　４０（１９８２）２３５）。

【０００５】すなわち、複合糖質の化学合成における主
要な問題はオリゴ糖を得るための単糖単位の立体選択的
および位置選択的連続結合、アグリコンを得るためのグ
リコシド結合の立体選択的形成およびとりわけ、アグリ
コン例えばペプチドまたはセラミドの合成である。

【０００６】これらの問題に対する解決には、たとえ比
較的小さなグリコペプチドの場合でさえ、炭水化物およ
びペプチド化学からの好適な保護基の組合せを用いた精
巧な合成手法が必要である。例えば化学的な糖タンパク
質合成は多段、時間浪費の反応であることが多く、保護
基全てが除去された目的物質は少量だけしか得られない
ことが多い〔Ｈ．　Ｋｕｎｚ，　Ａｎｇｅｗ．　Ｃｈｅ
ｍ．　９９（１９８７）２９７−３１１；Ｒ．Ｒ．　Ｓ
ｃｈｍｉｄｔ，　“Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　
ｏｆ　Ｏｒｇａｎｉｃ　ａｎｄ　Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ
　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ”，　Ｗ．　Ｂａｒ
ｔｍａｎｎａｎｄ　Ｋ．Ｂ．　Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，　
ｅｄ．　ｐ．　１６９，　Ｖｅｒｌａｇ　Ｃｈｅｍｉｅ
　Ｗｅｉｎｈｅｉｍ（１９８７）；Ｈ．Ｐａｕｌｓｅｎ
　ｅｔ　ａｌ．　Ｓｔａｒｃｈ／Ｓｔａｅｒｋｅ　４０
（１９８８）４６５−４７２〕。

【０００７】これらの物質の合成には今日、オリゴ糖生
合成からの酵素がますます使用されている。これに関連
した高い立体−および位置選択性並びに複雑な保護基化
学の回避はしばしば多段の化学合成に比べて良好な収率
を可能にする。

【０００８】ところで、化学酵素的な糖タンパク質合成
が最近になって初めて文献に記載された〔Ｃ．　Ａｕｇ
ｅ，　Ｃ．　Ｇａｕｔｈｅｒｏｎ　ａｎｄ　Ｈ．　Ｐｏ
ｒａ，　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ，　Ｒｅｓ．　１９３，　
２８８　（１９８９）；Ｊ．　Ｔｈｉｅｎ　ａｎｄ　Ｔ
．　Ｗｉｅｍａｎｎ，　Ａｎｇｅｗ．　Ｃｈｅｍ．　１
０２，　７８（１９９０）；Ｃ．　Ｕｎｖｅｒｚａｇｔ
，　Ｈ．　Ｋｕｎｚ　ａｎｄ　Ｊ．Ｃ．　Ｐａｕｌｓｏ
ｎ，　Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．　１１２，
９３０８（１９９０）〕。これらは炭水化物部分での酵
素によるグリコシド化、すなわちペプチドもしくはアミ
ノ酸および糖の化学的に合成された複合体の糖−糖結合
を介しての延長を伴っている。

【０００９】糖結合を形成するのに用いる酵素はグリコ
シルトランスフェラーゼである。これらはグリコシルド
ナーおよびその受容体に関して極めて特異的であるとみ
なされており、そしてグリコシド化のためには活性化糖
例えばＵＤＰ−グルコースを必要とする。しかし、グリ
コシルトランスフェラーゼおよび活性化糖を得ることが
困難であるためにインビトロでの広範な使用またはより
大規模な合成は不可能である。

