JPWO2002103025A1 - 新規な硫酸化糖及びその製造方法 - Google Patents

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Abstract

下記一般式で表される硫酸化糖が記載されている。［Ａ］−（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）−［Ｃ］−Ｒ（式中、（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）は６−硫酸化Ｎ−アセチルグルコサミン残基を示し、［Ａ］は水酸基又は糖残基を示し、［Ｃ］は糖残基を示し、Ｒは水酸基又は置換水酸基を示す）この硫酸化糖は、白血球に存在するセレクチンタンパク質と効果的に結合するため、抗炎症薬の作用を有するものであり、医薬の現場などで広く使用が期待される。

Description

技術分野
本発明は、新規な硫酸化糖及びその製造方法に関する。
背景技術
硫酸基を分子内に有する糖や糖脂質には、硫酸化シアリールルイスＸやスルファチドなどが知られており、ヒトや動物の白血球に存在するセレクチンタンパク質などと特異的に結合することが知られている。従って、これらの硫酸化糖は、セレクチンブロッカーを示すことから抗炎症薬やガン転移の防止といった医薬品などの開発応用に期待されている。
従来、この種の硫酸化糖及びその製造方法にはいろいろな方法が開発されており、以下のような方法がある。
（１）抽出法や、クロマトグラフィー等の分離法により天然物から回収する方法
（２）酵素を用いる方法
（３）化学合成による方法
（４）前記（２）及び（３）の組み合わせによる方法
前記（１）の方法は、一般に極微量の目的物を得られるにすぎない。前記（３）の方法は大量に目的化合物が得られるものの、反応ステップが一般に長く、多くの労力を必要とする。前記（２）の方法は、次に述べるように、硫酸基のない糖合成に関しては、比較的多くの報告例があるが、硫酸基を有する糖の合成例は、あまり知られていない。
ところで、酵素を用いる公知の硫酸化糖の合成方法は、用いる酵素の性質により、２つに分けられている。
（ａ）硫酸基転移酵素による合成
Figure 2002103025
この合成法については、Ｃ．−Ｈ．Ｗｏｎｇ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６５，５５６５−５５７４（２０００）．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１７，８０３１（１９９５）に記載されている。
（ｂ）ガラクトース転移酵素による合成
Figure 2002103025
この合成法については、Ｌｕｂｉｎｅａｕ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ．，３０５，５０１（１９９８）に記載されている。
前記した如き酵素を用いる反応は、反応としての有用性は指摘されているが、実際にその反応を実施するには大きな困難を伴う。
前記（ａ）の方法では、硫酸基を転移させる転移酵素（硫酸基転移酵素：スルフオトランスフエラーゼ）を使用する点に特徴があるが、使用する転移酵素は高価なものであり、このような高価な酵素を用いて硫酸化糖を製造する結果、製品が高価とならざるを得ず、実際の工業規模で生産を行う場合には、製造価格の点で使用できないものとなる。また、硫酸基の導入位置も還元末端側の６位に限られるため、非還元末端側に硫酸基を導入した硫酸化糖の合成が困難であるなど一般的な方法とは言い難い。
次に、（ｂ）の方法では、硫酸基を転移させる転移酵素（ガラクトース転移酵素）が用いられるが、この酵素自体は既に各反応に使用されることから既に開発されている状態にあるが、やはり高価であり、また、利用される基質も大幅に限定されており、実用的な方法であるとは言い難い。
本発明の課題を示すと、以下の通りである。
（１）糖の非還元末端側に硫酸化糖鎖を導入した構造を有する新規な硫酸化糖及びその硫酸化糖の製造方法を提供すること。
（２）糖の還元末端側に硫酸化糖鎖を導入した構造を有する新規な硫酸化糖及びその硫酸化糖の製造方法を提供すること。
発明の開示
本発明者らは、酵素として、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼまたはＮ−アセチルグルコサミニダーゼの存在下において、硫酸化糖を供与体に用い、「他の糖」を受容体に用いて両者を反応させると、その「他の糖」の非還元末側に硫酸化糖鎖を伸長させ得ることを見出した。また、同じく、硫酸化糖を受容体に用い、「他の糖」を供与体に用いて両者を反応させると、その「他の糖」の還元末端側に硫酸化糖鎖を伸長させ得ることを見いだした。
これらの方法に用いられるＮ−アセチルヘキソサミニダーゼ（又はＮ−アセチルグルコサミニダーゼ）は、実質上同一の酵素であるが、この酵素の使用により前記反応を促進させることができる。この酵素は、手に入りやすく、経済的に問題がない酵素であり、結果として前記の反応を工業的に有利に行うことができる。
本発明によれば、以下に示す新規な硫酸化糖及びその製造方法が提供される。
（１）下記一般式（Ｉ）で表されることを特徴とする硫酸化糖。
［Ａ］−（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）−［Ｃ］−Ｒ （Ｉ）
（式中、（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）は６−硫酸化Ｎ−アセチルグルコサミン残基を示し、［Ａ］は水酸基又は糖残基を示し、［Ｃ］は糖残基を示し、Ｒは水酸基又は置換水酸基を示す）
（２）該一般式（Ｉ）における［Ａ］を示す糖残基が、グルコース、ガラクトース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン及びそれら糖からなるオリゴ糖の中から選ばれる糖から誘導された糖残基であることを特徴とする前記（１）に記載の硫酸化糖。
