DE68918103T3 - Verfahren zur überwachung des kollagenabbaus. - Google Patents

Verfahren zur überwachung des kollagenabbaus.

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Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Überwachung des Collagenabbaus als diagnostisches Hilfsmittel im Zusammenhang besonders mit Osteoporose und rheumatoider Arthritis.
  • Collagen ist in verschiedener Form in allen Geweben vorhanden. Es ist gezeigt worden (Fujimoto et al. (1978) Biochemistry, Biophysics Research Communication, Bd. 84, 52-57), daß Collagen die Form von Aminosäureketten besitzt, die durch Pyridinolin vernetzt sind. Die Pyridiniumvernetzungen werden gebildet aus drei Hydroxylysinresten, zwei aus den terminalen (nicht-helixförmigen) Peptiden des Collagenmoleküls, die enzymatisch vor der Reaktion in Aldehyde umgewandelt worden sind, und einem dritten Hydroxylysin, das sich in dem helixförmigen Teil eines benachbarten Collagenmoleküls befindet. Robins et al (Annals of the Rheumatic Diseases 1986, 45, 969-973) haben ein Verfahren zur Messung von Pyridinolin im Urin beschrieben, bei dem ein Antikörper, der gegenüber Pyridinolin spezifisch ist, verwendet und durch ein Enzym-gebundenes Immunosorbens-Assay (ELISA) nachgewiesen wird. Dieses Verfahren ergibt jedoch nur ein Maß für Hydroxylysyl-pyridinolin in der Probe und erkennt Lysyldeoxypyridinolin nicht. Das erstere ist in Knochen und Gewebe vorhanden und das letztere nur in Knochen. So kann das Verfahren das Auftreten eines Collagenabbaus anzeigen, was das Vorliegen einer degenerativen Erkrankung anzeigt, aber ohne daß es die Art des betroffenen Gewebes anzeigt.
  • Die WO 89/04491, veröffentlicht am 18.05.89, beschreibt ein Verfahren zur Messung der Knochenresorption, bei dem Peptidfragmente, enthaltend eine 3-Hydroxypyridinium-Vernetzung, in nicht hydrolysiertem Urin gemessen werden.
  • Die vorliegende Erfindung beruht auf der Feststellung, daß Lysyl- und Hydroxylysyl-pyridinolin in biologischen Flüssigkeiten wie Urin vorhanden sind, gebunden an Fragmente der ursprünglichen Aminosäureketten oder an Zucker. Es besteht jedoch keine Sicherheit darüber, wo die ursprünglichen Ketten abgebaut worden sind. In nahezu allen Fällen sind jedoch ausreichend Aminosäuren vorhanden, um die Art des Gewebes zu identifizieren, aus dem das spezielle Collagen stammt.
  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Überwachung der Resorption von Knochencollagen bei einem Patienten, umfassend die Gewinnung einer Urinprobe von dem Patienten, Bestimmung der Menge an einem peptidfreien glycosylierten Hydroxylysyl-pyridinolin in der Probe mit einem solchen in einer nicht hydrolysierten Form und Anwendung der bestimmten Menge an peptidfreiem glycosyliertem Hydroxylysyl-pyridinolin als Indikator für einen Abbau von Knochencollagen.
  • Vorzugsweise ist der Zucker an Pyridinolin gebunden durch Glycosylierung mit Galactose oder mit Glucose und Galactose.
  • Das Collagen kann günstigerweise mit Knochen oder Knorpel verbunden sein.
  • Ausführungsformen der Erfindung werden nun mehr im Detail anhand von Beispielen erläutert.
  • Collagen besitzt die allgemeine Struktur:
  • wobei die A's, B's und C's Aminosäuren sind und P Lysyl- oder Hydroxylysyl-pyridinolin oder glycosyliertes Hydroxylysyl-pyridinolin ist.
