SE466521B - Reagens vid analys bestaaende av ett enzym och en annan ligand, vilka aer kovalent bundna till en vattenoloeslig partikel med en diameter paa mindre aen 500 aa - Google Patents
Reagens vid analys bestaaende av ett enzym och en annan ligand, vilka aer kovalent bundna till en vattenoloeslig partikel med en diameter paa mindre aen 500 aaInfo
- Publication number
- SE466521B SE466521B SE8803496A SE8803496A SE466521B SE 466521 B SE466521 B SE 466521B SE 8803496 A SE8803496 A SE 8803496A SE 8803496 A SE8803496 A SE 8803496A SE 466521 B SE466521 B SE 466521B
- Authority
- SE
- Sweden
- Prior art keywords
- enzyme
- particle
- substance
- derivative
- particles
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/829—Liposomes, e.g. encapsulation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
466 521 9-
av markörsubstans ( t. ex. ett enzym eller en radioaktiv substans ). Även
om flera sådana metoder baserade på kemiska reagens finns beskrivna i
litteraturen ( exempelvis glutaraldehyd, perjodat eller tiolsubstanser; se
O“Sullivan och Marks, Meth. Enzymol. vol. 73, sid. 147-166, ref. 3, ref. 2
samt övriga relevanta artiklar i Meth. Enzymol. volymerna 70, 73 och 92 )
så har de alla sina brister. Det är exempelvis svårt att med befintliga
tekniker reproducerbart och kontrollerbart producera t. ex. enzym-antigen,
enzym-antikropp eller enzym-lektin konjugat och andra typer av enzym-
ligand eller enzym-receptor konjugat. Man erhåller konjugat som är
heterogena till storlek och sammansättning. Dessutom kan konjugeringen
leda till nedsatt enzymaktivitet eller specificitet hos liganden eller
receptorn. Vidare, även om känsligheten ofta är tillräcklig så begränsas
ElA i många fall av otillräcklig känslighet. Man har sökt öka känsligheten
genom att använda mer eller mindre komplicerade system som avidin-
biotin ( Kendall et al, J. lmmunol. Meth., vol. 56, sid. 329, 1983, ref. 4; se
också ref. 1-3 och relevanta artiklar i Meth. Enzymol. ), eller s.k.
enzymkaskader ( Self, US Patent Application No. 307,600; ref. 5).
Ett enklare system utnyttjar lösligt oligomert enzym kopplat till antikropp
(Leary et al, Proc. Nat. Acad. Sci., vol. 80, sid. 4045, 1983; ref. 6). Även om
dessa s.k. amplifieringstekniker är användbara i flera applikationer har de
sina begränsningar och nackdelar och Ngo nämner i sin ElA-
översiktsartikel att ökad känslighet hos ElA och bättre metoder för
preparation av enzym-ligand eller enzym-receptor konjugat är önskvärda.
Föreliggande uppfinning syftar bl. a. till att reducera dessa
nackdelar hos EIA och en enkel metod att bilda enzym-antigen, enzym-
antikropp eller enzym-lektin konjugat såväl som konjugat mellan enzym
och andra typer ligander eller receptorer beskrivs. Vidare beskrivs hur
detta reagens kan användas vid detektion av en cell, ett virus eller en
annan komponent i ett prov och hur en ökad känslighet jämfört med
tidigare metoder kan uppnås genom att använda reagenset enligt
uppfinningen.
Dessa och andra syften uppnås enligt uppfinningen genom att
man kovalent eller nonkovalent binder enzym och antikropp eller enzym
och lektin eller enzym och antigen (eller generellt enzym och ligand eller
3 466 521
receptor) till lämplig typ av partiklar som är olösliga i det medium
(vanligtvis buffrat vatten ) som används vid konjugeringen till partikeln och
vid bestämning av analyten, samt genom att man använder det så bildade
reagenset istället för och på samma sätt som tidigare beskrivna
enzymkonjugat för specifik detektion av cell, ett virus eller en annan
komponent i ett prov.
Genom att variera partikelns storlek, kemiska och fysiska
struktur, typ av yta ( hydrofob, hydrofil, med eller utan reaktiva grupper),
enzym, antikropp eller antigen (annan typ av receptor eller ligand ) samt
dessas koncentrationer, kan man erhålla partikelkonjugat med för
applikationen lämpliga egenskaper.