【００１０】単糖またはオリゴ糖とアミノ酸またはペプ
チドとの、酵素結合による糖ペプチド（複合糖質）の調
製的合成は、今日ではトランスフェラーゼまたはその他
の酵素のいずれかを用いた場合についても記載はない〔
Ｇ．Ｍ．　Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｔ
ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　４５（１９８９），　５３６５
−５４２２〕。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】グリコシダーゼは天然
系においてグリコシド結合の加水分解を触媒作用する。 最近グリコシダーゼはますます、加水分解反応の反転に
より、さらにまたグリコシドの調製的合成のために使用
されている（Ｒ．　Ｗａｌｌｅｎｆｅｌｓ，　Ｒ．　Ｗ
ｅｉｌ，　“Ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍｅｓ”，　３．　Ｅｄ
．；Ｂｏｙｅｒ，　Ｐ．Ｄ．　（Ｅｄ）；Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９７２，　
Ｖｏｌ．　ＶＩＩ，　ｐ．　６１８；Ｊ．Ｅ．Ｇ．　Ｂ
ａｒｎｅｔｔ，　Ｉｎｔ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　
６（１９７５）３２１−３２８；Ｇ．Ｍ．　Ｗｈｉｔｅ
ｓｉｄｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
　４５（１９８９）５３６５−５４２２；Ｋｕｒｔ　Ｇ
．　Ｎｉｌｓｓｏｎ，　Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎ．　１９８８，　２５６）。ヌクレオフィルと
して用いられるヒドロキシル化合物は、簡単な第１また
は第２アルコール、いくつかの単糖類およびある場合に
はまたステロイド類でもある。これらの合成の主要な不
利点は低収量にありそして多くの場合には副生成物の生
成にある。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明によればＤ−およ
びＬ−セリン並びにＤ−およびＬ−セリン誘導体が良好
なヌクレオフィルとして同様に作用しうることが見出さ
れた。これにより初めて、本来この種の生成物用に意図
されていない酵素を用いてヒドロキシアミノ酸またはそ
れらの誘導体と単糖類とのインビトロでのグリコシド結
合を行わせることが可能になる。すなわち、複合糖質が
グリコシダーゼを用いて糖類をＤ−およびＬ−セリン、
Ｄ−およびＬ−セリン誘導体並びにＤ−およびＬ−セリ
ンペプチドと直接結合させることにより合成されうるこ
とを初めて証明することができるようになった。これは
、グリコシダーゼがＮ−含有単糖類似体例えば１−デオ
キシノジリマイシン〔Ｎ．　Ｐｅｙｒｉｅｒａｓ　ｅｔ
　ａｌ．，　Ｅｍｂｏ　Ｊ．　２，　８２３（１９８３
）〕、二環式Ｎ−含有化合物例えばスワインソニン〔８
α，β−インドリジジン−１α，２α，８β−トリオー
ル；Ｒ．Ｔ．　Ｓｃｈｗａｒｚ，　Ｒ．　Ｄａｔｅｍａ
，　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｓｃｉ．　９，
　３２（１９８４）〕により、しかしまたＮ−含有アル
コール例えばエタノールアミン〔Ｒ．　Ｗａｌｌｅｎｆ
ｅｌｓ，　Ｒ．　Ｗｅｉｌ．　“Ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍｅ
ｓ”，　３．　Ｅｄ．；Ｂｏｙｅｒ，　Ｐ．Ｄ．（Ｅｄ
）；Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒ
ｋ　１９７２，　Ｖｏｌ．　ＶＩＩ，　ｐ．　６１８〕
により阻害されるので特に意外である。すなわち、アミ
ノ酸およびそれらの誘導体もまた阻害剤として作用しう
るかもしれなかった。

【００１３】一部には、得られた化合物は部分的に保護
された天然の複合糖質に相当するか、または特に後者の
変形物を示しそしてより大きな複合体用の合成プレカー
サーとして使用されうる。

【００１４】

【発明の構成】すなわち、本発明は式Ｉ

【化６】 の複合糖質の製造方法に関する。その方法はグリコシダ
ーゼの存在下で式ＩＩ

【００１５】

【化７】 （式中Ｒ１はフッ素、ヒドロキシル基、１〜５個の炭素
原子を有するアルコキシ基、２〜５個の炭素原子を有す
るアルケニルオキシ基、６〜１０個の炭素原子を有する
アリールオキシ基であるか、または酸素原子を介して結
合されている炭水化物残基である）の化合物を式ＩＩＩ

【００１６】

【化８】 〔式中Ｒ２はアミノ保護基でありそしてＲ３はヒドロキ
シル基；アルコキシまたはアルキルメルカプト基または
アルケニルオキシ基（これらの各々は１〜１８個の炭素
原子を有しそしてハロゲンまたはシアノにより置換され
うる）；アリールオキシ基（これは６〜１０個の炭素原
子を有しそしてそれぞれ１〜５個の炭素原子を有するア
ルキル、アルコキシ、アルキルメルカプト、およびニト
ロ基により置換されうる）；または　−ＮＨＲ４（ここ
でＲ４は１〜５個の炭素原子を有するアルキル基である
かまたは式ＩＶ

