JPH10507266A

JPH10507266A - 体液中のコラーゲンの断片化パターンの評価とコラーゲンの代謝に関連する疾患の診断

Info

Publication number: JPH10507266A
Application number: JP8512947A
Authority: JP
Inventors: ボンデ、マーチン; クビスト、ペル
Original assignee: オステオミーター・ビオ・テク・エー／エス
Priority date: 1994-10-17
Filing date: 1995-10-16
Publication date: 1998-07-14
Also published as: WO1996012193A1; US6372442B1; EP0787301A1; DE69520111T2; DE69520111D1; AU3746295A; ATE199185T1; ES2154739T3; EP0787301B1

Abstract

(57)【要約】例えば血清や尿など体液中のコラーゲン分解産物に反映されるコラーゲン、特にI型コラーゲンの断片化パターンが、二種以上の異なる免疫検定法を用いて前記分解産物の量を測定することによって評価される。得られた結果は組み合わせて、病状又は患者タイプを診断する数値指標とすればよい。

Description

【発明の詳細な説明】体液中のコラーゲンの断片化パターンの評価とコラーゲンの代謝に関連する疾患の診断本発明は体液中のコラーゲンの断片化パターンを評価する方法に関する。また本発明はコラーゲン断片化パターンを決定するときに使用する幾つかの分析システムに関する。さらに本発明は骨の代謝に関連する疾患の存在を診断し且つ特徴づけるために上記方法を使用する用途に関する。とりわけ骨粗鬆症を含む骨の疾病は、社会にとって大きな負担となりつつある。1992年の米国における総費用は骨粗鬆症に関連する傷害だけで少なくとも100 億米ドルと推定されている（Riggs，New England Journal of Medicine，327: 6 20-627(1992)）。骨粗鬆症並びに他の多くの骨の疾病は、健常集団における骨減少速度と比較して骨減少速度が増大しているのが特徴である。かかる減少速度は、将来の骨折の危険性に高度に相関していることが明らかにされている（Christiansenら，「将来の骨折危険性の予測」，Christiansenら編，1993年第4回国際骨粗鬆症シンポジウム予稿集，香港，Osteopress Aps 1993; 52-54頁）。したがって骨減少速度は、このような疾患の診断について評価するべき重要なパラメーターである。骨減少速度を評価するには、骨再吸収速度の推定・評価が重要な役割を果たす。かかる骨減少速度は、骨形成速度と骨再吸収速度の正味の差であるが、骨再吸収マーカーのみでも、減少速度の良好な推定値であることが立証されている（Bo ndeet al."Immunoassay for Quantifying Type I Collagen Degradation Produc ts in Urine Estimated”，Clin．Chem．40/11，2022-2025（1994）-Endocrinol ogy and Metabolism）。しかしながら、骨減少の推定は、骨形成のマーカーをも含めることによって改善される（Qvistら，American Society of Bone and Mine ral Research，Abstract # 3 419，Kansas City，1994）。これまでに、様々な生化学的マーカーを測定することによって生体内でのコラーゲンの分解を追跡測定する検定法が幾つか開発されているが、そのようなマーカーのいくつかはコラーゲンの分解産物であった。例えば、ヒドロキシプロリンは、大半がコラーゲン−骨およびその他全ての結合組織中の主要構造タンパク質である−に限定されたアミノ酸であって、尿に排泄される。その排泄速度は、幾つかの症状、特にパジェット病−後述するように骨の回転率が著しく増大する代謝性骨疾患−において増大することが知られている。この理由により、尿ヒドロキシプロリンは、コラーゲン分解のアミノ酸マーカーとして広範に使用されてきた（Singer，F．R.et al.，Metabolic Bone Diseas e，Vol．II，eds．Avioli，L.V．and Kane，S.M.，489-575 (1978)，Academic Press，New York）。米合衆国特許第3600132号は、コラーゲン代謝の変動を追跡測定するために血清、尿、腰椎液および他の細胞間液などの体液の中のヒドロキシプロリンを測定する方法を開示している。この特許において述べられているように、ヒドロキシプロリンは、例えばパジェット病、マルファン症候群、骨形成不全症、コラーゲン組織及び様々な病態の小人症における新生物発生などの病状に関連してコラーゲンの同化作用または異化作用が昂進することと相関関係があるのである。パジェット病に関連した骨再吸収も、骨コラーゲンの分解後に尿中に排泄されるヒドロキシプロリンを含有する小型のペプチドを測定することによって追跡監視されている（Russellら，Metab．Bone Dis．and Rel．Res．4 and 5，225026 2（1981）；Singer，F．R.et al.，supra）。パジェット病の場合、尿ヒドロキシプロリンの増加は、大半が骨分解に由来する；しかしながら、ヒドロキシプロリンは一般的には、骨分解の特異的指標としては使用できない。尿中のヒドロキシプロリンの多くは、新規のコラーゲン合成（新しく合成されたタンパク質の相当量が、組織構造中に組込まれることなく分解され、排泄される）およびある種の血液タンパク質とヒドロキシプロリンを含有する他のタンパク質の代謝回転に由来する可能性がある。