（３）該一般式（Ｉ）における［Ｃ］を示す置換水酸基が、パラニトロフェノキシ基であることを特徴とする前記（１）又は（２）に記載の硫酸化糖。
（４）該［Ａ］を示す糖残基が、硫酸基又はリン酸基を含有することを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれかに記載の硫酸化糖。
（５）該一般式（Ｉ）における［Ｃ］を示す糖残基が、グルコース、ガラクトース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン及びそれらの糖からなるオリゴ糖の中から選ばれる糖から誘導された糖残基であることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれかに記載の硫酸化糖。
（６）該［Ｃ］を示す糖残基が、硫酸基又はリン酸基を含有することを特徴とする前記（５）に記載の硫酸化糖。
（７）下記一般式（ＩＩ）で表されることを特徴とする硫酸化糖。
ＨＯ−（ＧｌｃＮＡｃ）−（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）−［Ｄ］ （ＩＩ）（式中、（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）は６−硫酸化Ｎ−アセチルグルコサミン残基を示し、（ＧｌｃＮＡｃ）はＮ−アセチルグルコサミン残基を示し、［Ｄ］は水酸基、置換水酸基又は糖残基を示す）
（８）該一般式（ＩＩ）における［Ｄ］を示す糖残基が、グルコース、ガラクトース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン及びそれら糖からなるオリゴ糖の中から選ばれる糖から誘導された糖残基であることを特徴とする前記（７）に記載の硫酸化糖。
（９）該一般式（ＩＩ）における［Ｄ］を示す置換水酸基が、パラニトロフェノキシ基であることを特徴とする前記（７）又は（８）に記載の硫酸化糖。
（１０）該［Ｄ］を示す糖残基が、硫酸基又はリン酸基を含有することを特徴とする前記（７）〜（９）のいずれかに記載の硫酸化糖。
（１１）下記一般式（Ｉ）
［Ａ］−（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）−［Ｃ］−Ｒ （Ｉ）
（式中、（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）は６−硫酸化Ｎ−アセチルグルコサミン残基を示し、［Ａ］は水酸基又は糖残基を示し、［Ｃ］は糖残基を示し、Ｒは水酸基又は置換水酸基を示す）
で表される硫酸化糖を製造する方法において、下記一般式（Ｉａ）
［Ａ］−（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）−［Ｂ］ （Ｉａ）
（式中、（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）及び［Ａ］は前記と同じ意味を有し、［Ｂ］は置換水酸基又は糖残基を示す）
で表される硫酸化糖鎖と、下記一般式（Ｉｂ）
ＨＯ−［Ｃ］−Ｒ （Ｉｂ）
（式中、［Ｃ］及びＲは前記と同じ意味を有する）
で表される糖とを、Ｎ−アセチルヘキサミニダーゼ又はＮ−アセチルグルコサミダーゼの存在下で反応させることを特徴とする前記一般式（Ｉ）で表される硫酸化糖鎖の製造方法。
（１２）下記一般式（ＩＩ）
ＨＯ−（ＧｌｃＮＡｃ）−（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）−［Ｄ］ （ＩＩ）（式中、（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）は６−硫酸化Ｎ−アセチルグルコサミン残基を示し、（ＧｌｃＮＡｃ）はＮ−アセチルグルコサミン残基を示し、［Ｄ］は水酸基、置換水酸基又は糖残基を示す）
で表される硫酸化糖を製造する方法において、下記一般式（ＩＩａ）
ＨＯ−（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）−［Ｄ］ （ＩＩａ）
（式中、（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）及び［Ｄ］は前記と同じ意味を有する）
で表される硫酸化糖と、下記一般式（ＩＩｂ）
ＨＯ−（ＧｌｃＮＡｃ）−［Ｚ］ （ＩＩｂ）
（式中、（ＧｌｃＮＡｃ）はＮ−アセチルグルコサミン残基を示し、［Ｚ］は、水酸基、置換水酸基又は糖残基を示す）
で表される糖とを、Ｎ−アセチルヘキサミニダーゼ又はＮ−アセチルグルコサミダーゼの存在下で反応させることを特徴とする前記一般式（ＩＩ）で表される硫酸化糖の製造方法。
本発明の第１の態様によれば、下記一般式（Ｉ）で表される硫酸化糖及びその製造方法が提供される。
［Ａ］−（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）−［Ｃ］−Ｒ （Ｉ）
前記式中、（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）は６−硫酸化Ｎ−アセチルグルコサミンから誘導される残基を示す。
前記［Ａ］は、水酸基又は糖残基を示す。糖残基には、単糖、オリゴ糖及び多糖の中から選ばれる糖から誘導される残基が包含される。単糖には、従来公知のもの、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン等が包含される。オリゴ糖には、それらの単糖からなるオリゴ糖や、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン等が包含される。多糖には、前記単糖やオリゴ糖が高度に重合したもの等が包含される。これらの糖は、硫酸基やリン酸基を含有していてもよい。