  • Hydroxylysinreste in der Helix sind glycosyliert durch Addition von Zuckergruppen an ihre Hydroxylgruppen. Wenn die Bildung der Pyridinolin(Pyd)-Vernetzung ein glycosyliertes Hydroxylysin umfaßt, entsteht eine glycosylierte Vernetzung. Das Vernetzungsanaloge Lysylpyridinolin, das durch Reaktion mit einem Lysinrest in der Helix gebildet worden ist, kann keine glycosylierten Derivate bilden, da es keine Seitenketten-Hydroxylgruppe enthält.
  • Es gibt zwei Arten von Glycosylierung, entweder mit Galactose (Gal) allein oder dem Disaccharid Glucosyl-galactose (Gal.Glc). So existieren zwei mögliche Formen von peptidfreiem glycosyliertem Hydroxylysyl-pyridinolin, wie unten angegeben, Pyd-Gal und Pyd-Gal.Glc. Pyd-Gal (I) Pyd-Gal.Glc (II)
  • Der relative Anteil von Mono- und Disaccharid-Derivaten von Hydroxylysin variiert mit unterschiedlichen Geweben. Von den Hauptgeweben, die von Interesse sind (d. h. solche, die Pyridinolin enthalten), enthält Knorpel nahezu vollständig Gal.Glc, während im Knochencollagen das Monosaccharid überwiegt.
  • Sowohl die Mono- als auch die Disaccharid-Derivate von Pyridinolin (Strukturen I und II) wurden aus menschlichem Urin isoliert und identifiziert. Diese Komponenten sind normalerweise im Urin vorhanden; es hat sich jedoch gezeigt, daß sie in erhöhten Mengen bei verschiedenen Knochenerkrankungen und bei arthritischen Erkrankungen vorhanden sind.
  • Die Hauptpunkte von Interesse an diesen Feststellungen sind:
  • 1. Die Komponenten sind im Urin ohne hydrolytische Behandlung vorhanden und ein Assay-Verfahren wäre daher direkt auf Urin anwendbar.
  • 2. Bestimmungen der beiden Komponenten ergeben eine gewisse Gewebe-spezifische Information über den Collagenabbau. Die Messung von Pyd-Gal ergibt einen Index für die Knochencollagenresorption: Pyd-Gal.Glc-Mengen im Urin sind hauptsächlich ein Zeichen für Knochen- oder Knorpelabbau, und die relativen Mengen an Pyd-Gal und Pyd-Gal.Glc geben eine Information über das relative Ausmaß des Abbaus von Knochen und Knorpel.
  • 3. Das Vorhandensein der Zuckergruppen kann die Antigenität (Leichtigkeit, mit der gute Antikörper gebildet werden können) der Komponenten erhöhen. Der Zuckeranteil bildet einen Teil der Antikörper-Erkennungsstellen, so daß spezifische Antikörper für jede Struktur gebildet werden können.
  • Zwei Arten von Gewebe von besonderem Interesse sind Knochen und Knorpel Das Vorliegen eines Abbaus von Knochencollagen allein ist ein Indikator für Osteoporose und andere Knochenerkrankungen, während das Auftreten eines Abbaus sowohl von Knochencollagen als auch von Knorpelcollagen ein Indikator für arthritische Störungen oder Erkrankungen ist.
  • Allgemein können Antikörper durch die folgenden Stufen erhalten werden:
  • 1. Identifizierung eines speziellen interessierenden X in einer biologischen Flüssigkeit.
  • 2. Isolierung von X.
  • 3. Bindung von X an ein geeignetes Protein.
  • 4. Injektion des Produktes von 3 in ein Wirtstier und Bildung eines Antikörpers.
  • 5. Verwendung dieses Antikörpers in einem ELISA oder anderem geeigneten Assay-Verfahren.
  • Speziellere Beispiele für die Erfindung werden nun angegeben.
  • Die Schemata 1 und 2 fassen die Vorgehensweisen zur Isolierung von Vernetzungen enthaltenden Fragmenten aus Urin zusammen und geben Details der isolierten Komponenten an. Variationen dieser Schemata sind im Detail unten angegeben.