さらにタンパク質分解に由来する遊離のヒドロキシプロリンの約80％は、肝臓で代謝され、尿中には決して現れない（Kiviriko，K．I.，Int．Rev．Connect． Tissue Res.5:93（1970）;Weiss，P．H．and Klein，L.，J．Clin．Invest． 48:1（1969））。ヒドロキシプロリンは、骨再吸収に特異的でないとしても骨中のコラーゲンに特異的であるので、骨粗鬆症の良好なマーカーであるが、取扱いが厄介である。ヒドロキシリジンとそのグリコシド誘導体は共に、コラーゲン性タンパク質に特有で、コラーゲン分解のマーカーとしてはヒドロキシプロリンより正確であると考えられてきた。しかし、ヒドロキシプロリンについて上述したのと同じ理由で、ヒドロキシリジンとそのグリコシドは同程度に非特異的な骨再吸収のマーカーであると思われる（Krane，S．M．and Simon，L.，Develop．Biochem．22:185 (1981)）。他の研究者らは、関節疾患におけるコラーゲン分解の指標として尿中の架橋化合物である3-ヒドロキシピリジニウムをこれまで測定してきた。その背景と実例については、Wu and Eyre，Biochemistry，23: 1850（1984）；Blacket al.，A nnals of the Rheumatic Diseases，45: 969-973（1986）；Seibelら，The Jour nal of Dermatology，16: 964（1989）を参照のこと。本発明とは異なり、これらの先行研究者は、体液から得たペプチドを加水分解した後、遊離の3-ヒドロキシピリジニウム残基の存在を探索したのである。 I型、II型およびIII型コラーゲンの分解を測定する検定法は、欧州特許第0394 296号、米合衆国特許第4973666号および米合衆国特許第5140103号に開示されている。しかしこれらの特許は、架橋物である3-ヒドロキシピリジニウムを含有するコラーゲン断片に限定されている。さらに上述の検定法には、その検定において抗体の製造に使用すると共に抗原としても使用する3-ヒドロキシピリジニウムを含むコラーゲン断片を尿から精製するのに退屈で複雑な方法が必要となる。現在のところ米合衆国特許第4973666号と米合衆国特許第5140103号において記載された方法を用いた臨床データは、殆ど入手不可能である。とりわけ、Ｉ型コラーゲンの3-ヒドロキシピリジニウム含有テロペプチドの尿中濃度（上述の特許に記載の方法によって測定）と実際の骨減少（骨密度測定法による反復測定によって測定）の間の相関関係については、データは一切発表されていない。尿中に 3-ヒドロキシピリジニウム含有テロペプチドが存在するには、骨再吸収過程前の様々な時点でこの特異的架橋構造が骨組織中で適度に形成される必要がある。これらの過程に関する情報はほとんど発表されていないので、架橋構造の正しい形成に対してこのように依存しないほうがが望ましいであろう。英国特許出願第2205643号は、体内におけるIII型コラーゲンの分解をIII型コラーゲンに由来するN-末端テロペブチドの体液中の濃度を測定することによって定量的に測定することができる旨報告している。この方法は、細菌性コラーゲナーゼによるIII型コラーゲン分解によって遊離されたN-末端テロペプチドに対して生成した抗体を使用するのであるが、該テロペプチドを標識して検定に使用する。 Schroter-Kermani et al.，Immunol．Invest．19:475-491（1990）は、コラーゲンI 型およびII型のCNBr断片に基づく免疫学的測定システムを記述している。ペプシン可溶化コラーゲンヲ利用するのであって、テロペプチドは組織中に残したままとしている（上述の英国特許出願第2205643号を参照）。ペプシン可溶化I 型コラーゲンに対して産生されたモノクローナル抗体の開発が、Werkmeisterら，Eur．J．Biochem．1987:439-443（1990）に記載されている。この抗体は、組織断片の免疫組織化学的染色と細胞培養物中のコラーゲン含量の測定に使用される。これらの測定は、体液については行われない。欧州特許出願第0505210号には、Ｉ型コラーゲンに由来する精製した架橋C-末端テロペプチドを用いて免疫することによって試薬を開発することが記載されている。その免疫原は、ヒト骨コラーゲンを細菌性コラーゲナーゼで可溶化することによって調製するが、このようにして調製した抗体は、架橋テロペプチドと非架橋テロペプチドの双方及びピリジノリン以外の架橋性物質と反応する能力をゆうするのである。国際特許出願第W091/09114は、固形基質に対する細胞接着を促進するために使用される幾つかの合成ペプチドを開示している。それらの合成ペプチドを免疫学的試薬として使用する用途については、触れられていない。幾つかのコラーゲンプロペプチドを定量することによってコラーゲン分解を測定することが出来ることを示す報告がいくつかある。プロペプチドは、プロコラーゲン分子におけるその位置や生体内でのその切断時期とによってテロペプチドやコラーゲン核のアルファ螺旋領域とは識別されている（米合衆国特許第450458 7号；米合衆国特許第4312853号；Pierardet al.,Analytical Biochemistry 141 : 127-136(1984); Niemela，Clin．Chem．31/8: 1301-1304 (1985);Rohdeetal. ，European Journal of Clinical Investigation，9: 451-459 (1979) を参照）。欧州特許出願第0298210号と第0339443号は共に、プロコラーゲンペプチドIII 型とその断片の免疫学的測定を記載している。さらにプロコラーゲンの測定に基づく方法が、欧州特許出願第0465104号に開示されている。 IX型コラーゲンから誘導された配列を持つ合成ペプチドを免疫学的試薬の開発に使用することが、PCT 特許出願第W090/08195号に開示されている。