JP5892750B2 - Ｎ−アセチルグルコサミンがαで結合した糖誘導体の調製方法 - Google Patents

Description

本発明は、抗ピロリ菌効果等を有する機能性オリゴ糖鎖として有用な、α結合型Ｎ−アセチルグルコサミン糖誘導体を、酵素的に調製する新規な方法に関する。

近年高等生物の胃や十二指腸腺粘液中のムチン型糖タンパク質糖鎖の非還元末端にＮ-アセチルグルコサミン(ＧｌｃＮＡｃ)がαでガラクトース(Ｇａｌ)に結合したオリゴ糖鎖、ＧｌｃＮＡｃα１→４Ｇａｌ−Ｒが存在することが報告されている（非特許文献１）。この糖鎖は近年、胃癌や胃潰瘍の原因とされるヘリコバクターピロリ菌を殺菌もしくは増殖抑制する物質として注目されており（非特許文献２）、最近になって、ＧｌｃＮＡｃがαで結合した種々の誘導体の抗ピロリ菌効果が報告されるようになった。

また、最近、ＧｌｃＮＡｃα１→４Ｇａｌ−Ｒに関連する糖鎖に対するいくつかのモノクローナル抗体が商品化されたことから、ＧｌｃＮＡｃがαで結合した糖鎖の新たな機能の発見が期待されている。これらの物質のうち、比較的高い抗ピロリ菌効果を有する物質は、少なくとも上記のようにＧｌｃＮＡｃがαでガラクトースに結合した物質であると考えられており、いくつかの化学的合成手法が試みられている(非特許文献３)。しかしながら、一般にＧｌｃＮＡｃがαで結合した化合物の調製において、特にそのグリコシル化における立体制御法が化学的合成法では未だに達成されておらず、多段階の誘導化なしに一度の反応において１００％のα選択的グリコシド化が達成された例は報告されていない（非特許文献４）。さらに上記のように、目的のオリゴ糖鎖を化学的に調製するためには、複雑で多段階の合成手法や技術が必要であるために、いまだに大量調製化への目途はたっていない。

また、上記の天然型糖鎖は、高等動物が有する糖転移酵素、α１，４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（α４ＧｎＴ)の働きによって生成することが知られていることから、α４ＧｎＴによる調製も試みられている（非特許文献５、特許文献１）。しかしながら、この方法は高価な基質である糖ヌクレオチドを使用し、かつα４ＧｎＴの調製においても、動物細胞等しか生産媒体にできないために、大量生産には向かない。さらにα４ＧｎＴはその糖受容体に対する構造特異性が比較的厳密であるために、ＧｌｃＮＡｃをαで結合した新しい糖鎖およびその誘導体を調製するには不向きであると考えられる。

一方、糖加水分解酵素によるオリゴ糖鎖の合成手法は、用いる糖供与体が比較的調製しやすく、酵素自体も微生物由来のものが多いために、目的とする物質の大量調製も視野に入れることができる。このような観点から、今までに多くの酵素的合成法が報告されてきた。しかしながら、ＧｌｃＮＡｃをαで結合した糖鎖およびその誘導体の酵素的調製方法は今までに報告例がなく、本発明者ら自身も、多糖類（ヘパリン硫酸など）からＧｌｃＮＡｃを遊離する酵素として報告されているヒトのα−Ｎ-アセチルグルコサミニダーゼのアミノ酸配列に似た微生物由来の酵素ホモログ（これらのホモログはグリコシルハイドロラーゼファミリー８９（ＧＨ８９）に属する）を見出し、既存の糖供与体(パラニトロフェニル誘導体（ＧｌｃＮＡｃ−α−ｐＮＰ）、およびメチルウンベリフェリル誘導体（ＧｌｃＮＡｃ−α−ＭＵ)）を糖供与体とする (特許文献２)糖転移を試みてきたが、達成することはできなかった。したがって、新しい糖供与体と糖加水分解酵素の組み合わせによる調製方法が求められていた。

特開２００１−４６０７７号公報 特開２００９−２３２８３８号公報

イシハラ ケー（Ｉｓｈｉｈａｒａ Ｋ）ら、バイオケミストリー ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍｓｔｒｙ Ｊｏｕｒｎａｌ）、１９９６年、第３１８巻、ｐ４０９−４１６． カワクボ エム（Ｋａｗａｋｕｂｏ Ｍ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２００４年、第３０５巻、ｐ１００３−１００６． マナベ エス（Ｍａｎａｂｅ Ｓ）ら、ジャーナル オブ オルガニック ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２００７年、第７２巻、ｐ６１０７−６１１５． ボルナーニ エフ エル（Ｂｏｒｎａｇｈｉ Ｆ Ｌ）ら、テトラヘドロン レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ）、２００５年、第４６巻、ｐ３４８５−３４８８． ナカヤマ ジェー（Ｎａｋａｙａｍａ Ｊ）ら、プロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンスィズ オブ ユーエスエー（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ＵＳＡ）、１９９９年、第９６巻、ｐ８９９１−８９９６． タナカ ティー（Ｔａｎａｋａ Ｔ）ら、ケミカル コミュニケーション、（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）、２００８年、第１７巻、ｐ２０１６−２０１８． ハンコック エス エム（Ｈａｎｃｏｃｋ Ｓ Ｍ）ら、カレント オピニオン イン ケミカル バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、２００６年、第５巻、ｐ５０９−５１９．

本発明は前記の課題を解決するためになされたもので、Ｎ−アセチルグルコサミンがαで結合した糖誘導体を、簡便にかつ大量に製造できる、新規な酵素的調製方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記現状にかんがみ、まずＧｌｃＮＡｃがαで結合した糖鎖からＧｌｃＮＡｃを遊離する酵素の遺伝子と考えられるいくつかのＤＮＡ配列情報を基に、いくつかの組換えタンパク質を作製したところ、あるアミノ酸配列を持つタンパク質がＧｌｃＮＡｃα１→４Ｇａｌ−Ｒの糖鎖をはじめとするいくつかのＧｌｃＮＡｃがαで結合した糖誘導体からＧｌｃＮＡｃを遊離する活性を持つことを見出していた(特許文献２)。しかしながら、既存の糖供与体（パラニトロフェニル誘導体、ＧｌｃＮＡｃ−α−ｐＮＰ、およびメチルウンベリフェリル誘導体、ＧｌｃＮＡｃ−α−ＭＵ）で上記α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼによる糖転移を試みたが、目的とする糖誘導体を得ることはできなかった。