前記［Ｃ］は、糖残基を示す。糖残基には、単糖、オリゴ糖及び多糖の中から選ばれる糖から誘導される残基が包含される。単糖には、従来公知のもの、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン等が包含される。オリゴ糖には、それらの単糖からなるオリゴ糖や、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン等が包含される。多糖には、前記多糖やオリゴ糖が高度に重合したもの等が包含される。これらの糖は、硫酸基やリン酸基を含有していてもよい。
Ｒは水酸基又は置換水酸基を示す。
前記置換水酸基は、水酸基における水素が置換基で置換されたものを意味し、−ＯＲ’で表される。この場合のＲ’が置換基を示し、この置換基Ｒ’には、脂肪族基や芳香族基が包含される。脂肪族基には不飽和結合が存在していてもよく、その炭素数は１〜４である。このような脂肪族基としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル等が挙げられる。芳香族基には、フェニル及び置換フェニルが包含される。置換フェニルとしては、ニトロ基やアルコキシ基等で置換されたものが挙げられ、好ましい置換フェニルは、パラニトロフェニルやオルトニトロフェニル等である。
本発明の第２の態様によれば、下記一般式（ＩＩ）で表される硫酸化糖及びその製造方法が提供される。
ＨＯ−（ＧｌｃＮＡｃ）−（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）−［Ｄ］ （ＩＩ）
前記式中、（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）は前記と同じ意味を示し、（ＧｌｃＮＡｃ）はアセチルグルコサミンから誘導された残基を示す。
前記［Ｄ］は、水酸基、置換水酸基又は糖残基を示す。糖残基には、単糖、オリゴ糖及び多糖の中から選ばれる糖から誘導される残基が包含される。単糖には、従来公知のもの、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン等が包含される。オリゴ糖には、それらの単糖からなるオリゴ糖や、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン等が包含される。多糖には、前記単糖やオリゴ糖が高度に重合したもの等が包含される。これらの糖は、硫酸基やリン酸基を含有していてもよい。
前記置換水酸基は、水酸基における水素が置換基で置換されたものを意味し、その具体例としては前記で示したものを挙げることができる。
本発明による前記一般式（Ｉ）で表される硫酸化糖は、下記一般式（Ｉａ）
［Ａ］−（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）−［Ｂ］ （Ｉａ）
（式中、（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）及び［Ａ］は前記と同じ意味を有し、［Ｂ］は置換水酸基又は糖残基を示す）
で表される硫酸化糖と、下記一般式（Ｉｂ）
ＨＯ−［Ｃ］−Ｒ （Ｉｂ）
（式中、［Ｃ］は糖残基を示し、Ｒは水酸基又は置換水酸基を示す）
で表される糖とを、Ｎ−アセチルヘキサミニダーゼ又はＮ−アセチルグルコサミダーゼの存在下で反応させることによって製造される。
前記反応は、以下の反応式で示される。
［Ａ］−（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）−［Ｂ］＋ＨＯ−［Ｃ］−Ｒ
→ ［Ａ］−（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）−［Ｃ］−Ｒ＋Ｂ （ａ）
前記一般式（Ｉａ）において、［Ｂ］と（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）との間の結合様式は、α結合およびβ結合のいずれでもよく、［Ｂ］は、（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）の１位に結合している。［Ｂ］が単糖及びオリゴ糖の中から選ばれる糖から誘導された残基の場合、その［Ｂ］の２位、３位、４位又は６位と［６−ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ］の１位とが結合している。但し、［Ｂ］がＮ−アセチルグルコサミンやＮ−アセチルマンノサミン等から誘導される残基の場合、その［Ｂ］の１位以外の３位、４位又は６位と（６−ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）の１位とが結合している。
前記一般式（ＩＩａ）で表される硫酸化糖は、公知の化合物であり、その天然品及び合成品が市販されている。
前記一般式（ＩＩａ）で表される硫酸化糖の具体例を示すと、以下の通りである。
（１）ＨＯ−（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＣＨ３
（２）ＨＯ−（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＣ２Ｈ５
（３）ＨＯ−（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＣ６Ｈ４ＮＯ２
（ＮＯ２はオルト又はパラ位が好ましい）
（４）ＨＯ−［Ｇａｌ］−（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＣＨ３
（５）ＨＯ−［Ｇａｌ］−（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＣ２Ｈ５
（６）ＨＯ−［Ｇａｌ］−（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＣ６Ｈ４ＮＯ２
（ＮＯ２はオルト又はパラ位が好ましい）