Exempel på användningar av reagenset enligt uppfinningen är
vid ELISA ( ref. 1 och 2), i immunohistokemiska studier ( Avrameas,
Histochem. J., vol. 4, sid. 321, 1972; ref. 7), immunoblotting (Tsang et al,
Meth. Enzymol. vol. 92, sid. 377; ref. 8 ), vid mikroskopiska studier,
detektion av antikroppar i cellkulturer etc.
Som exempel på tekniker där reagenset enligt uppfinningen kan
komma till användning är kompetitiva och nonkompetitiva ELISA-metoder
och i s. k. USEFllA ( Meth. Enzymol. vol. 73, sid. 383, Hsu et al.; ref. 9). De
lösliga enzymkonjugat som använts tidigare i dessa metoder ersätts
således med de enligt uppfinningen beskrivna reagensen. Övrigt utförande
är identiskt eller likartat med i litteraturen beskrivna EIA-tekniker ( ref. 1, 2
etc. ) Exempel på ELISA-utiörandeprinciper med reagens enligt
uppfinningen visas i nedanstående figurer ( L är analyten, dvs
komponenten som skall bestämmas, Ab är antikropp eller lektin, kolhydrat,
koenzym, etc. med specifik affinitet till L, E är enzym, S är enzymsubstrat
och P är produkt som detekteras, Lm-o-Eh och Abm-o-En symboliserar
exempel på reagens enligt uppfinningen ) :
-o- = partikel
I =" fast fas " (se nedan)
466 521
Kgmpeftiv typ
L air I-Åb I L
l-Ab s
Lme-Ehfwn-Ab : Lmf-En (ßp
lnhipitign typ
L. I AbmfEh
Abm-rEh S
I-L /”"""\~l-L : Abm-o-Eh
P
Ngnkgmpejitiv l sandwigh l
I-Ab + L --->I-Ab I L S
Abm+E,,/"“\~|-Ab : uAbme-En (_ å
P
MEN (ÅbfianajYï)
I-L + Ab,-->I-L:Ab4 S
Abm-o-Eh zf"_““-Ll-L:Ab,,:Abmo-Eh Q
P
I referenserna 1 och 2 givna ovan och referenser givna i dessa
artiklar förklaras ovanstående Elisatekniker med lösliga enzymkonjugat
utförligt liksom ingående reagens och applikationer och utförandet och
applikationerna med reagenset enligt uppfinningen är likartat eller
identiskt. Fieagenset enligt uppfinningen kan också användas tillsammans
med flera av de amplifieringstekniker som beskrivits för ELISA ( avidin-
biotin, enzym-kaskad, USEFllA, etc. ). lavidin-biotin fallet kan således
avidin (A) och enzym ( E ) kopplas till partiklarna ( o ) och användas för
detektion av bunden biotinmärkt antikropp eller analyt och följande
slutkomplex kan (som exempel) detekteras:
s
I-Ab ; L-biøiin :Avidinm-ø-Eh C
P
s
|-Ab ; L-biofin :Avidin :bløiinm-u-Eh (P
4166 521
E
I-Ab : L :Ab :Ab -biotin :Avidinm-É-biotin ( etc; Dakopatts Product
s ~/\*P
List, 1988; ref. 10).
För sammanfattande artiklar avidin-biotin se Hsu et al, sid. 467, i Ngo och
Lenhoff ( ref. 1 ) och Wilchek och Bayer, Immunology Today, vol. 5, sid. 39,
1984 ( ref. 11 ). Känsligheten kan ökas genom att produkten P som bildas i
ovanstående enzymreaktioner omvandlas vidare med andra enzymer
enligt t.ex. ref. 5 ovan, eller P omvandlas till luminiscent substans enligt
t.ex. Wannlund och Deluca, Meth. Enzymol. vol. 92, sid. 426 ( ref. 12 ).
Slutprodukten detekteras lämpligen med konventionell ELlSA-teknik dvs
visuellt, spektrofotometriskt, fluorometriskt, etc. eller reaktionen följs
kinetiskt ( Tsang et al, Meth. Enzymol. vol. 92, sid. 391; ref. 13). Dessutom
kan produkten P vara radioaktiv och kan separeras fràn substratet med
t.ex. en Sephadex-pelare och kvantifieras med scintillationsräknare
(USEFilA; ref. 9 ovan).
Ovanstående principiella utförande-exempel utgör enbart
exempel på hur uppfinningen kan komma till användning och är inte
avsedda att begränsa uppfinningens omfattning. Detsamma gäller
nedanstående exemplifiering av partikel-typ, konjugeringskemi, enzymer,
ligander eller receptorer, typ av prov och komponenter och några typer av
fasta faser som kan användas vid applikation av uppfinningen.