そこで、近年、糖加水分解酵素によりすみやかに加水分解されるＤＭＴ（ジメトキシトリアゾール）化糖（非特許文献６）に焦点を当て、Ｎ−アセチルグルコサミンがαで結合したジメトキシトリアゾール（ＧｌｃＮＡｃ−α−ＤＭＴ。４，６-ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル２−アセタミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシド）に対するα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの水溶液中における挙動を調査したところ、上記の合成基質よりも、すみやかに加水分解されることをつきとめ、本発明の調製方法を完成するに至った。

本発明は、水溶液中一段階で調製できるジメトキシトリアゾールをαで有するＮ−アセチルグルコサミン(ＧｌｃＮＡｃ−α−ＤＭＴ)もしくはその誘導体を糖供与体とし、微生物由来の糖加水分解酵素の作用により、厳密にα選択的に糖受容体へ糖転移するというものである。本発明により、結果として抗ピロリ菌効果を有するオリゴ糖鎖（ＧｌｃＮＡｃα１→４Ｇａｌ−Ｒ）を特別な設備を必要とせずに簡単に調製することができる。また、用いる糖加水分解酵素により、位置特異性の異なるオリゴ糖鎖およびその誘導体を得ることもできる。

以上のように、本法によって、糖転移酵素を使用せずに、はじめてＮ−アセチルグルコサミンをα選択的に一段階で糖転移させることができる。また糖加水分解酵素の糖受容体特異性の幅広さにより、糖転移酵素を用いた方法では成しえない多くの種類の化合物をαグルコサミニル化できることになる。

すなわち、本発明は、以下の調製方法を提供するものである。
［１］ Ｎ−アセチルグルコサミン誘導体と、そのアノマー位にグリコシド結合しうる糖受容体とを糖加水分解酵素により反応させて、Ｎ−アセチルグルコサミンがαグリコシド結合した糖誘導体を選択的に調製する方法。
［２］ Ｎ−アセチルグルコサミン誘導体が、（化１）の式で表されるＧｌｃＮＡｃ−α−ＤＭＴまたはその誘導体である［１］に記載の方法。

（式中、ＸはＯ、Ｃ、Ｓ、Ｎまたはなくてもよく、ＲはＨ、置換または非置換アルキル、もしくは置換または非置換ヘテロアルキルを表す。）
［３］ 糖加水分解酵素が、グリコシルハイドロラーゼファミリー８９（ＧＨ８９）に属するα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼである［１］に記載の調製方法。
［４］ 糖加水分解酵素が、バクテロイデス セタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ ＶＰＩ５４８２）由来のα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ１、２または３である［１］に記載の調製方法。
［５］ そのアノマー位にグリコシド結合しうる糖受容体が、アルコール類、ガラクトース誘導体、またはガラクトースを含む糖の誘導体である［１］に記載の調製方法。

本発明により、ＧｌｃＮＡｃがαで結合した糖誘導体および糖鎖を、より簡単かつ大量に調製可能となる。特異的にピロリ菌増殖を抑制する化合物、およびそれを含み安全で、耐性菌を生じさせないピロリ菌増殖抑制剤の調製が可能となる。さらに、従来の方法では調製できなかった多くの種類の糖誘導体が調製可能となることから、より強い抗ピロリ剤を見出す可能性を有する。

実施例１で得た反応溶液を分析した結果を示すＨＰＬＣチャート。 実施例２で得た反応溶液を分析した結果を示すＨＰＬＣチャート。 実施例３で得た反応溶液を分析した結果を示すＨＰＬＣチャート。 実施例４で得た反応溶液を分析した結果を示すＨＰＬＣチャート。

本発明において用いる糖加水分解酵素は、バクテロイデス セタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ ＶＰＩ５４８２）由来の３種のα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ１、２または３が特に好ましいが、グリコシルハイドロラーゼファミリー８９（ＧＨ８９）に属するα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼのホモログは上記以外の宿主にも多数見出すことができるので、それらも本法と同様に用いることができる。特に、ヒト、マウス、蛇由来のα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼではＧｌｃＮＡｃ−α−ｐＮＰだけでなくヘパリン構成糖であるＧｌｃＮＡｃ−α１，４−ＩｄｏＡ−ＲやＧｌｃＮＡｃ−α１，４−ＧｌｃＡ−Ｒにも加水分解活性があるので、同様に糖受容体としてイズロン酸誘導体（ＩｄｏＡ−Ｒ）やグルクロン酸誘導体（ＧｌｃＡ−Ｒ）も用いることができる。また、本発明において、酵素においては糖加水分解酵素や糖転移酵素が有する活性アミノ酸残基の変異体も用いることができる（非特許文献７）。これにより、生成したαグルコサミン化合物に対する加水分解を、野生型の糖加水分解酵素を用いた時に比べて、顕著に抑えることができ、結果的に目的物の収率向上させることができる。

バクテロイデス セタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ ＶＰＩ５４８２）由来の３種のα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ１、２または３は、特許文献２を参照してリコンビナント蛋白質として調製できる。グリコシルハイドロラーゼファミリー８９（ＧＨ８９）に属するα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼも、それぞれの出典の文献（ヒト由来のリコンビナント酵素調製（ウェバー ビー（Ｗｅｂｂｅｒ Ｂ）ら、プロテイン エクスプレッション アンド ピュアリフィケーション（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、２００１年、第２１巻２号、ｐ２５１−２５９）、蛇毒からの調製（アンドリュー ジェー エヌ（Ａｎｄｒｅｗ Ｊ Ｎ）ら、ジャーナル オブ ケミカル アンド モレキュラー トキシコロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ）、２００１年、第１５巻４号、ｐ２２１−２２７）を参照してリコンビナント蛋白質としてもしくは天然からの抽出物として調製できる。

本発明において糖供与体として用いるＮ−アセチルグルコサミン誘導体とは、糖のアノマー位に脱離基を有するＮ−アセチルグルコサミン誘導体であり、上記［１］に記載の調製方法により、非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンがα選択的に結合した化合物を与える。Ｎ−アセチルグルコサミン誘導体としてはＧｌｃＮＡｃ−α−ＤＭＴが好ましいが、この化合物に限られない。用いる糖加水分解酵素によっては（糖加水分解酵素の活性アミノ酸残基等の変異体も含む）その他の脱離基を有するＮ−アセチルグルコサミン誘導体も糖供与体となりうるからである。