前記式中、［Ｇａｌ］は、ガラクトース残基を示す。ガラクトース残基［Ｇａｌ］は、グルコース残基、マンノース残基、Ｎ−アセチルグルコサミン残基、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基又はＮ−アセチルマンノサミン残基、それらのオリゴ糖残基等で置換することができる。
前記［Ａ］−（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）−［Ｂ］の構造式を示すと下記の通りである。
Figure 2002103025
前記式中、Ｒ１とＲ２との組合せは以下の通りである。
▲１▼ Ｒ１＝［Ａ］、Ｒ２＝Ｈ
▲２▼ Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２＝［Ａ］
▲３▼ Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２＝Ｈ（［Ａ］がＯＨである場合）
前記［Ａ］を示す糖残基の構造式を示すと下記の通りである。
Figure 2002103025
前記式中、Ｒ３〜Ｒ６は水素であるか又はＲ３〜Ｒ６のうちの１つが硫酸基、リン酸基又は糖残基であり、残りのものは水素である。糖残基としては、グルコース、ガラクトース等の単糖から誘導される糖残基や、それらの糖のオリゴ糖等から誘導される糖残基が包含される。
前記［Ｂ］を示す糖残基の構造式を示すと下記の通りである。
Figure 2002103025
前記式中、Ｒ７はアルキル基、フェニル基、置換フェニル基、水素又は糖残基を示し、Ｒ８〜Ｒ１１のうちの１つは結合手（−）であり、（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）の１位（構造式Ｉａの［Ｂ］が結合する位置）に結合し、残りは水素を示す。その水素の１つは硫酸基又はリン酸基で置換されていてもよい。
なお、前記式［Ａ］及び［Ｂ］において、Ｒ３Ｏ−、Ｒ５Ｏ−、Ｒ７−、Ｒ８Ｏ−、Ｒ１０Ｏ−は、アキシャル配置でも、エクアトリアル配置でもよい。
前記一般式（Ｉ）及び（Ｉａ）において、［Ａ］と（６−ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）との間の結合様式は、α結合及びβ結合のいずれでもよく、［Ａ］の１位と、（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）の３位又は４位とが結合している。
また、前記［Ａ］を示す糖残基において、その６位、２位、３位又は４位は硫酸化又はリン酸化されていてもよい。この糖の硫酸化物やリン酸化物には、例えば、３位が硫酸化されたガラクトースや６位がリン酸化されたグリコース等が包含される。
前記［Ｃ］−Ｒにおいて、［Ｃ］は糖残基を示す。この場合の糖残基には、単糖、オリゴ糖及び多糖の中から選ばれる糖から誘導される残基が包含される。多糖には、従来公知のもの、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン等が包含される。オリゴ糖には、それらの単糖からなるオリゴ糖や、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン等が包含される。多糖には、前記単糖やオリゴ糖が高度に重合したもの等が包含される。
Ｒは水酸基又は置換水酸基を示すが、この場合の置換水酸基の具体例としては、前記したものを挙げることができる。
前記［Ｃ］を示す糖残基において、その１位の水酸基は、置換水酸基であることができる。この場合の置換水酸基としては、前記したものを挙げることができる。
前記［Ｃ］を示す糖残基の１例についてその構造式を示すと、以下の通りである。
Figure 2002103025
前記式中、Ｒ１２は水素、置換基又は糖残基を示す。Ｒ１３〜Ｒ１６のうちの１つは結合手（−）であり、残りは水素を示すが、その１つは糖残基や、硫酸基やリン酸基等であってもよい。ＯＲ１３はＮＨＡｃであってもよい。
前記、糖残基［Ｃ］を与える糖としては、以下のものが挙げられる。
メチル α−グルコピラノシド、
ラクトース（ガラクトピラノシルβ１→４グルコピラノシド）
β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン
本発明では、前記一般式（Ｉａ）の硫酸化糖と前記一般式（Ｉａ）の糖とを反応させる。この場合の反応は、硫酸基（ＳＯ３）含有糖を転移させる反応である。
原料の使用割合は、通常モル比で、１対１の割合であるが、どちらかを過剰量用いても差し支えない。反応は液相で行われ、反応温度は、０〜８０℃、好ましくは室温〜５０℃の範囲である。用いる酵素は、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（又はＮ−アセチルグルコサミニダーゼ）である。この酵素は、カビ、仔牛の臓器、バクテリア、豆、酵母又は組み換えＤＮＡ等に由来するものであることができる。
酵素である、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．５２）または、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．５２）（両酵素は本質的に同一であるが、市販品の中には２つの異なった名称で市販されている）は、各種の担体に担持させて用いることもできる。酵素を担体に担持させて用いる場合には、安価に行うことができる。担体には、アルギン酸樹脂、リポソームなどを挙げることができる。
反応は溶媒の存在下に行う。溶媒としては通常水系媒体が用いられる。
反応終了後反応生成物は原料物質に対して１〜８０％の単離収率で得ることができる。反応終了後、反応生成物を逆相クロマトグラフィー、分子ふるい、イオン交換などの手段により分離精製することができる。