Partiklarna kan utgöras av ett vflrrenolösligt volymer: ämne cci
kan utgöras av naturliga, halvsyntetiska eller syntetiska material. Som
exempel kan nämnas silikater, borosilikater, zeoliter, aluminater,
oorganiskapartiklar vars yta modifierats med organiska ämnen
innehållande exempelvis alkyl-grupper, aromatiska grupper,
hydroxylgrupper, epoxigrupper, aldehydgrupper, estrar, plaster
(polyvinylalkohol, polystyren etc. ), kopolymerer typ Eupergit och Dynosfär,
tvärbundna polysackarider, liposomer, artificiella celler etc.
lmmobilisering av enzym och ligand eller receptor till partiklarna
466 521 _ é
kan enkelt utföras av fackmannen och begränsar inte uppfinningens
omfattning. Partiklarnas yta kan vara mer eller mindre hydrofob. En
hydrofob yta kan utnyttjas för nonkovalent bindning till partikeln av enzym
och ligand eller receptor. Både hydrofoba ( t.ex. polystyrenpartiklar
nitreras, reduceras och diazoteras ) och hydrofila ytor kan kemiskt
modifieras för att introducera reaktiva grupper för kovalent bindning och
litteraturen är omfattande på detta område (se exempelvis Methods
Enzymology volymerna 44, 104 och 135 ). Således kan t.ex. diazo, cyanat
ester, tosyl eller tresyl grupper, aldehyd, epoxi, divinylsulfon, FM P-
grupper enkelt bildas. Efter detta s.k. aktiveringssteg sker den s.k.
kopplingen av enzymet och liganden ( samtidigt eller konsekutivt ) till
partikeln. Efter kopplingen som skett vid lämpligt pH och temperatur tvättas
partiklarna efter centrifugering och reagenset kan sedan användas i t.ex.
de typer av ElA som nämnts ovan.
Vid kopplingen hålls koncentrationen av partiklarna i lämpligt
intervall för att undvika tvärbundna partiklar. Eventuellt storlekssepareras
de bildade partiklarna med bundet enzym och ligand eller receptor mha
t.ex. en Sephadex-kolonn. Förhållandet mellan ligand och enzym eller
mellan receptor och enzym väljs efter applikationen. Ett högt förhållande
enzym till receptor eller ligand kan ge hög enzymaktivitet men sämre
inbindningsförmåga. Fackmannen kan enkelt avgöra det optimala
förhållandet från fall till fall. Eventuellt kan enzymet kopplas först och
liganden eller receptorn därefter antingen direkt på resterande partikelyta
eller på enzymet mha tvärbindare typ glutaraldehyd eller reagens typ
perjodat. Naturligtvis kan enligt uppfinningen färdiga konjugat av enzym
och ligand eller enzym och receptor också kopplas till partiklarna. Man
uppnår med reagenset enligt uppfinningen en ökad känslighet jämfört med
det lösliga konjugatet pga multipla enzymmolekyler per partikel och
komponent i provet.
Storleken på partiklarna väljs med hänsyn till applikationen.
Företrädesvis används partiklar med diameter < 500 Å för att minimera
risken att reagenset enligt uppfinningen "släpper" efter inbindning vid
tvättstegen i t.ex. en sandwich-ELISA. Denna storlek tillåter flera
enzymmolekyler och receptor eller ligandmolekyler att binda till varje
7 i 466 521
partikel och tillåter dessutom en homogen partikelsuspension. Exempel på
kommersiellt tillgängliga partiklar av lämplig storlek är Degussas
silikatpartiklar Aerosil. De hydrofila Aerosilpartiklarna kan enkelt silaniseras
och aktiveras med t.ex. tresylklorid ( Nilsson och Mosbach, Meth. Enzymol.
vol. 104, sid. 56; ref. 14), perjodat, etc.
Valet av enzym och enzymsubstrat kan enkelt göras av
fackmannen och begränsar inte uppfinningens omfattning. Alla enzymer
som kan kopplas till partiklar kan användas enligt uppfinningen. l övrigt
väljs ett enzym och ett substrat därtill som är lämpligt för applikationen och
samma enzym och substrat som tidigare använts vid ELlSA,
immunohistokemiska studier, immunoblotting och mikroskopiska studier
kan användas. Exempel på enzymer som kan användas är peroxidas,
alkalint fosfatas, galaktosidas, ureas. gIukos-6-fosfatdehydrogenas och
luciferas. För att öka enzymaktivitet per partikel kan ett enzym med högt
Vmax och relativt låg molvikt användas. Exempel på enzymsubstrat som
kan användas med reagenset enligt uppfinningen ges i referenserna 1-13
och i relevanta artiklar i Meth. Enzymol. volymerna 70, 73 och 92.