さらにこの出願は、このようにして製造した抗体を体液中のIX型コラーゲン断片の測定に使用することを記載している。米合衆国特許第4778768号は、関節軟骨内で起こる変化を決定する方法であって、滑液試料中のプロテオグリカン単量体またはその抗原性断片を定量することから成る方法に関する。 Dodge，J．Clin Invest 83: 647-661（1981）は、ヒトおよびウシII型コラーゲンの非屈曲アルファ鎖および臭化シアン誘導ペプチドと特異的に反応するポリクローナル抗血清を利用して、II型コラーゲンの分解を解析する方法を開示している。コラーゲンの分解産物は、体液中では検出されたことはなく、細胞培養物の染色（すなわち「in situ」検出）によって組織化学的に検出されている。 WO94/03813は、試料中のコラーゲンまたはコラーゲン断片を検出するための競争的免疫検定法であって、コラーゲンの非螺旋状C-末端またはN-末端ドメインに相当した合成直鎖ペプチドを含有する結合パートナーを、その直鎖線状合成ペプチドに対する抗体および試料と共にインキュベートし、その結合パートナーに対する抗体の結合を測定するという方法を記載している。 WO95/08115は、合成ペプチドと反応性を有する抗体に反応させることによって体液中のコラーゲン断片を測定する検定方法に係わる。この検定法は、試料とかかるペプチドとが、抗体−コラーゲンのコラーゲナーゼ分解によって得られるコラーゲン断片に対して産生せしめたポリクローナル抗体である可能性がある−を目掛けて競争反応する競争検定法であり得る。またはその代わりに、かかる合成ペプチドに対して産生させた抗体−モノクローナル抗体である可能性があるが− を使用する検定法であり得る。我々が体液中、特に尿中において発見した一つの具体的なペプチド断片は、次式で表される：上式において、K−K−Kは架橋を表し、例えばヒドロキシピリジニウム架橋であってもよいが、天然に存在する架橋であってもよく、具体的にはLastら，Int ．J．Biochem.，Vol.22,No.．6，559-564，1990において議論されているものならなんでもよい。上記のより小型の断片を含む大型のペプチド断片は、欧州特許第0394296号に報告されている。 WO95/08115に記述されているある骨再吸収検定法（CrossLapsT^TM）では、1型コラーゲンのC-テロペプチドの８個のアミノ酸からなる特異配列を含有するI型コラーゲン断片が定量されている(Bondeet al.，Immunoassay for quantifying type I collagen degradation products in urine evaluated，Clin．Chem．40/ 11，2022-2025（1994）−Endocrinology and Metabolismをも参照のこと）。 WO94/038113に記述されているもう一の骨再吸収検定法は、Ｉ型コラーゲンのN -テロペプチドの2つのペプチド鎖とピリジノリン構造を含有するすべての断片に係わるものである（Hanson et al.，A specific immunoassay for monitoring h uman bone resorption: quantification of type I collagen cross-linked N-t elepeptides in urine，Journal of Bone and Mineral Research，Vol．7，No. ．11，1992をも参照のこと）。我々は、これらの検定法の何れにおいても反応性を有する断片は、その大きさと架橋分子（例えばピリジノリン、エールリッヒ発色原およびピロール構造など）の含量という点でかなり大きくの変動するものと考える。様々な研究が、ある一つの先行技術検定法を用いて得らた結果を同じ試料について別の先行技術検定で得られた結果と比較検討することによってこれまでに行われている。これらの研究の目的は、骨再吸収速度の尺度としてこれらの検定法の信頼性を確立することであった。例えば、Garneroe tal.，Journal of Clinic al Endocrinology and Metabolism，70，N0．3，780-785を参照のこと。この種の研究は、異なる検定法によって得られた結果の類似性における有意さを探索するものであるが、我々が信じるところでは、かかる研究は、得られた結果から明らかにし得る個別の患者毎の骨再吸収の起源と原因に関する価値ある情報を正しく認識・評価出来るものではないのである。生体内におけるI 型コラーゲンの正確な断片化パターンは、まだ完全には解明されていない。しかし、ゲルろ過手法において反応性のパターンによって測定されるI型コラーゲンの断片化パターンが、ある抗再吸収治療を受けた女性と別の治療を受けた女性とでは有意に相違することが示されている（Garneroet al.，A merican Society of Bone and Mineral Reserach，Abstract 134,Kansas City,1 994）。また、治療を受けていない女性では、断片化パターンがかなり変動することも明らかにされている（未発表の観察結果）。更に我々は今や、断片化パターンに関するこのような差異が、骨コラーゲン分解産物の免疫学的検定法を変えて得られた結果の差異に反映されていることを立証し確立したのである。本発明はかくして、体液中のコラーゲン、好ましくは1型コラーゲンの断片化パターンを評価する方法であって、該体液の試料を少なくともに二種類の異なる免疫学的検定法−各々が該試料中のコラーゲン分解産物の各群の量を測定する− に供し、該測定の結果を比較することからなる方法を提供するのである。即ち、ある診断の局面においては、Ｉ型コラーゲン断片の測定を目的とすればよく、これによって「病的な」性格を有しうる断片により重点を置き、骨格の「健常な」再生の過程で生成する断片には重点を置かないで済ますことが出来る。