前記［２］の（化１）の式に記載のＸは、Ｏ、Ｃ、Ｓ、Ｎであればよく、なくてもトリアジン基として、酵素の糖供与体となりうる。Ｒはアルキルを示すが、「アルキル」という用語は、それ自体によってまたは別の置換基の一部として、特記しない限り、完全飽和、モノまたはポリ不飽和のいずれであってもよく、指定の数の炭素原子を有する（すなわち、Ｃ１−Ｃ１０は１〜１０炭素を意味する）二価または多価ラジカルを含んでいてもよい直鎖または分枝鎖、または環状炭化水素基、またはその組み合わせを意味する。飽和炭化水素基の例としては、限定はされないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチルなどの基、たとえばｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルなどの同族体および異性体などが挙げられる。不飽和アルキル基は、１つ以上の二重結合または三重結合を有するものである。不飽和アルキル基の例としては、限定されないが、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブダジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−および３−プロピニル、３−ブチニル、およびより高次の同族体および異性体が挙げられる。

本発明において用いる、そのアノマー位にグリコシド結合しうる糖受容体とは、前記［５］に示すように、水酸基を有する化合物であり糖供与体と反応できるものであれば特に限定しないが、具体的にはメタノール、フェニルアルコールなどのアルコール類、ベンジル β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｇａｌ−β−ＯＢｎ）やｐ−メトキシフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｇａｌ−β−ｐＭＰ）などのガラクトース誘導体、グルクロン酸やイズロン酸の誘導体などの例を挙げることができる。

本発明において酵素を用いる糖転移反応の条件は、公知の条件を用いることができるが、具体的には以下のようになる。
溶液は、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液などの例を挙げることができ、特にリン酸緩衝化生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ，ＰＢＳ）が好ましい。
溶液のｐＨは、中性付近が好ましく、ｐＨ６．０からｐＨ８．０が特に好ましい。
反応の温度は、２５℃から４５℃が好ましく、３２℃が特に好ましい。
反応の時間は、酵素濃度が数十から数百ｎＭで数時間から２４時間が好ましく、さらに酵素濃度８００ｎＭとした場合に、４から５時間程度が特に好ましい。しかしながら、酵素濃度が数十ｎＭ以下においては、反応時間が２４時間以上で、比較的高い糖転移収率を得ることがある。

反応容器においては、系内の温度を制御でき、かつ溶解しているタンパク質や糖質化合物を特に吸着させる容器でないかぎりどのようなものを用いてもよい。また、本発明において用いているリコンビナントタンパクや基質はいずれも室温から３７℃付近では比較的安定であるために、反応において、振とうや撹拌操作を行えば、出発物質の分解もほとんどなく反応時間を短縮させることができる。
本発明で調製される糖誘導体には、糖鎖、糖蛋白質、糖脂質などが含まれる。

糖供与体として用いる、ＧｌｃＮＡｃ−α−ＤＭＴは、次のようにして合成した。
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）２２１ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）を水６．２５ｍｌに溶解し、塩化４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウム（ＤＭＴ−ＭＭ））５５３ｍｇ（２．０ｍｍｏｌ）、次いで２，６−ルチジン０．２３ｍｌ（２．０ｍｍｏｌ）を室温で加え、反応溶液を室温で２４時間撹拌した。（化２）式の反応が進行した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で反応終了を確認後、減圧下溶媒を除去し、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィ（展開溶媒：酢酸エチル／メタノール＝７／１）により精製して、４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル２−アセタミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシド（ＧｌｃＮＡｃ−α−ＤＭＴ）２８８ｍｇ（０．８０ｍｍｏｌ、８０％）を得た。

以下に、本発明の調製方法（糖転移反応）を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明を何ら限定するものではない。

糖供与体としてＧｌｃＮＡｃ−α−ＤＭＴ １．８ｍｇ（５μｍｏｌ、終濃度５０ｍＭ）をＰＢＳ溶液に溶解し、糖受容体としてメタノール１２．３μｌ（３００μＭ、１２．３ｖｏｌ．％）、およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ ＶＰＩ５４８２由来α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＢ２（４．９５μｇ、０．４９５μｇ／μｌ、特許文献２参照）のＰＢＳ溶液を加え、３７℃で２２時間インキュベートした。（化３）式の反応が進行した。反応溶液をＨＰＬＣで分析（カラム：ＴＳＫ−ＧｅｌＡｍｉｄｅ−８０（４．６×２５０ｍｍ，ＴＯＳＯＨ）， 溶離液：アセトニトリル／水＝３／１， 流速：１ｍｌ／ｍｉｎ， 温度：３０℃， 検出：ＵＶ（２１４ｎｍ））したところ、メチル ２−アセタミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシド （ＧｌｃＮＡｃ−α−ＯＭｅ）が２７％の収率で生成していることを確認した。その結果を図１に示す。

糖供与体としてＧｌｃＮＡｃ−αＤＭＴ １．８ｍｇ（５μｍｏｌ、終濃度５０ｍＭ）、糖受容体としてベンジル β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｇａｌ−β−ＯＢｎ）９．５ｍｇ（３５μＭ）をＰＢＳ溶液に溶解し、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ ＶＰＩ５４８２由来α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＢ２（４．９５μｇ、０．４９５μｇ／μｌ、特許文献２参照）のＰＢＳ溶液を加え、３７℃で６時間インキュベートした。（化４）式の反応が進行した。反応溶液をＨＰＬＣで分析（カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒ（４．６×２５０ｍｍ，Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ）， 溶離液：アセトニトリル／水＝９／９１， 流速：１ｍｌ／ｍｉｎ， 温度：３０℃， 検出：ＵＶ（２５４ｎｍ））したところ、ベンジル ６−Ｏ−（２−アセタミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド （ＧｌｃＮＡｃ−α１→６−Ｇａｌ−β−ＯＢｎ）、ベンジル ２−Ｏ−（２−アセタミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド （ＧｌｃＮＡｃ−α１→２−Ｇａｌ−β−ＯＢｎ）が、各々４％、８％の収率で生成していることを確認した。その結果を図２に示す。