Som antytts ovan skall liganden eller receptorn, dvs den
substans som kopplas till partikeln tillsammans med enzymet, biospecifikt
binda(s) till antingen analyten ( dvs komponenten i provet som skall
detekteras ), till en antikropp, till ett annat protein ( lektin, avidin etc), till ett
koenzym, kolhydrat etc. Substansen som kopplas till partikeln tillsammans
med enzymet kan vara identisk med analyten eller vara en analog till
denna. Substansen kan vara exempelvis en antikropp, ett lektin, avidin,
annan typ av protein eller glykoprotein, ett kolhydratderivat, en glykolipid,
ett neoglykoprotein, ett steroidderivat, koenzymderivat, metabolitderivat,
analog eller metabolit av läkemedel, metabolit, hormon, nukleotid eller
derivat därav, annan virus eller cellkomponent eller ett derivat därav.
Provet som innehåller cellen, viruset eller komponenten kan vara
i form av en vätska ( tårar, saliv, serum, urin, vattenprov, etc), i form av ett
mer eller mindre fast material (vävnad, nitrocellulosa, etc). Cellen, viruset
eller komponenten som kan analyseras mha reagenset enligt
uppfinningen är t.ex. patogena organismer som parasiter, jästceller,
466 521 8
bakterier, mykoplasma, virus, toxiner, läkemedel och deras metaboliter,
andra metaboliter, hormoner, antikroppar och andra proteiner, steroider,
prostaglandiner, kolhydrater, glykokonjugat, nukleotider och biomolekyleri
celler, virus, pä cellytor, i vävnader eller i cirkulationen och andra celler,
virus eller komponenter i t.ex. avloppsvatten jord, växter, djur och
livsmedel.
Den fasta fasen som används för separationssteget vid ELlSA
med reagens enligt uppfinningen kan vara av samma typ som används vid
ELISA med tidigare beskrivna enzymkonjugat ( se t.ex. sid 388-391 i Meth.
Enzymol. vol. 70, 1980): plaster i form av provrör, mikrotiterplattor,
partiklar, filter etc, glasfiber eller filter av papper, jonbytare,
agarospartiklar, Sephadexpartiklar, polyakrylamidgel, bentonit,
magnetiska preparationer av cellulosa, agaros eller plast, etc. Formen pä
den fasta fasen beror av applikationen och t.ex. kulor, kolonn, dipstick,
mikrotiterplatta, membran, filter eller provrör kan användas.
Efter separationen av bundna enzympartiklar från icke-bundna
bestäms aktiviteten antingen hos den bundna fraktionen eller hos den
icke-bundna.
Några exempel på hur uppfinningen kan komma till praktisk
användning beskrivs i de följande Exemplen som dock på intet sätt är
avsedda att begränsa uppfinningens omfattning.
EXEMPEL
Aktivering av kiselpagiklar:
Kiselpartiklar frän Degussa ( 400 mg, Aerosil TT600 ) silaniserades vid
140° C med X -glycidoxypropyltrimetoxisilan (300 mikroliter) med
trimetylamin ( 300 mikroliter ) som katalysator i vacuumexcickator under
4 timmar. Proceduren upprepades. Epoxigrupperna hydrolyserades med
vatten och HCI ( pH 3 ) vid 90° C under 30 minuter. Centrifugering och tvätt
med vatten och successiv överföring till aceton enligt ref. 14, följt av
4660521
aktivering av hydroxylgrupperna med tresylklorid ( 30 mikroliter per 150
mg partiklar) i 1 ml aceton och med 40 mikroliter pyridin vid 0°_C under 20
minuter, tvätt enligt ref. 14, mha centrifugering av partiklarna, gav partiklar
med 150 mikromol tresylgrupper per g partiklar enligt elementaranalys.
K nn v rxi hkmn ni-hmn rnfrrin' mn l n
ddh av pardxidaa Qçh kanin anti-humant tX-t -fatdprdtain immdndgldbulig
till tragylaktivarada Aardailpadiklar: '
Peroxidas ( 12 mg, affinitetsrenad, Sigma) och antitransferrin-( 1,5 ml,
dialyserad mot 0,3 M natriumbikarbonat, pH 8,5; Dakopatts ), blandades
långsamt under omrörning med de tresylaktiverade silikapartiklarna
(250 mg våtvikt i 4 ml buffert) och ultraljudbehandlades under 5 minuter.