それぞれの検定法によって検出される分解産物の母集団は、重複し得る可能性があることが理解されるであろう。実際、該母集団の内のあるものは、他の母集団に完全に包含される部分母集団となる可能性がある。骨形成の速度も当然高いものと仮定すれば、骨格の「健常な」再生においては骨再吸収速度が速くなる可能性があり得るので、特異的断片の濃度とそれ以外の断片または双方の断片の和の濃度とを、例えば比率を計算することによって、比較対照することは、このような意味合いにおいては極めて適切・至当である。一例として、ある検定法を用いて分解産物の和の測定を行い、一方では別の検定法で「正常な」または「通常の」コラーゲン分解過程で生成する分子を選択的に検出すればよい。二つの検定方法の間の指標を作成することによって、「病的な」コラーゲン分解、例えば骨転移によって生成するコラーゲン断片の量に関する情報が間接的に得られるだろう。ある診断上の並行的関係が、アテローム性動脈硬化の危険を評価する分野では存在する。この場合、総コレステロール及びHDLとL DLの形状をしたコレステロールの副画分を測定する。本発明によれば、結果を数学的に組み合わせて、例えばそれらの比率をとることにより、数値指標を作成することによって、結果を比較するのが好ましいことになろう。二つの独立した骨吸収の免疫学的検定法で測定した断片の濃度から得られる比率は、I型コラーゲンの断片化パターンに依存する指標であって、それゆえにコラーゲン代謝に関連した疾患について診断に使用することができる指標を提供するものである。二つ以上の検定法から導かれた数値指標を、所望であれば試料中のコラーゲン断片を例えばHPLCやゲルろ過で分離し、次いで特定の分画中のペプチドの量を測定し、任意には問題対象とするペプチドを同定することによって、特定の同定された断片化パターンに結び付けてもよい。しかし、これは本発明を実施するには必要でない。単に特定の数値指標の結果を特定の患者タイプに関連付けてもよい。これは、タイプが既知である試料集団を一対のまたはそれ以上の複数の選択した検定に供し、結果のデータベースを構築することによって行ってもよい。そうすれば、未知試料の断片化パターンを過去に試験したある具体的な試料クラスの典型であると同定してもよいのである。「患者タイプ」という用語は、年齢および/または性別が異なる健常な患者と一つ以上の病的または異常な症状の患者の両方を包含する。本発明によれば、該分解産物の母集団の各々は、Ｉ型コラーゲンのテロペプチドの分解産物を含んで成るのが好ましい。好ましくは、少なくとも一つの前記母集団は、ヒト1型コラーゲンの次のアミノ酸配列の一種以上をから成るペプチドを含有する分解産物集団である：このような母集団の一つは、ヒトII型コラーゲンの次のアミノ酸配列の1以上から成るペプチドを含有していてもよい: またはヒトIII型コラーゲンの次のアミノ酸配列の一以上を含有してもよい：アスパラギン酸がイソアスパラギン酸に置換された類似の配列も検出される可能性がある。好ましくは、前記検定法の内の一つが、イソアスパラギン酸を含有することを特徴とする分解産物の母集団の量を測定するものである。前記母集団は、配列EKAH*GGR−本式において、＊はイソアスパラギン酸でありまたＫは、コラーゲン架橋の一部またはリジンを表す）を持つ一以上のペプチドを含有する分解産物を含むで成るか又は該分解産物から構成されてもよい。検定法の一つが、前記体液中に存在する次の式2で表されるペプチドの量，またはイソアスパラギン酸を含有する式2のペプチド中に存在するエピトープを組み込んだ一以上のペプチドの量を測定することから成るものであればよい：上記式において、K-K-Kは、天然に存在する架橋を表し、^*は、ソアスパラギン酸を表す。前記測定は、その操作中に試料内に存在するイソアスパラギン酸含有種に特異的な免疫学的結合パートナーを用いて行うことができる。免疫学的結合パートナーは、該コラーゲン配列内において前記アミノ酸配列のアスパラギン酸がイソアスパラギン酸に置換したコラーゲン内配列に対応する直鎖線状ペプチドに対して産生させた抗体であってもよい。またコラーゲンの断片に対して産生させた抗体であって、かかるイソアスパラギン酸含有ペプチドへの親和性があるよう選択されたものであってもよい。好ましくは、前記検定法の内の一つの又は他の検定法が、イソアスパラギン酸の代わりにアスパラギン酸が存在するためにある検定法で検出されるものに関係するペプチドを含有する分解産物の一つの母集団を測定するものであってもよい。本発明は、体液中の1型コラーゲンの断片化パターンを評価する際に使用するキットであって、I型コラーゲン分解産物の第一母集団のための免疫学的結合パートナー、1型コラーゲン分解産物の第に母集団のための免疫学的結合パートナーおよび任意には、緩衝液、洗浄溶液、合成ペプチド、抗イディオタイプ抗体、抗体−酵素複合体、抗体−酵素複合体の基質、体液対照試料、標準溶液および酵素複合体反応停止溶液から選択される一種以上の検定キット成分を含んで成る前記キットを包含する。本発明のとりわけ好ましい実施態様に従えば、ゲルろ過技法の尿試料中で測定決定したＩ型コラーゲンの特定の断片化パターンが、二種の免疫学的検定法を用いて得られる結果間の比率を求めることによって評価できることが本発明者らによって見出されたのである。なおこれら検定法は何れも骨再吸収の検定法であり、共にI 型コラーゲンの分解産物を測定するものである。これらの検定法の内の第一の検定法はポリクローナル抗体に基づき、Bondeet al.，Immumnoassay for quantifying type I collagen degradation products in urine estimated，Cli n．Chem．40/11，2022-2025（1994）-Endocrinology and Metabolismに記載されている。第二の検定法はモノクローナル抗体に基づくもので、Fledeliuset al., American Society of Bone and Mineral Research，Abstract C 344,KansasCity ，1994に記載されている。これらの検定法は共にWO95/08115にも記載されている。尿試料についてのゲルろ過実験を用いると、I 型コラーゲンの分解が個体間で定量的にも定性的にも変動することが観測される。I 型コラーゲン分解における定性的相違を定量的に記述表現するため、I 型コラーゲンの異なる分解断片を検出する上記検定法のそれぞれで得られる結果間の比率を作成すればよい。この比率を用いて、ある検定法又は別の検定法において同等の測定値を与える複数の尿試料を識別することができる（表１参照）ので、この比率は種々の診断目的に有用である。総コレステロールと副分画(HDL、LDL)を測定し、副分画と総コレステロール間の関連する比率を作成することによりアテローム性動脈硬化の診断および危険性の評価を行うことと同様に、複数の骨再吸収の検定方法の間の関連する比率を作成するという方法を使用して、コラーゲン代謝の障害を診断することが意図されたのである。要約すれば、上記検定法は、I 型コラーゲンのαI鎖のC-末端テロペプチドの一部に認められるアミノ酸配列（Glu-Lys-Ala-His-Asp-Gly-Gly-Arg＝8AA）を持つ固定化合成ペプチドに依拠するものである。第一の検定法で使用するポリクローナル抗体を作成するため、ウサギをコラーゲナーゼ処理コラーゲンで免疫感作し、8AAと反応する抗体血清を選択した。第二の検定法のモノクローナル抗体を作成するため、二段階カルボジイミド法を用いてBSAに結合した8AAでウサギを免疫感作した。微量滴定プレートをコートするため、8AAペプチドをグルタルアルデヒドを用いてチログロブリンに結合した（Soinila S，Mpitsos GJ，Soinila J.,Immuno-h istochemistry of encephalins: Model studies on hapten-carrier conjugates and fixation，J．Histchem Cytochem 1992: 2: 231-9)。試料をこれらの抗体と共にインキュベートする過程において、固定化ペプチドと尿中のI型コラーゲン分解産物の間で競争が生起する。溶液中のペプチド含量が増大するにつれて、固定化ペプチドに結合する抗体が少なくなり、光学密度が減少する。驚くべきことに、モノクローナル抗体は8AA配列の全部または一部を含有する尿中ペプチドをうまく検出するにに対して、検定条件下のポリクローナル抗体は、8AA配列中のアスパラギン酸がイソアスパラギン酸で置換されている類似のアミノ酸配列（イソ-8AA）の全部または一部を含有するペプチドを尿中で選択的に検出することが発見されたのである。従って、このようなポリクローナル抗体の代わりに、イソ-8AAペプチドとの反応性を目的として選択されたポリクローナル抗体か又はイソ-8AAに対して産生させたモノクローナル抗体を使用することができる。即ち、本発明者らは、式中のアスパラギン酸をイソアスパラギン酸で置換することによって、体液中のペプチド断片の一部を同一式で表されるペプチド、例えば式1のペプチドに関係ずけられることを発見したのである。アスパラギン酸の異性化は、生理学的条件下で起こる自発的反応であることが既に報告されている。例えば、Brennanet al.，Protein Science 1993，2，331-338; Galletti et a l.，Biochem．J．1995，306，313-325; Lowenson et al.，Blood Cells 1988，1 4，103-117; Oliya et al.，Pharmaceutical Research，Vol．11，No．5，1994 ，751を参照のこと。上記発見は、この異性化が骨組織内でも起こり、従って異性化の程度が、当該骨組織の年齢のマーカーになるものと期待されることを示している。さらに、このような骨ペプチド断片中にの異性化が存在することは、そのペプチド断片が、実際現実に骨の分解に由来するものであって、例えば新生したものの、決して骨に取り込まれなかったコラーゲンの分解などたのソースに由来するものではないことをとりもなおさず確認するものである。従って、これら検定法の内一つの方法は、操作中に試料内に存在するイソアスパラギン酸含有種、好ましくは式2で表される前記ペプチド又はイソアスパラギン酸を含有する式2のペプチド中に存在するエピトーブを組込んだペプチドに対して特異的な免疫学的結合パートナーを用いて実施すすのが好ましいのである。かかる免疫学的結合パートナーは、モノクローナル抗体であってもよいし又はポリクローナル抗体であってもよい。免疫学的結合パートナーが、イソアスパラギン酸含有種に特異的でなくてはならないという必要性は、当該免疫学的結合パートナーが前記種と類似したアスパラギン酸含有種とを当該検定法において有用な程度に識別出来るということを意味する。好適な免疫学的結合パートナーには、Fab、Fab'やF(ab')₂断片を含む同一抗原性決定基を結合する能力を有する抗体の断片が挙げられる。好ましくは、かかる免疫学的結合パートナーは、該コラーゲン配列内のアスパラギン酸を該アミノ酸配列中でイソアスパラギン酸で置換したコラーゲン内配列に対応する直鎖ペプチド、好ましくは合成ペプチドに対して産生させた抗体である。各検定法は、多くの形態を取りうるのであって、例えばELISA、RIAまたはIRMA 法など、あまりにもよく知られているのでここに記述するまでもない方法をも含む。この種のELISAにおいては、かかる合成ペプチドは固体支持体上に固定化すればよい。合成ペプチドのポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を固体支持体に接触させながら試料をインキュベートし、洗浄した後、ペルオキシダーゼ結合（呈示）抗体を加えればよいのである。さらにインキュベートした後、ペルオキシダーゼ基質溶液を加える。競争によって、抗体と反応する試料中のペプチドがペルオキシダーゼ反応を阻害する。合成ペプチドを用いてモノクローナル免疫学的結合パートナーを産生させる場合、その合成ペプチドは、本検定法における競争剤である必要はない。例えばコラーゲナーゼ処理コラーゲンを精製し、固体支持体上に固定化し、モノクローナル抗体を用いてELISAを行えばよい。一種以上のアスパラギン酸含有ペプチド及びイソアスパラギン酸含有類縁体に対してそれぞれ選択的な抗体を作成してもよい。次にこれらのペプチドの一種又は複数種の両方の変種について検定法を実施することが可能である。イソアスパラギン酸の相対量は、現に破壊・分解の過程にある骨の年齢一の指標となるものであろう。従って本発明は、患者におけるコラーゲン再吸収に関する情報を得る方法を提供するものであり、該方法は、コラーゲンに由来する少なくとも一種のアスパラギン酸含有ペプチドとそれに対応するイソアスパラギン酸含有ペプチドとの相対量を体液中で測定することからなるものである。本発明は、ヒトにも動物にも適用し得る。好適な体液としては、例えばヒトの尿、血液、血清、血漿および滑液が含まれる。この方法は、例えば唾液や汗にも使用できると想定される。体液をそのまま使用してもよいし、接触段階の前に精製してもよい。かかる精製段階は、多数の標準的手法、例えばカートリッジ吸着と溶出、分子篩クロマトグラフィー、透析、イオン交換、アルミナクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびそれらの組み合わせなど−但し、これらに限定されない−を用いて行うことができる。本発明を以下に詳述する。なお添付の図面について説明するが、本図面において：図１は、ゲルろ過クロマトグラフィーによって分離した11歳の子供の尿の分画の免疫学的反応性を示す。図２は、53歳の女性から得た同様の結果を示す。図３は、ガン患者について実施例4で得た結果のヒストグラムである。図４は、対照に対する同様の結果を示す。本発明方法の好ましい態様においては、本検定法の何れか又は双方を、阻害EL ISA（酵素結合イムノソルベント検定法）に従い試料をコラーゲン由来の配列を持つ合成ペプチドおよびその合成ペプチドと免疫反応する抗体とに接触させることによって行う。この合成ペプチドは固体支持体上に固定化する。該抗体は、合成ペプチドに対して産生させるか又はコラーゲン分解産物に対して産生させ、次いでかかる合成ペプチドを使用して検索すればよい。合成ペプチドの調製は、当該技術分野で良く知られている方法、例えば一般に「メリフィールド合成」と呼ばれている固相ペプチド合成技術によって行えばよい。また古典的な溶液相技術を使用してもよい。対象とする配列には、コラーゲン架橋の潜在的部位が含まれる（例えばKuhn，K.，Immunochemistry of the ext racellular matrix，1: 1-29（1982）；Eyre，D．R.，Ann．Rev．Biochem．53: 717-48（1984）又は米合衆国特許第5140103号を参照のこと）。このようなペプチド配列の例は、上記において述べた通りである。合成ペプチドについては、(a)対応する天然コラーゲン断片のイソアスパラギン酸類縁体を認識する抗体を産生する能力または(b)天然断片の該類縁体に対するそのような抗体の結合を阻害する能力の双方をを本質的に失わせることなく、架橋可能部位配列から一種以上のアミノ酸残基を削除するか又は架橋可能部位配列に一種以上のアミノ酸残基を付加することが可能である。より長いコラーゲン断片および/またはキメラペプチドを用いて抗体を産生させることが可能であり、原則として競争検定法における競争剤や免疫原と同一のペプチドを使用する必要はない。モノクローナル抗体とポリクローナル抗体を作成する方法は共に当該技術分野で良く知られている。例えば、Campbell，A．M．，Laboratory Techniques in B iochemistry and Molecular Biology，Vol.12（1986）を参照のこと。免疫感作によって合成ペプチドに対する抗体を製造することが可能である。しかしながら、これらの化合物は分子量が比較的小さいので、そのハプテンを担体分子に結合することが好ましい。好適な担体分子には、ウシ血清アルブミン、チログロブリン、卵白アルブミン、破傷風変性毒素およびキーホールリムペットヘモシアニンが含まれるがこれらに限定されない。好ましい担体は、ウシ血清アルブミンである。免疫感作される動物の抗体産生細胞に最も免疫原的な形態でハプテンを提示するため、数多くのカップリングプロトコールを使用することができる。好適な方法には、グルタルアルデヒド、カルボジイミドおよび過ヨウ素酸が含まれるがこれらに限定されない。好ましい結合剤は、グルタルアルデヒド及びカルボジイミドである。抗体の作成は、担体に結合させた合成ペプチドまたはコラーゲン断片を用いた免疫感作を含む従来技法によって行うことができる。免疫原性を改善するため、注射する前に免疫原をアジュバントと混合することが好ましい。アジュバントの例としては、水酸化アルミニウム、フロインドアジュバントおよび免疫刺激複合体（ISCOM）があるが、これらに限定されない。ISCOMは、Morein，B.et al.，Na ure 308:457-460（1984）に記載された方法で作成することができる。担体分子上のハプテンに対するモノクローナル抗体もポリクローナル抗体もいずれも作成することができる。モノクローナル抗体の作成には、マウスを免疫感作することが好ましい。免疫感作したマウスから脾細胞を収集し、ホモジナイズした後、ポリエチレングリコール中でガン細胞と融合して、コラーゲンに由来するペプチド断片に特異的なモノクローナル抗体を生産する細胞ハイブリッドを作成する。好適なガン細胞には、骨髄腫、肝腫瘍、癌腫および肉腫細胞が含まれるが、これらに限定されない。モノクローナル抗体作成の詳細な記述は、Goding， J．W.，Monoclonal Antibodies: Principles and Practice（1986）になされている。好ましい予備スクリーニングプロトコールは、担体に結合し且つ微量滴定プレートの固体表面にコートした合成ペプチドを使用することからなる。コラーゲン由来のペプチド断片と反応するポリクローナル抗体を作成するには、様々な動物種を免疫感作することができる。好適な種にはニワトリ、ウサギおよびヤギが含まれるが、これらに限定されない。ニワトリとウサギが好ましい。このようにして作成した抗体を、イソアスパラギン酸を含有する適当な配列の合成ペプチドとの反応性を試験することによって、本発明に従って使用する際の好適性についてスクリーニングすればよい。抗体断片は、当該技術分野で既知の方法によって調製される（E．Ishikawa，J ournal of Immunoassay 3: 209-327（1983）を参照のこと）。従って上述のごとく作成された抗体用いた免疫検定法を利用することによって、生物学的な液体試料を前もって分画または加水分解することなく検定することが可能である。生物学的液体中の目的とするコラーゲンに対する特異性は、検定法構成において合成ペプチド（この合成ペプチドに対して既に抗体を産生させたことがあるか、又は何れにしろ抗体がこの合成ペプチドと免疫化学的に反応する）を使用することと組み合わせて抗体により付与させればよい。代替法として、当該免疫検定法は、モノクローナル抗体を用いて行うことができる。この検定法設計の基本的な概念は、検定の特異性を抗原（合成ペプチドからコラーゲンへ）から抗体（ウサギ抗血清からモノクローナル抗体へ）に移動させることである。このような構成を用いると、この検定法にはもはや合成ペプチドを使用する必要がない。このような免疫検定法の変法は、好適には精製したコラーゲナーゼ処理コラーゲンで予めコートしておいた微量滴定プレート中で患者の試料または標準溶液をペルオキシダーゼ結合抗体溶液と共にインキュベートすることによって行われる。洗浄後、プレートのウェルを暗所で基質溶液と共にインキュベートする。停止溶液の添加によって発色反応を停止させ、最後に吸光度を測定する。免疫検定法それ自体は、当該技術分野で一般に知られている様々な標準的検定法プロトコールから選択されるいずれの手法を用いて行ってもよい。一般的に理解されるように、本検定法は、特異的免疫学的結合パートナーと所望の分析物の間の相互作用により特異性を探索し且つ分析物と免疫学的結合パートナーによって形成される複合体を検出するための何らかの手段を利用するように構成される。免疫学的結合パートナーを固体支持体に結合し、それを分析物の捕捉免疫学的結合パートナーとして使用してもよい。この方法は、分析物−免疫学的結合パートナー複合体の形成を例えば蛍光、放射活性または酵素的標識によって検出する直接型で行ってもよいし、標識した標品が免疫学的結合パートナーについて分析物と競争する競争形式で行ってもよい。また、その形式を凝集検定として構成してもよいし、適当な沈殿剤を反応混合物に添加することによって複合体を沈殿させてもよい。免疫検定法の具体的な設計には広範囲にわたる様々な選択が可能であり、利用できる臨床的検定装置および方法の数は非常に多い。そのような様々な方法については米合衆国特許第5001225号を参照のこと。標準的な検出プロトコール、例えば放射性同位体標識、蛍光標識あるいは直接形式または競争形式のELISAなどを用いる免疫検定を実施するための抗体と呈示試薬を、検定に必要な成分と使用法とを含むキットとして便利に供給することができる。本発明の一態様として、そのようなキットは、関連する合成ペプチドでコートされた微量滴定プレート、標準曲線を作成するための標準溶液、分析作業の定性試験用の尿または他の体液対照、上述の合成ペプチドと反応するウサギ抗体、ペルオキシダーゼに結合した抗ウサギ免疫グロブリン、基質溶液、停止溶液、洗浄緩衝液および使用指示マニュアルを含む。免疫検定法は、抗体と特異的合成ペプチドを用いて構成できるので、適当な生物学的液体中の幾つかの対応するコラーゲン断片配列の比率を、これらの個別量およびそれらの合計量と共に決定・決定することができる。即ち、本検定法は、数種のイソアスパラギン酸含有ペプチドおよび任意には天然ペプチド配列を決定するか又は単一のイソアスパラギン酸含有ペプチド配列および対応する（または異なる）天然ペプチド配列又はそれらの所望する如何なるの組み合わせでも決定することか出来るような抗体を含むように設計することができる。以下の実施例は、本発明を詳細に説明することを意図するものであり、本発明の限定するものではない。一般論以下の実施例において記載した検定法の実際的な実施に際しては、15μｌの標準液または未知試料を、予めコートしておいたELISAプレートの適当なウェルにピペットで加えたが、これを二回別々に行った。次に100μlの抗体溶液を各ウェルに加え、プレートをシールテープで覆い、振とう装置上室温で60分間インキュベートした。以下の操作もすべて室温で行った。インキュベーション後、プレートを希釈した洗浄緩衝液で3回洗浄した。ペルオキシダーゼ結合抗体（ウサギIgGに対するHRP-結合ヤギ抗体，100μl/ウェル）を加え、密封したウェルを振とう装置上で60分間インキュベートした。更に洗浄した後、100μlのTMB基質溶液をすべてのウェルに加え、それを密閉して、15分間インキュベートした。15分後に100μlの停止溶液を添加することによって酵素反応は停止した。光学密度を450nmにおいてELISA-測定器で読み取った。５つの標品（0.1〜5.0μg/ml）の平均吸光度をプロットすることによって対数 −一次グラフ用紙上に補正曲線を作成した。各患者試料中の合成ペプチド（Glu- Lys-Ala-His-Asp-Gly-Gly-Arg）に等価な物質の濃度を補正曲線上での内挿法によって決定した。モノクローナル抗体（ASbAY）を使用する検定法については、ピペット採取計画ならびにインキュベーションおよび洗浄段階は、ポリクローナル抗体を使用する検定法と同一とした。実施例１子供と成人女性から採取した尿のゲルろ過子供（年齢11歳）の尿試料と女性（年齢53歳）の尿試料をそれぞれゲルろ過カラムにかけた。G25 Sephadexスーパーファインゲル（Pharmacia,Uppusala,Swede n）58mlを含有する同様の900×10mmカラムに0.75mlの尿を注入した。溶出は、25 モル/lリン酸緩衝液（pH 7.4）を用いて0.22ml/分の流速で行い、それを280nmにおいてUV検出器で追跡監視した。集めた分画(1 分画あたり1.6〜1.8ml)をCrossL aps^TMMELISA（Bondeet al.，Clin．Chem．40/11，2022-2025（1994）−Endcrino logy and Metabolism）で分析した。図１に認められるように、11歳の子供の尿は、約56ml後に一つの主要ピークしか示さない。女性（年齢53歳）の尿から得た溶出図を見ると、二つの異なるピークが観測される（53mlの第一ピークと64mlの第二ピーク）。これらの観測結果は、患者間でI 型コラーゲンの断片の分布に相違があることを示している。子供の尿は、成人女性の尿中の64mlに認められる第二ピークを欠いているので、この尿には小型の断片が欠落しているように思われる。実施例２子供および成人女性から採取した尿試料についての免疫検定 8人の女性（年齢23〜56）と8人の子供（年齢8〜12）の尿試料を二つの免疫検定法（それぞれ一介の上述のポリクローナルとモノクローナル法）で分析した。表1に各尿試料の結果を示づ。さらに、一つの試料について二つの検定系で得た値の比率をも示す。子供から得られた値は全て0.82〜1.12の範囲にあり、一方、成人女性の値は0.14〜0.25の範囲にある。表中に示した各値は、二つの検定法における三回の独立した試験に基づいている。実施例３パジェット病前記二つの免疫検定法を既知のパジェット病患者及び対照から得た試料について使用した。表２に示す結果から、異なる断片化パターンは試料の識別を可能にするだけの比率を与えることが判る。実施例４二次骨転移を伴う乳ガン実施例３で使用した検定法を、二次骨転移を伴う乳ガンにかかっている患者から採取した尿試料及び健常患者の対照について行った。健常な母集団について得られた結果の比率は、0.1〜0.4であったが、それに対して骨転移患者から得た試料の50％は、比率が0.4以上であった。。その結果を図３および４に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．体液中のコラーゲンの断片化パターンを評価する方法であって、前記体液の試料を少なくとも二つの異なる免疫学的検定法−各検定方とも該試料中の各コラーゲン分解産物群の母集団量を測定する−に供しかつ測定値の結果を比較することから成る前記方法。２．前記分解産物群のそれぞれが、1型コラーゲンの分解産物を含んで成る、請求項１に記載された方法。３．前記分解産物の母集団がそれぞれ、コラーゲンのテロペプチドの分解産物を含んで成る、請求項１または請求項２に記載された方法。４．前記母集団の少なくとも一つが、以下に示すヒトＩ型コラーゲンのアミノ酸配列の一種以上を含んで成る複数のペプチドを含有する分解産物である、請求項２に記載された方法：５．前記母集団の少なくとも一つが、以下に示すヒトII型アミノ酸配列の一種以上：及び／又は以下に示すヒトコラーゲンIII型アミノ酸配列の一種以上：とを含んで成る複数のペプチドを含有する分解産物である、請求項２に記載された方法。６．前記結果を数学的に組み合わせて数値指標を作成することによって前記結果を比較する、前記請求項のいずれかに記載された方法。７．前記検定法の内の一つの検定法が、イソアスパラギン酸を含有することを特徴とした分解産物群の母集団量を測定するものである、前記請求項のいずれかにに記載された方法。８．前記母集団が、配列EKAH^*GR−なお本式において、^*はイソアスパラギン酸でありまたKはコラーゲン架橋の一部またはリジンである−で表されるペプチドを一種以上含有する分解産物を含んで成るか又は該分解産物から構成されるものである、請求項７に記載された方法。９．該体液中に存在する下記の式２によって表されるペプチドの量又はイソアスパラギン酸を含有する、式２で表されるペプチド中に存在するエピトープを組み込んだペプチドの量を測定することから成る、請求項８に記載された方法：なお本式において、K-K-Kは、天然に存在する架橋でありまた、^*は、イソアスパラギン酸である。 10．前記測定が、測定中の過程において試料中に存在するイソアスパラギン酸含有種に対して特異的である免疫学的結合パートナーを用いて実施される、請求項８または請求項９に記載された方法。 11．免疫学的結合パートナーが、前記コラーゲン配列内のアスパラギン酸を該アミノ酸配列中でイソアスパラギン酸で置換したコラーゲン内配列に対応する直鎖ペプチド対して産生させた抗体である、請求項10に記載された方法。 12．前記検定法の内の一方又は他方が、前記いずれかの検定法においてイソアスパラギン酸の代わりにアスパラギン酸が存在することによって検出されたペプチドに関連ずけられるペプチドを含有する分解産物の母集団を測定するものである、請求項８乃至11までの内のいずれか一項に記載された方法。 13．体液中のI型コラーゲンの断片化パターンを評価するのに使用するキットであって、コラーゲン分解産物の第一母集団に対する免疫学的結合パートナー、コラーゲン分解産物の第二母集団に対する免疫学的結合パートナー及び任意には緩衝液、洗浄溶液、合成ペプチド、抗イディオタイプ抗体、抗体−酵素複合体、抗体−酵素複合体の基質、体液対照試料、標準溶液および酵素複合体反応停止溶液から選択される一種以上の検定キット成分を含んで構成される前記キット。