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Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur
Herstellung eines umgestalteten Kohlenhydrats oder Glykokonjugates
durch Verwenden der Transglycosylierungsaktivität einer
Glycosidase.
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Zuckerketten von Glycoproteinen spielen in verschiedenen
biologischen Phänomenen, wie dem Immunsystem mit zweitem Boten,
eine wichtige Rolle. Daher ist eine Modifikation oder
Ersetzung von Zuckerketten in Glycoproteinen für die
pharmakologische Industrie nützlich.
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Diese Technik kann daher den neuen Typ von Medikamenten
erzeugen, der den Zielzellen zugeführt werden kann oder der
länger die Wirksamkeit des Medikaments aufweisen kann. Zu
diesem Zweck können zwei Vorgehensweisen verwendet werden:
eine chemische und eine enzymatische. Da chemische Reaktionen
üblicherweise organische Medien oder andere strenge
Bedingungen erfordern, kann diese Vorgehensweise eine Denaturierung
von Glycoproteinen verursachen. Andererseits wird die
enzymatische Vorgehensweise üblicherweise in wässrigen Lösungen,
wie einer Pufferlösung etc., ausgeführt und schädigt somit
die Proteine nicht. Ein weiterer Vorteil der enzymatischen
Vorgehensweise besteht darin, dass sie spezifischer reagiert.
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Die Techniken zur enzymatischen Umgestaltung von
Zuckerketten, die zur Zeit allgemein eingesetzt werden, umfassen eine
Exoglycosidase oder eine Glycosyltransferase und eine
sequentielle Umwandlung beginnend vom nicht-reduzierenden Ende
einer Zuckerkette, wie von D. H. Joziasse et al., European
Journal of Biochemistry, 191, 75 bis 83 (1990) berichtet
wird.
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Im Hinblick auf eine Transglycosylierung durch eine
Endoglycosidase haben R. B. Trimble et al. [Journal of Biological
Chemistry, 261, 12000 bis 12005 (1986)] über eine berichtet,
die sich auf Endo-β-N-acetylglucosaminidase F (Endo-F) von
Flavobacterium meningosepticum bezieht, und R. M. Bardales et
al. [Journal of Biological Chemistry, 264, 19893 bis 19897
(1989)] haben über eine weitere berichtet, die sich auf Endo-
α--N-acetylgalactosaminidase von Diplococcus pneumoniae
bezieht. Glycerol dient als Akzeptor in dem ersteren Bericht,
während Glycerol, Tris, p-Nitrophenol, Serin und Threonin als
Akzeptor in dem letzteren Bericht dienen.
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Berichte über einen Umgestaltungsmechanismus, bei dem ein
Kohlenhydrat oder ein Glycokonjugat direkt als Akzeptor
dient, umfassen einen, der sich auf
Endo-β-N-acetylglucosaminidase A (Endo-A) von Arthrobacter protophormiae bezieht,
offenbart durch die japanische Offenlegungsschrift Nr.
64594/1993, sowie einen, der sich auf
Endo-β-N-acetylglucosaminidase M (Endo-M) von Mucor hiemalis bezieht,
beschrieben in Seikagaku, 65, 1014 (1993).
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Wenn ein Glycokonjugat mit einer umgestalteten Zuckerkette
hinsichtlich Stabilität und biologischen Aktivitäten im
Vergleich zu dem entsprechenden natürlichen Glycokonjugat
verbessert wird, ist es sehr gut auf Arzneimittel anwendbar, wie
vorstehend beschrieben.
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Es ist bei den herkömmlichen Umgestaltungstechniken bei
Anwesenheit von Exoglycosidasen oder Glycosyltransferasen jedoch
notwendig, für jeden Zuckerrest eine enzymatische Reaktion
durchzuführen, was eine Anzahl von Reaktionsschritten sowie
äußerst komplizierte Prozeduren erfordert.
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Außerdem dient weder ein Kohlenhydrat noch ein Glycokonjugat
in der vorstehend erwähnten Transglycosylierung mit der
Verwendung einer Endo-F- oder Endo-α-N-acetylgalactosaminidase
von Diplococcus pneumoniae als Akzeptor.
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Andererseits ist die Transglycosylierung in Anwesenheit von
Endo-A oder Endo-M eine Umgestaltungsreaktion, bei der ein
Kohlenhydrat oder ein Glycokonjugat direkt als ein Akzeptor
dient. Somit ist es das bequemste und praktisch nützlichste
Verfahren zur Umgestaltung von Zuckerketten, das gegenwärtig
bekannt ist.
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Endo-A, das zur Umgestaltung einer Zuckerkette verwendet
wird, wird von Arthrobacter protophormiae AKU 0647 erzeugt.
[Diese Art wurde am 14. August 1991 am National Institute of
Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science
and Technology (1-3, Higashi 1 chome Tsukuba-shi Ibaraki-ken
335, JAPAN) gemäß dem Budapester Vertrag unter der
Zugriffsnummer FERM BP-4948 hinterlegt]. Dieses Enzym schließt eine
Zuckerkette vom Oligomannose-Typ an der Stelle auf, die in
der folgenden chemischen Formel 1 durch einen Pfeil
gekennzeichnet ist.
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Dieses Endo-A nimmt an einer Transferreaktion teil, die durch
die folgende chemische Formel 2 repräsentiert wird.
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(chemische Formel 2]
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X-GlcNAc-Y + Z → X-GlcNAc-Z + Y
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In dieser Transferreaktion repräsentiert X ein Kohlenhydrat.
Bei Verwendung als Enzym wirkt Endo-A gut auf X, das ein
Homooligomer, das zum Beispiel aus Mannose (Man) oder Glucose
(Glc) besteht, oder ein Heterooligomer ist, das aus zwei oder
mehr Komponenten besteht, die aus zum Beispiel Man, Glc und
N-Acetylglucosamin (GlcNAc) ausgewählt sind. Bei Verwendung
als Enzym wirkt Endo-M gut auf X, das ein Homooligomer, das
zum Beispiel aus Man oder Glc besteht, oder ein
Heterooligomer ist, das aus zwei oder mehr Komponenten besteht, die zum
Beispiel aus Man, Glc, GlcNAc und Galaktose (Gal) ausgewählt
sind.
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Y repräsentiert ein Kohlenhydrat oder ein Glycokonjugat.