糖供与体としてＧｌｃＮＡｃ−αＤＭＴ ０．３６ｍｇ（１μｍｏｌ、終濃度５０ｍＭ）、糖受容体としてベンジル β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｇａｌ−β−ＯＢｎ）１．９ｍｇ（７μｍｏｌ）をＰＢＳ溶液に溶解し、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ ＶＰＩ５４８２由来α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＢ３（０．１０μｇ、０．０８６μｇ／μｌ、特許文献２参照）のＰＢＳ溶液を加え、３７℃で２９時間インキュベートした。（化４）式の反応が進行した。反応溶液をＨＰＬＣで分析（カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒ（４．６×２５０ｍｍ，Ｎａｋａｒａｉ ｔｅｓｑｕｅ）， 溶離液：アセトニトリル／水＝９／９１， 流速：１ｍｌ／ｍｉｎ， 温度：３０℃， 検出：ＵＶ（２５４ｎｍ））したところ、ベンジル ６−Ｏ−（２−アセタミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド （ＧｌｃＮＡｃ−α１→６−Ｇａｌ−β−ＯＢｎ）、ベンジル ２−Ｏ−（２−アセタミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド （ＧｌｃＮＡｃ−α１→２−Ｇａｌ−β−ＯＢｎ）が、各々０．４％、０．３％の収率で生成していることを確認した。その結果を図３に示す。

＜生成物のＮＭＲ法による解析結果＞
ベンジル ６−Ｏ−（２−アセタミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド （ＧｌｃＮＡｃ−α１→６−Ｇａｌ−β−ＯＢｎ）
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ ＭＨｚ， ＣＤ_３ＯＤ） ： δ ７．４７−７．３０（５Ｈ， ｍ， Ｐｈ）， ４．９５（１Ｈ， ｄ， −ＣＨ _２−， Ｊ ＝ １２．０ Ｈｚ） ， （１Ｈ， ｄ， Ｈ−１’）， ４．６８（１Ｈ， ｄ， −ＣＨ _２−， Ｊ ＝ １１．８ Ｈｚ）， ４．３８（１Ｈ， ｄ， Ｈ−１， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ）， ２．０３（３Ｈ， ｓ， −ＣＯＣＨ _３）．
ＤＥＰＴ−１３５ ＮＭＲ （１２６ ＭＨｚ， ＣＤ_３ＯＤ）： δ １２８．０−１２７．３（Ｐｈ）， １０２．６（Ｃ−１）， ９７．３（Ｃ−１’）， ７０．４（−ＣＨ_２−）， ６６．４（Ｃ−６）， ６１．３（Ｃ−６’）， ２１．３（−ＣＯＣＨ_３）．
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ ； ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_２１Ｈ_３１ＮＯ_１１［Ｍ＋Ｎａ］^＋ ： ４９６．５， Ｆｏｕｎｄ ： ４９６．８

ベンジル ２−Ｏ−（２−アセタミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド （ＧｌｃＮＡｃ−α１→２−Ｇａｌ−β−ＯＢｎ）
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ ＭＨｚ， ＣＤ_３ＯＤ） ： δ ７．４７−７．２９（５Ｈ， ｍ， Ｐｈ）， ５．３２（１Ｈ， ｄ， Ｈ−１’， Ｊ ＝ ３．７ Ｈｚ）， ５．０３（１Ｈ， ｄ， −ＣＨ _２−， Ｊ ＝ １１．４ Ｈｚ）， ４．６３（１Ｈ， ｄ， −ＣＨ _２−， Ｊ ＝ １１．４ Ｈｚ）， ４．６０（１Ｈ， ｄ， Ｈ−１， Ｊ ＝ ７．８ Ｈｚ）， ４．１５（１Ｈ， ｄｄｄ， Ｈ−５’， Ｊ ＝ ２．１， ５．２， １０．１ Ｈｚ）， ４．０（１Ｈ， ｄｄ， Ｈ−２’， Ｊ ＝ ３．６， １０．７ Ｈｚ）， ３．８９−３．７１（７Ｈ， ｍ， Ｈ−２， Ｈ−４， Ｈ−６ａ， Ｈ−６ｂ， Ｈ−３’， Ｈ−６’ａ， Ｈ−６’ｂ）， ３．６４−３．５３（２Ｈ， ｍ， Ｈ−３， Ｈ−５）， ３．４２（１Ｈ， ｔ， Ｈ−４’， Ｊ ＝ ９．５ Ｈｚ）， １．８３（３Ｈ， ｓ， −ＣＯＣＨ _３）．
ＤＥＰＴ−１３５ ＮＭＲ （１２６ ＭＨｚ， ＣＤ_３ＯＤ）： δ １２８．１−１２７．３（Ｐｈ）， １０２．８（Ｃ−１）， ９７．５（Ｃ−１’）， ７６．２（Ｃ−２）， ７５．４（Ｃ−５）， ７２．５（Ｃ−３）， ７２．２（Ｃ−５’）， ７１．７（Ｃ−３’）， ７０．９（Ｃ−４’）， ７０．６（−ＣＨ_２−）， ６９．３（Ｃ−４）， ６１．３（Ｃ−６’）， ６１．１（Ｃ−６）， ５３．８（Ｃ−２’）， ２１．３（−ＣＯＣＨ_３）．
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ ； ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_２１Ｈ_３１ＮＯ_１１［Ｍ＋Ｎａ］^＋ ： ４９６．５， Ｆｏｕｎｄ ： ４９６．６

糖供与体としてＧｌｃＮＡｃ−αＤＭＴ ０．２２ｍｇ（０．６μｍｏｌ、終濃度３０ｍＭ）、糖受容体としてｐ−メトキシフェニル β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｇａｌ−β−ｐＭＰ）０．１７ｍｇ（０．６μｍｏｌ）をＰＢＳ溶液に溶解し、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ ＶＰＩ５４８２由来α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＢ１（１４．４μｇ、１４．４μｇ／μｌ、特許文献２参照）のＰＢＳ溶液を加え、３７℃で５時間インキュベートした。（化５）式の反応が進行した。反応溶液をＨＰＬＣで分析（カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（４．６×２５０ｍｍ，ＧＬ−Ｓｃｉｅｎｃｅ）， 溶離液：アセトニトリル／水＝５／９５→１５／８５（０→２５ｍｉｎ）， 流速：１ｍｌ／ｍｉｎ， 温度：３０℃， 検出：ＵＶ（２８０ｎｍ））したところ、ｐ−メトキシフェニル ４−Ｏ−（２−アセタミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド （ＧｌｃＮＡｃ−α１→４−Ｇａｌ−β−ｐＭＰ）が、１０％の収率で生成していることを確認した。その結果を図４に示す。