本反応には、燐酸緩衝液やトリス塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液のような通常用いられる緩衝液を用いる。また、アセトニトリルやメタノールなどの親水性有機溶媒もこの緩衝液中に加えられる。その割合は、０〜９０％であるが、１０〜５０％が望ましい。まれに、トルエンやジエチルエーテルのような溶媒も用いられるが、この場合には、２相系となる。反応は、０℃〜８０℃の範囲で行われる。望ましくは、室温近辺〜５０℃で行われる。
前記反応で得られる［Ａ］−［６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ］−［Ｃ］−Ｒにおいて、その（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）と［Ｃ］との結合様式は、β１→２，β１→３，β１→４，β１→６，α１→２、α１→３、α１→４、α１→６のいずれか、もしくは、これらの混合物である。［Ｃ］がＮ−アセチルグルコサミンやＮ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルマンノサミンの場合には、β１→２及びα１→２の結合様式は除かれる。［Ｃ］に硫酸基やリン酸基が含まれる場合には、それらのアニオン性基が存在する位置への結合は除かれる。
［Ａ］と（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）との結合様式は、α結合及びβ結合のいずれでもよく、［Ａ］の１位と（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）の３位又は４位とが結合している。
前記一般式（Ｉ）の硫酸化糖の具体的例を示すと、以下の通りである。
（１）ＨＯ−β−Ｄ−（６−ｓｕｌｆｏ）−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−α−Ｇｌｃ−ＯＣＨ３
（２）ＨＯ−（６−ｓｕｌｆｏ）−ＧｌｃＮＡｃβ−（１→３ ｏｒ ６）−Ｇａｌβ１→４−Ｇｌｃ
（３）ＨＯ−（６−ｓｕｌｆｏ）−ＧｌｃＮＡｃβ−（１→３ ｏｒ ４）−ＧｌｃＮＡｃ
本発明の一般式（Ｉ）の化合物の特徴は、硫酸化糖を糖鎖供与体に、他の糖を糖鎖受容体に用いて処理することにより得られる、非還元末端側に硫酸化糖鎖を伸長させた構造体である。この目的生成物に対応する副生成物は、糖Ｂである。
本発明による前記の一般式（Ｉ）の化合物は、白血球に存在するセレクチンタンパク質と効果的に結合するため、抗炎症薬の作用を有するものであり、医薬の現場などで広く使用されると期待される。
本発明による前記一般式（ＩＩ）で表される硫酸化糖は、下記一般式（ＩＩａ）
ＨＯ−（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）−［Ｄ］ （ＩＩａ）
で表される硫酸化糖と、下記一般式（ＩＩｂ）
ＨＯ−（ＧｌｃＮＡｃ）−［Ｚ］ （ＩＩｂ）
で表される糖とを、前記した酵素の存在下で反応させることによって製造される。
この場合の反応式を示すと以下の通りである。
ＨＯ−（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）−［Ｄ］＋ＨＯ−（ＧｌｃＮＡｃ）
−［Ｚ］ → ＨＯ−（ＧｌｃＮＡｃ）
−（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）−［Ｄ］＋Ｚ （ｂ）
前記［Ｄ］は、水酸基、置換水酸基又は糖残基を示す。糖残基には、単糖、オリゴ糖及び多糖の中から選ばれる糖から誘導される残基が包含される。多糖には、従来公知のもの、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン等が包含される。オリゴ糖には、それらの単糖からなるオリゴ糖や、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン等が包含される。多糖には、前記単糖やオリゴ糖が高度に重合したもの等が包含される。これらの糖は、硫酸基やリン酸基を含有していてもよい。［Ｚ］及び［Ｄ］が糖残基の場合、［Ｚ］は［Ｄ］と異なる糖残基であることが好ましい。
置換水酸基は、水酸基の水素が置換基によって置換されたものを意味し、その具体例については前記に示されている。
この［Ｄ］を示す糖残基と６−硫酸化−Ｎ−アセチルグルコサミン残基（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）との間の結合様式は、（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）の１位と、［Ｄ］の２位、３位、４位又は６位との間の結合である。［Ｄ］は、その２位、３位、４位及び６位のうちの（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）と結合していない位置に存在する水酸基のうちの１つは、硫酸化又はリン酸化されていてもよい。また、［Ｄ］がＮ−アセチルグルコサミン残基等の場合は、その２位が封鎖されていることから、その結合位置は２位を除いた３位、４位又は６位である。
前記一般式（ＩＩａ）で表される硫酸化糖は、反応に際しては、糖鎖受容体として作用し、糖鎖供与体としてのＨＯ−（ＧｌｃＮＡｃ）−［Ｚ］と反応させることにより、その糖還元末端に硫酸化糖鎖を伸長させることができる。本発明で糖鎖受容体として用いる好ましい硫酸化糖としては、ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−（６−スルホ）−Ｎ−アセチルグルコサミンを示すことができる。
前記ＨＯ−（ＧｌｃＮＡｃ）−［Ｚ］において、［Ｚ］は（ＧｌｃＮＡｃ）の１位に結合する。［Ｚ］が糖残基の場合には、（ＧｌｃＮＡｃ）と［Ｚ］との結合様式は、α結合及びβ結合のいずれでもよく、（ＧｌｃＮＡｃ）の１位と、［Ｚ］の２位、３位、４位又は６位と結合している。［Ｚ］において、その２位、３位、４位及び６位のうちの（６−ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）と結合していない位置に存在する水酸基の１つは硫酸化又はリン酸化されていてもよい。また、糖残基［Ｚ］がＮ−アセチルグルコサミン残基等の２位が封鎖されている場合には、その結合位置は２位を除いた３位、４位又は６位である。