Koppling i provrör under omrörning med vippbord under 70 timmar vid 4° C.
Tvätt med kopplingsbuffert (4 ggr) mha centrifugering av partiklarna.
Bovint serum albumin (40 mg i 5 ml ) tillsätts för att blockera eventuellt
kvarvarande tresylgrupper. Förvaras vid 4° C. Spektrofotometrisk
bestämning av absorbansen hos tvättlösningarna vid 403 nm och 280 nm
indkerade att 2 mg peroxidas och 2 mg antitransferrin kopplats.
Peroxidas ( 15 mg, 1000 U/mg, Boehringer, ELISA-kvalitet ) och anti-(X-t -
fetoprotein immunoglobulin (50 mg, Dakopatts) kopplades vid 4° C under
40 timmar på liknande sätt men med 8,5 ml kopplingsbuffert ( enligt ovan )
och gradvis tillsats av tresylaktiverade silikapartiklar ( 25 mg torrvikti 1 ml
buffert). Resterande tresylgrupper blockerades med TFtlS-HCI,
pH 8.3, 0.2 M.
Bestämning av humant transfarrin mad fiandwigh-ELlfiA användande
rxt -nirnfrrin-ilik:
Steg 1. En mikrotiterplatta inkuberades med 300 mikroliter i varje brunn
av 10 mikrogram kanin antitransferrin immunoglobulin ( Dakopatts A061,
lot 012 ) löst i PBS ( 10 mM natriumfosfat + 145 mM NaCl, pH 7.2 ).
lnkubation vid 4° C över natten. Tvättades med PBS som innehöll 0.1 %
Tween 20 och 0.5 M NaCl ( buffert B ).
466 521 ”
Steg 2. Plattan inkuberades med en spädningsserie ( 10 mikrogram till
0.02 ng ) av humant transferrin ( apoform, Sigma) löst i buffert B.
lnkubation under 2 timmar vid 20° C. '
Steg 3. Peroxidas-antitransferrin-partiklar preparerade enligt ovan
suspenderades i buffert B och adderades till brunnarna. lnkubation under
3 timmar vid 20° C med lätt omrörning ( skakbord ). Tvättades 3 ggr med
buffert B och substratlösning ( 150 mikroliter av 8 mg 1,2-fenylendiamin
dihydroklorid löst i 0.1 M citronsyra-fosfat buffert pH 5.0, 12 ml, 'och
12 mikroliter H 202 ) tillsattes brunnarna ( steg 4 ). '
Efter 50 min avlästes absorbansen i plattans brunnar med en multiscanner
vid 492 nm. Brunnar som i steg 2 inkuberats med mindre än 2 ng
transferrin gav högre absorbans än bakgrundsabsorbansen erhållen i
brunnar som i steg 2 inkuberats utan antigen (dvs enbart buffert B ).
Humant (X-l-fetoprotein ( Dakopatts X900 standard, lot 014 ) bestämdes
med samma procedur och buffertar som användes i föregående exempel
med skillnaden att silikapartiklar med koimmobiliserat peroxidas och anti-off
-1-fetoprotein immunoglobulin preparerade enligt ovan användes.
I steg 1 inkuberades med anti-oz-f -fetoprotein immunoglobulin (kanin,
Dakopatts, A008, lot 085 ) och i steg 2 sattes 0<-1 -fetoprotein till brunnarna
i en spädningsserie fràn 1 mikrogram till 0.1 ng. l steg 3 användes lösligt
konjugat av peroxidas och antihumant 06-1 -fetoprotein ( kanin, Dakopatts,
P128, lot 046 ) som jämförelse med silikakonjugatet.
Brunnar som i steg 2 inkuberats med 0.1 ng antigen och i steg 3 inkuberats
med enzym-antikropp-partiklarna gav mer än dubbelt så hög absorbans
än bakgrundsabsorbansen erhällen i brunnar där inget antigen
inkuberades i steg 2. Lösligt enzym-antikropp konjugat gav ingen
absorbansskillnad för 0.1 ng antigen. Både lösligt och partikelbundet
konjugat gav ca 10 ggr skillnad i absorbans för brunnar som i steg 2
inkuberats med 1 mikrogram antigen jämfört med blankbrunnarna.
