SE466521B - Reagens vid analys bestaaende av ett enzym och en annan ligand, vilka aer kovalent bundna till en vattenoloeslig partikel med en diameter paa mindre aen 500 aa - Google Patents

Description

466 521 9- av markörsubstans ( t. ex. ett enzym eller en radioaktiv substans ). Även om flera sådana metoder baserade på kemiska reagens finns beskrivna i litteraturen ( exempelvis glutaraldehyd, perjodat eller tiolsubstanser; se O“Sullivan och Marks, Meth. Enzymol. vol. 73, sid. 147-166, ref. 3, ref. 2 samt övriga relevanta artiklar i Meth. Enzymol. volymerna 70, 73 och 92 ) så har de alla sina brister. Det är exempelvis svårt att med befintliga tekniker reproducerbart och kontrollerbart producera t. ex. enzym-antigen, enzym-antikropp eller enzym-lektin konjugat och andra typer av enzym- ligand eller enzym-receptor konjugat. Man erhåller konjugat som är heterogena till storlek och sammansättning. Dessutom kan konjugeringen leda till nedsatt enzymaktivitet eller specificitet hos liganden eller receptorn. Vidare, även om känsligheten ofta är tillräcklig så begränsas ElA i många fall av otillräcklig känslighet. Man har sökt öka känsligheten genom att använda mer eller mindre komplicerade system som avidin- biotin ( Kendall et al, J. lmmunol. Meth., vol. 56, sid. 329, 1983, ref. 4; se också ref. 1-3 och relevanta artiklar i Meth. Enzymol. ), eller s.k. enzymkaskader ( Self, US Patent Application No. 307,600; ref. 5).

Ett enklare system utnyttjar lösligt oligomert enzym kopplat till antikropp (Leary et al, Proc. Nat. Acad. Sci., vol. 80, sid. 4045, 1983; ref. 6). Även om dessa s.k. amplifieringstekniker är användbara i flera applikationer har de sina begränsningar och nackdelar och Ngo nämner i sin ElA- översiktsartikel att ökad känslighet hos ElA och bättre metoder för preparation av enzym-ligand eller enzym-receptor konjugat är önskvärda.

Föreliggande uppfinning syftar bl. a. till att reducera dessa nackdelar hos EIA och en enkel metod att bilda enzym-antigen, enzym- antikropp eller enzym-lektin konjugat såväl som konjugat mellan enzym och andra typer ligander eller receptorer beskrivs. Vidare beskrivs hur detta reagens kan användas vid detektion av en cell, ett virus eller en annan komponent i ett prov och hur en ökad känslighet jämfört med tidigare metoder kan uppnås genom att använda reagenset enligt uppfinningen.

Dessa och andra syften uppnås enligt uppfinningen genom att man kovalent eller nonkovalent binder enzym och antikropp eller enzym och lektin eller enzym och antigen (eller generellt enzym och ligand eller 3 466 521 receptor) till lämplig typ av partiklar som är olösliga i det medium (vanligtvis buffrat vatten ) som används vid konjugeringen till partikeln och vid bestämning av analyten, samt genom att man använder det så bildade reagenset istället för och på samma sätt som tidigare beskrivna enzymkonjugat för specifik detektion av cell, ett virus eller en annan komponent i ett prov.

Genom att variera partikelns storlek, kemiska och fysiska struktur, typ av yta ( hydrofob, hydrofil, med eller utan reaktiva grupper), enzym, antikropp eller antigen (annan typ av receptor eller ligand ) samt dessas koncentrationer, kan man erhålla partikelkonjugat med för applikationen lämpliga egenskaper.

Exempel på användningar av reagenset enligt uppfinningen är vid ELISA ( ref. 1 och 2), i immunohistokemiska studier ( Avrameas, Histochem. J., vol. 4, sid. 321, 1972; ref. 7), immunoblotting (Tsang et al, Meth. Enzymol. vol. 92, sid. 377; ref. 8 ), vid mikroskopiska studier, detektion av antikroppar i cellkulturer etc.