本発明で好ましく用いられる用いられる糖鎖供与体は、パラニトロフェニル−β−アセチルグルコサミン（（ＧｌｃＮＡｃ）−［パラニトロフェニル］）等である。
本発明においては、前記ＨＯ−（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）−［Ｄ］で表される硫酸化糖と、一般式ＨＯ−（ＧｌｃＮＡｃ）−［Ｚ］で表される糖とを反応させて、一般式ＨＯ−（ＧｌｃＮＡｃ）−［Ｚ］の糖鎖ＨＯ−（ＧｌｃＮＡｃ）を、一般式ＨＯ−（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）−［Ｄ］の硫酸化糖鎖（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）に転移させる。これによって前記一般式（ＩＩ）の硫酸化糖を製造することができる。
原料の使用割合は、通常、モル比で１対１の割合で反応させるが、どちらかを過剰量用いても差し支えない。反応は液相で行われ、反応温度は、０〜８０℃、好ましくは室温〜５０℃の範囲である。
用いる酵素は、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．５２）又はＮ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．５２）である。これら酵素の由来は、カビ、仔牛の臓器、バクテリア、豆、酵母及び組み換えＤＮＡ等である。酵素は各種の担体に担持させて用いることができる。このように酵素を担体に担持させて用いることにより、安価に反応を行うことができる。担体には、アルギン酸ポリマーやリポソームなどを挙げることができる。
反応は溶媒の存在下に行う。溶媒としては、通常水が用いられる。反応終了後、反応生成物を原料物質に対して１〜８０％の単離収率で得ることができる。反応終了後、反応生成物を逆相クロマトグラフィー、分子ふるい（ゲル濾過）、イオン交換樹脂の手段により分離精製することができる。
本反応は、リン酸緩衝液やトリス塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液のような通常用いられる緩衝液をもちいる。また、アセトニトリルやメタノールなどの親水性有機溶媒もこの緩衝液中に加ることができる。その割合は、０〜９０％であるが、１０〜５０％が望ましい。まれに、トルエンやジエチルエーテルのような溶媒も用いられるが、この場合には、２相系となる。反応は、０℃〜８０℃の範囲で行われる。反応温度は、望ましくは、室温近辺〜５０℃である。
本発明による第２の硫酸化糖鎖は、下記一般式（ＩＩ）で表される。
ＨＯ−（ＧｌｃＮＡｃ）−（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）−［Ｄ］ （ＩＩ） 前記式中、［Ｄ］は前記と同じ意味を有する。
前記（ＧｌｃＮＡｃ）と（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）との間の結合様式は、α結合及びβ結合のいずれでもよく、（ＧｌｃＮＡｃ）の１位と、（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）の３位又は４位とが結合している。つまり、本発明の硫酸化糖鎖は、糖の還元末端側に硫酸化糖鎖を有することを特徴とする糖化合物である。
本発明による前記一般式（ＩＩ）の硫酸化糖鎖は、白血球に存在するセレクチンタンパク質と効果的に結合するため、抗炎症薬の作用を有するものであり、医薬の現場などでとして広く使用されると期待される。
本発明による好ましいものは、下記式で表される硫酸化糖である。
Figure 2002103025
実施例
以下に、本発明の実施例を示す。本発明はこれに限定されるものではない。得られた物質の確認は、ＮＭＲによった。
実施例１
（一般式（Ｉ）の化合物の合成）
ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−（６−スルフォ）−Ｎ−アセチルグルコサミンナトリウム塩（５４ｍｇ）とメチルα−Ｄ−グルコピラノシド（５００ｍｇ）を、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０、１ｍＬ）中に溶かし、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来のβ−Ｄ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（１０．５ユニット）（ＥＣ．３．２．１．５２，シグマ社製）を加え、３５℃で７１時間インキュベートした。反応液を１００℃の水に５分間浸して反応を止めた。次に、その反応混合液をＤＥＡＥ セファデックスＡ−２５カラムで精製した（溶離液：水→０．２Ｍ酢酸アンモニウム溶液）。Ｄｏｗｅｘ−５０Ｗ−Ｘ８カラム（Ｈ＋）でさらに精製し、最後にＢｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−２クロマトグラフィーで精製した。その結果、目的生成物である、β−Ｄ−（６−ｓｕｌｆｏ）−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−α−Ｇｌｃ−ＯＣＨ３を９．８ｍｇ（１７％）得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨＺ，Ｄ２Ｏ）：δ５．１８７（ｄ，１Ｈ，Ｊ１，２ ３．２Ｈｚ，Ｈ−１），４．７０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ１，２ ８．４Ｈｚ，Ｈ−１’），３．４０３（ｓ，３Ｈ，ＯＭｅ），ａｎｄ ２．０３２（３Ｈ，Ａｃ）．