【００１７】

【化９】 の基または式ＶまたはＶＩ

【００１８】

【化１０】 のジ−またはトリペプチド残基であって、ここでＲ５は
ヒドロキシル基、各場合１〜５個の炭素原子を有しそし
てハロゲンまたはシアノにより置換されうるアルコキシ
、アルキルメルカプトまたはアルケニルオキシ基、また
は６〜１０個の炭素原子を有しそして各場合に１〜５個
の炭素原子を有するアルキル、アルコキシ、アルキルメ
ルカプト、およびニトロ基により置換されうるアリール
オキシ基であり、そしてＲ６、Ｒ７およびＲ８は同一で
あるかまたは相異なっていて水素であるか、または１〜
１０個の炭素原子を有しそしてハロゲン、ヒドロキシル
、アルコキシ、メルカプト、アルキルメルカプト、アリ
ールまたはヘテロアリールにより置換されうる直鎖状、
分枝鎖状または環状のアルキルまたはアルケニル基であ
る）である〕の化合物とインキュベートすることからな
る。

【００１９】グルコース、ガラクトースおよびマンノー
スが式ＩＩの化合物として可能でありかつ好ましい。式
ＩＩのＲ１位のアルコキシ基としてはメトキシ基を用い
るのが好ましいし、アルケニルオキシ基としてはアリル
オキシまたはビニルオキシ基を用いるのが好ましい。ア
リールオキシ基は電子求引性置換基例えばニトロまたは
シアノ基、またはハロゲンにより置換されうる。フェノ
キシ、ｏ−またはｐ−ニトロフェノキシまたはジニトロ
フェノキシ基を用いるのが好ましい。Ｒ１位の炭水化物
残基により形成される糖はマルトースまたはラクトース
であるのが好ましい。Ｒ１は特に好ましくはフッ素また
はｐ−またはｏ−ニトロフェノキシ基である。

【００２０】式ＩＩＩのＲ２位中の保護基としてはペプ
チドおよび糖ペプチド化学で慣用のアミノ保護基例えば
アシル基例えば長鎖脂肪酸のアシル基およびアルキル−
またはアリールオキシカルボニル基を用いることが本質
的に可能である。使用できる保護基は例えばＨ．　Ｈｕ
ｂｂｕｃｈ，　Ｋｏｎｔａｋｔｅ　３／７９，　ｐａｇ
ｅ　１４，　Ｔ．Ｗ．　Ｇｒｅｅｎｅ，　Ｐｒｏｔｅｃ
ｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎ
ｓ　１９８１，　ｐ２２３ｆｆまたはＨｏｕｂｅｎ−Ｗ
ｅｙｌ，　Ｖｏｌ．　１５／１　ｐ．　４６の論文中に
記載されている。用いるのに好ましいのはベンジルオキ
シカルボニル（Ｚ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｏ
ｃ）および第三ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）並び
にトリクロロエトキシカルボニル、ホルミル、アセチル
、クロロアセチル、トリフルオロアセチル、フェナセチ
ル、ベンゾイルまたは６〜２４個の炭素原子を有する長
鎖脂肪酸のアシル基である。

【００２１】Ｒ３位の基および式ＩＶ−ＶＩ中のＲ５は
メトキシ、メトキシメチル、ベンジルオキシメチル、メ
チルメルカプトメチル、エトキシ、クロロエトキシ、ブ
ロモエトキシもしくはシアノエトキシ、およびビニルオ
キシ基およびペプチド化学での慣用カルボキシル保護基
（Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ．　Ｖｏｌ．　１５／１，　
ｐ．　３１５ｆｆ）例えばベンジルオキシ、トリクロロ
エトキシ、ｐ−ニトロベンジルオキシ、ｐ−メトキシベ
ンジルオキシ、ピペロニルオキシ、アリルオキシまたは
第三ブチルオキシおよび第三ブチルジメチルシリルオキ
シ基であるのが好ましい。