Som exempel på tekniker där reagenset enligt uppfinningen kan komma till användning är kompetitiva och nonkompetitiva ELISA-metoder och i s. k. USEFllA ( Meth. Enzymol. vol. 73, sid. 383, Hsu et al.; ref. 9). De lösliga enzymkonjugat som använts tidigare i dessa metoder ersätts således med de enligt uppfinningen beskrivna reagensen. Övrigt utförande är identiskt eller likartat med i litteraturen beskrivna EIA-tekniker ( ref. 1, 2 etc. ) Exempel på ELISA-utiörandeprinciper med reagens enligt uppfinningen visas i nedanstående figurer ( L är analyten, dvs komponenten som skall bestämmas, Ab är antikropp eller lektin, kolhydrat, koenzym, etc. med specifik affinitet till L, E är enzym, S är enzymsubstrat och P är produkt som detekteras, Lm-o-Eh och Abm-o-En symboliserar exempel på reagens enligt uppfinningen ) : -o- = partikel I =" fast fas " (se nedan) 466 521 Kgmpeftiv typ L air I-Åb I L l-Ab s Lme-Ehfwn-Ab : Lmf-En (ßp lnhipitign typ L. I AbmfEh Abm-rEh S I-L /”"""\~l-L : Abm-o-Eh P Ngnkgmpejitiv l sandwigh l I-Ab + L --->I-Ab I L S Abm+E,,/"“\~|-Ab : uAbme-En (_ å P MEN (ÅbfianajYï) I-L + Ab,-->I-L:Ab4 S Abm-o-Eh zf"_““-Ll-L:Ab,,:Abmo-Eh Q P I referenserna 1 och 2 givna ovan och referenser givna i dessa artiklar förklaras ovanstående Elisatekniker med lösliga enzymkonjugat utförligt liksom ingående reagens och applikationer och utförandet och applikationerna med reagenset enligt uppfinningen är likartat eller identiskt. Fieagenset enligt uppfinningen kan också användas tillsammans med flera av de amplifieringstekniker som beskrivits för ELISA ( avidin- biotin, enzym-kaskad, USEFllA, etc. ). lavidin-biotin fallet kan således avidin (A) och enzym ( E ) kopplas till partiklarna ( o ) och användas för detektion av bunden biotinmärkt antikropp eller analyt och följande slutkomplex kan (som exempel) detekteras: s I-Ab ; L-biøiin :Avidinm-ø-Eh C P s |-Ab ; L-biofin :Avidin :bløiinm-u-Eh (P 4166 521 E I-Ab : L :Ab :Ab -biotin :Avidinm-É-biotin ( etc; Dakopatts Product s ~/\*P List, 1988; ref. 10).

För sammanfattande artiklar avidin-biotin se Hsu et al, sid. 467, i Ngo och Lenhoff ( ref. 1 ) och Wilchek och Bayer, Immunology Today, vol. 5, sid. 39, 1984 ( ref. 11 ). Känsligheten kan ökas genom att produkten P som bildas i ovanstående enzymreaktioner omvandlas vidare med andra enzymer enligt t.ex. ref. 5 ovan, eller P omvandlas till luminiscent substans enligt t.ex. Wannlund och Deluca, Meth. Enzymol. vol. 92, sid. 426 ( ref. 12 ).

Slutprodukten detekteras lämpligen med konventionell ELlSA-teknik dvs visuellt, spektrofotometriskt, fluorometriskt, etc. eller reaktionen följs kinetiskt ( Tsang et al, Meth. Enzymol. vol. 92, sid. 391; ref. 13). Dessutom kan produkten P vara radioaktiv och kan separeras fràn substratet med t.ex. en Sephadex-pelare och kvantifieras med scintillationsräknare (USEFilA; ref. 9 ovan).

Ovanstående principiella utförande-exempel utgör enbart exempel på hur uppfinningen kan komma till användning och är inte avsedda att begränsa uppfinningens omfattning. Detsamma gäller nedanstående exemplifiering av partikel-typ, konjugeringskemi, enzymer, ligander eller receptorer, typ av prov och komponenter och några typer av fasta faser som kan användas vid applikation av uppfinningen.