Endo-A oder Endo-M der vorliegenden Erfindung wirken gut auf Y,
das ein Monosaccharid, wie Glc, Man oder GlcNAc, ein
Homooligomer, das aus zwei oder mehr Molekülen eines Monosaccharids
besteht, die daraus ausgewählt werden, oder ein
Heterooligomer ist, das aus zwei oder mehr Komponenten besteht, die
daraus ausgewählt sind. Außerdem kann ein Glycokonjugat, das Asn
oder ein über Asn an die Endstelle daran gebundenes
Polypeptid aufweist, oder ein Glycokonjugat als Y verwendet werden,
das Thr oder Ser oder ein über Thr oder Ser an das Ende
gebundenes Polypeptid aufweist.
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Betrachtet man Z, das in der Transferreaktion in Anwesenheit
von Endo-A oder Endo-M als Akzeptor dient, läuft die Reaktion
in Anwesenheit eines Kohlenhydrat- oder eines Glycokonjugat-
Akzeptors gut weiter, der ein Saccharid mit freier Hydroxy-
Gruppe (OH) an der C-4-Position an dem nicht-reduzierenden
Ende aufweist.
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Unter den Akzeptor-Sacchariden mit freiem OH an der C-4-
Position umfassen besonders bevorzugte jene, die in der
Zusammensetzung an der C-4- und der C-5-Position die gleichen
sind wie Glucose. Derartige Akzeptor-Saccharide umfassen Glc,
Glucosamin, GlcNAc, Man, Mannosamin, N-Acetylmannosamin und
Allose sowie Kohlenhydrate oder Glycokonjugate mit diesen
Sacchariden an dem nicht-reduzierenden Ende. Außerdem wirkt
Endo-A oder Endo-M gut auf α- und β-Methylglycoside und α-
und β-p-Nitrophenylglycoside von Kohlenhydraten, Glucose-1-
phosphate sowie Mannose-1-phosphate.
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Die Zuckerketten-Transferreaktion mit Endo-A oder Endo-M wird
üblicherweise durch Hinzufügen des Kohlenhydrates oder
Glycokonjugates, das als Akzeptor verwendet wird, zu einer
Startlösung gestartet, die den Kohlenhydrat- oder Glycokonjugat-
Startdonator, die Endoglycosidase und Puffersalze enthält.
Diese Transferreaktion läuft gleichmäßig weiter, wenn die
Suartlösung zum Beispiel durch Zugeben eines organischen
Mediums oder eines anorganischen Salzes zu dieser hydrophob
gemacht wird. Wenn zum Beispiel Methanol als organisches Medium
verwendet wird, kann die Reaktion für ein Kohlenhydrat oder
ein Glycokonjugat verwendet werden, die in Wasser schlecht·
löslich sind. Wenn Endo-A verwendet wird, läuft die Reaktion
in Anwesenheit von 40% Methanol gut weiter, und die relative
Aktivität in einer Lösung mit 50% Methanol beträgt etwa 80%
im Vergleich zu jener in Abwesenheit von Methanol. Alternativ
können DMSO (Dimethylsulfoxid), DMF (N,N-Dimethylformamid)
etc. verwendet werden.
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Wie vorstehend beschrieben ist die enzymatische Umgestaltung
einer Zuckerkette äußerst nützlich, da sie unter milden
Reaktionsbedingungen durchgeführt werden kann und die
Spezifizität eines Enzyms darin eingesetzt werden kann.
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Cn einer Umgestaltungsreaktion einer Zuckerkette in
Anwesenheit einer Exoglycosidase oder Endoglycosidase wird die so
gebildete, umgestaltete Zuckerkette jedoch durch Glycosidase
hydrolysiert, und somit werden hydrolytische Produkte
erzeugt, die für den ursprünglichen Zweck unerwünscht sind.
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Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur
Herstellung eines Kohlenhydrats oder eines Glycokonjugates ohne
Bildung jeglichen hydrolytischen Produkts der umgestalteten
Zuckerkette bereit.
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Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur
Herstellung eines Kohlenhydrats oder eines Glycokonjugates durch
eine Transglycosylierungsreaktion in Anwesenheit einer
Glycosidase bereit, gekennzeichnet durch die Durchführung der
Transglycosylierungsreaktion in einem wässrigen Medium, das ein
wasserlösliches Keton und/oder Dioxan enthält.
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Die vorliegenden Erfinder haben festgestellt, dass wenn eine
Reaktion zur Transglycosylierung eines Kohlenhydrates oder
eines Glycokonjugates in Anwesenheit einer Glycosidase in
Anwesenheit eines wasserlöslichen organischen Mediums
durchgeführt wird, diese Reaktion effizient weiterläuft und die
Hydrolyse des transglycosylierten Produkts durch die
Glycosidase unterdrückt wird und somit das transglycosylierte
Zielprodukt mit einer hohen Ausbeute hergestellt wird. Die
vorliegende Erfindung wurde basierend auf dieser Feststellung
durchgeführt.
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Beispiele für die in der vorliegenden Erfindung zu
verwendendc Glycosidase umfassen die Exoglycosidase, die in European
Journal of Biochemistry beschrieben ist, wie vorstehend
zitiert, während Beispiele für die hierin zu verwendende
Endoglycosidase das vorstehend erwähnte Endo-F, die
Endo-α-Nacetylgalactosaminidase von Diplococcus pneumoniae, Endo-A
und Endo-M sind.
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In Anwesenheit einer Glycosidase, die aus den vorstehend
erwähnten ausgewählt wird, wird in der vorliegenden Erfindung
eine Transferreaktion durchgeführt, die durch die folgende
chemische Formel 3 repräsentiert ist:
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[chemische Formel 3]
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A-B + C -4 A-C + B
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(wobei A ein Kohlenhydrat repräsentiert, B ein Kohlenhydrat
oder ein Glycokonjugat repräsentiert und C ein Kohlenhydrat
oder ein Glycokonjugat repräsentiert). Das Verfahren der
vorliegenden Erfindung wird unter derartigen Bedingungen
durchgeführt, dass die Hydrolyse des Produktes A-C in der
chemischen Formel 3 unterdrückt wird.
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Diese Bedingungen können erfüllt werden, indem die
Transglycosylierungsreaktion, die durch die vorstehende chemische
Formel 3 repräsentiert ist, in Anwesenheit eines
wasserlöslichen organischen Mediums durchgeführt wird.
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Ein durch die vorstehende chemische Formel 3 als A
repräsentiertes Kohlenhydrat ist zum Beispiel ein Monosaccharid, ein
Oligomer, das aus Disaccharid oder mehr besteht, oder
Saccharide mit einem endständigen GlcNAc. Bei Verwendung als Enzym
wirkt Endo-A gut auf A, das ein Homooligomer, das zum
Beis~iel aus Man oder Glc besteht, oder ein Heterooligomer ist,
das aus zwei oder mehr Komponenten besteht, die zum Beispiel
aus Man, Glc und GlcNAc mit einem endständigen GlcNAc
ausgewählt werden. Bei Verwendung als Enzym wirkt Endo-M gut auf
A,, das ein Homooligomer, das zum Beispiel aus Man oder Glc
besteht, oder ein Heterooligomer ist, das aus zwei oder mehr
Komponenten besteht, die zum Beispiel aus Man, Glc und GlcNAc
und Gal mit einem endständigen GlcNAc ausgewählt werden.