【００２２】Ｒ３がアミノ基ＮＨＲ４である場合には、
Ｒ４は式ＩＶおよびＶの基であるのが好ましい。式中Ｒ
６およびＲ７は同一であるかまたは相異なっていて、水
素であるかまたは１〜１０個の炭素原子を有しそしてハ
ロゲン、ヒドロキシル、メルカプト、アルコキシ、アル
キルメルカプト、アリールまたはヘテロアリールにより
置換されうる直鎖、分枝鎖状または環状のアルキルまた
はアルケニル基である。Ｒ６およびＲ７の置換基は本質
的には中性、脂肪族、芳香族または環状α−アミノ酸の
側鎖である。式ＩＩＩの化合物として使用されるのが特
に好ましいのはＺ−Ｓｅｒ−Ｏアリル、Ｚ−Ｓｅｒ−Ａ
ｌａ−ＯＭｅ、Ｚ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−ＯＭｅ、Ａｌｏｃ
−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＯＥｔＣｌ、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ−Ｏア
リルおよびＡｌｏｃ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−ＯＭｅである。 式ＩＩＩの化合物中のＲ２が６〜２４個の炭素原子を有
する長鎖脂肪酸のアシル基でありそしてＲ３が６〜１８
個の炭素原子を有するアルコキシ基である場合には、式
ＩＩＩの化合物はスフィンゴシンまたはスフィンガニン
と構造上類似している化合物であって、それはグリコシ
ダーゼの触媒作用による、グリコスフィンゴ脂質合成の
ためのモデル物質として興味深い。

【００２３】式ＩＩおよびＩＩＩの各基質は購入されう
る（例えばニトロフェニルグリコシド類）かまたはそれ
自体知られた手法によって容易に製造されうる（Ｆ．　
Ｍｉｃｈｅｅｌ，　Ａ．Ｋｌｉｍｅｒ，　Ａｄｖ．　Ｃ
ａｒｂｏｈｙｄｒ．　Ｃｈｅｍ．　１６，　８５（１９
６１）；ドイツ国特許出願公開公報第３０４０８０５号
および第３４３２５６５号各明細書によるグリコシルフ
ルオライド類；Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ，　Ｖｏｌｕｍ
ｅｓ　１５／Ｉおよび１５／ＩＩに記載の各手法による
アミノ酸およびペプチド並びに保護された誘導体）かの
いずれかである。

【００２４】式ＩＩの化合物および式ＩＩＩの化合物は
４：１〜１：１０、好ましくは３：２〜１：４の割合で
用いることができる。グリコシルドナーＩＩＩのミリモ
ル当たり４〜４０単位の酵素を用いるのが好都合である
。

【００２５】反応はｐＨ５．０〜８．０、有利にはｐＨ
６．０〜７．５で行うことができる。使用しうる緩衝液
はＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＣＩＮ、ＴＡＰＳ、ＭＥＳ、ＴＥ
ＳおよびＭＯＰＳ、ＣＨＥＳ、ＴＲＩＳ並びにりん酸カ
リウムおよびりん酸ナトリウム緩衝液である。モル濃度
は０．０１〜１．０好ましくは０．０１〜０．１である
べきである。さらに、温度は約−３０℃〜５０℃好まし
くは２０℃〜３５℃で保持されるべきである。酵素は温
度が５０℃以上に増加するにつれ、ますます不可逆的に
不活化する。培養時間は１〜３０時間であることができ
る。

【００２６】使用するのに有利な酵素は酵母および甘扁
桃からのグルコシダーゼ、大腸菌、コーヒー豆、ウシの
精巣およびアスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓ　ｎｉｇｅｒ）からのガラクトシダーゼ、アーモン
ド、タチナタマメおよびカタツムリアセトン粉末からの
マンノシダーゼ、アスペルギルスオリゼ（Ａｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）、バチルスズブチリス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびブタの膵臓
からのアミラーゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒ
ｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）からのアミログルコシダー
ゼおよびトランスグルコシダーゼである。

【００２７】グルコシルドナーがグルコースまたは１−
グルコ−ヘキソピラノシドである場合には、グルコシダ
ーゼを酵素として使用することが特に好ましい。しかし
、ガラクトースもしくは１−ガラクト−ヘキソピラノシ
ド、またはマンノースもしくは１−マンノ−ヘキソピラ
ノシドが用いられる場合には、使用するのが有利な酵素
はガラクトシダーゼまたはマンノシダーゼである。すな
わちグルコシルドナーＩＩの場合には比較的広範な基質
特異性があるので、式ＩＩＩの化合物の選択に融通性が
ある。すなわち、多数の相異なるＮ−およびカルボキシ
ル−保護基を自由に併用することができる。