Partiklarna kan utgöras av ett vflrrenolösligt volymer: ämne cci kan utgöras av naturliga, halvsyntetiska eller syntetiska material. Som exempel kan nämnas silikater, borosilikater, zeoliter, aluminater, oorganiskapartiklar vars yta modifierats med organiska ämnen innehållande exempelvis alkyl-grupper, aromatiska grupper, hydroxylgrupper, epoxigrupper, aldehydgrupper, estrar, plaster (polyvinylalkohol, polystyren etc. ), kopolymerer typ Eupergit och Dynosfär, tvärbundna polysackarider, liposomer, artificiella celler etc. lmmobilisering av enzym och ligand eller receptor till partiklarna 466 521 _ é kan enkelt utföras av fackmannen och begränsar inte uppfinningens omfattning. Partiklarnas yta kan vara mer eller mindre hydrofob. En hydrofob yta kan utnyttjas för nonkovalent bindning till partikeln av enzym och ligand eller receptor. Både hydrofoba ( t.ex. polystyrenpartiklar nitreras, reduceras och diazoteras ) och hydrofila ytor kan kemiskt modifieras för att introducera reaktiva grupper för kovalent bindning och litteraturen är omfattande på detta område (se exempelvis Methods Enzymology volymerna 44, 104 och 135 ). Således kan t.ex. diazo, cyanat ester, tosyl eller tresyl grupper, aldehyd, epoxi, divinylsulfon, FM P- grupper enkelt bildas. Efter detta s.k. aktiveringssteg sker den s.k. kopplingen av enzymet och liganden ( samtidigt eller konsekutivt ) till partikeln. Efter kopplingen som skett vid lämpligt pH och temperatur tvättas partiklarna efter centrifugering och reagenset kan sedan användas i t.ex. de typer av ElA som nämnts ovan.

Vid kopplingen hålls koncentrationen av partiklarna i lämpligt intervall för att undvika tvärbundna partiklar. Eventuellt storlekssepareras de bildade partiklarna med bundet enzym och ligand eller receptor mha t.ex. en Sephadex-kolonn. Förhållandet mellan ligand och enzym eller mellan receptor och enzym väljs efter applikationen. Ett högt förhållande enzym till receptor eller ligand kan ge hög enzymaktivitet men sämre inbindningsförmåga. Fackmannen kan enkelt avgöra det optimala förhållandet från fall till fall. Eventuellt kan enzymet kopplas först och liganden eller receptorn därefter antingen direkt på resterande partikelyta eller på enzymet mha tvärbindare typ glutaraldehyd eller reagens typ perjodat. Naturligtvis kan enligt uppfinningen färdiga konjugat av enzym och ligand eller enzym och receptor också kopplas till partiklarna. Man uppnår med reagenset enligt uppfinningen en ökad känslighet jämfört med det lösliga konjugatet pga multipla enzymmolekyler per partikel och komponent i provet.

Storleken på partiklarna väljs med hänsyn till applikationen.

Företrädesvis används partiklar med diameter < 500 Å för att minimera risken att reagenset enligt uppfinningen "släpper" efter inbindning vid tvättstegen i t.ex. en sandwich-ELISA. Denna storlek tillåter flera enzymmolekyler och receptor eller ligandmolekyler att binda till varje 7 i 466 521 partikel och tillåter dessutom en homogen partikelsuspension. Exempel på kommersiellt tillgängliga partiklar av lämplig storlek är Degussas silikatpartiklar Aerosil. De hydrofila Aerosilpartiklarna kan enkelt silaniseras och aktiveras med t.ex. tresylklorid ( Nilsson och Mosbach, Meth. Enzymol. vol. 104, sid. 56; ref. 14), perjodat, etc.