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Ein Kohlenhydrat oder ein Glycokonjugat, die durch die
vorstehende chemische Formel 3 als B oder C repräsentiert sind,
sind zum Beispiel ein Monosaccharid oder ein Oligomer, das
aus Disaccharid oder mehr besteht. Außerdem kann ein
Glycokonjugat mit einer endständigen Aminosäure oder einem
endständigen, über eine Aminosäure gebundenen Polypeptid oder
ein Glycokonjugat mit einer Aminosäure oder einem über eine
Aminosäure gebundenen Polypeptid verwendet werden. Endo-A
oder Endo-M der vorliegenden Erfindung wirkt gut auf B oder
C, das ein Monosaccharid, wie Glc, Man, GlcNAc, Gal, Fucose
(Fuc), Fructose (Fru), Xylose (Xyl), ein
p-Nitrophenylglycosid-Derivat und ein Methylglycosid-Derivat, ein Homooligomer,
das aus zwei oder mehr Molekülen eines Monosaccharides
besteht, das daraus ausgewählt wird, oder ein Heterooligomer
ist, das aus zwei oder mehr Komponenten besteht, die daraus
ausgewählt sind. Außerdem kann ein Glycokonjugat mit
endständigem Asn oder einem endständigen, über Asn gebundenen
Polypeptid oder ein Glycokonjugat mit endständigem Thr oder Ser
oder einem endständigen, über Thr oder Ser gebundenen
Polypeptid verwendet werden.
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Das zu verwendende wasserlösliche organische Medium ist ein
wasserlösliches Keton und/oder Dioxan. Die
Transglycosylierungsreaktion wird in einem wässrigen Medium durchgeführt,
das ein derartiges Medium (a) enthält.
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Beispiele für die hierin verwendbaren wasserlöslichen Ketone
umfassen Aceton, Methylethylketon und Diethylketon.
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Der Gehalt an wasserlöslichem Keton und/oder Dioxan in dem
wässrigen Medium, in dem die Transglycosylierungsreaktion
durchzuführen ist, wird auf einen derartigen Pegel reguliert,
dass die Hydrolyse des transglycosylierten Produkts durch
eine Glycosidase unterdrückt werden kann und das umgestaltete
Produkt effizient erhalten werden kann. Zum Beispiel kann
Aceton hinzugefügt und mit 50% (v/v) oder weniger verwendet
werden, indem die Stabilität des Enzyms in dem wässrigen Medium,
das Aceton enthält, und die Effizienz der
Transglycosylierungsreaktion berücksichtigt werden. Aus dem gleichen
Grund kann Dioxan hinzugefügt und mit 50% (v/v) oder weniger
verwendet werden.
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Die Transferreaktion der vorliegenden Erfindung wird
üblicherweise durch Hinzufügen eines Kohlenhydrats oder eines
Glycokonjugates, das als Akzeptor dient, zu einer Startlösung
ausgeführt, die ein Start-Kohlenhydrat oder -Glycokonjugat,
eine Glycosidase und einen Puffer enthält. Das Startmaterial
oder der Akzeptor können in einer Menge bis zur Sättigung
ohne spezielle Beschränkung verwendet werden. Es ist bevorzugt,
dass der Akzeptor im Überschuss vorliegt, und daher wird der
Ahzeptor üblicherweise in einer Konzentration Von 200 mM oder
mehr verwendet. In der vorliegenden Erfindung läuft die
Reaktion jedoch selbst bei einer Akzeptorkonzentration von etwa
10 mM weiter. Daher wird in einer Transglycosylierungsreaktion
in Anwesenheit eines Akzeptors, der eine geringe Löslichkeit
aufweist oder nur in einer begrenzten Menge verwendet werden
kann, eine bemerkenswerte Leistungsfähigkeit bereitgestellt.
Die Menge der in der vorliegenden Erfindung zu verwendenden
Glycosidase ist nicht speziell beschränkt, sondern wird über
einen breiten Bereich geeignet ausgewählt. Üblicherweise kann
des 0,1 mU oder mehr sein, vorzugsweise zwischen 3 mU und lau
pro ml der Startlösung. Ein Puffer, der in der vorliegenden
Erfindung geeignet verwendet wird, ist einer mit einem pH-
Wert von etwa 5 bis 11. Die Reaktion wird üblicherweise in
einem Acetatpuffer mit einem pH-Wert von etwa 6 durchgeführt.
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Nunmehr wird die vorliegende Erfindung detailliert unter
Bezugnahme auf ein Beispiel dargestellt, bei dem Endo-A als
Glycosidase verwendet wurde, Man&sub9;-GlcNAc-GlcNAc-Asn
(hergestellt von Biocarb Chemicals: im Folgenden als M&sub9;GN&sub2;Asn
bezeichnet) und Man&sub6;-GlcNAc-GlcNAc-Asn (hergestellt von Biocarb
Chemicals: im Folgenden als M&sub6;GN&sub2;Asn bezeichnet) als Start-
Glycokonjugat verwendet wurden und GlcNAc (hergestellt von
Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) als Akzeptor verwendet
wurde.
[Tabelle 1] Tabelle 1
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Die Effekte verschiedener organischer Medien auf die
Transglycosylierungsreaktion in Anwesenheit von Endo-A wurden
durch Verwenden verschiedener organischer Medien unter den
Reaktionsbedingungen untersucht, wie sie in Tabelle 1
spezifiziert sind. Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse. Wie Tabelle 2
zeigt, wurde das Substrat durch Endo-A in Anwesenheit von
Aceton in Man&sub9;-GlcNAc (im Folgenden einfach als M&sub9; GN
bezeichnet) und GlcNAc-Asn (im Folgenden einfach als Asn-GN
bezeichnet) gespalten. Das M&sub9; GN wurde in GlcNAc des Akzeptors
transferiert, und somit wurde eine umgestaltete Zuckerkette Man9-
GlcNAc-GlcNAc (im Folgenden einfach als M&sub9;GN&sub2; bezeichnet) mit
einer Ausbeute von 100% gebildet. Demgemäß ist Aceton als
organisches Medium für die Transglycosylierungsreaktion
gegenüber bekannten, wie DMF und DMSO, überlegen. In Tabelle 2
repräsentiert THF Tetrahydrofuran.