【００２８】基質ＩＩおよびＩＩＩの溶解を改善するに
は、酵素活性への悪影響が全くないかまたはほんの僅か
である溶媒を用いることが可能である。これらの例には
アセトン、ジメトキシエタン、ジグライムがあるが、特
にジイソプロピルエーテルおよび第三ブチルメチルエー
テル、トルエンおよびキシレンがある。また、使用する
酵素と生理学的に融和性である塩を加えることにより反
応速度を増大させることも可能である。このような塩の
例としてはＭｎＳＯ４、ＣａＣｌ２、ＫＣｌ、ＮａＢｒ
、ＬｉＣｌ、ＬｉＢｒおよびＫＭｎＯ４があるが、Ｎｉ
ＳＯ４およびＭｇＣｌ２がより好ましい。

【００２９】本発明により用いられるグリコシダーゼは
、水溶液中において遊離の水溶性酵素としてまたは慣用
法により担体に結合された水に不溶性形態で（ドイツ国
特許出願公開公報第２７３２３０１号参照）用いること
ができる。酵素が固定化形態で用いられる場合には、こ
れはバッチ法および連続法の両手法で実施されうる。

【００３０】反応の進行はＨＰＬＣ〔ＯＤＳ−Ｈｙｐｅ
ｒｓｉｌ　５μｍ４．６×２５０ｍｍ、ＭｅＯＨ−Ｈ２
Ｏ、Ｂｉｏｓｅｌｅｃｔ　１００／１０−８　２５０×
４．６ｍｍ、ＣＨ３ＣＮ−Ｈ２Ｏ〕によりまたはＴＬＣ
〔ＣＨＣｌ３／Ｈｅｘ／ＭｅＯＨ＝３：１：１〕により
追跡されうる。

【００３１】その後の後処理は例えば、トルエンまたは
ジイソプロピルエーテルでの抽出、ＸＡＤ吸着剤（例え
ばＸＡＤ−２）での処理によるニトロフェノールの除去
、水性相の凍結乾燥およびクロマトグラフィー例えば調
製用薄層クロマトグラフィー、シリカゲルでのクロマト
グラフィー（フラッシュまたは慣用の）、フラッシュク
ロマトグラフィーまたはＥｕｒｏｓｉｌ　Ｂｉｏｓｅｌ
ｅｃｔ　１００−３０　Ｃｌ８（Ｋｎａｕｅｒ社製）も
しくはＬｉＣｈｒｏＰｒｅｐ　ＲＰ　１８（Ｍｅｒｃｋ
社製）でのＭＰＬＣおよびＳｅｐｈａｄｅｘ　ＬＨ２０
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）もしくはＢｉｏｇｅｌ　Ｐ
２　１００−２００メッシュ（ＢｉｏＲａｄ社製）での
クロマトグラフィーによる精製によって実施される。ま
た、最初に反応溶液を凍結乾燥し次に固形残留物をメタ
ノールで抽出することも可能である。その場合メタノー
ル溶液の濾過および濃縮の次にはさらに精製するために
前記のクロマトグラフィー手法を使用することができる
。

【００３２】

【実施例】以下に本発明を説明するために実施例を記載
する。

【００３３】実施例　　１ 大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ（５０μｌの（ＮＨ
４）２ＳＯ４懸濁液、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ社製）７５Ｕを、りん酸カリウム緩衝液（０．
１Ｍ、ｐＨ＝７；１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２）１００ｍｌ中
のｏ−ニトロフェニルβ−ガラクトシド　１．２４ｇ（
４．１ミリモル）および（Ｌ）−Ｚ−セリンエチルエス
テル２．０ｇ（７．５ミリモル）に加え、その混合物を
室温で５時間撹拌した。凍結乾燥し、残留物をメタノー
ルで抽出し次いでシリカゲルでのフラッシュクロマトグ
ラフィー（ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン＝１：６
：６）に付しそして最後に調製用薄層クロマトグラフィ
ー（ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３／ヘキサン＝２：６：６）に
より精製して目的の複合糖質３００ｍｇ（１７％）を得
た。これは１Ｈ／１３Ｃ−ＮＭＲによれば純粋な化合物
であった。 １３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、７５ＭＨｚ、δ　ｐ
ｐｍ表示）： Ｃｌ（Ｇａｌ）：１０４．０３（β） ＦＡＢ−ＭＳ：ＭＨ＋＝４３０