    • Beispiel 1 (Vergleich) Methode
  • a. Urinproben, enthaltend hohe Konzentrationen an gesamten Pyridinium-Vernetzungen, wurden von Patienten gesammelt mit Erkrankungen, umfassend entweder eine erhöhte Knochenumwandlung (Hyperparathyroidismus) oder erhöhten Knorpel- und Knochenabbau (rheumatoide Arthritis).
  • b. Insgesamt 1,0 bis 1,5 l Urin wurden gefriergetrocknet, wieder in 0,2 M Essigsäure gelöst und der Gelfiltrations-Chromatographie in einzelnen Anteilen unterworfen unter Verwendung einer 2,6 · 140 cm-Säule von Biogel® P2.
  • c. Ausgewählte Fraktionen, enthaltend mit Pyridinium vernetzte Derivate, wurden rechromatographiert durch Phasenumkehr-HPLC unter Verwendung eines C&sub1;&sub8;-Trägers unter Eluieren mit einer mobilen Phase, enthaltend Acetonitril. Die Peptide wurden weiter gereinigt durch Ionenaustausch-HPLC unter Verwendung von DEAE- und SP-5PW-Säulen.
  • d. Die isolierten Komponenten wurden durch Massenspektrometrie durch Bombardierung mit schnellen Atomen und durch Aminosäuresequenzanalyse charakterisiert; die Glycosylierungsstellen wurden identifiziert durch Gas/Flüssigkeits-Chromatographie von Alkalihydrolysaten der Peptide.
  • e. Durch Kenntnis der Aminosäuresequenzen um die Vernetzungsstellen in Knochen und Knorpel wurde der Ursprung der aus Urin isolierten Peptide festgestellt. Eine Anzahl von drei Peptiden, enthaltend die Kernsequenz, die für unterschiedliche Gewebe repräsentativ ist, wurde ausgewählt zur Erzeugung von Antikörpern.
  • f. Jedes der gereinigten Peptide (1 umol) wurde kovalent an Ovalbumin (0,25 umol) gebunden unter Verwendung von N-Ethyl- N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-hydrochlorid.
  • g. Balb/c-Mäuse wurden mit den Ovalbumin-Konjugaten immunisiert und monoklonale Antikörper wurden nach Fusion mit Ag8.653 Myelomzellen gebildet. Positive Klone wurden nachgewiesen durch ELISA unter Verwendung von Mikroröhrchen-Platten, die beschichtet waren mit den Peptiden, gebunden an Gelatine durch Umsetzung mit einem unterschiedlichen Carbodiimidreagens N-Cyclohexyl-N'-2-(4'-methylmorpholinium)ethyl-carbodiimid-p-toluolsulfonat.
  • Die so gebildeten monoklonalen Antikörper können angewandt werden für Immunoassay-Tests zur Diagnose und Überwachung von unterschiedlichen Arten von Knochenerkrankungen und degenerativen Gelenkerkrankungen.
    • Beispiel 2 Methode
  • Stufe 1. Urin (300 ml), der auf ein Zehntel seines ursprünglichen Volumens konzentriert worden war, wurde über eine Säule (3,0 · 100 cm) von Sephadex G25M mit 0,2M Essigsäure als Eluens chromatographiert. Die Fraktionen zwischen 540 und 630 ml (Ve/Vo = 1,6-1,9), die etwa 60% der charakteristischen Pyridinium-Vernetzungsfluoreszenz enthielten, wurden zusammengegeben und gefriergetrocknet.
  • Stufe 2. Die Fraktion von Stufe 1 (280 mg) wurde erneut über eine Säule (1,7 · 140 cm) von Sephadex® G10 chromatographiert, eluiert mit 0,2M Essigsäure, um die Vernetzungskomponenten von Aminosäuren und anderen niedermolekularen Substanzen abzutrennen. Die Fraktionen wurden durch Fluoreszenz überwacht (Ex 295 nm; Emm 400 nm) und Substanzen, die zwischen 105 und 121 ml (Ve/Vo = 1,1-1,3) eluiert wurden, wurden zusammengegeben und zur Trockene eingedampft.