Tabelle 2
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Als nächstes zeigt Fig. 1 die Stabilität von Endo-A in
wässrigen Medien, die Aceton enthalten. Fig. 1 zeigt speziell die
Ergebnisse, die durch Vorinkubieren von 3 mU Endo-A bei 37ºC
während einer vorgegebenen Zeitspanne in 20 ul eines 25 mM
Acetatpuffers (pH-Wert 6,0), der Aceton mit einer beliebigen
Konzentration enthält, Hinzufügen von 1 ul der vorinkubierten
Lösung zu 20 ul einer 25 mM Acetatpufferlösung, die 3 nmol
M&sub9;GN&sub2;Asn enthält, Durchführen der Reaktion bei 37ºC während
10 Minuten und anschließendes Bestimmen der Aktivität von
Endo-A erzielt wurden. Die Ordinate bezieht sich auf die
relative Aktivität (%) jedes behandelten Enzyms, die bestimmt
wird, indem die Aktivität des nicht-reagierten Endo-A als
100% angenommen wird, während sich die Abszisse auf die
Vorinkubationszeit (Minuten) bezieht. Wie Fig. 1 zeigt, ist
Endo-A in einem wässrigen Medium; das 30% Aceton enthält,
äußerst stabil.
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Üblicherweise ist es bevorzugt, dass ein Akzeptor in einer
Reaktion zur Umgestaltung einer Zuckerkette im Überschuss
vorliegt. Als nächstes zeigt Fig. 2 eine Beziehung zwischen
der Transglycosylierungsreaktion und der
Akzeptorkonzentratian in der vorliegenden Erfindung. Fig. 2 zeigt speziell die
Ergebnisse, die erhalten werden, indem die Reaktion unter den
Bedingungen gemäß jenen in Tabelle 1 spezifizierten mit der
Verwendung von GlcNAc in verschiedenen Konzentrationen in
Anwesenheit von 30% Aceton durchgeführt wird und die so
erzeugten Mengen von M&sub9;GN&sub2; und M&sub9; GN durch das System mit
Hochleisuungs-Anionenaustauschchromatographie und gepulstem
Amperemeter-Detektor (HPAEC/PAD) (hergestellt von Dionex Corp.)
bestimmt werden. Die Ordinate bezieht sich auf die
PAD-Antwort, während sich die Abszisse auf die GlcNAc-Konzentration
(M) bezieht. Wie Fig. 2 zeigt, wurde M&sub9;GN&sub2; selbst mit 25mM
GlcNAc in Anwesenheit von 30% Aceton ausreichend gebildet.
Bei 200 mN oder mehr GlcNAc wurde des weiteren die Hydrolyse
der umgestalteten Zuckerkette ausreichend unterdrückt. Bei
500 mN GlcNAc wurde die Bildung von M&sub9; GN (d. h. des
hydrolytischen Produkts) vollständig unterdrückt.
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Fig. 3 zeigt die Bildung der umgestalteten Zuckerkette durch
Endo-A in wässrigen Medien, die Aceton enthalten, und einem
wässrigen Medium, das davon frei ist. Fig. 3 zeigt speziell
die Ergebnisse, die erhalten werden, indem die Reaktion unter
den Bedingungen gemäß jenen in Tabelle 1 spezifizierten in
Anwesenheit von 0%, 30%, 40% und 50% Aceton durchgeführt wird
und M&sub9;GN&sub2;Asn, M&sub9;GN&sub2;, M&sub9; GN und Asn-Gn zeitabhängig bestimmt
werden. Die Ordinate bezieht sich auf die Menge (%) jeder
Substanz, während sich die Abszisse auf die Reaktionszeit
(Minuten) bezieht. Wie Fig. 3 zeigt, wird bei Anwesenheit von
30% bis 50% Aceton kein M&sub9; GN erzeugt. Die Ausbeute an M&sub9;GN&sub2; in
Abwesenheit von Aceton betrug etwa 50%. Im Gegensatz dazu
betrug die Ausbeute von M&sub9;GN&sub2; in Anwesenheit von 30% Aceton
100%.
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Um Akzeptoren in Reaktionsgemischen, die Aceton enthielten,
zu erörtern, wurde ermöglicht, dass 20 ul einer 25 mN
Acetatpufferlösung (pH-Wert 6,0), die je 3 nmol M&sub9;GN&sub2;Asn, 4 umol
eines Akzeptors und 1 mU Endo-A enthielt, bei 37ºC während 15
Minuten (in den Fällen von L-Fuc und L-Gal) oder 10 Minuten
(in den Fällen von anderen Akzeptoren) in Anwesenheit von 35%
(in den Fällen von L-Fuc und L-Gal) oder 30% (in den Fällen
von anderen Akzeptoren) Aceton reagierten, und es wurden die
Ausbeuten (%) von so gebildeten umgestalteten Zuckerketten
bestimmt. Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse. Wie Tabelle 3
zeigt, erfuhren Man, L-Fuc, L-Gal, Fru, Xyl, 2-Deoxy-Glc
(hergestellt von SIGMA), 6-Deoxy-Glc (hergestellt von SIGMA),
Methyl-α-GlcNAc (hergestellt von SIGMA) sowie 3-0-Me-Glc
(hergestellt von SIGMA) eine Transglycosylierung.
[Tabelle 3] Tabelle 3
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Als nächstes zeigt Fig. 4 die Erzeugung der umgestalteten
Zuckerkette durch Endo-A in wässrigen Medien, die Dioxan
enthalten, und einem wässrigen Medium, das davon frei ist. Fig.
4 zeigt speziell die Ergebnisse, die durch Überwachen der
Transglycosylierungsreaktion in Anwesenheit von 0%, 20% und
30% Dioxan zeitabhängig erhalten werden. Die Ordinate bezieht
sich auf die Ausbeute (%) der umgestalteten Zuckerkette,
während sich die Abszisse auf die Reaktionszeit (Minuten)
bezieht. Wie Fig. 4 zeigt, lief die
Transglycosylierungsreaktion effizient weiter, und die Hydrolyse der
transglycosylierten Zuckerkette wurde in Anwesenheit von 30% Dioxan
unterdrückt.