Valet av enzym och enzymsubstrat kan enkelt göras av fackmannen och begränsar inte uppfinningens omfattning. Alla enzymer som kan kopplas till partiklar kan användas enligt uppfinningen. l övrigt väljs ett enzym och ett substrat därtill som är lämpligt för applikationen och samma enzym och substrat som tidigare använts vid ELlSA, immunohistokemiska studier, immunoblotting och mikroskopiska studier kan användas. Exempel på enzymer som kan användas är peroxidas, alkalint fosfatas, galaktosidas, ureas. gIukos-6-fosfatdehydrogenas och luciferas. För att öka enzymaktivitet per partikel kan ett enzym med högt Vmax och relativt låg molvikt användas. Exempel på enzymsubstrat som kan användas med reagenset enligt uppfinningen ges i referenserna 1-13 och i relevanta artiklar i Meth. Enzymol. volymerna 70, 73 och 92.

Som antytts ovan skall liganden eller receptorn, dvs den substans som kopplas till partikeln tillsammans med enzymet, biospecifikt binda(s) till antingen analyten ( dvs komponenten i provet som skall detekteras ), till en antikropp, till ett annat protein ( lektin, avidin etc), till ett koenzym, kolhydrat etc. Substansen som kopplas till partikeln tillsammans med enzymet kan vara identisk med analyten eller vara en analog till denna. Substansen kan vara exempelvis en antikropp, ett lektin, avidin, annan typ av protein eller glykoprotein, ett kolhydratderivat, en glykolipid, ett neoglykoprotein, ett steroidderivat, koenzymderivat, metabolitderivat, analog eller metabolit av läkemedel, metabolit, hormon, nukleotid eller derivat därav, annan virus eller cellkomponent eller ett derivat därav.

Provet som innehåller cellen, viruset eller komponenten kan vara i form av en vätska ( tårar, saliv, serum, urin, vattenprov, etc), i form av ett mer eller mindre fast material (vävnad, nitrocellulosa, etc). Cellen, viruset eller komponenten som kan analyseras mha reagenset enligt uppfinningen är t.ex. patogena organismer som parasiter, jästceller, 466 521 8 bakterier, mykoplasma, virus, toxiner, läkemedel och deras metaboliter, andra metaboliter, hormoner, antikroppar och andra proteiner, steroider, prostaglandiner, kolhydrater, glykokonjugat, nukleotider och biomolekyleri celler, virus, pä cellytor, i vävnader eller i cirkulationen och andra celler, virus eller komponenter i t.ex. avloppsvatten jord, växter, djur och livsmedel.

Den fasta fasen som används för separationssteget vid ELlSA med reagens enligt uppfinningen kan vara av samma typ som används vid ELISA med tidigare beskrivna enzymkonjugat ( se t.ex. sid 388-391 i Meth.

Enzymol. vol. 70, 1980): plaster i form av provrör, mikrotiterplattor, partiklar, filter etc, glasfiber eller filter av papper, jonbytare, agarospartiklar, Sephadexpartiklar, polyakrylamidgel, bentonit, magnetiska preparationer av cellulosa, agaros eller plast, etc. Formen pä den fasta fasen beror av applikationen och t.ex. kulor, kolonn, dipstick, mikrotiterplatta, membran, filter eller provrör kan användas.

Efter separationen av bundna enzympartiklar från icke-bundna bestäms aktiviteten antingen hos den bundna fraktionen eller hos den icke-bundna.

Några exempel på hur uppfinningen kan komma till praktisk användning beskrivs i de följande Exemplen som dock på intet sätt är avsedda att begränsa uppfinningens omfattning.

EXEMPEL Aktivering av kiselpagiklar: Kiselpartiklar frän Degussa ( 400 mg, Aerosil TT600 ) silaniserades vid 140° C med X -glycidoxypropyltrimetoxisilan (300 mikroliter) med trimetylamin ( 300 mikroliter ) som katalysator i vacuumexcickator under 4 timmar. Proceduren upprepades. Epoxigrupperna hydrolyserades med vatten och HCI ( pH 3 ) vid 90° C under 30 minuter. Centrifugering och tvätt med vatten och successiv överföring till aceton enligt ref. 14, följt av 4660521 aktivering av hydroxylgrupperna med tresylklorid ( 30 mikroliter per 150 mg partiklar) i 1 ml aceton och med 40 mikroliter pyridin vid 0°_C under 20 minuter, tvätt enligt ref. 14, mha centrifugering av partiklarna, gav partiklar med 150 mikromol tresylgrupper per g partiklar enligt elementaranalys.