【００３４】実施例　　２ 大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ（１００μｌの（Ｎ
Ｈ４）２ＳＯ４懸濁液、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ）１５０Ｕを、りん酸カリウム緩衝液（０．
０７Ｍ、ｐＨ＝７；１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２）２００ｍｌ
中のｏ−ニトロフェニルβ−ガラクトシド　２．５ｇ（
８．３ミリモル）および（Ｌ）−Ｚ−セリンアリルエス
テル８．０ｇ（２８．７ミリモル）に加え、その混合物
を室温で２４時間撹拌した。凍結乾燥、メタノールでの
残留物の抽出およびシリカゲルでのカラムクロマトグラ
フィー（ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン＝１：６：
２）による後処理を行って目的の複合糖質４３５ｍｇ（
１２％）を得た。 １３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、７５ＭＨｚ、δ　ｐ
ｐｍ表示）： Ｃｌ（Ｇａｌ）：１０４．０６（β） ＦＡＢ−ＭＳ：ＭＨ＋＝４４２

【００３５】実施例　　３ ｏ−ニトロフェニルβ−ガラクトシド１２４ｍｇ（０．
４１ミリモル）および（Ｌ）−Ｚ−セリンアリルエステ
ル２００ｍｇ（０．７２ミリモル）をりん酸カリウム緩
衝液（０．０７Ｍ、ｐＨ＝７．０；１０ｍＭ　ＭｇＣｌ
２）１０ｍｌ中において大腸菌由来のβ−ガラクトシダ
ーゼ（５μｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４懸濁液、Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）７．５Ｕとともに
５０℃で２　１／４時間撹拌した。凍結乾燥しついで調
製用薄層クロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３／
ヘキサン＝２：２：６）に付して予想されたグリコシド
２２ｍｇ（１２％）を得た。分光学上のデータは実施例
２に相当した。

【００３６】実施例　　４ ｏ−ニトロフェニルβ−ガラクトシド２２５ｍｇ（０．
８５ミリモル）および（Ｌ）−Ｚ−セリンアリルエステ
ル５００ｍｇ（１．８ミリモル）をりん酸カリウム緩衝
液（０．０７Ｍ、ｐＨ＝７．０；１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
）２０ｍｌ中において大腸菌由来のβ−ガラクトシダー
ゼ（１０μｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４懸濁液、Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）１５Ｕとともに室
温で２　１／４時間撹拌した。凍結乾燥し、残留物をメ
タノールで抽出しついでメタノールを用いてＳｅｐｈａ
ｄｅｘ　ＬＨ２０（カラム　６０×２．５ｃｍ）でクロ
マトグラフィーに付した。目的生成物３４ｍｇ（９％）
が得られた。 分光学上のデータは実施例２に相当した。

【００３７】実施例　　５ 大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ（５０μｌの（ＮＨ
４）２ＳＯ４懸濁液、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ社製）７５ＵをＴＲＩＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐ
Ｈ＝７．２）５０ｍｌ中においてｏ−ニトロフェニルβ
−ガラクトシド　５３８ｍｇ（１．７８ミリモル）およ
び（Ｄ）−Ｚ−セリンアリルエステル１．０７ｇ（３．
８４ミリモル）に加え、その混合物を室温で６．５時間
撹拌した。凍結乾燥し、次いで水を用いたＢｉｏｇｅｌ
　Ｐ２（１００〜２００メッシュ、カラム５０×３ｃｍ
）でのクロマトグラフィーそしてＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３
／ヘキサン＝１：３：１を用いたシリカゲルでのクロマ
トグラフィーに付した。目的の複合糖質が９５ｍｇ（１
２％）の収量で得られた。 １３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、７５ＭＨｚ、δ　ｐ
ｐｍ表示）： ＦＡＢ−ＭＳ：ＭＨ＋＝４４２