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Fig. 5 zeigt eine Beziehung zwischen der
Akzeptorkonzentration und der so gebildeten umgestalteten Zuckerkette. Die
Ordinate bezieht sich auf die Ausbeute (%) der
transglycosylierten Zuckerkette, während sich die Abszisse auf die
Akzeptorkonzentration (M) bezieht. Wie Fig. 5 zeigt, lief die
Transglycosylierungsreaktion selbst bei einer
Akzeptorkonzentration von 10 nM weiter, und die umgestaltete Zuckerkette wurde
mit einer Ausbeute von etwa 50% gebildet. Bei einer
Akzeptorkonzentration von 100 mN oder mehr belief sich des weiteren
die Ausbeute der umgestalteten Zuckerkette auf 100%, und die
Hydrolyse der umgestalteten Zuckerkette wurde vollständig
unterdrückt.
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Wie vorstehend beschrieben, kann die Umgestaltungs-Effizienz
in der Transferreaktion eines Kohlenhydrats mit einer
Glycosidase durch Hinzufügen eines spezifischen, wasserlöslichen
organischen Mediums, von Aceton oder Dioxan zu dem
Reaktionsgemisch signifikant erhöht werden.
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Jedes von dem vorstehend erwähnten Aceton und Dioxan kann
alleine verwendet werden. Alternativ kann eine Kombination von
Aceton mit Dioxan eingesetzt werden.
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In Anwesenheit von Aceton und/oder Dioxan wird die
Transglycosylierungsreaktion üblicherweise bei einer Temperatur von
Raumtemperatur bis etwa 60ºC, vorzugsweise von 30ºC bis 40ºC,
bei einem pH-Wert von etwa 5 bis etwa 11 durchgeführt. Die
Transferreaktion ist üblicherweise innerhalb von 5 Minuten
bis 5 Stunden beendet, vorzugsweise von 10 Minuten bis 60
Minuten, wenngleich die Reaktionszeit in Abhängigkeit von den
Reaktionsbedingungen variiert.
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Das so gebildete umgestaltete Kohlenhydrat oder Glycokonjugat
ist frei von jeglichen Nebenprodukten. Somit kann es ohne
weiteres gemäß allgemein bekannten Mitteln von dem
Reaktionsgemisch getrennt und gereinigt werden. Zum Beispiel wird das
umgestaltete Kohlenhydrat oder Glycokonjugat durch
Gelfiltrationssäulenchromatographie oder
Ionenaustauschharzsäulenchromatographie gefolgt von Konzentrierung, Entsalzung,
Gefriertrocknung etc. von dem Reaktionsgemisch getrennt.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung läuft die
Transglycosylierungsreaktion selbst bei einer geringen Akzeptorkonzentration
weiter, und das umgestaltete Produkt kann selbst durch einen
Akzeptor, der eine geringe Löslichkeit aufweist, oder einen
Akzeptor mit beschränkter Menge effizient erhalten werden.
Des weiteren machen es Aceton und Dioxan möglich, die
Transglycosylierung im Vergleich zu DMSO und DMF mit einer hohen
Reaktionsgeschwindigkeit vor sich gehen zu lassen. Außerdem
weisen sie niedrige Siedepunkte auf und können somit leicht
aus dem Reaktionsgemisch herausdestilliert werden. Daher sind
sie als Beschleuniger für die Transglycosylierungsreaktion
äußerst nützlich.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
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[Fig. 1]
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Eine Figur, welche die Stabilität des Enzyms in Anwesenheit
von Aceton in verschiedenen Konzentrationen zeigt.
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[Fig. 2]
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Eine Figur, welche die Beziehung zwischen der
Donatorkonzentration und der Ausbeute des Reaktionsproduktes zeigt.
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[Fig. 3]
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Eine Figur, welche die Beziehung zwischen der Ausbeute des
Reaktionsprodukts und der Zeit in Anwesenheit von Aceton in
verschiedenen Konzentrationen zeigt.
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[Fig. 4]
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Eine Figur, welche die Beziehung zwischen der Ausbeute eines
umgestalteten Produkts und der Zeit in Anwesenheit von Dioxan
in verschiedenen Konzentrationen zeigt.
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[Fig. 5]
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Eine Figur, welche die Beziehung zwischen der
Donatorkonzentration und der Ausbeute eines umgestalteten Produktes zeigt.
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[Fig. 6]
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Eine Figur, welche die Beziehungen zwischen der
Acetonkonzentration und den Mengen des Donators, des hydrolytischen
Produkts und des umgestalteten Produkts zeigt.
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[Fig. 7]
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Eine Figur, welche die Ergebnisse einer HPLC-Analyse
hinsichtlich des Glycopeptids vor und nach einem Aufschluss mit
Endo-M zeigt.
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[Fig. 8]
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Eine Figur, welche die Ergebnisse einer Analyse hinsichtlich
der Aminosäurenzusammensetzung des GlcNAc-Pentapeptides
zeigt.
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[Fig. 9]
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Eine Figur, welche die Ergebnisse der HPLC-Analyse
hinsichtlich des Glycopeptides vor und nach der
Transglycosylierungsreaktion zeigt.
Beispiele
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Die folgenden Beispiele illustrieren die vorliegende
Erfindung weiter im Detail. Sie sind jedoch nicht dazu gedacht,
den Umfang der vorliegenden Erfindung zu beschränken.
Beispiel 1: Untersuchung eines hinzuzufügenden organischen
Mediums bei der Zuckerketten-Transferreaktion
mit Endo-A
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Zu 25 mN Acetatpuffer (pH-Wert 6,0) wurden organische Medien
(IMF, DMSO, Aceton, CH&sub3;CN und THF), M&sub9;GN&sub2;Asn und GlcNAc in
einer derartigen Weise hinzugefügt, dass sich jeweilige
Konzentrationen von 25%, 3 nmol und 500 mM ergaben, wodurch
Reaktionsgemische hergestellt wurden. Zu jedem Reaktionsgemisch
wurden 3 mU Endo-A (Gesamtvolumen: 20u1) hinzugefügt und bei
37ºC während 10 Minuten inkubiert. Dann wurde das
Reaktionsgemisch bis zur Trockenheit im Vakuum eingedampft. Dieses
getrocknete Produkt wurde in Wasser gelöst und durch ein
HPAEC/PAD-System analysiert. Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse.
Wie Tabelle 2 zeigt, belief sich die Ausbeute an M&sub9;GN&sub2; in dem
Aceton enthaltenden Reaktionsgemisch auf 100%.