＜生成物のＮＭＲ法による解析結果＞
ｐ−メトキシフェニル−４−Ｏ−２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ ＭＨｚ， ＣＤ_３ＯＤ） ： δ ７．０８（２Ｈ， ｄ， Ｐｈ， Ｊ ＝ ９．１ Ｈｚ）， ６．８６（２Ｈ， ｄ， Ｐｈ， Ｊ ＝ ９．１ Ｈｚ）， ４．９５（１Ｈ， ｄ， Ｈ−１’， Ｊ ＝ ３．６ Ｈｚ）， ４．８４（１Ｈ， ｄ， Ｈ−１， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ）， ４．２９（１Ｈ， ｄｄｄ， Ｈ−５’， Ｊ ＝ ２．５， ４．０， ９．９ Ｈｚ）， ４．０４（１Ｈ， ｄ， Ｈ−４， Ｊ ＝ ２．８ Ｈｚ）， ３．９７（１Ｈ， ｄｄ， Ｈ−２’， Ｊ ＝ ３．６， １０．９ Ｈｚ）， ３．８３（１Ｈ， ｄｄ， Ｈ−６ａ’， Ｊ ＝ ２．２， １１．８ Ｈｚ）， ３．７９−３．７１（８Ｈ， ｍ， Ｈ−２， Ｈ−５， Ｈ−６ａ， Ｈ−３’， Ｈ−６’ｂ， −ＯＣＨ _３）， ３．６９−３．６５（２Ｈ， ｍ， Ｈ−３， Ｈ−６ｂ）， ３．４６（１Ｈ， ｔ， Ｈ−４’， Ｊ ＝ ９．４， ９．５ Ｈｚ）， ２．０２（３Ｈ， ｓ， −ＣＯＣＨ _３）．
^１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ ＭＨｚ， ＣＤ_３ＯＤ）： δ １７３．８（−ＣＯＣＨ_３）， １５６．７， １５３．０， １１９．１， ａｎｄ １１５．５（Ｐｈ）， １０４．０（Ｃ−１）， １００．３（Ｃ−１’）， ７７．７（Ｃ−４）， ７６．８（Ｃ−５）， ７４．３（Ｃ−３）， ７３．７（Ｃ−５’）， ７２．６（Ｃ−３’）， ７２．４（Ｃ−２）， ７２．０（Ｃ−４’）， ６２．３（Ｃ−６’）， ６０．７（Ｃ−６）， ５６．１（−ＯＣＨ_３）， ５５．５（Ｃ−２’）， ２２．７（−ＣＯＣＨ_３）．

ＧｌｃＮＡｃ−α−ＤＭＴを５０ｍＭ、ｐＭＰ−β−Ｇａｌ １４ｍｇを５０ｍＭになるようにｐＨ６．５の１００ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、３７℃で上記と同様にα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＢ１のＰＢＳ溶液（酵素濃度０．８μＭ）を加え、反応を８時間行い、ＨＰＬＣにより測定した。上記と同様に測定し、ＧｌｃＮＡｃ−α（１→４）−Ｇａｌ−β−ＯｐＭＰが収率５２％で得られていることがわかった。

ＧｌｃＮＡｃ−α−ＤＭＴ ４５．０ｍｇ（０．１３ｍｍｏｌ、５０ｍＭ）、メトキシβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｇａｌ−β−Ｏ−Ｍｅ ２５．０ｍｇ（０．１３ｍｍｏｌ，５０ｍＭ））をｐＨ６．５、１００ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、３７℃で１０分間プレインキュベート後、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＢ１のＰＢＳ溶液（２．８８ｍｇ／ｍｌ，１３４μｌを加え、全量２．５ｍｌとして反応を開始した。（化６）式の反応１時間後に溶離液で５倍に希釈し、分取ＨＰＬＣにより単離した。カラムをＡｍｉｄｅ−８０（Φ２１．５×３００ｍｍ）、溶離液をアセトニトリル／水＝４／１、流量を８ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度を４０℃、検出器をＵＶ２４０ｎｍとした。ＮＭＲにより構造決定を行ったところメトキシ−４−Ｏ−２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド （ＧｌｃＮＡｃ−α（１→４）−Ｇａｌ−β−Ｏ−Ｍｅ）を得た。（収量；７．８ｍｇ，収率；１６．５％）

＜生成物のＮＭＲ法による解析結果＞
メトキシ−４−Ｏ−２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
^１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＣＤ_３ＯＤ） ： δ ４．８８（１Ｈ， ｄ， Ｈ−１’， Ｊ ＝ ３．７ Ｈｚ）， ４．２４（１Ｈ， ｄｄｄ， Ｈ−５’， Ｊ ＝ ２．５ Ｈｚ， ４．４ Ｈｚ， １０．２ Ｈｚ）， ４．２１（１Ｈ， ｄ， Ｈ−１， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ）， ３．９７（１Ｈ， ｄ， Ｈ−４， Ｊ ＝ ３．０ Ｈｚ）， ３．９４（１Ｈ， ｄｄ， Ｈ−２’， Ｊ ＝ ３．７ Ｈｚ， １０．８ Ｈｚ）， ３．７９（１Ｈ， ｄｄ， Ｈ−６’ａ， Ｊ ＝ ２．６ Ｈｚ， １１．８ Ｈｚ）， ３．７４−３．５８（５Ｈ， ｍ， Ｈ−６’ｂ， Ｈ−６ａ， Ｈ−３’， Ｈ−６ｂ， Ｈ−５）， ３．５８（３Ｈ， ｓ， −ＯＣＨ _３）， ３．５５（１Ｈ， ｄｄ， Ｈ−３， Ｊ ＝ ３．０ Ｈｚ， １０．１ Ｈｚ）， ３．５０（１Ｈ， ｄｄ， Ｈ−２， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， １０．１ Ｈｚ），３．４３（１Ｈ， ｄｄ， Ｈ−４’， Ｊ ＝ ９．０ Ｈｚ， １０．１ Ｈｚ）， ２．０３（３Ｈ， ｓ， −ＣＯＣＨ _３）．
^１３Ｃ ＮＭＲ （１２６ ＭＨｚ， ＣＤ_３ＯＤ） ： δ １７３．７（−ＣＯＣＨ_３）， １０６．３（Ｃ−１）， １００．３（Ｃ−１’）， ７７．６（Ｃ−４）， ７６．７（Ｃ−５）， ７４．４（Ｃ−３）， ７３．６（Ｃ−５’）， ７２．７（Ｃ−３’）， ７２．６（Ｃ−２）， ７２．０（Ｃ−４’）， ６２．３（Ｃ−６’）， ６０．８（Ｃ−６）， ５７．８（−ＯＣＨ_３）， ５５．５（Ｃ−２’）， ２２．７（−ＣＯＣＨ_３）