【００３８】実施例　　６ 大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ（５０μｌの（ＮＨ
４）２ＳＯ４懸濁液、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ社製）７５ＵをＴＲＩＳ緩衝液（０．０１Ｍ、
ｐＨ＝７．２）５０ｍｌ中においてｏ−ニトロフェニル
β−ガラクトシド　５４２ｍｇ（１．８ミリモル）およ
び（Ｌ）−Ｚ−セリンエチルエステル１．０６ｇ（３．
８ミリモル）に加え、その混合物を室温で５．５時間撹
拌した。次に凍結乾燥、水によるＢｉｏｇｅｌ　Ｐ２（
１００〜２００メッシュ、カラム５０×３ｃｍ）および
ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ヘキサン（３：１：１）による
シリカゲルでのクロマトグラフィーにより精製を実施し
た。目的グリコシド７８ｍｇ（１０％収率）が得られた
。 分光学上のデータは実施例１に相当した。

【００３９】実施例　　７ ｏ−ニトロフェニルβ−ガラクトシド５３２ｍｇ（１．
７７ミリモル）および（Ｌ）−Ｂｏｃ−セリンアリルエ
ステル１．０２ｇ（４．１６ミリモル）をＴＲＩＳ緩衝
液（０．０１Ｍ、ｐＨ＝７．２）５０ｍｌ中において大
腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ（５０μｌの（ＮＨ４
）２ＳＯ４懸濁液、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈ
ｅｉｍ社製）７５Ｕとともに室温で５．５時間撹拌した
。凍結乾燥し、水を用いたＢｉｏｇｅｌ　Ｐ２（１００
〜２００メッシュ、カラム５０×３ｃｍ）でのクロマト
グラフィーおよびＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ヘキサン（３
：１：１）を用いたシリカゲルでのクロマトグラフィー
に付して目的の複合糖質１３０ｍｇ（１８％）を得た。

【００４０】この化合物はＴＬＣ、１Ｈ／１３Ｃ−ＮＭ
ＲおよびＦＡＢ−ＭＳによれば純粋であった。 １３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、７５ＭＨｚ、δ　ｐ
ｐｍ表示）： Ｃｌ（Ｇａｌ）：１０４．０１（β） ＦＡＢ−ＭＳ：ＭＨ＋＝４０８

【００４１】実施例　　８ ｐ−ニトロフェニルα−マンノシド３９１ｍｇ（１．３
ミリモル）および（Ｌ）−Ｚ−セリンアリルエステル７
１４ｍｇ（２．９ミリモル）をＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ６
、０．０１Ｍ）３５ｍｌ中においてα−マンノシダーゼ
（タチナタマメから、Ｓｉｇｍａ社製）２２Ｕ（２２０
μｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４懸濁液）とともに室温で３．
５時間撹拌した。凍結乾燥し、Ｅｍｏｓｉｌ−Ｂｉｏｓ
ｅｌｅｃｔ（アセトニトリル／水　４０：６０中の１０
０−３０　Ｃ１８）９０ｇでのクロマトグラフィーおよ
びシリカゲル（ＣＨＣｌ３／メタノール／ヘキサン　３
：１：１）でのクロマトグラフィーに付して目的の生成
物２２ｇ（４％）を得た。これは１Ｈ／１３Ｃ−ＮＭＲ
およびＦＡＢ−ＭＳによれば純粋であった。 １３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、７５ＭＨｚ、δ　ｐ
ｐｍ表示）： Ｃｌ（Ｍａｎ）：１００．６１（α） ＦＡＢ−ＭＳ：ＭＨ＋＝４４２