Claims (8)
1. Reagens, kännetecknat av att minst ett enzym och minst en annan substans är kovalent eller nonkovalent bundna till en partikel som har låg eller ingen löslighet i vatten vid de betingelser som råder vid sättet enligt uppfinningen och som är mindre eller lika med 500 Å i diameter.
2. Reagens enligt patentkrav 1, kännetecknat av att partikeln består av ett naturligt, halvsyntetiskt eller syntetiskt material, som exempelvis en polysackarid, glas, silikat, borsilikat, aluminat, guld, zeolit, tvärbunden eller ytmodifierad organisk eller oorganisk polymer, plast, kopolymer, eller en artificiell cell.
3. Reagens enligt patentkrav 1 och 2, kännetecknat av att partikelns yta har hydrofila eller hydrofoba grupper eller har reaktiva grupper, som någon av diazo, epoxi, aldehyd, cyanatester, tosyl, tresyl, annan ester, acylacid, aromatisk karbamat, triazin, succinimid, karbodiimid, imidater, disulfid, reaktiv halogen, divinylsulfon, FMP, eller en fotoaktiv substans, etc, för kovalent koppling av enzym och substans till partikeln.
4. Reagens enligt patentkrav 1-3, kännetecknat av att enzym och substans binds samtidigt till eller efter varandra till partikeln eller att ett konjugat mellan enzym och substans först bildas och som därefter kopplas till partikeln eller att enzym och substans tvärbinds efter adsorption till partikelytan med tvärbindare som exempelvis glutaraldehyd.
5. Reagens enligt patentkrav 1-4, kännetecknat av att enzymet är något av exempelvis alkalint fosfatas, ureas, ß- galaktosidas, lysozym, proteas, annat hydrolas, glukosoxidas, peroxidas, glukos-6-fosfatdehydrogenas, annat oxidoreduktas. 466 521 ä
6. Reagens enligt patentkrav 1-5, kännetecknat av substansen är exempelvis en antikropp, ett lektin, avidin, annat protein, polysackarid, kolhydrat eller derivat därav, glykolipid, neoglykokonjugat, koenzym eller derivat därav, steroidderivat, prostaglandinderivat, hormon eller derivat därav, läkemedel eller en metabolit eller en analog därav, nukleotid, nukleinsyra eller ett derivat därav, annan cell eller viruskomponent.
7. Reagens enligt patentkrav 1-6, kännetecknat av att enzym och substans kovalent bundits mha reaktiva grupper som tresylgrupper till en silika partikel vars yta modifierats först med öeglycidoxypropyltrimetoxysilan, hydrolyserats vid svagt sur pH och därefter aktiverats med exempelvis tresyl klorid.
8. Sätt eller användning av ett reagens enligt patentkrav 1, för bestämning av en cell, ett virus eller en komponent därav eller en annan typ av komponent i ett prov med ELISA-teknik och liknande enzymatiska tekniker, för immunohistokemiska studier, för immunoblotting, för mikroskopiska studier, etc, i vilka tekniker eller studier reagenset enligt patentkrav 1 används på samma sätt och i stället för tidigare beskrivna enzymkonjugat, dvs för specifik inbindning och för katalytisk omvandling av enzymsubstrat till detekterbar produkt eller till produkt som kan detekteras efter omvandling mha exempelvis en enzymkaskad.