１３Ｃ ＮＭＲ：δ１７６．２３，１００．９８，９６．６３，７７．６６，７５．６１，７４．７９，７３．２３，７２．９２，７２．３８，７１．５２，７１．２５，６２．２６，５６．７１，５５．７９，２３．５８．
［α］Ｄ＋２７．５°（Ｃ＝０．４７，Ｈ２Ｏ）
ＦＡＢ−ＭＳ ５２２（Ｍ＋Ｎａ）＋
実施例２
（一般式（Ｉ）の化合物の合成）
ｐ−ニトロフェニル β−Ｄ−（６−スルフォ）−Ｎ−アセチルグルコサミン ナトリウム塩（４０ｍｇ）とラクトース（ガラクトピラノシルβ１→４グルコピラノシド）（５１０ｍｇ）を５０ｍＭの酢酸ナトリウムの緩衝液（ｐＨ６．０，１．４ｍＬ）中に溶かし、ｂｏｖｉｎｅ ｅｐｉｄｉｄｙｍｓ（仔牛）由来のβ−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＡ（ＥＣ．３．２．１．５２，シグマ社製）（５ユニット／４．２ｍＬ）を１．２ｍＬ加え、３５℃で２９時間インキュベートした。反応液を１００℃の水に５分間浸して反応を止めた。次に、その反応混合液をＣ−１８ ＯＤＳカラム、ＤＥＡＥ セファデックスＡ−２５カラム、Ｄｏｗｅｘ−５０Ｗ−Ｘ８カラム（Ｈ＋）、最後に、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ２カラムの順で精製した。その結果、目的生成物である、（６−ｓｕｌｆｏ）−ＧｌｃＮＡｃβ−（１→３）−Ｇａｌβ１→４−Ｇｌｃを１６ｍｇ得た。
１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ５．１８８（ｄ，１Ｈ，Ｊ１，２ ３．６Ｈｚ，Ｈ−１α），４．７３３（Ｈ−１”），４．７１０（Ｈ−１’），４．６８９（Ｈ−１β），ａｎｄ ２．０３２（３Ｈ，Ａｃ）．
実施例３
（一般式（Ｉ）の化合物の合成）
ｐ−ニトロフェニル β−Ｄ−（６−スルフォ）−Ｎ−アセチルグルコサミン ナトリウム塩（５０ｍｇ）とβ−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン（２５０ｍｇ）を５０ｍＭの酢酸ナトリウムの緩衝液（ｐＨ６．０，２．０ｍＬ）中に溶かし、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来のβ−Ｄ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（ＥＣ．３．２．１．５２，シグマ社製）（３０ユニット／５００μｌ）０．５ｍｌを加え、３５℃で３７０時間インキュベートした。反応液を１００℃の水に５分間浸して反応を止めた。次に、その反応混合液をＣ−１８ ＯＤＳカラム、ＤＥＡＥ セファデックスＡ−２５カラム、Ｄｏｗｅｘ−５０Ｗ−Ｘ８カラム（Ｈ＋）、最後に、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ２カラムの順で精製した。その結果、目的生成物である、（６−ｓｕｌｆｏ）−ＧｌｃＮＡｃβ−（１→４）−ＧｌｃＮＡｃを７．３ｍｇ（３８％）得た。
４００ＭＨＺ−１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ５．１８０（ｄ，１Ｈ，Ｊ１，２ ２．４Ｈｚ，Ｈ−１α），４．６９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ１，２ ７．６Ｈｚ，Ｈ−１β），４．５９１（ｄ，１Ｈ，Ｊ１’，２’ ８．４Ｈｚ，Ｈ−１’α），），４．５８２（ｄ，１Ｈ，Ｊ１’，２’ ８．４Ｈｚ，Ｈ−１’β），ａｎｄ ２．０５４ ａｎｄ ２．０３２（３Ｈ，Ａｃ Ｘ２）．
［α］Ｄ＋１２°（Ｃ＝１．３，Ｈ２Ｏ）
ＦＡＢ−ＭＳ ５４８（Ｍ＋Ｎａ）＋
実施例４
（一般式（ＩＩ）の化合物の合成）
ｐ−ニトロフェニル β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン（１００ｍｇ）とｐ−ニトロフェニル β−Ｄ−（６−スルフォ）−Ｎ−アセチルグルコサミン（８００ｍｇ）を５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０，１０ｍＬ）中に溶かし、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来のβ−Ｄ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（シグマ社製）３ユニットを加え、３５℃で７時間インキュベートした。反応液を１００℃の水に５分間浸して反応を止めた。次に、その溶液を直接Ｃ−１８ ＯＤＳ カラムで精製した。生成物と未反応のアクセプターの混合したフラクションについて、２５％メタノール溶液を溶離液としトヨパール ＨＷ−４０Ｓでさらに精製した。目的とするβ−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−β−Ｄ−（６−ｓｕｌｆｏ）−ＧｌｃＮＡｃ−ＯＣ６Ｈ４ＮＯ２−ｐを２５ｍｇ（１４％）得た。
１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ８．２５１（ｄ，２Ｈ，Ｊ ９．２Ｈｚ，ｍ−Ｐｈ），７．１９１（ｄ，２Ｈ，Ｊ ９．２Ｈｚ，ｏ−Ｐｈ），５．３２５（ｄ，１Ｈ，Ｊ１，２ ８．４，Ｈ−１），４．６５８（ｄ，１Ｈ，Ｊ１’，２’ ８．４，Ｈ−１’），２．１０２，２．００５（６Ｈ，２Ａｃ）．
［α］Ｄ−２８°（Ｃ＝０．６，Ｈ２Ｏ）
ＦＡＢ−ＭＳ ６７０（Ｍ＋Ｎａ）＋
産業上の利用可能性
本発明によれば、市販酵素であるＮ−アセチルヘキソサミニダーゼを用いて、（１）硫酸化糖を供与体とし、他の糖を受容体として反応させると、非還元末側に硫酸化糖を伸長させた新規な硫酸化糖を得ることができた。また、（２）硫酸化糖を受容体に、他の糖を供与体に用いて処理すると、還元末側に硫酸化糖を伸張させた新規な硫酸化糖を得ることができた。