K nn v rxi hkmn ni-hmn rnfrrin' mn l n ddh av pardxidaa Qçh kanin anti-humant tX-t -fatdprdtain immdndgldbulig till tragylaktivarada Aardailpadiklar: ' Peroxidas ( 12 mg, affinitetsrenad, Sigma) och antitransferrin-( 1,5 ml, dialyserad mot 0,3 M natriumbikarbonat, pH 8,5; Dakopatts ), blandades långsamt under omrörning med de tresylaktiverade silikapartiklarna (250 mg våtvikt i 4 ml buffert) och ultraljudbehandlades under 5 minuter.

Koppling i provrör under omrörning med vippbord under 70 timmar vid 4° C.

Tvätt med kopplingsbuffert (4 ggr) mha centrifugering av partiklarna.

Bovint serum albumin (40 mg i 5 ml ) tillsätts för att blockera eventuellt kvarvarande tresylgrupper. Förvaras vid 4° C. Spektrofotometrisk bestämning av absorbansen hos tvättlösningarna vid 403 nm och 280 nm indkerade att 2 mg peroxidas och 2 mg antitransferrin kopplats.

Peroxidas ( 15 mg, 1000 U/mg, Boehringer, ELISA-kvalitet ) och anti-(X-t - fetoprotein immunoglobulin (50 mg, Dakopatts) kopplades vid 4° C under 40 timmar på liknande sätt men med 8,5 ml kopplingsbuffert ( enligt ovan ) och gradvis tillsats av tresylaktiverade silikapartiklar ( 25 mg torrvikti 1 ml buffert). Resterande tresylgrupper blockerades med TFtlS-HCI, pH 8.3, 0.2 M.

Bestämning av humant transfarrin mad fiandwigh-ELlfiA användande rxt -nirnfrrin-ilik: Steg 1. En mikrotiterplatta inkuberades med 300 mikroliter i varje brunn av 10 mikrogram kanin antitransferrin immunoglobulin ( Dakopatts A061, lot 012 ) löst i PBS ( 10 mM natriumfosfat + 145 mM NaCl, pH 7.2 ). lnkubation vid 4° C över natten. Tvättades med PBS som innehöll 0.1 % Tween 20 och 0.5 M NaCl ( buffert B ). 466 521 ” Steg 2. Plattan inkuberades med en spädningsserie ( 10 mikrogram till 0.02 ng ) av humant transferrin ( apoform, Sigma) löst i buffert B. lnkubation under 2 timmar vid 20° C. ' Steg 3. Peroxidas-antitransferrin-partiklar preparerade enligt ovan suspenderades i buffert B och adderades till brunnarna. lnkubation under 3 timmar vid 20° C med lätt omrörning ( skakbord ). Tvättades 3 ggr med buffert B och substratlösning ( 150 mikroliter av 8 mg 1,2-fenylendiamin dihydroklorid löst i 0.1 M citronsyra-fosfat buffert pH 5.0, 12 ml, 'och 12 mikroliter H 202 ) tillsattes brunnarna ( steg 4 ). ' Efter 50 min avlästes absorbansen i plattans brunnar med en multiscanner vid 492 nm. Brunnar som i steg 2 inkuberats med mindre än 2 ng transferrin gav högre absorbans än bakgrundsabsorbansen erhållen i brunnar som i steg 2 inkuberats utan antigen (dvs enbart buffert B ).

Humant (X-l-fetoprotein ( Dakopatts X900 standard, lot 014 ) bestämdes med samma procedur och buffertar som användes i föregående exempel med skillnaden att silikapartiklar med koimmobiliserat peroxidas och anti-off -1-fetoprotein immunoglobulin preparerade enligt ovan användes.

I steg 1 inkuberades med anti-oz-f -fetoprotein immunoglobulin (kanin, Dakopatts, A008, lot 085 ) och i steg 2 sattes 0<-1 -fetoprotein till brunnarna i en spädningsserie fràn 1 mikrogram till 0.1 ng. l steg 3 användes lösligt konjugat av peroxidas och antihumant 06-1 -fetoprotein ( kanin, Dakopatts, P128, lot 046 ) som jämförelse med silikakonjugatet.