Priority Applications (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SE8803496A SE466521B (sv) | 1988-10-03 | 1988-10-03 | Reagens vid analys bestaaende av ett enzym och en annan ligand, vilka aer kovalent bundna till en vattenoloeslig partikel med en diameter paa mindre aen 500 aa |
DE68919828T DE68919828T2 (de) | 1988-10-03 | 1989-10-02 | Nanoteilchen mit gebundenen enzym und ligand zur verwendung bei analysen. |
EP89910963A EP0394398B1 (en) | 1988-10-03 | 1989-10-02 | Nanoparticle with bound enzyme and bound ligand useful in analysis |
PCT/SE1989/000539 WO1990004181A1 (en) | 1988-10-03 | 1989-10-02 | Nanoparticle with a bound enzyme and another ligand useful in analysis |
US08/185,213 US5405752A (en) | 1988-10-03 | 1994-01-14 | Enzyme conjugate prepared with insoluble nonoparticle |
US08/730,966 US5738986A (en) | 1988-10-03 | 1996-10-16 | Analytical reagent particle with covalently-bound enzyme |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SE8803496A SE466521B (sv) | 1988-10-03 | 1988-10-03 | Reagens vid analys bestaaende av ett enzym och en annan ligand, vilka aer kovalent bundna till en vattenoloeslig partikel med en diameter paa mindre aen 500 aa |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SE8803496D0 SE8803496D0 (sv) | 1988-10-03 |
SE8803496L SE8803496L (sv) | 1990-04-04 |
SE466521B true SE466521B (sv) | 1992-02-24 |
Family
ID=20373508
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SE8803496A SE466521B (sv) | 1988-10-03 | 1988-10-03 | Reagens vid analys bestaaende av ett enzym och en annan ligand, vilka aer kovalent bundna till en vattenoloeslig partikel med en diameter paa mindre aen 500 aa |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US5405752A (sv) |
EP (1) | EP0394398B1 (sv) |
DE (1) | DE68919828T2 (sv) |
SE (1) | SE466521B (sv) |
WO (1) | WO1990004181A1 (sv) |
Families Citing this family (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SE9203159D0 (sv) * | 1992-10-28 | 1992-10-28 | Procur Ab | Partikel suspension |
SE9301270D0 (sv) * | 1993-04-19 | 1993-04-17 | Biosensor | |
US5936075A (en) * | 1994-05-17 | 1999-08-10 | Bioflexin Ab | Amino-deoxy-disaccharides and amino-deoxy-oligosaccharides |
SE9301677L (sv) * | 1993-05-14 | 1994-11-18 | Kurt G I Nilsson | Syntesmetod |
US6183994B1 (en) | 1993-05-14 | 2001-02-06 | Bioflexin Ab | N-containing saccharides and method for the synthesis of N-containing saccharides from amino-deoxy-disaccharides and amino-deoxy-oligosaccharides |
SE9400034D0 (sv) | 1994-01-06 | 1994-01-06 | Glycorex Ab | Laktosaminderivat |
US7014049B2 (en) * | 1996-12-23 | 2006-03-21 | Glycorex Transplantation Ab | Device for bio-affinity material |
US6613581B1 (en) * | 1999-08-26 | 2003-09-02 | Caliper Technologies Corp. | Microfluidic analytic detection assays, devices, and integrated systems |
US20030095897A1 (en) * | 2001-08-31 | 2003-05-22 | Grate Jay W. | Flow-controlled magnetic particle manipulation |
DE10240035A1 (de) * | 2002-08-30 | 2004-03-11 | Rehm, Bernd H.A., PD Dr.rer.nat. | Biogene Polyester-Partikel definierter Größe mit funktionalisierten Oberflächen:Herstellungsverfahren und pharmazeutische Zubereitungen, in denen diese enthalten sind |
US20040101822A1 (en) * | 2002-11-26 | 2004-05-27 | Ulrich Wiesner | Fluorescent silica-based nanoparticles |
ES2375962T3 (es) * | 2003-09-22 | 2012-03-07 | Bioarray Solutions Ltd | Polielectrolito inmovilizado en superficie con múltiples grupos funcionales capaces de unirse covalentemente a biomoléculas. |
US7700312B2 (en) * | 2004-12-16 | 2010-04-20 | Kansas State University Research Foundation | Preparation containing nanoscale particles with electrostatically adhered enzyme |
AU2006295515A1 (en) * | 2005-09-27 | 2007-04-05 | Polybatics Limited | Polymer particles and uses thereof |
US20140342377A1 (en) * | 2011-07-20 | 2014-11-20 | Glycorex Ab | Method for the detection of an analyte in a sample |
WO2019035044A1 (en) | 2017-08-18 | 2019-02-21 | The Procter & Gamble Company | CLEANING METHOD |
EP3444323A1 (en) | 2017-08-18 | 2019-02-20 | The Procter & Gamble Company | Cleaning kit |
CA3071086A1 (en) | 2017-08-18 | 2019-02-21 | The Procter & Gamble Company | Cleaning agent |
EP3444328A1 (en) | 2017-08-18 | 2019-02-20 | The Procter & Gamble Company | Cleaning agent |
CN113933289A (zh) * | 2021-09-03 | 2022-01-14 | 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 | 一种基于检测试纸的靶标物半定量检测方法及检测试纸 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4193983A (en) * | 1978-05-16 | 1980-03-18 | Syva Company | Labeled liposome particle compositions and immunoassays therewith |