これらの新規生成物は、白血球に存在するセレクチンタンパク質と効果的に結合するため、抗炎症薬の作用を有するものであり、医薬の現場などでとして広く使用されると期待される。

Claims (12)

  1. 下記一般式（Ｉ）で表されることを特徴とする硫酸化糖。
    ［Ａ］−（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）−［Ｃ］−Ｒ （Ｉ）（式中、（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）は６−硫酸化Ｎ−アセチルグルコサミン残基を示し、［Ａ］は水酸基又は糖残基を示し、［Ｃ］は糖残基を示し、Ｒは水酸基又は置換水酸基を示す）
  2. 該一般式（Ｉ）における［Ａ］を示す糖残基が、グルコース、ガラクトース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン及びそれら糖からなるオリゴ糖の中から選ばれる糖から誘導された糖残基であることを特徴とする請求の範囲（１）に記載の硫酸化糖。
  3. 該一般式（Ｉ）における［Ｃ］を示す置換水酸基が、パラニトロフェノキシ基であることを特徴とする請求の範囲（１）又は（２）に記載の硫酸化糖。
  4. 該［Ａ］を示す糖残基が、硫酸基又はリン酸基を含有することを特徴とする請求の範囲（１）〜（３）のいずれかに記載の硫酸化糖。
  5. 該一般式（Ｉ）における［Ｃ］を示す糖残基が、グリコース、ガラクトース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン及びそれらの糖からなるオリゴ糖の中から選ばれる糖から誘導された糖残基であることを特徴とする請求の範囲（１）〜（４）のいずれかに記載の硫酸化糖。
  6. 該［Ｃ］を示す糖残基が、硫酸基又はリン酸基を含有することを特徴とする請求の範囲（５）に記載の硫酸化糖。
  7. 下記一般式（ＩＩ）で表されることを特徴とする硫酸化糖。
    ＨＯ−（ＧｌｃＮＡｃ）−（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）−［Ｄ］ （ＩＩ）（式中、（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）は６−硫酸化Ｎ−アセチルグルコサミン残基を示し、（ＧｌｃＮＡｃ）はＮ−アセチルグルコサミン残基を示し、［Ｄ］は水酸基、置換水酸基又は糖残基を示す）
  8. 該一般式（ＩＩ）における［Ｄ］を示す糖残基が、グリコース、ガラクトース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン及びそれらの糖からなるオリゴ糖の中から選ばれる糖から誘導された糖残基であることを特徴とする請求の範囲（７）に記載の硫酸化糖。
  9. 該一般式（ＩＩ）における［Ｄ］を示す置換水酸基が、パラニトロフェノキシ基であることを特徴とする請求の範囲（７）又は（８）に記載の硫酸化糖。
  10. 該［Ｄ］を示す糖残基が、硫酸基又はリン酸基を含有することを特徴とする請求の範囲（７）〜（９）のいずれかに記載の硫酸化糖。
  11. 下記一般式（Ｉ）
    ［Ａ］−（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）−［Ｃ］−Ｒ （Ｉ）
    （式中、（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）は６−硫酸化Ｎ−アセチルグルコサミン残基を示し、［Ａ］は水酸基又は糖残基を示し、［Ｃ］は糖残基を示し、Ｒは水酸基又は置換水酸基を示す）
    で表される硫酸化糖を製造する方法において、下記一般式（Ｉａ）
    ［Ａ］−（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）−［Ｂ］ （Ｉａ）
    （式中、（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）及び［Ａ］は前記と同じ意味を有し、［Ｂ］は置換水酸基又は糖残基を示す）
    で表される硫酸化糖と、下記一般式（Ｉｂ）
    ＨＯ−［Ｃ］−Ｒ （Ｉｂ）
    （式中、［Ｃ］は糖残基を示し、Ｒは水酸基又は置換水酸基を示す）
    で表される糖とを、Ｎ−アセチルヘキサミニダーゼ又はＮ−アセチルグルコサミダーゼの存在下で反応させることを特徴とする前記一般式（ＩＩ）で表される硫酸化糖の製造方法。
  12. 下記一般式（ＩＩ）
    ＨＯ−（ＧｌｃＮＡｃ）−（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）−［Ｄ］ （ＩＩ）
    （式中、（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）は６−硫酸化Ｎ−アセチルグルコサミン残基を示し、（ＧｌｃＮＡｃ）はＮ−アセチルグルコサミン残基を示し、［Ｄ］は水酸基、置換水酸基又は糖残基を示す）
    で表される硫酸化糖を製造する方法において、下記一般式（ＩＩａ）
    ＨＯ−（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）−［Ｄ］ （ＩＩａ）
    （式中、（６ＳＯ３−ＧｌｃＮＡｃ）及び［Ｄ］は前記と同じ意味を有する）
    で表される硫酸化糖と、下記一般式（ＩＩｂ）
    ＨＯ−（ＧｌｃＮＡｃ）−［Ｚ］ （ＩＩｂ）
    （式中、（ＧｌｃＮＡｃ）Ｎ−アセチルグルコサミン残基を示し、［Ｚ］は、水酸基、置換水酸基又は糖残基を示す）
    で表される糖とを、Ｎ−アセチルヘキサミニダーゼ又はＮ−アセチルグルコサミダーゼの存在下で反応させることを特徴とする前記一般式（ＩＩ）で表される硫酸化糖鎖の製造方法。
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