Brunnar som i steg 2 inkuberats med 0.1 ng antigen och i steg 3 inkuberats med enzym-antikropp-partiklarna gav mer än dubbelt så hög absorbans än bakgrundsabsorbansen erhällen i brunnar där inget antigen inkuberades i steg 2. Lösligt enzym-antikropp konjugat gav ingen absorbansskillnad för 0.1 ng antigen. Både lösligt och partikelbundet konjugat gav ca 10 ggr skillnad i absorbans för brunnar som i steg 2 inkuberats med 1 mikrogram antigen jämfört med blankbrunnarna.

Claims (8)

f] 4:» m m m i-à H PATENTKRAV

1. Reagens, kännetecknat av att minst ett enzym och minst en annan substans är kovalent eller nonkovalent bundna till en partikel som har låg eller ingen löslighet i vatten vid de betingelser som råder vid sättet enligt uppfinningen och som är mindre eller lika med 500 Å i diameter.

2. Reagens enligt patentkrav 1, kännetecknat av att partikeln består av ett naturligt, halvsyntetiskt eller syntetiskt material, som exempelvis en polysackarid, glas, silikat, borsilikat, aluminat, guld, zeolit, tvärbunden eller ytmodifierad organisk eller oorganisk polymer, plast, kopolymer, eller en artificiell cell.

3. Reagens enligt patentkrav 1 och 2, kännetecknat av att partikelns yta har hydrofila eller hydrofoba grupper eller har reaktiva grupper, som någon av diazo, epoxi, aldehyd, cyanatester, tosyl, tresyl, annan ester, acylacid, aromatisk karbamat, triazin, succinimid, karbodiimid, imidater, disulfid, reaktiv halogen, divinylsulfon, FMP, eller en fotoaktiv substans, etc, för kovalent koppling av enzym och substans till partikeln.

4. Reagens enligt patentkrav 1-3, kännetecknat av att enzym och substans binds samtidigt till eller efter varandra till partikeln eller att ett konjugat mellan enzym och substans först bildas och som därefter kopplas till partikeln eller att enzym och substans tvärbinds efter adsorption till partikelytan med tvärbindare som exempelvis glutaraldehyd.

5. Reagens enligt patentkrav 1-4, kännetecknat av att enzymet är något av exempelvis alkalint fosfatas, ureas, ß- galaktosidas, lysozym, proteas, annat hydrolas, glukosoxidas, peroxidas, glukos-6-fosfatdehydrogenas, annat oxidoreduktas. 466 521 ä

6. Reagens enligt patentkrav 1-5, kännetecknat av substansen är exempelvis en antikropp, ett lektin, avidin, annat protein, polysackarid, kolhydrat eller derivat därav, glykolipid, neoglykokonjugat, koenzym eller derivat därav, steroidderivat, prostaglandinderivat, hormon eller derivat därav, läkemedel eller en metabolit eller en analog därav, nukleotid, nukleinsyra eller ett derivat därav, annan cell eller viruskomponent.

7. Reagens enligt patentkrav 1-6, kännetecknat av att enzym och substans kovalent bundits mha reaktiva grupper som tresylgrupper till en silika partikel vars yta modifierats först med öeglycidoxypropyltrimetoxysilan, hydrolyserats vid svagt sur pH och därefter aktiverats med exempelvis tresyl klorid.

8. Sätt eller användning av ett reagens enligt patentkrav 1, för bestämning av en cell, ett virus eller en komponent därav eller en annan typ av komponent i ett prov med ELISA-teknik och liknande enzymatiska tekniker, för immunohistokemiska studier, för immunoblotting, för mikroskopiska studier, etc, i vilka tekniker eller studier reagenset enligt patentkrav 1 används på samma sätt och i stället för tidigare beskrivna enzymkonjugat, dvs för specifik inbindning och för katalytisk omvandling av enzymsubstrat till detekterbar produkt eller till produkt som kan detekteras efter omvandling mha exempelvis en enzymkaskad.