Beispiel 2: Prüfung der Stabilität von Endo-A in
Reaktionsgemischen, die Aceton in verschiedenen
Konzentrationen enthalten
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Zu einem 25 mM Acetatpuffer (pH-Wert 6,0) wurde Aceton
hinzugefügt, um Konzentrationen von 1%, 30%, 40%, 45% und 50% zu
ergeben, womit Reaktionsgemische erzeugt wurden. Zu diesen
Reaktionsgemischen wurden 3 mU Endo-A (Gesamtvolumen: jeweils
20 ul) hinzugefügt und bei 37ºC während 0 Minuten, 5 Minuten,
10 Minuten, 20 Minuten und 30 Minuten vorinkubiert. 2g1 jedes
Reaktionsgemisches wurden als Probe genommen und zu einem
25 mM Acetatpuffer (pH-Wert 6,0) hinzugefügt, der 3 nmol
M&sub9;GN&sub2;Asn (das separat hergestellt wurde) enthielt, und
während 10 Minuten bei 37ºC vorinkubiert. Nach Erwärmung auf
100ºC während 3 Minuten wurde ein Viertel des
Reaktionsgemisches durch das HPAEC/PAD-System analysiert, um dadurch die
verbliebene Enzymaktivität zu untersuchen. Fig. 1 zeigt die
Beziehung zwischen der Vorinkubierungszeit (Minuten;
Abszisse) in dem Aceton enthaltenden Reaktionsgemisch und die
relative Aktivität (%; Ordinate). Wie Fig. 1 zeigt, wurde das
Enzym in Anwesenheit von 30% Aceton kaum inaktiviert.
Beispiel 3: Untersuchung der Akzeptorkonzentration in der
Zuckerkettentransferreaktion mit Endo-A
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Die Zuckertransferreaktion mit 3 mU Endo-A wurde unter
Verwendung von 3 nmol M&sub9;GN&sub2;Asn als dem Donator in einem 25 mM
Acetatpuffer (pH-Wert 6,0), der 30% Aceton enthielt, bei 37ºC
während 10 Minuten durchgeführt, während die Konzentration (M)
des als Akzeptor verwendeten GlcNAc variiert wurde (25 mW
50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mN und 500 mM). Die Reaktion wurde
durch Erwärmen auf 100ºC während 3 Minuten beendet, und M&sub9; GN
(d. h. das hydrolytische Produkt) und M&sub9;GN&sub2; (d. h. das
umgestaltete Produkt) wurden durch das HPAEC/PAD-System bestimmt.
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Fig. 2 zeigt die Ergebnisse. In Fig. 2 bezieht sich die Ordinette
auf die PAD-Antwort, während sich die Abszisse auf die
Konzentration (M) von GlcNAc bezieht. Fig. 2 zeigt, dass die
Transferreaktion bei einer GlcNAc-Konzentration von 200 mM
oder mehr nahezu vollständig gegenüber der Hydrolyse
vorherrscht.
-
Beispiel 4: Änderung des
Zuckerkettentransferreaktionsprodukts im Verlauf der Zeit
-
3 nmol M&sub9;GN&sub2;Asn, 50 mW GlcNAc und 3mU Endo-A wurden in 20 ul
eines 25 mW Acetatpuffers (pH-Wert 6,0) in Anwesenheit von 0%
bis 50% Aceton bei 37ºC während 2 Minuten, 4 Minuten, 8
Minuten, 15 Minuten und 30 Minuten inkubiert, danach wurde das
Reaktionsgemisch als Probe genommen und durch das HPAEC/PAD-
System analysiert. Fig. 3 zeigt die Ergebnisse. In Fig. 3
bezieht sich die Ordinate auf die Ausbeute (%) der
umgestalteten Zuckerkette, während sich die Abszisse auf die
Reaktionszeit (Minuten) bezieht. Wie Fig. 3 zeigt, nahm der
Zuckerkettendonator M&sub9;GN&sub2;Asn (*) ab, das umgestaltete Produkt M&sub9;GN&sub2; (0)
nahm jedoch im Verlauf der Zeit zu. In Anwesenheit von 30%
Aceton wurde das umgestaltete Produkt mit einer Ausbeute von
100% nach 30 Minuten erhalten.
Beispiel 5: Untersuchung der Zuckerkettentransferreaktion
mit verschiedenen Akzeptoren in Aceton
enthaltenden Reaktionsgemischen
-
20 ul einer 25 mW Acetatpufferlösung (pH-Wert 6,0), die jeweils
3 nmol M&sub9;GN&sub2;Asn als Donator enthielt, 4 umol eines Akzeptors,
1 mU Endo-A und 35% (in den Fällen von L-Fuc und L-Gal) oder
30% (in den Fällen von anderen Akzeptoren) Aceton wurden bei
37ºC während 15 Minuten (in den Fällen von L-Fuc und L-Gal)
oder 10 Minuten (in den Fällen von anderen Akzeptoren)
inkubiert. Nach Beendigung der Reaktion durch Erwärmen bei 100ºC
während 3 Minuten wurde jedes Reaktionsgemisch bis zur Trockenheit
im Vakuum eingedampft. Dieses getrocknete Produkt
wurde in Wasser einer Menge von k derjenigen des
Reaktionsgemischs gelöst und dann durch das HPAEC/PAD-System analysiert.
Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse. Wenn 2-Deoxy-Glc oder 3-O-Me-
Glc als Akzeptor verwendet wurden, wurde das Reaktionsgemisch
durch das Hochleistungsflüssigchromatogramm (HPLC) mit einer
graphitisierten Kohlenstoffsäule (hergestellt von Shandon
Scientific) analysiert. Tabelle 3 zeigt die Ausbeuten (%) von
umgestalteten Zuckerketten, die so unter Verwendung von
GicNAc, Man, L-Fuc, L-Gal, Fru, Xyl, 2-Deoxy-Glc, 3-Deoxy-
GÄc, 6-Deoxy-Glc, Methyl-α-GlcNAc und 3-O-Me-Glc als Akzeptor
gebildet wurden. Wie Tabelle 3 zeigt, erfuhren Man, 1-Fuc, L-
Gal, Fru, Xyl, 2-Deoxy-Glc, 6-Deoxy-Glc, Methyl-α-GlcNAc und
3--O-Me-Glc ebenfalls eine Transglycosylierung.
Beispiel 6: Untersuchung der Aceton-Konzentration in einer
Zuckerkettentransferreaktion mit Endo-A
-
2O ul einer 25 mM Acetatpufferlösung (pH-Wert 6,0), die 3nmol
MqGN&sub2;Asn als Donator enthielt, 4umo1 GlcNAc als Akzeptor, 1 mU
Endo-A sowie Aceton wurden bei 37ºC während 15 Minuten
inkubiert. Nach Beendigung der Reaktion durch Erwärmen bei 100ºC
während 3 Minuten wurde das Reaktionsgemisch bis zur
Trockenheit im Vakuum eingedampft. Dieses getrocknete Produkt wurde
in Wasser einer Menge von k derjenigen des Reaktionsgemischs
gelöst und dann durch das HPAEC/PAD-System analysiert. Fig. 6
zeigt die Ergebnisse. Fig. 6 zeigt speziell die Beziehungen
zwischen der Acetonkonzentration (%, Abszisse) und den Mengen
(%, Ordinate) des Donators (O), des hydrolytischen Produkts
( ) und von M&sub9;GN&sub2; (, d. h. des umgestalteten Produkts). Fig.