【００４２】

【表１】

【００４３】

【表２】

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　グリコシダーゼの存在下で式ＩＩ【化
   １】 （式中Ｒ１はフッ素、ヒドロキシル基、１〜５個の炭素
   原子を有するアルコキシ基、２〜５個の炭素原子を有す
   るアルケニルオキシ基、６〜１０個の炭素原子を有する
   アリールオキシ基であるか、または酸素原子を介して結
   合されている炭水化物残基である）の化合物を式ＩＩＩ
   【化２】 〔式中Ｒ２はアミノ保護基でありそしてＲ３はヒドロキ
   シル基；アルコキシまたはアルキルメルカプト基または
   アルケニルオキシ基（これらの各々は１〜１８個の炭素
   原子を有しそしてハロゲンまたはシアノにより置換され
   うる）；アリールオキシ基（これは６〜１０個の炭素原
   子を有しそしてそれぞれ１〜５個の炭素原子を有するア
   ルキル、アルコキシ、アルキルメルカプト、およびニト
   ロ基により置換されうる）；または　−ＮＨＲ４（ここ
   でＲ４は１〜５個の炭素原子を有するアルキル基である
   かまたは式ＩＶ 【化３】 の基または式ＶまたはＶＩ 【化４】 のジ−またはトリペプチド残基であって、ここでＲ５は
   ヒドロキシル基、各場合１〜５個の炭素原子を有しそし
   てハロゲンまたはシアノにより置換されうるアルコキシ
   、アルキルメルカプトまたはアルケニルオキシ基、また
   は６〜１０個の炭素原子を有しそして各場合に１〜５個
   の炭素原子を有するアルキル、アルコキシ、アルキルメ
   ルカプト、およびニトロ基により置換されうるアリール
   オキシ基であり、そしてＲ６、Ｒ７およびＲ８は同一で
   あるかまたは相異なっていて水素であるか、または１〜
   １０個の炭素原子を有しそしてハロゲン、ヒドロキシル
   、アルコキシ、メルカプト、アルキルメルカプト、アリ
   ールまたはヘテロアリールにより置換されうる直鎖状、
   分枝鎖状または環状のアルキルまたはアルケニル基であ
   る）である〕の化合物とインキュベートすることからな
   る式Ｉ 【化５】 の複合糖質の製造方法。
2. 【請求項２】　　式ＩＩにおいてＲ１がフッ素、メトキ
   シ基、アリルオキシ基、ビニルオキシ基、フェノキシ基
   、ｏ−またはｐ−ニトロフェノキシ基またはジニトロフ
   ェノキシ基である化合物を用いる請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】　　式ＩＩＩにおいてＲ２がベンジルオキ
   シカルボニル、アリルオキシカルボニル、第三ブチルオ
   キシカルボニル、ホルミル、アセチル、クロロアセチル
   、トリフルオロアセチル、フェナセチル、ベンゾイルま
   たは６〜２４個の炭素原子を有する長鎖脂肪酸のアシル
   基である化合物を用いる請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】　　式ＩＩＩにおいてＲ３がメトキシ、メ
   トキシメチル、ベンジルオキシメチル、メチルメルカプ
   トメチル、エトキシ、クロロエトキシ、ブロモエトキシ
   もしくはシアノエトキシ、ベンジルオキシ、ｐ−ニトロ
   ベンジルオキシ、ｐ−メトキシベンジルオキシ、ピペロ
   ニルオキシ、アリルオキシもしくはビニルオキシおよび
   第三ブチルオキシもしくは第三ブチルジメチルシリルオ
   キシであるか、またはＲ３が基ＮＨＲ４である場合には
   Ｒ４が式ＩＶまたはＶ（式中Ｒ５はＲ３で定義した意味
   を有する）の基であり、Ｒ３およびＲ５は同一であるか
   または相異なることができる化合物を用いる請求項１ま
   たは３記載の方法。
5. 【請求項５】　　式ＩＩおよび式ＩＩＩの各化合物が４
   ：１〜１：１０の比で用いられる請求項１〜４のいずれ
   か１項に記載の方法。
6. 【請求項６】　　反応を５．０〜８．０のｐＨ範囲で行
   う請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 【請求項７】　　反応を−３０〜５０℃の温度で行う請
   求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 【請求項８】　　酵母および甘扁桃からのグルコシダー
   ゼ、大腸菌、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌ
   ｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）、コーヒー豆またはウシの精巣か
   らのガラクトシダーゼ、カタツムリアセトン粉末形態で
   のβ−マンノシダーゼまたはタチナタマメまたはアーモ
   ンドからのα−マンノシダーゼ、アスペルギルスオリゼ
   （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）、バチルス
   ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ま
   たはブタの膵臓からのアミラーゼまたはアスペルギルス
   ニガーからのアミログルコシダーゼをグリコシダーゼと
   して用いる請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。