US4267235A (en) * | 1979-03-19 | 1981-05-12 | California Institute Of Technology | Polyglutaraldehyde microspheres |
US4415665A (en) * | 1980-12-12 | 1983-11-15 | Pharmacia Fine Chemicals Ab | Method of covalently binding biologically active organic substances to polymeric substances |
US4434150A (en) * | 1981-10-19 | 1984-02-28 | Ortho Diagnostic Systems, Inc. | Immunological reagents employing polymeric backbone possessing reactive functional groups |
US4552839A (en) * | 1983-08-01 | 1985-11-12 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Determination of analytes in particle-containing medium |
EP0155224A3 (en) * | 1984-03-15 | 1987-05-06 | CHROMAGENICS, Inc. | Solid-borne complex bearing chromagen responsive functionality for antibody, antigen, receptor, or ligand detection |
US4698263A (en) * | 1985-05-23 | 1987-10-06 | Becton Dickinson And Company | Sac having a marker linked thereto |
SE451849B (sv) * | 1985-12-11 | 1987-11-02 | Svenska Sockerfabriks Ab | Sett att syntetisera glykosidiska bindningar samt anvendning av pa detta sett erhallna produkter |
-
1988
- 1988-10-03 SE SE8803496A patent/SE466521B/sv not_active IP Right Cessation
-
1989
- 1989-10-02 WO PCT/SE1989/000539 patent/WO1990004181A1/en active IP Right Grant
- 1989-10-02 DE DE68919828T patent/DE68919828T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-10-02 EP EP89910963A patent/EP0394398B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-01-14 US US08/185,213 patent/US5405752A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-10-16 US US08/730,966 patent/US5738986A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US5405752A (en) | 1995-04-11 |
EP0394398A1 (en) | 1990-10-31 |
SE8803496L (sv) | 1990-04-04 |
DE68919828D1 (de) | 1995-01-19 |
WO1990004181A1 (en) | 1990-04-19 |
EP0394398B1 (en) | 1994-12-07 |
US5738986A (en) | 1998-04-14 |
SE8803496D0 (sv) | 1988-10-03 |
DE68919828T2 (de) | 1995-07-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
SE466521B (sv) | Reagens vid analys bestaaende av ett enzym och en annan ligand, vilka aer kovalent bundna till en vattenoloeslig partikel med en diameter paa mindre aen 500 aa | |
US4273867A (en) | Method and reagent for counteracting lipemic interference | |
US4960692A (en) | Assay employing binding pair members on particles and on a filter or membrane | |
US4039652A (en) | Column method of immunoassay employing an immobilized binding partner | |
US4343896A (en) | Method and test pack for the demonstration and determination of an antigen or antibody | |
US4772550A (en) | Heterogeneous specific binding assay employing an aggregatable binding reagent | |
US4526871A (en) | Conjugate obtained by coupling a lectin and a specific ligand, containing such a conjugate and its applications in biology | |
US4434227A (en) | Immunoassay for class specific immunoglobulin antibodies | |
EP0014530B1 (en) | Method for detecting and determining proteinaceous specific binding agents and materials bindable thereto, test composition and testkit therefor | |
EP0468585B1 (en) | Biologically active reagent, analytical element and methods for use of the reagent | |
EP0709676B2 (en) | Method for coupling antibody to latex substrate and its use in immunoassay | |
US7919331B2 (en) | Chromatographic test strips for one or more analytes | |
JP2579972B2 (ja) | 膜親和濃縮免疫測定方法 | |
EP0241140B1 (en) | Assay method with a multivalently labelled reagent, and means therefor | |
FI72822C (sv) | Immunologisk reagens för bestämning av graviditet, förfarande för fram ställning av detta och förfarande för bestämning av graviditet. | |
EP0152254A2 (en) | Chromogenic support immunoassay utilizing labeled complement components | |
US5017472A (en) | Microflotation devices used for immunoassays and cell/molecular fractionation | |
JP2972241B2 (ja) | 全イムノグロブリンクラスの抗原特異的抗体を測定するための1段階イムノアツセイ | |
McCreath et al. | Affinity adsorption of Saccharomyces cerevisiae on concanavalin a perflurocarbon emulsions | |
EP0184701B1 (en) | A method for determining a ligand | |
JPH08254534A (ja) | 免疫反応物質固定化担体 | |
EP0673510A1 (en) | Suspension of particles with a diameter of less than 1 micro m with immobilized enzyme and protein | |
JPH0933529A (ja) | 抗dna抗体の測定方法及びキット |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
NAL | Patent in force |
Ref document number: 8803496-2 Format of ref document f/p: F |
|
NUG | Patent has lapsed |