6 zeigt, dass die höchste Ausbeute des umgestalteten Produkts
bei 20% Aceton erzielt wurde.
Beispiel 7: Umgestaltung einer Glycopeptid-Zuckerkette
-
Ein Glycopeptid mit einer Zuckerkette mit biantennärem
Komplex wurde präpariert, indem Bovinfibrinogen mit einem
Gemisch aus Chymotrypsin und Trypsin aufgeschlossen wurde.
Dieses Glycopeptid wurde durch HPLC gereinigt, und sein
N-Terminus wurde mit einer Naphthylacetyl-Gruppe modifiziert.
-
Als nächstes wurde Endo-M von Muco hiemalis [diese Art wurde
am 18. Mai 1988 am National Institute of Bioscience and
Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology
(1-3, Higashi 1 chome Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305, JAPAN)
gemäß dem Budapester Vertrag unter der Zugriffsnummer FERM BP-
4991 hinterlegt] durch ein Verfahren gereinigt, das in
Agricultural and Biological Chemistry, 54, 97 bis 106 (1990)
beschrieben ist. Durch Verwendung des Enzyms wurde das
vorstehend erwähnte Glycopeptid weitgehend aufgeschlossen. 1,3 ml
einer 0,1 M Ammoniumacetatpufferlösung (pH-Wert 6,0), die
1,25 mmol des Glycopeptids enthielt, und 1,77 mU Endo-M wurden
über Nacht bei 37ºC inkubiert. Das Glycopeptid wurde durch
HPLC vor und nach dem Aufschluss mit Endo-M analysiert. Fig.
7 zeigt die Ergebnisse. Fig. 7 zeigt speziell das HPLC des
Glycopeptids vor dem Aufschluss mit Endo-M (oben) und jenes
des aufgeschlossenen Glycopeptids (unten), wobei sich die
Ordinate auf die Fluoreszenzintensität bezieht, während sich
die Abszisse auf die Retentionszeit (Minuten) bezieht. Das
HPTJC wurde durch eine Umkehrphasen (RP) -C&sub8;-Säule (4,6 mm x 250 mm)
mit einer 50 mM Ammoniumacetatlösung als Extraktionsmittel A
und einer 50% Acetonitril enthaltenden 50 mM
Ammoniumacetatlösung als Extraktionsmittel B durchgeführt. Die Extraktion
wurde unter Verwendung der Lösung B mit einem Verhältnis von
4,5% bei Raumtemperatur und mit einer Flussrate von /ml/min
durchgeführt. Das Glycopeptid wurde mit einem
Fluorometriedetektor mit einer Anregungswellenlänge von 320 nm und einer
Fluoreszenzwellenlänge von 380 nm detektiert. Fig. 7 zeigt,
dass das Glycopeptid nahezu vollständig aufgeschlossen wurde
und die Zuckerkette mit biantennärem Komplex daraus
eliminiert wurde. Dieses Glycopeptid (GlcNAc-Pentapeptid), von dem
die Zuckerkette eliminiert wurde, wurde durch HPLC gereinigt,
und die Aminosäurenzusammensetzung derselben wurde
analysiert. Fig. 8 zeigt die Ergebnisse. Fig. 8 zeigt speziell die
Ergebnisse der Analyse hinsichtlich der
Aminosäurenzusammenseazung des GlcNAc-Pentapeptids, wobei sich die Ordinate auf
die Ultraviolett-Absorption bei 254 nm bezieht, während sich
die Abszisse auf die Retentionszeit (Minuten) bezieht. Wie
Fig. 8 zeigt, weist das GlcNAc-Pentapeptid eine
Aminosäurenzusammensetzung von Asp : Glu : Val : Lys = 1 : 2 : 1 : 1
auf. Basierend auf der Aminosäurensequenz des Fibrinogens,
die bereits berichtet wurde, wurde festgestellt, dass dieses
Glycopeptid die folgende Aminosäurensequenz aufweist:
[Aminosäurensequenz 1]
-
Gln-Val-Glu-Asn(CHO)-Lys (SEQ ID NR: 1)
-
(wobei CHO einen Zuckerrest repräsentiert, der mit einer
Arnidgruppe in Asn kombiniert ist).
-
Als nächstes wurden lOpil einer 50 nmM
Ammoniumacetatpufferlösung (pH-Wert 6,0), die 14 nmol GlcNAc-Pentapeptid als
Akzeptor enthielt, 3 nmol M&sub9;GN&sub2;Asn als Donator, 3 mU Endo-A und 35%
Aceton, bei 37ºC während 15 Minuten inkubiert. Dann wurde das
Reaktionsgemisch unter den gleichen Bedingungen wie jenen,
die im Fall von Fig. 7 eingesetzt wurden, einer HPLC-Analyse
unterzogen. Fig. 9 zeigt die Ergebnisse. Fig. 9 zeigt
speziell das HPLC des Glycopeptids vor der Umgestaltung (oben) und
jenes des umgestalteten Glycopeptids (unten), wobei sich die
Ordinate auf die Fluoreszenzintensität bezieht, während sich
die Abszisse auf die Retentionszeit (Minuten) bezieht. Wie
Fig. 9 zeigt, kann ein Spitzenwert identifiziert werden, der
anscheinend dem umgestalteten Produkt zuzuordnen ist. Die
Größe des Spitzenwerts des Chromatogramms zeigt an, dass die
Ausbeute des umgestalteten Produkts, d. h. von
GlcNAc-Pentapeptid, etwa 5% beträgt.