  • Stufe 3. Die Fraktion aus Stufe 2 wurde der Kationenaustauscher-Chromatographie über eine Säule (0,9 · 15 cm) von sulfonierten Polystyrolharz-Perlen (5 um), vernetzt (8%) mit Divinylbenzol (Locarte Co. Ltd., London; Cat No LA 48/08), unterworfen, die bei 56ºC durchgeführt wurde, wobei mit 67 mmol Natriumcitratpuffer, pH 3,84, eluiert wurde. Fraktionen von 5 ml wurden gesammelt und entsprechende Fraktionen über eine Säule (1,7 · 50 cm) von Sephadex G10 entsalzt und gefriergetrocknet.
  • In diesem System wurde Pyd-Gal (I) zwischen 91 und 105 min und Pyd-Gal.Glc (II) zwischen 41 und 50 min eluiert.
  • Die Endreinigung von I und II wurde durch Phasenumkehr- HPLC durchgeführt über eine Säule (0,9 · 25 cm) mit Rosil C&sub1;&sub8; Packung (3 um), eluiert mit 0,1% Heptafluorbuttersäure, und einem linearen Gradienten von 15 bis 30% Acetonitril über 30 min. (I) und (II) wurden bei 17,3 bzw. 16,9 min eluiert.
    • Charakterisierung 1. Hydrolyseeigenschaften
  • Durch milde saure Hydrolyse (0,1M HCl bei 108ºC während 12-h) wurde Pyd-Gal.Glc (II) vollständig umgewandelt in ein Gemisch aus Pyd-Gal (I) und Pyridinolin (Pyd). Hydrolyse von Pyd-gal (I) in 2M HCl bei 108ºC während 8 h führte zu einer vollständigen Umwandlung dieser Komponente in Pyd. Dieses Verhalten ist charakteristisch für diese Art von Verbindungen und wurde früher festgestellt für die Umwandlung von Hydroxylysin-glycosiden in Hydroxylysin.
    • 2. Zusammensetzung
  • Bei der Hydrolyse mit starker Mineralsäure ergaben beide Verbindungen (I) und (II) Pyd, wobei keine anderen Aminosäuren in den Hydrolysaten nachgewiesen wurden. Die Kohlenhydratzusammensetzungen wurden bestimmt durch Gas/Flüssigkeits-Chromatographie von methylierten Derivaten nach Hydrolyse in 2M H&sub2;SO&sub4; und Reduktion mit Natriumborhydrid. Aufgrund dieser Ergebnisse und der Bestimmung der Vernetzung durch HPLC waren die molaren Verhältnisse:
  • Komponente I Pyridinolin (1,0); Galactose (0,9)
  • Komponente II Pyridinolin (1,0); Galactose (0,8); Glucose (0,9).
  • Die obigen Ergebnisse bestätigen daher, daß die Strukturen der Verbindungen I und II wie oben angegeben sind.
  • Neben den oben angegebenen Verbindungen wurde ein damit verbundenes Derivat, das als 'X' bezeichnet wird und das zwischen 184 und 195 min in Stufe 3 eluiert wurde, isoliert. Diese Komponente enthält Pyd und ist erhöht bei Patienten mit Knochenerkrankungen.
  • Immunoassays für diese Komponenten werden präzise entwickelt, wie es oben beschrieben ist, für Peptide mit Konjugation an Ovalbumin über ihre Amino- oder Carboxylgruppen. SCHEMA 1 SCHEMA 2

Claims (3)

1. Verfahren zur Überwachung der Resorption bzw. des Abbaus von Knochencollagen bei einem Patienten, umfassend
Gewinnung einer Urinprobe von dem Patienten,
Bestimmung der Menge an einem peptidfreien glycosylierten Hydroxylysylpyridinolin in der Probe mit einem solchen in einer nichthydrolysierten Form und
Anwendung der bestimmten Menge an peptidfreiem glycosyliertem Hydroxylysyl-pyridinolin als Indikator für einen Abbau von Knochencollagen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das peptidfreie glycosylierte Hydroxylysylpyridinolin ein Galactosyl-pyridinolin ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das peptidfreie glycosylierte Hydroxylysylpyridinolin ein Glucosyl-galactosyl-pyridinolin ist.
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