終濃度がＧｌｃＮＡｃ−α−ＤＭＴ ７５ｍＭ、２−ピリジル−１−チオ−２−アセトアミド−２−デオキシ−４−Ｏ−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシド （ＬａｃＮＡｃ−β−Ｓｐｙ）２５ｍＭになるようｐＨ６．５，１００ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、３７℃で１０分間プレインキュベート後、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＢ１ ＰＢＳ溶液（２．７５ｍｇ／ｍｌ）３．６μｌを加え、全量１００μｌとして反応を開始した。この反応を１２サンプル用意し、反応３時間後、分取ＨＰＬＣにより分取した。カラムをＡｍｉｄｅ−８０（Φ２１．５×３００ｍｍ）、溶離液をアセトニトリル／水＝３／１、流量を８ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度を３０℃、検出器をＵＶ２４０ｎｍとした。２−ピリジル−１−チオ−２−アセトアミド−２−デオキシ−４−Ｏ−（４−Ｏ−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシド （ＧｌｃＮＡｃ−α（１→４）−ＬａｃＮＡｃ−β−Ｓｐｙ）８．２ｍｇ（収率３９％）を得た。

＜生成物のＮＭＲ法による解析結果＞
２−ピリジル−１−チオ−２−アセトアミド−２−デオキシ−４−Ｏ−（４−Ｏ−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシド
^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ_３ＯＤ）： δ ８．３８， ７．６８， ７，４０， ａｎｄ ７．１６（４Ｈ， Ｐｙｒｉｄｙｌ）， ５．４５（１Ｈ， ｄ， Ｈ−１， Ｊ ＝ １０．７ Ｈｚ）， ４．９０（１Ｈ， ｄ， Ｈ−１”， Ｊ ＝ ３．７ Ｈｚ）， ４．４８（１Ｈ， ｄ， Ｈ−１’， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ）， ４．２０（１Ｈ， ｄｄｄ， Ｈ−５” ， Ｊ ＝ ２．４， ４．６， ７．８ Ｈｚ）， ３．９９（１Ｈ， ｄｄ， Ｈ−２， Ｊ ＝ ９．６， １０．５ Ｈｚ）， ３．９５（１Ｈ， ｄ， Ｈ−４’， Ｊ ＝ ２．２ Ｈｚ）， ３．９３−３．８９（３Ｈ， ｍ， Ｈ−６ａ， Ｈ−６ｂ， Ｈ−２”）， ３．８１（１Ｈ， ｄｄ， Ｈ−６”ａ， Ｊ ＝ ２．５， １１．９ Ｈｚ）， ３．７８−３．５４（１０Ｈ， ｍ， Ｈ−３， Ｈ−４， Ｈ−５， Ｈ−２’， Ｈ−３’， Ｈ−５’， Ｈ−６’ａ， Ｈ−６’ｂ， Ｈ−３”， Ｈ−６”ｂ）， ３．４２（１Ｈ， ｄｄ， Ｈ−４”， Ｊ ＝ ８．９， １０．１ Ｈｚ）， ２．０１（３Ｈ， ｓ， −ＣＯＣＨ _３）， １．９５（３Ｈ， ｓ， −ＣＯＣＨ _３）．
^１３Ｃ ＮＭＲ （１０１ ＭＨｚ， ＣＤ_３ＯＤ）： δ １７３．７ ａｎｄ １７３．５（−ＣＯＣＨ_３）， １５８．９， １５０．３， １３８．５， １２４．４， ａｎｄ １２２．０（Ｐｙｒｉｄｙｌ）， １０５．４（Ｃ−１’）， １００．１（Ｃ−１”）， ８４．８（Ｃ−１）， ８０．９（Ｃ−５）， ８０．６（Ｃ−４）， ７８．１（Ｃ−４’）， ７７．２（Ｃ−５’）， ７５．７（Ｃ−３）， ７４．５（Ｃ−３’）， ７３．８（Ｃ−５”）， ７２．５（Ｃ−２’， Ｃ−３”）， ７２．１（Ｃ−４”）， ６２．４（Ｃ−６”）， ６１．８（Ｃ−６）， ６１．３（Ｃ−６’）， ５５．６（Ｃ−２”）， ５５．５（Ｃ−２）， ２２．９ ａｎｄ ２２．７（−ＣＯＣＨ_３）．

終濃度がＧｌｃＮＡｃ−α−ＤＭＴ ７５ｍＭ、２−ピリジル−１−チオ−４−Ｏ−（４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシド （Ｌａｃ−β−Ｓｐｙ）２５ｍＭになるようｐＨ６．５，１００ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、３７℃で１０分間プレインキュベート後、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＢ１ ＰＢＳ溶液（２．７５ｍｇ／ｍｌ）７．３μｌを加え、全量１００μｌとして反応を行った。（化７）式の反応２４時間後、分取ＨＰＬＣにより分取した。カラムをＡｍｉｄｅ−８０（Φ２１．５×３００ｍｍ）、溶離液をアセトニトリル／水＝３／１、流量を８ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度を３０℃、検出器をＵＶ２４０ｎｍとした。２−ピリジル−１−チオ−４−Ｏ−（４−Ｏ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシド （ＧｌｃＮＡｃ−α（１→４）−Ｌａｃ−β−Ｓｐｙ）４．３ｍｇ（収率４５％）を得た。

＜生成物のＮＭＲ法による解析結果＞
２−ピリジル−１−チオ−４−Ｏ−（４−Ｏ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシド
^１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＣＤ_３ＯＤ）： δ ８．４２， ７．７３， ７，４９， ａｎｄ ７．２１（４Ｈ， Ｐｙｒｉｄｙｌ）， ５．２９（１Ｈ， ｄ， Ｈ−１， Ｊ ＝ １０．７ Ｈｚ）， ４．９３（１Ｈ， ｄ， Ｈ−１”， Ｊ ＝ ３．７ Ｈｚ）， ４．４９（１Ｈ， ｄ， Ｈ−１’， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ）， ４．２４（１Ｈ， ｍ， Ｈ−５”）， ３．９８（１Ｈ， ｄ， Ｈ−４， Ｊ ＝ １．９ Ｈｚ）， ３．９４（１Ｈ， ｄｄ， Ｈ−２”， Ｊ ＝ ３．４， １１．２ Ｈｚ）， ３．９２（２Ｈ， ｄ， Ｈ−６ａ， Ｈ−６ｂ， Ｊ ＝ ２．７ Ｈｚ）， ３．８４（１Ｈ， ｄｄ， Ｈ−６”ａ， Ｊ ＝ １．９， １１．８ Ｈｚ）， ３．７７−３．５９（１０Ｈ， ｍ， Ｈ−３， Ｈ−４， Ｈ−５， Ｈ−２’， Ｈ−３’， Ｈ−５’， Ｈ−６’ａ， Ｈ−６’ｂ， Ｈ−３”， Ｈ−６”ｂ）， ３．４９−３．４４（２Ｈ， ｍ， Ｈ−２， Ｈ−４”）， ２．０５（３Ｈ， ｓ， −ＣＯＣＨ _３）．
^１３Ｃ ＮＭＲ （１２６ ＭＨｚ， ＣＤ_３ＯＤ）： δ １７２．４（−ＣＯＣＨ_３）， １５７．８， １４８．９， １３７．３， １２３．２， ａｎｄ １２０．７（Ｐｙｒｉｄｙｌ）， １０４．０（Ｃ−１’）， ９８．６（Ｃ−１”）， ８４．６（Ｃ−１）， ７９．３（Ｃ−５）， ７８．７（Ｃ−４）， ７６．８（Ｃ−３）， ７６．６（Ｃ−４’）， ７５．８（Ｃ−５’）， ７３．１（Ｃ−３’）， ７２．３（Ｃ−２， Ｃ−５”）， ７１．１（Ｃ−２’， Ｃ−３”）， ７０．１（Ｃ−４”）， ６１．０（Ｃ−６”）， ６０．４（Ｃ−６）， ５９．９（Ｃ−６’）， ５４．３（Ｃ−２”）， ２１．３（−ＣＯＣＨ_３）．
ＦＡＢ−ＭＳ ； ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_２５Ｈ_３８Ｎ_２Ｏ_１５Ｓ［Ｍ＋Ｈ］^＋ ： ６３９．２０７１， Ｆｏｕｎｄ ： ６３９．２０７５

終濃度がＧｌｃＮＡｃ−α−ＤＭＴ ５０ｍＭ、ＧＮＢ−α−ＤＭＴ ２５ｍＭになるようｐＨ６．５、１００ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、３７℃で１０分間プレインキュベート後、ＧｌｃＮＡｃａｓｅ Ｂ１ ＰＢＳ溶液（２．７５ｍｇ／ｍｌ）５．５μｌを加え、全量１００μｌとして反応を開始した。（化８）式の反応を１６サンプル用意し、反応４時間後、分取ＨＰＬＣにより分取した。カラムをＡｍｉｄｅ−８０（Φ２１．５×３００ｍｍ）、溶離液をアセトニトリル／水＝３／１、流量を８ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度を３０℃、検出器をＵＶ２１４ｎｍとした。４，６ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（４−Ｏ−（２−アセトアミド−２デオキシα−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド （ＧｌｃＮＡｃ−α（１→４）−ＧＮＢ−α−Ｏ−ＤＭＴ）１２．７ｍｇ（収率４４％）を得た。

＜生成物のＮＭＲ法による解析結果＞
４，６ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（４−Ｏ−（２−アセトアミド−２デオキシα−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ_３ＯＤ）： δ ６．６３（１Ｈ， ｄ， Ｈ−１， Ｊ ＝ ３．７２ Ｈｚ）， ４．９３（１Ｈ， ｄ， Ｈ−１”， Ｊ ＝ ３．７ Ｈｚ）， ４．６６（１Ｈ， ｄｄ， Ｈ−２， Ｊ ＝ ３．７， １１．３ Ｈｚ）， ４．５６（１Ｈ， ｄ， Ｈ−１’， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ）， ４．２７（１Ｈ， ｄ， Ｈ−４， Ｊ ＝ ２．１ Ｈｚ）， ４．２０−４．１６（２Ｈ， ｍ， Ｈ−３， Ｈ−５”）， ４．０２−４．００（７Ｈ， ｍ， −ＯＣＨ _３， Ｈ−５）， ３．９７（１Ｈ， ｄ， Ｈ−４’， Ｊ ＝ ２．８ Ｈｚ）， ３．９４（１Ｈ， ｄｄ， Ｈ−２”， Ｊ ＝ ３．７， １０．９ Ｈｚ）， ３．８１（１Ｈ， ｄ， Ｈ−６”ａ， Ｊ ＝ ２．３ １１．８ Ｈｚ）， ３．７６−３．５４（９Ｈ， ｍ， Ｈ−６ａ， Ｈ−６ｂ， Ｈ−２’， Ｈ−３’， Ｈ−５’， Ｈ−６’ａ， Ｈ−６’ｂ， Ｈ−３”， Ｈ−６”ｂ）， ３．４２（１Ｈ， ｄｄ， Ｈ−４”， Ｊ ＝ ８．９， １０．０ Ｈｚ）， ２．０２（３Ｈ， ｓ， −ＣＯＣＨ _３）， １．９２（３Ｈ， ｓ， −ＣＯＣＨ _３）．
^１３Ｃ ＮＭＲ （１０１ ＭＨｚ， ＣＤ_３ＯＤ）： δ １７５．１， １７４．３， １７３．８， ａｎｄ １７３．７（ｔｒｉａｚｉｎｅ， −ＣＯＣＨ_３）， １０６．１（Ｃ−１’）， １００．１（Ｃ−１”）， ９６．４（Ｃ−１）， ７８．４（Ｃ−３）， ７８．１（Ｃ−４’）， ７６．８（Ｃ−５’）， ７４．８（Ｃ−５）， ７４．５（Ｃ−３’）， ７３．８（Ｃ−５”）， ７２．６（Ｃ−３”）， ７２．５（Ｃ−２’）， ７２．１（Ｃ−４”）， ６９．５（Ｃ−４）， ６２．５（Ｃ−６）， ６２．４（Ｃ−６”）， ６１．３（Ｃ−６’）， ５６．１（−ＯＣＨ_３）， ５５．６（Ｃ−２”）， ４９．６−４８．４（Ｃ−２ ｉｎ ｐｅａｋ ｏｆ ＣＨＤ_２ＯＤ）， ２２．７ ａｎｄ ２２．６（−ＣＯＣＨ_３）．

ＧｌｃＮＡｃ−α−ＤＭＴ ３９．６ｍｇ（０．１１ｍｍｏｌ，５０ｍＭ）、イソプロピル−１−チオ−β−Ｇａｌ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド （Ｇａｌ−β−ＳｉＰｒ）７９．２ｍｇ（０．３３ｍｍｏｌ、１５０ｍＭ）をｐＨ６．５、１００ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、３７℃で１０分間プレインキュベート後、ＧｌｃＮＡｃａｓｅ Ｂ１ ＰＢＳ溶液（２．８８ｍｇ／ｍｌ）１１８μｌを加え、全量２．２ｍｌとして反応を開始した。（化９）式の反応１時間後に溶離液で５倍に希釈し、分取ＨＰＬＣにより単離した。カラムをＡｍｉｄｅ−８０（Φ２１．５×３００ｍｍ）、溶離液をアセトニトリル／水＝４／１、流量を８ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度を４０℃とし、ＵＶ２１４ｎｍにおける紫外吸収を測定した。ＮＭＲにより構造決定を行ったところイソプロピル−１−チオ−β−（４−Ｏ−２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを得た。（収量；１４ｍｇ、収率；２８．６％）

＜生成物のＮＭＲ法による解析結果＞
イソプロピル−１−チオ―β―４−Ｏ−２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
^１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＣＤ_３ＯＤ） ： δ ４．８９（１Ｈ， ｄ， Ｈ−１’， Ｊ ＝ ３．７ Ｈｚ）， ４．５１（１Ｈ， ｄ， Ｈ−１， Ｊ ＝ ９．６ Ｈｚ）， ４．２２（１Ｈ， ｄｄｄ， Ｈ−５’， Ｊ ＝ ２．５， ４．４， １０．１ Ｈｚ）， ４．０１（１Ｈ， ｄ， Ｈ−４， Ｊ ＝ ３．０ Ｈｚ）， ３．９５（１Ｈ， ｄｄ， Ｈ−２’， Ｊ ＝ ３．７， １０．８ Ｈｚ）， ３．７９（１Ｈ， ｄｄ， Ｈ−６’ａ， Ｊ ＝ ２．５， １１．８ Ｈｚ）， ３．７３（１Ｈ， ｄｄ， Ｈ−６’ｂ， Ｊ ＝ ４．５， １１．８ Ｈｚ）， ３．７０−３．５９（４Ｈ， ｍ， Ｈ−３’， Ｈ−５， Ｈ−６ａ， Ｈ−６ｂ）， ３．５６（１Ｈ， ｄｄ， Ｈ−３， Ｊ ＝ ３．０， ９．６ Ｈｚ）， ３．４８（１Ｈ， ｔ， Ｈ−２， Ｊ ＝ ９．６ Ｈｚ）， ３．４３（１Ｈ， ｄｄ， Ｈ−４’， Ｊ ＝ ９．０， １０．１ Ｈｚ）， ３．２５（１Ｈ， ｓｅｐｔ， ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ）， ２．０３（３Ｈ， ｓ， −ＣＯＣＨ _３） １．３４（３Ｈ， ｄ， ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ）， １．３３（３Ｈ， ｄ， ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ），．
^１３Ｃ ＮＭＲ （１２６ ＭＨｚ， ＣＤ_３ＯＤ） ： δ １７３．７（−ＣＯＣＨ_３）， １００．５３（Ｃ−１’）， ８７．３（Ｃ−１）， ８０．５（Ｃ−５）， ７８．３（Ｃ−４）， ７５．９（Ｃ−３）， ７３．６（Ｃ−５’）， ７２．７（Ｃ−３’）， ７２．０（Ｃ−４’）， ７１．７（Ｃ−２）， ６２．３（Ｃ−６’）， ６０．８（Ｃ−６）， ５５．５（Ｃ−２’）， ３６．２（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）， ２４．４， ２４．１（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）， ２２．７（−ＣＯＣＨ_３）．

Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）がαでガラクトース（Ｇａｌ）に結合したオリゴ糖鎖（αＧｌｃＮＡｃ含有オリゴ糖鎖）は、従来の抗生物質とは全く異なり、あらゆるピロリ菌の生育に必須の増殖活動を抑制するという機序でピロリ菌に対する抗菌作用を示すから、抗ピロリ菌剤として有用である。また、本発明によりαＧｌｃＮＡｃ含有オリゴ糖鎖を、人工高分子担体だけでなく、クラゲや卵白などの容易に入手可能な天然のムチン型糖蛋白質糖鎖へも導入可能であることが明らかである。

したがって、調製した物質は、ピロリ菌増殖抑制剤として、サプリメントや飲食品添加物として有用であると考えられる。またそのピロリ菌増殖抑制剤を含有する飲食品は、機能性飲食品や健康飲食品として有用である。そのピロリ菌増殖抑制剤を含有する医薬製剤は、ピロリ菌に起因する消化器系疾患、特に胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍のような胃疾患を軽減したり治癒したり予防したりする医薬品として、有用である。

Claims (3)

1. Ｎ−アセチルグルコサミン誘導体と、そのアノマー位にグリコシド結合しうる糖受容体とを糖加水分解酵素により反応させて、Ｎ−アセチルグルコサミンがαグリコシド結合した糖誘導体を選択的に調製する方法であって、
   Ｎ−アセチルグルコサミン誘導体が、（化１０）の式で表されるＧｌｃＮＡｃ−α−ＤＭＴまたはその誘導体であり、糖加水分解酵素が、グリコシルハイドロラーゼファミリー８９（ＧＨ８９）に属するα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼである方法。
   

   

   （式中、ＸはＯ、Ｃ、Ｓ、Ｎまたはなくてもよく、ＲはＨ、置換または非置換アルキル、もしくは置換または非置換ヘテロアルキルを表す。）
2. 糖加水分解酵素が、バクテロイデス セタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ ＶＰＩ５４８２）由来のα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ１、２または３である請求項１に記載の調製方法。
3. そのアノマー位にグリコシド結合しうる糖受容体が、アルコール類、ガラクトース誘導体、またはガラクトースを含む糖の誘導体である請求項１に記載の調製方法。

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