Beispiel 8: Untersuchung einer Zuckerkettentransferreaktion
mit Endo-A in Reaktionsgemischen, die Dioxan in
verschiedenen Konzentrationen enthalten
-
Zu 25 mM Acetatpuffer (pH-Wert 6,0) wurden 4 mU Endo-A und
100 mM GlcNAc hinzugefügt und bei 37ºC während 10 Minuten
vorinkubiert. Dann wurde Dioxan in einer derartigen Weise
dazugefügt, dass sich Reaktionsgemische ergaben, die 0%, 10%,
2()%, 30%, 40% und 50% Dioxan enthielten. Nach Hinzufügen von
4 nmol M&sub6;GN&sub2;Asn als Zuckerkettendonator wurde jedes
Reaktionsgemisch (Gesamtvolumen: 40 pl) bei 37ºC während 10 Minuten
inkubiert, um dadurch die Zuckerkettentransferreaktion
durchzuführen. Nach Beendigung der Reaktion durch Erwärmung auf
100ºC während 3 Minuten wurde das Reaktionsgemisch mit 2-
Aminopyridin markiert und durch HPLC analysiert. Tabelle 4
zeigt die Ergebnisse. Wie Tabelle 4 zeigt, herrschte die
Transferreaktion bei einer Dioxankonzentration von 30% oder
mehr gegenüber der Hydrolyse nahezu vollständig vor.
-
Die Markierung mit 2-Aminopyridin wurde durch das in Japanese
Patent Publication Nr. 65108/1993 beschriebene Verfahren
durchgeführt. Dann wurde das so markierte M&sub6;GN&sub2; (im Folgenden
einfach als M&sub6;GN&sub2;-PA bezeichnet) und das so markierte M&sub6; GN (im
Folgenden einfach als M&sub6; GN-PA bezeichnet) fraktioniert und
bestimmt. Die Ausbeuten (%) der umgestalteten Zuckerkette,
die in Tabelle 4 aufgelistet sind, wurden gemäß der folgenden
numerischen Formel 1 bestimmt.
[Numerische Formel 1]
Beispiel 9: Änderung des
Zuckerkettentransferreaktionsprodukts im Verlauf der Zeit
-
Es wurden drei Ampullen hergestellt, in denen jeweils 4 mU
Endo-A und 100 mM GlcNAc in 25 mM Acetatpuffer (pH-Wert 6,0) bei
37ºC vorinkubiert wurden. Nach 10 Minuten wurde Dioxan
zugegeben, um endgültige Konzentrationen von 0%, 20% und 30% zu
ergeben. Als nächstes wurde M&sub6;GN&sub2;Asn, das als
Zuckerkettendonator dient, mit 6 ug zugegeben, und die Reaktion wurde bei
37ºC durchgeführt. Nach 10 Minuten, 30 Minuten, 60 Minuten,
90 Minuten, 180 Minuten und 300 Minuten wurden die Reaktionsgemische
als Probe genommen, während 3 Minuten auf 100ºC
erwärmt und dann mit 2-Aminopyridin markiert. Das so gebildete
M&sub6;GN&sub2;-PA wurde durch HPLC bestimmt. Fig. 4 zeigt die
Ergebnisse. In Fig. 4 bezieht sich die Ordinate auf die Ausbeute
(%) an M&sub6;GN&sub2;-PA basierend auf dem Zuckerkettendonator (d. h.
die Ausbeute der umgestalteten Zuckerkette), während sich die
Abszisse auf die Zeit (Minuten) bezieht.
-
Wie Fig. 4 zeigt, überstieg die Ausbeute des umgestalteten
Produkts M&sub6;GN&sub2; basierend auf dem Zuckerkettendonator
(M&sub6;GN&sub2;Asn) bei einer Dioxankonzentration von 20% oder 0%
nicht 60%. In Anwesenheit von 30% Dioxan erreichte die
Ausbeute an M&sub6;GN&sub2; nach 60 Minuten 100%. Es wurde außerdem
herausgefunden, dass das transferierte Produkt selbst dann nicht
hydrolysiert wurde, wenn die Reaktion während weiterer 240
Minuten fortgesetzt wurde.
Beispiel 10: Untersuchung der Akzeptorkonzentration in einer
Zuckerkettentransferreaktion mit Endo-A in
Anwesenheit von 30% Dioxan
-
Unter Verwendung von 4 nmol M&sub6;GN&sub2;Asn als Zuckerkettendonator
wurden 4 mU Endo-A bei 37ºC während 10 Minuten in 30% Dioxan
enthaltenden 25 mN Acetatpuffer (pH-Wert 6,0) in
Reaktionsampullen mit verschiedenen Konzentrationen von als Akzeptor
verwendetem GlcNAc (0 mM, 10 mM, 50 mN, 100 mN, 200 mM, 300 mM und
500 mM) vorinkubiert, wodurch eine
Zuckerkettentransferreaktion durchgeführt wurde. Nach Beendigung der Reaktion durch
Erwärmen auf 100ºC während 3 Minuten wurde das so gebildete
M&sub6;GN&sub2; mit 2-Aminopyridin markiert und durch HPLC analysiert.
-
Fig. 5 zeigt die Ergebnisse. In Fig. 5 bezieht sich die
Ordinate auf die Ausbeute (%) an M&sub6;GN&sub2;-PA basierend auf dem
Zuckerkettendonator (d. h. die Ausbeute der umgestalteten
Zuckerkette), während sich die Abszisse auf die
GlcNAc-Konzentration (M) bezieht. Wie Fig. 5 zeigt, herrschte die Transferreaktion
bei einer GlcNAc-Konzentration von 100 mM oder mehr
nahezu vollständig gegenüber der Hydrolyse vor.
SEQUENZ-AUFLISTUNG
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1) ALLGEMEINE INFORMATION
-
(i) ANMELDER
-
(A) NAME: TAKARA SHUZO CO., LTD
-
(B) STRASSE: 609, TAKENAKA-CHO
-
(C) STADT: FUSHIMI-KU
-
(D) LAND: KYOTO
-
(E) STAAT: JP
-
(F) POSTLEITZAHL (ZIP): KEINE
-
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG
EINES KOHLENHYDRATS ODER EINES GLYCOKONJUGATS
-
(iii) ANZAHL VON SEQUENZEN: 1
-
(iv) COMPUTERLESBARE FORM:
-
(A) TYP DES MEDIUMS: Diskette
-
(B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
-
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
-
(D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version
#1.25 (EPO)
-
(v) MOMENTANE ANMELDEDATEN:
-
ANMELDENUMMER: EP 00000000.0
-
(vi) FRÜHERE ANMELDEDATEN:
-
(A) ANMELDENUMMER: JP 82698/94
-
(B) DATUM DER EINREICHUNG: 30. März 1994
-
2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 1:
-
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
-
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
-
(B) TYP: Aminosäure
-
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
-
(D) TOPOLOGIE: linear
-
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
-
(ix) MERKMAL:
-
(A) NAME/SCHLÜSSEL: verschiedene Merkmale
-
(B) STELLE: 4
-
(D) WEITERE INFORMATION: Xaa ist ein Asn-Derivat,
welches eine Amidgruppe in Asn mit einem
Zukkerrest kombiniert
-
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR:1: